PHÂN lập và xác ĐỊNH đặc điểm SINH hóa của VI KHUẨN PHÂN lập từ cá rô ĐỒNG (anabas testudineus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THỊ HƯƠNG THẢO

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA
VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ RÔ ĐỒNG (Anabas
testudineus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

\

2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THỊ HƯƠNG THẢO

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA
VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ RÔ ĐỒNG (Anabas
testudineus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

Giáo viên hướng dẫn
PGs. Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

Ks TRƯƠNG QUỲNH NHƯ

2012


LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thủy Sản đặc biệt là các
thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền đạt những
kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình em học tập và
nghiên cứu tại trường.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc cô Đặng Thị Hoàng Oanh, đã tận tình
hướng dẫn và truyền đạt kiến thức cho em trong quá trình làm đề tài tốt
nghiệp..
Chân thành cám ơn chị Trương Quỳnh Như và các anh, chị trong bộ
môn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực
hiện đề tài.
Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn Nguyễn Thị Thu Hằng
cùng các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K34 đã động viên và hỗ trợ em trong
thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp.

i


TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập và xác định đặc điểm sinh học bệnh của vi khuẩn phân lập từ
cá rô đồng (Anabas testudineus)” được thực hiện nhằm tìm hiểu một số đặc
điểm sinh lý, sinh hóa, kiểu huyết thanh và xác định khả năng gây bệnh của vi
khuẩn phân lập từ cá rô đồng.
Vi khuẩn được phục hồi từ tủ âm 80o có 6 chủng (cá1 não1, cá1 não2,

cá1 não3, cá2 não, cá3 não, cá4 não). Qua kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản như
nhuộm gram, tính di động, oxydase, catalase, tiến hành định danh theo
phương pháp truyền thống và kit API 20 Strep được cả 5/6 chủng là
Streptococcus agalactiae. Tuy nhiên kết quả kiểm tra API lại sai khác đối với
một số chỉ tiêu (GLYG, RIB).
Kháng sinh đồ được thực hiện trên cả 6 chủng Streptococcus
agalactiae với 12 loại thuốc kháng sinh. Kết quả chỉ có kháng sinh
Cefazoline, Florfernicol, Neomycine thể hiện tính nhạy. Các loại kháng sinh
còn lại thể hiện tính nhạy trung bình hoặc kháng với các chủng vi khuẩn trên.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn với các kháng sinh
Cefalecin, Enrofloxacin, Trimethoprim/Sulfamethoxazol Kết quả chỉ có
Cefalecin, Enrofloxacin là còn nhạy, nhưng giá trị MIC vẫn còn ở mức cao. Vi
khuẩn thể hiện tính kháng với kháng sinh Trimethoprim/Sulfamethoxazol .

ii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm tạ .......................................................................................................i
Tóm tắt.......................................................................................................... ii
Mục lục ........................................................................................................ iii
Danh sách hình ..............................................................................................v
Danh sách bảng ............................................................................................vi
Phần 1 : Giới thiệu ........................................................................................1
1.1 .

Giới thiệu .....................................................................................1

1.2 . Mục tiêu ........................................................................................2

1.3 . Nội dung ........................................................................................2
Phần 2 : Tổng quan tài liệu...........................................................................3
2.1 . Tổng quan về cá rô đồng và tình hình nuôi cá rô đồng ở ĐBSCL ..3
2.2. Tình hình dịch bệnh trên cá rô đồng ................................................4
2.3. Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ....................................5
2.4. Phản ứng kháng nguyên- kháng thể ................................................7
2.5. Các nhóm thuốc kháng sinh thường dùng trong NTTS....................7
Phần 3 : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ..........................................10
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...............................................10
3.2. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................10
3.3. Phương pháp nghiên cứu...............................................................10
Chương 4 : Kết quả và thảo luận ...............................................................21
4.1.

Kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống......21

4.2. Kết quả định danh bằng bộ kit API20 Strep.................................22
4.3.

Kết quả ngưng kết miễn dịch ......................................................23

4.4.

Kết quả kháng sinh đồ.................................................................23

4.5.

Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC..........................25

4.6.

Kết quả thí nghiệm gây cảm nhiễm .............................................27
iii


Phần 5 : Kết luận và đề xuất ......................................................................30
5.1. Kết luận .......................................................................................30
5.2. Đề xuất.........................................................................................30
Tài liệu tham khảo ......................................................................................31
Phụ lục ........................................................................................................33

iv


DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.

Cá rô ............................................................................................3

Hình 4.1

Vi khuẩn Streptococcus agalactiae được phục hồi trên BHIA ............21

Hình 4.2

Nhuộm Gram vi khuẩn có dạng hình cầu và không gây tan huyết21

Hình 4.3

Kết quả API20 Strep......................................................................22

Hình 4.3

Kết quả ngưng kết miễn dịch dương tính. ........................................23

Hình 4.4

Giá trị MIC đối với cefazoline.......................................................26

Hình 4.5

Sự kháng thuốc của vi khuẩn với Trimethoprim/Sulfamethoxazol...27

Hình 4.6

Gốc vây ngực bị xuất huyết.........................................................27

Hình 4.7

Xoang bụng chứa dịch đỏ............................................................27

Hình 4.8.

Kính phết mẫu thận cá rô bệnh do gây cảm nhiễm ......................28

Hình 4.9

Biểu đồ tỷ lệ cá chết tích lũy (%) theo ngày cảm nhiễm. .............28

Hình 4.10 Vi khuẩn phân lập từ cá gây cảm nhiễm......................................39

v


DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1

Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ ........................15

Bảng 3.2

Thao tác pha loãng thuốc kháng sinh ..........................................17

Bảng 3.3

Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau........................18

Bảng 4.1

Độ nhạy của vi khuẩn với thuốc kháng sinh................................24

Bảng 4.2

Kết quả MIC...............................................................................25

Bảng 4.3 Số cá chết ở mỗi bể ......................................................................28
Bảng 5. Kết quả định danh vi khuẩn Streptococcus agalactiae bằng phương
pháp sinh lý, sinh hóa truyền thống ...............................................................36
Bảng 6.

Kết quả định danh bằng bộ kíp AIP20 Strep .................................37

Bảng 7.

Kết quả kháng sinh đồ ..................................................................38

Bảng 8. Giá trị MIC của các chủng vi khuẩn ...............................................38
Bảng 9. Cách đọc kết quả định danh bằng bộ kíp AIP20 Strep ....................39
Bảng 10. Kết quả nhuộm Gram của vi khuẩn phân lập từ cá bệnh ...............40

vi


PHẦN 1

GIỚI THIỆU
1.1. Giới thiệu
Trong các nước xuất khẩu thủy sản trên thế giới, Việt Nam được coi là một
trong những nước có tốc độ tăng trưởng thủy sản nhanh nhất, với tốc độ tăng
trưởng trung bình trong giai đoạn1998-2008 đạt 18%/năm. Mặt hàng thủy sản
của Việt Nam cũng đã và đang có mặt ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ trên
thế giới.
Đóng góp quan trọng này không thể không kể đến Đồng Bằng sông Cửu Long
(ĐBSCL) một nơi được thiên nhiên ưu ái cho phát triển thủy sản đặc biệt là
thủy sản nước ngọt. ĐBSCL có bờ biển dài trên 700 km với diện tích khoảng
360.000km 2 hệ thống sông ngòi chằn chịt, hàng năm bị ngập lũ gần 50% diện
tích từ 3 - 4 tháng tạo nên những điều kiện thuận lợi cho việc đánh bắt, nuôi
trồng thủy sản.
Việc ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật, thâm canh hóa, đa dạng các đối

tượng nuôi đã góp phần nâng cao hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản. Bên cạnh
các đối tượng chủ lực như cá tra, cá basa, cá điêu hồng… một số đối tượng mới
đã được người dân đưa vào mô hình ao nuôi và thâm canh hóa như cá lóc, sặc
rằn, rô đồng, lươn…được nuôi ngày càng phổ biến góp phần tăng thu nhập cho
người nuôi. Tuy nhiên việc mở rộng diện tích nuôi cũng như việc đa dạng đối
tượng nuôi và thâm canh hóa đối tượng nuôi đã phát sinh nhiều vấn đề quan
tâm như: môi trường, con giống, thức ăn, quản lý ao nuôi và dịch bệnh.
Cá rô đồng (Anabas testudineus) là loài cá bản địa vùng ĐBSCL và có tiềm
năng lớn, thịt cá thơm ngon, có giá trị và được mọi người ưa chuộng. Chúng
được nuôi nhiều ở các nước như Thái Lan, Lào, Campuchia. Ở nước ta, cá rô
đồng được nuôi chủ yếu ở các tỉnh ĐBSCL như An Giang, Đồng Tháp, Sóc
Trăng (Phuong et al., 2002; Hien et al., 2003; Trieu và Long, 2001). Do chủ
động được con giống, thức ăn và nước cấp nên mô hình nuôi cá rô đồng ngày
được thâm canh hóa mang lại lợi nhuận cao.
Bên cạnh việc nuôi thâm canh hóa với mật độ cao thì vấn đề quản lý chất lượng
nước ao nuôi, quản lý dịch bệnh là rất khó khăn nên bệnh xuất hiện trong quá
trình nuôi là không thể tránh khỏi. Tuy nhiên, hiện nay thông tin về bệnh ở cá
rô đồng còn rất hạn chế và nhất là các nghiên cứu bài bản về bệnh ở đối tượng
nuôi này còn rất hiếm. Vì vậy, việc xác định tác nhân gây bệnh để tìm ra
phương pháp trị bệnh phù hợp nhằm giảm bớt thiệt hại khi mầm bệnh tái xuất
hiện trong quá trình nuôi là cần thiết. Do đó đề tài “Phân lập và xác định đặc

1


điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng (Anabas testudineus)” được
thực hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa, kiểu
huyết thanh và khả năng gây bệnh của vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng để cung

cấp dữ liệu cho các nghiên cứu tiếp theo giúp đề xuất các biện pháp phòng trị
hiệu quả bệnh ở cá rô đồng.
1.3. Nội dung đề tài
Phục hồi và định danh vi khuẩn bằng phương pháp truyền thống và kit API 20
Strep.
Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với 6 chủng vi
khuẩn.
Bố trí thí nghiệm để tiềm hiểu khả năng gây bệnh của vi khuẩn phân lập từ cá
rô đồng.

2


PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Tổng quan về cá rô đồng và tình hình nuôi cá rô đồng ở ĐBSCL

Sơ lược đặc điểm sinh học của cá rô đồng (Theo Bloch, 1972. Fishbase, 2010).
Cá rô đồng (Anabas testudineus) thuộc:
Ngành có dây sống:
Chordata
Lớp cá xương:
Actinopterygii
Bộ cá vược:
Perciformes
Họ:
Anabantidae

Giống:
Anabas
Loài:
Anabas testudineus

Hình 1. Cá rô đồng
Cá rô đồng là loài có phân bố rộng, chúng có thể sống ở các thủy vực nước
ngọt và nước lợ. Chúng phân bố nhiều ở các quốc gia trên thế giới như Ấn Độ,
Philippin, Thái Lan, Lào, Campuchia, Trung Quốc, Việt Nam…và nhiều quốc
gia Châu Á khác.
Cá rô đồng sống chủ yếu ở kênh, rạch, ao, hồ, đầm lầy và cửa sông. Chúng
cũng có thể được tìm thấy ở các con sông lớn, những nơi ngập lụt và nơi tù
đọng. Do cá có cơ quan hô hấp khí trời nên có thể chịu đựng được các điều
kiện bất lợi của môi trường như thiếu oxy, những ao tù đọng. Cá rô đồng có thể
vùi mình dưới bùn vào mùa khô để chờ những cơn mưa xuống, chúng cũng có
thể di chuyển trên cạn bằng hai nắp mang để tìm nơi cư trú thích hợp (Trương
Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993; Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hổ, 2003;
Fishbase, 2010).
3


Ngoài tự nhiên cá rô đồng ăn mùn bã hữu cơ, các phiêu sinh vật, cá, tôm nhỏ
(Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993; Fishbase, 2010). Mùa vụ
sinh sản của cá từ tháng 4-10, đẻ tập trung vào đầu mùa mưa, tháng 6-7 (Ngô
Trọng Lư và Thái Bá Hổ, 2003). Sau 5-6 tháng tuổi thì cá bắt đầu bắt cặp sinh
sản.
Cá được nuôi dưới nhiều hình thức từ nuôi trong ao, trong ruộng lúa, nuôi ghép
với nhiều loại cá khác và đang là một trong những đối tượng giúp người dân
thoát nghèo. Do việc nuôi cá rô đồng mang lại năng suất và lợi nhuận cao trong
những năm gần đây nên một số tỉnh đã đầu tư để phát triển loài thủy sản này.

Cá rô đồng được nuôi với mật độ 50-60 con/m2 (Dương Nhựt Long và ctv.,
2003). Các nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh sản, sinh trưởng trên cá rô
đồng khá nhiều nhưng những nghiên cứu về bệnh trên cá rô đồng để giúp người
nuôi khắc phục trong quá trình nuôi chưa nhiều.
2.2.

Tình hình dịch bệnh trên cà rô đồng

Cá rô đồng dễ nuôi, có giá trị thương phẩm cao, do đó mật độ nuôi đã được
tăng tối đa nhằm tăng năng suất và lợi nhuận cho vụ nuôi. Cá rô đồng cũng như
các loại cá khác, khi sống trong điều kiện môi trường xấu đến các chức năng
sinh lý, hoạt động của các cơ quan, tổ chức trong cơ thể sẽ bị ảnh hưởng.
Một số nghiên cứu cho thấy độc tố nước thải có thể làm phá hoại tổ chức mang
của cá rô đồng (Narian et al., 1990).
Một thí nghiệm cảm nhiễm 3 giống nấm Achlya, Aphanomyces và Saprolegnia
phân lập từ 21 loài cá lên cá rô đồng, trong vòng 3-7 ngày kể từ thời điểm cảm
nhiễm các sợi nấm phát triển nhanh chóng tại các vết thương và làm cá chết
trong vòng 5-10 ngày (Srivastava, 1980).
Bệnh nấm nhớt xảy ra trên cá rô đồng thương phẩm sau 3 tháng nuôi đã được
báo cáo xuất hiện ở 2 tỉnh Cần Thơ và Hậu Giang (Trần Ngọc Tuấn, 2010).
Bệnh nấm nhớt xuất hiện cùng với sự giảm sút của chất lượng nước ao nuôi
vào các tháng cuối vụ, làm giảm giá trị thương phẩm của cá và làm giảm năng
suất cũng như ảnh hưởng đến kinh tế của người nuôi.
Bên cạnh đó, vi khuẩn cũng là một tác nhân gây thiệt hại nghiêm trọng trên cá
rô đồng. Pal và Pradhan (1990), đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn, 2 chủng
thuộc giống Pseudomonas với các chỉ tiêu hóa, lý gần với P. fluorescens và P.
aeruginosa, một chủng Aeromonas hyrophila anaerogens (biotype II) và chủng
Micrococcus variance trên 129 mẫu cá rô đồng có dấu hiệu lâm sàng với các
đóm đỏ trên cơ thể và vết loét trên da. Đến năm 2005, vi khuẩn A. aeruginosa
cũng đã được phân lập từ ruột cá rô đồng bị bệnh với các biểu hiện lâm sang

những tổn thương ở da, cơ (Das et al., 2006).
4


Đặc biệt các nghiên cứu gần đây đã chứng minh sự hiện diện của vi khuẩn
Edwardsiella tarda trên loài cá này cùng với sự suy giảm chất lượng nước, hàm
lượng chất hữu cơ cao, nhiệt độ môi trường thay đổi làm cá bị stress, nuôi với
mật độ cao (Mohanty và Shoo, 2007). Một số thí nghiệm cảm nhiễm trước đó
cũng đã chứng minh khả năng gây bệnh của E. tarda trên cá rô đồng, kết quả
gây cảm nhiễm ở nhiệt độ nước 20-22oC cho thấy cá mẫn cảm với mầm bệnh
E. tarda ở mật độ 107 và 108 tế bào, cá bệnh có biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ, bụng cá
trương to có màu vàng ánh đến hơi đỏ, xuất huyết bề mặt cơ thể và các vây. Cá
chết 100% ở mật độ 109 tế bào trong vòng 3 ngày (Sahoo et al., 2000).
Một loài vi khuẩn gram âm khác cũng đã được công bố là gây bệnh trên cá rô
đồng. Vi khuẩn Flavobacterium columnare hình que, di động trượt đã được
phân lập trên cá rô đồng (Sarker et al., 2002; Dash et al,. 2009). Kết quả cảm
nhiễm cho thấy ở mật độ 107 và 10 8 CFU/ml, cá mẫn cảm nhanh với mầm bệnh
và chết 50-100% trong vòng 7 ngày, riêng ở mật độ F. columnare 106 CFU/ml,
sau 7 ngày cá chết 10-30%. Các điều kiện bất lợi như thiếu thức ăn cùng với
độc lực của vi khuẩn gây bệnh đủ mạnh thì bệnh sẽ xảy ra với tốc độ nhanh và
các tổn thương khá đặc trưng (Sarker et al., 2002; Sahoo et al., 2010).
2.3.

Bệnh do vi khuẩn Streptococcus

2.3.1. Dấu hiệu bệnh lý
Cá bệnh có một số biểu hiện bên ngoài là cơ thể sậm màu, một bên hoặc hai
bên mắt bị lồi và đục, xuất huyết ở các vây và xương nắp mang. Cá bị bệnh vận
động khó khăn, bơi không có định hướng, não, thận và tỳ tạng là những cơ
quan bị làm tổn thương nhiều nhất và đây là lý do gây chết cá. Cá bệnh cấp tính

sẽ chết nhanh với tỉ lệ chết cao. Tuy nhiên, cá có thể bị bệnh mãn tính, chỉ có
một vài nốt xuất huyết trên thân mà không có hiện tượng thương tổn nội tạng
(Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011).
2.3.2. Tác nhân gây bệnh
Tác nhân gây bệnh là vi khuẩn thuộc giống Streptococcus. Đây là nhóm khuẩn
hình cầu hoặc ovan, kích thước khá nhỏ, bắt màu gram dương, không di động,
lên men trong môi trường glucose. Streptococcus sinh trưởng tốt trong môi
trường Trypyicase Soy Agar (TSA) có thêm 5% glucose, môi tường BHIA
(Brain Heart Ifnusion Agar), môi trường THBA (Todd Hewitt Broth Agar), môi
trường thạch máu ngựa (Horse Bood Agar). Nuôi cấy ở 20-30oC, sau 24-48 giờ
hình thành khuẩn lạc nhỏ đường kính 0.5-1.0mm, màu hơi vàng, hình tròn hơi
lồi. Các tế bào vi khuẩn Streptococcus thường ghép với nhau thành chuỗi dài,
nên được gọi là liên cầu khuẩn (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004).
5


2.3.3. Phân bố và lan truyền bệnh
Bệnh có thể xảy ra ở một số loài cá nước ngọt như: cá basa (Pangasius
bocourti), cá rô phi (Oreochrromis niloticus), cá chép (Cyprinus carpio) và một
số loài cá biển như cá chẽm (Lates calcarifer)... Bệnh Streptococcus thường
bùng phát ở nhiệt độ 20-30oC. (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004).
Bệnh nhiễm khuẩn S. agalactiae lần đầu tiên được báo cáo ở cá hồi
(Oncorhynchus mykiss) ở tỉnh Shizuoka, Nhật Bản vào tháng 04 – 1957 (trích
dẫn Quan Ngô Huy Tân, 2010). Sau đó bệnh lan dần ra nhiều nơi trên thế giới
như Mỹ, Nam Phi, Singapore.
Bệnh được ghi nhận và làm chết rãi rác cá điêu hồng nuôi bè tại An Giang đầu
tiên vào năm 2004, sau đó bệnh cũng gây thiệt hại ngiêm trọng cho các bè nuôi
cá điêu hồng tại các tỉnh Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang. Bệnh lan truyền
theo chiều ngang, lây lan từ cá bệnh sang cá khỏe hoặc từ thức ăn (phân cá
bệnh ) (Từ Thanh Dung, 2011).

Theo Robinson và Meyer (1966) bệnh có thể lây nhiễm trực tiếp bằng cách gây
cảm nhiễm khi ngâm cá vào bể kính với mật độ vi khuẩn 106CFU/ml trong 10
phút (trích dẫn Inglis, 1993).
Trần Thị Viên (2007) nghiên cứu một số bệnh trên cá rô phi (Oreochromis sp).
Thí nghiệm được thực hiện qua các bước như: thu thập thông tin, tiếp theo là
thu và bảo quản mẫu, phân tích và định danh mầm bệnh, kiểm tra kháng sinh
đồ và viết báo cáo. Kết quả tìm thấy chủ yếu là Trichodina và Gyrodactylus.
Bên cạnh đó kết quả phân tích vi sinh đã định danh được bốn loài vi khuẩn S.
iniae, S. agalactiae, Vibrio proteolyticus,
V. cholerae và
1 giống
Staphylococcus sp. Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ cho thấy các loài vi khuẩn
này nhạy với doxycyline và ofloxacin, nhưng kháng lại với sulfamethoxazoletrimethoprim.
Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh (2010) nghiên cứu đặc điểm mô
học ở cá điêu hồng nhiễm vi khuẩn S agalactiae trong điều kiện thí nghiệm.
Thí nghiệm được thực hiện với chủng vi khuẩn S. agalactiae S09-01 phân lập
từ cá điêu hồng, gây cảm nhiễm trên cá khỏe với mật độ 4.23x101 – 4.23x10 6
CFU/ml. Mẫu thu vào ngày thứ 1, 3, 5, 10, 14 sau khi gây cảm nhiễm. Kết quả
kính phết mẫu tươi mô gan thận và tỳ tạng tất cả các mẫu đều phát hiện vi
khuẩn hình oval hoặc hình cầu, kích thước khá nhỏ, gram (+) không có sự biến
đổi mô da, cơ của các mẫu cá thu. Mô thận và tỳ tạng ở cá nhiễm mật độ 4.23x
104 - 4.23x 106 CFU/ml bị thay đổi vào ngày thứ 3, biến đổi nặng vào ngày thứ
5 và bị phá hủy vào ngày thứ 10. Mô gan biến đổi chậm bắt đầu bị biến đổi vào
ngày thứ 5 ở mật độ 4.23x 105 - 4.23x 10 6 CFU/ml, cấu trúc mang ít bị biến đổi
6


đến ngày thứ 5 mới bắt đầu bị biến đổi ở mật độ vi khuẩn là 4.23x 105 - 4.23x
106 CFU/ml.
2.4.

Phản ứng kháng nguyên- kháng thể

Kháng thể tồn tại trong huyết thanh miễn dịch, do đó các phản ứng kháng
nguyên- kháng thể dùng kháng huyết thanh gọi là phản ứng huyết thanh học.
Phản ứng huyết thanh dùng để chẩn đoán kháng nguyên hoặc kháng thể khi đã
biết một thành phần, gọi là phương pháp chẩn đoán huyết thanh học.
Vì kháng thể không nhìn thấy bằng mắt thường nên kháng thể chỉ có thể được
xác định khi chúng gắn với kháng nguyên đặc hiệu. Phản ứng kháng nguyênkháng thể có thể được xác định thông qua sự ngưng kết, sự cố định bổ thể, sự
phát quỳnh quang, hoạt tính enzyme hay gắn với đồng vị phóng xạ.
Cơ chế phản ứng kết hợp kháng nguyên- kháng thể : Khi kháng nguyên tiếp
xúc với kháng thể đặc hiệu tương ứng thì phản ứng kết hợp kháng nguyênkháng thể sẽ xảy ra, có thể thấy được bằng mắt thường dưới hình thức lên
bông, kết tủa hay ngưng kết. Sự kết hợp này dù không phải là liên kết đồng hóa
nhưng lại có nhiều lực tác dụng vì thế chúng cũng trở nên khá mạnh. Sự kết
hợp có sự tác động của các lực: lực tĩnh điện, lực của cầu nối hydro, lực Vander
walls, lực liên kết kỵ nước.
Ngưng kết miễn dịch là hiện tượng kháng nguyên và kháng thể kết hợp với
nhau để hình thành đám ngưng kết đủ to để mắt thường nhìn thấy được. Sự
hình thành một mạng lưới giữa kháng nguyên và kháng thể chỉ có thể xuất hiện
với các kháng thể có ít nhất 2 hóa trị. Phản ứng ngưng kết miễn dịch đòi hỏi
kháng nguyên hữu hình. Đó là kháng nguyên có kích thước lớn như: hồng cầu,
và tế bào vi sinh vật. Kháng nguyên hữu hình có epitop bề mặt có thể kết chéo
với các kháng thể tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy được bằng mắt thường.
Kháng thể trong phản ứng này gọi là kháng thể gây ngưng kết. Phản ứng ngưng
kết nhạy hơn phản ứng kết tủa nên được dùng để định tính và bán định lượng
kháng thể trong huyết thanh. Có hai loại ngưng kết miễn dich là ngưng kết chủ
động và ngưng kết thụ động.
2.5.

Các nhóm thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thủy sản

Nhóm Tetracylin
Là nhóm kháng sinh có tác dụng kiềm khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở
nồng độ cao, có tác dụng đối với vi khuẩn gram (-) và (+) (Bùi Thị Tho, 2003).
Nhóm này được chia làm 2 thế hệ. Thế hệ I bao gồm các loại kháng sinh như:
tetracylin, chlotetracylin và oxytetracylin. Đây là những loại thuốc có thời gian
7


tác động ngắn và trung bình. Thế hệ II bao gồm các chất bán dược tổng hợp
gần đây có thời gian tác động dài như: doxycyclin, minocyclin (Poole, 2004).
Trong đó, tetracylin được dùng để điều trị nhiễm khuẩn toàn thân và nhiễm
trùng ruột. Độc tính của tetracylin là có thể gây xáo trộn tiêu hóa, xáo trộn chức
năng gan, thận… Khi điều trị bệnh không nên kết hợp với các loại kháng sinh
ampicillin, colistin…vì nó sẽ làm giảm tác dụng điều trị và gây ra hiện tượng
kháng thuốc (Bùi Kim Tùng, 2001).
Nhóm Sulfonamid
Thuốc có phổ kháng khuẩn rộng, bao gồm nhiều vi khuẩn Gram âm và Gram
dương. Tuy nhiên sự đề kháng của vi khuẩn với thuốc nhanh. Đại diện cho
nhóm này là: sulfadiazine, sulfadimidine, sulfamethoxazone. Sulphamid với
liều kiềm khuẩn sẽ ức chế sự sinh sản phát triển của vi khuẩn do thuốc cạnh
tranh với acid para amonozenzoic một yếu tố sinh trưởng của mọi loài tế bào
trong đó có tế bào vi khuẩn (Bùi Thị Tho, 2003).
Nhóm Quinolone
Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn, chúng có tác dụng ức chế tổng hợp
ADN. Các thuốc thuộc nhóm này được phát triển qua 2 thế hệ với phổ kháng
sinh và cơ chế kháng khuẩn khác nhau. Thế hệ I có phổ kháng khuẩn hẹp, tác
dụng chủ yếu trên vi khuẩn Gram âm. Thế hệ II có phổ kháng khuẩn vừa
nhanh, vừa mạnh, tác dụng trên cả Gram âm và Gram dương. Đại diện cho
nhóm này là: enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin ,

ciprofloxacin, oxolinic acid… (Bùi Thị Tho, 2003). Trong nuôi trồng thủy sản
các kháng sinh thuộc nhóm quinolone được sử dụng khá phổ biến trong điều trị
bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri như: enrofloxacin, norfloxacin rất có hiệu
quả (Từ Thanh Dung và ctv., 2005).
Nhóm Phenicol
Đây là nhóm kháng sinh có tác dụng kìm khuẩn nhưng cũng có tác dụng diệt
khuẩn trong một số trường hợp bệnh truyền nhiễm với những điều kiện nhất
định và nồng độ cao hơn. Thuốc có tác dụng ức chế vi khuẩn với nồng độ thấp,
hoạt phổ của nó rất rộng, tác dụng trên nhiều loài vi khuẩn Gram âm và Gram
dương (Bùi Thị Tho, 2003).
Nhóm Beta-Lactamin
Là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, đại diện thông dụng
là ampicilin, amoxicilin. Nhóm có tính diệt khuẩn bằng cách ức chế giai đoạn

8


cuối của sự tổng hợp peptidoglycan chất hình thành tế bào vi khuẩn (Bùi Kim
Tùng, 2001).
Bicozamycin
Bicozamycin là loại thuốc kháng sinh mới được nghiên cứu và có nguồn gốc từ
Nhật Bản.
Nhóm Ripamycin
Là nhóm kháng sinh diệt khuẩn, ức chế ARN polymerase của vi khuẩn. Có hoạt
phổ rộng bao gồm các vi khuẩn gram (-) và gram (+), có tác dụng diệt khuẩn ở
trong và ngoài tế bào, nhất là trong giai đoạn tăng trưởng (Bùi Kim Tùng,
2001). Thuốc được hấp thụ hoàn toàn qua ruột và có ái lực mạnh với mô gan
(Prescott et al, 2000).

9

Phần 3:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
-

Thời gian thực hiện đề tài : từ tháng 02/2012 đến tháng 05/2012.
Địa điểm nghiên cứu : phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy
sản, Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ.

3.2. Vật liệu nghiên cứu
-

Nguồn vi khuẩn : được phục hồi từ tủ - 80oC từ bộ sưu tập vi khuẩn
thuộc bộ môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản - Khoa Thủy Sản - Trường
Đại học Cần Thơ. Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường BHIA, ủ
trong tủ ấm ở 30 oC. Sau 24 – 48 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn
lạc, kiểm tra tính thuần.

-

Thiết bị : tủ cấy vô trùng, nồi Autoclave, kính hiển vi, cân điện tử, bếp
nhiệt, máy li tâm, máy vortex , tủ lạnh, tủ ấm…
Môi trường : Brain heart ifusion agar, Brain heart ifusion broth.
Hóa chất: cồn, nước cất, ethanol, NaCl, paraffin, hóa chất nhuộm Gram,
hóa chất dùng để test các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa, định danh vi khuẩn,
kíp API20 Strep…
Kháng sinh

Gồm các loại kháng sinh: cefazoline, Neomycine, Ciprofloxacine,
flofenicol, Gentamycine, Ampiciline, Norfloxacine, tetracyline,
trimethoprim /sufamethoxazole, enrofloxacine , docyxiline, Amoxiciline.

-

-

3.3. Phương pháp nghiên cứu
Nguồn vi khuẩn được phục hồi từ tủ - 80 oC gồm 6 chủng vi khuẩn: Cá1 Não1,
Cá1 Não2, Cá1 Não3, Cá2 Não, Cá3 Não và Cá4 Não.
Nhuộm Gram: Nhỏ một giọt nước cất hoặc nước muối sinh lý 0,85% đã được
tiệt trùng lên lame, dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn trải đều lên giọt
nước. Để mẫu khô tự nhiên, sau đó hơ lướt lame mẫu trên ngọn lửa đèn cồn để
cố định mẫu. Tiến hành nhuộm qua các bước :
1. Nhỏ dung dịch Crytal violet (dung dịch I) lên lame. Để yên 1 phút. Rửa
lại bằng nước cất cho vết hết màu tím, vẩy cho ráo nước.
10


2. Nhỏ dung dịch Iodine (dung dịch II) lên lame. Để yêu 1 phút. Nghiên
lame cho dung dịch chảy ra hết.
3. Dùng dung dịch cồn : aceton (dung dịch III) để tẩy màu bằng cách để
nghiên lame rồi nhỏ từ từ dung dịch III cho đến khi không còn màu tím.
Rửa lại bằng nước cất và vẩy cho ráo nước.
4. Nhỏ dung dịch Safranin (dung dịch IV) lên lame. Để yên 2 phút. Sau đó
rửa lại bằng nước cất và để mẫu khô ở nhiệt độ phòng.
5. Đọc kết quả : tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi 100X có giọt dầu.
 Vi khuẩn bắt màu xanh hoặc tím : Gram dương
 Vi khuẩn bắt màu hồng hoặc đỏ : Gram âm.

Quan sát tính di động: Nhiều loại vi khuẩn có khả năng di động nhờ vào tiêm
mao. Sự di động này có thể quan sát bằng phương pháp giọt ép. Nhỏ một ít
nước cất hoặc nước muối sinh lý 0,85% đã được tiệt trùng lên lame, dùng que
cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước. Đậy lamenla lại và quan
sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X có giọt dầu.
Phản ứng Oxydase: Dùng que cấy tiệt trùng phết một ít vi khuẩn lên giấy tẩm
cytochrome oxydase. Quan sát mẫu trong 30 giây. Kết quả: vi khuẩn cho phản
ứng oxydase (+) sẽ làm giấy tẩm cytochrome oxydase chuyển sang màu tím
đậm (so màu theo hướng dẫn của nhà sản xuất) và ngược lại.
Phản ứng Catalase: Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn để lên lame
rồi nhỏ một giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame. Kết quả: vi khuẩn cho phản ứng
catalase (+) sẽ gây ra hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H2O2 và ngược lại.
Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (OF test): Chuẩn bị 2 ống
nghiệm chứa môi trường OF đã tiệt trùng. Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn
cấy thẳng đứng từ trên xuống đáy của 2 ống nghiệm. Cho khoảng 0,5 – 1,0 ml
dầu parafffin. Tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí (F). Ống
còn lại không phủ paraffin. Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 – 30 oC. Đọc kết quả
sau 24 – 48 giờ (Bảng 1) (có thể kiểm tra kết quả trong 7 ngày).

11


Bảng 1. Bảng kiểm tra kết quả test O/F
Ống tiếp xúc không khí

Ống phủ dầu paraffin

Xanh lá cây

Xanh lá cây

Không phản ứng với
glucose

Xanh lơ ở phần trên

Xanh lá cây

Phản ứng kiềm tính

Vàng

Xanh lá cây

Phản ứng oxy hóa

Vàng

Vàng

Phản ứng lên men

Kết quả

Khả năng phát triển của vi khuẩn ở nồng độ muối 6,5%: Lấy một ít vi
khuẩn cho vào ống nghiệm TSB có chứa 6,5% NaCl. Để trong tủ ấm ở 30 oC.
Sau 2 – 4 ngày môi trường đục cho kết quả (+) và ngược lại.
Khả năng sử dụng máu (tan huyết): Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi
khuẩn cấy ria trên môi trường Blood agar có bổ sung 5% máu cừu. Ủ mẫu ở tủ
ấm 30oC. Đọc kết quả sau 24 – 48 giờ.

 Tan huyết dạng Alpha: vi khuẩn phá vỡ một phần tế bào máu, tạo thành
khu vực màu xanh quanh khuẩn lạc.
 Tan huyết dạng Beta: vi khuẩn phá vỡ hoàn toàn tế bào máu trên môi
trường nuôi cấy.
 Tan huyết dạng Gamma: vi khuẩn không sử dụng máu trên môi trường
nuôi cấy.
Phương pháp ngưng kết miễn dịch:
Sử dụng bộ kít Streptococcus Strep – B – Latex, gồm các bước:
Chuẩn bị: Ống nghiệm chứa 3 – 5 mL nước muối sinh lý 0,9% và tăm tiệt
trùng.
Thực hiện: Dùng que cấy nhặt từ 3 – 5 khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa
nước muối sinh lý. Nhỏ một giọt dung dịch kháng nguyên lên lame. Nhỏ tiếp
10 µl dung dịch vi khuẩn. Trộn đều vi khuẩn với dung dịch kháng nguyên.
Kết quả: Phản ứng cho kết quả dương tính khi có sự kết dính giữa vi khuẩn và
dung dịch chứa kháng nguyên sau 5 – 10 giây. Nếu phản ứng xảy ra sau hơn 30
giây thì kết quả là dương tính giả.
12


Phương pháp làm tiêu bản kính phết
-

Dùng kim tiêm lấy máu, nhỏ một giọt máu ở đầu lame, kế tiếp dùng một
lame sạch khác đặt vào ngay giọt máu hợp một gốc 45o để máu lan ra sau đó
kéo về phía cuối lame.

-

Dùng nhíp tiệt trùng lấy một ít cơ quan từ gan, thận, tỳ tạng phết đều lên
lame sạch.

-

Để khô nhiệt độ phòng.

-

Cố định trong methanol trong thời gian 1 phút.

-

Để ở ngăn mát (nếu chưa nhuộm liền).

-

Nhuộm mẫu theo phương pháp Humason, 1979 trích dẫn bởi Rowley, 1990
+ Cho lame vào dung dịch Wright trong 3-5 phút.
+ Chuyển mẫu sang dung dịch pH 6,2-6,8 từ 5-6 phút.
+ Sau đó cho vào dung dịch Giemsa trong 20-30 phút.
+ Cho mẫu vào dung dịch pH từ 15-30 phút.

-

Đọc kết quả dưới kính hiển vi vật kính 100X có giọt dầu.

Kit API20 Strep :
Chuẩn bị: Dùng pipet hút 5 mL nước cất cho vào khuôn nhựa để giữ ấm trong
suốt quá trình ủ trong tủ ấm. Đặt bộ kíp API20 Strep vào khuôn nhựa. Dùng
que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào ống chứa 2 mL API Suspension
Medium (dung dịch gốc). Xác định mật độ vi khuẩn bằng cách so độ đục của

dung dịch gốc với ống chuẩn McFarland số 4. Hút 500 µl dung dịch gốc cho
vào API GP Medium (dung dịch 1). Lắc trộn đều vi khuẩn.
Thực hiện: Dùng pipet tiệt trùng hút 100 µl dung dịch vi khuẩn của dung dịch
gốc cho đầy vào các ô VP, HIP, ESC, PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL,
LAP. Và cho đầy (nữa ô bên dưới) vi khuẩn vào ô ADH. Cho đầy (nữa ô bên
dưới) vi khuẩn từ dung dịch 1 vào các ô còn lại (từ ô RIB đến GLYG). Tiếp tục
cho dầu (mineral oil) đã được tiệt trùng (nữa ô bên trên) vào các ô từ RIB →
GLYG. Đậy nắp khuôn nhựa. Ủ bộ kíp ở nhiệt độ 35oC +2oC.
Kết quả :
Sau 4 – 4,5 giờ, cho thuốc thử vào các ô:
13


- VP : 1 giọt VP1 + 1 giọt VP2.
- HIP : 2 giọt NIN.
- PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP : 1 giọt Zym A + 1 giọt Zym B
- Lưu ý : đọc kết quả của các phản ứng sau 10 phút.
Sau 24 giờ:
- Đọc kết quả các ô ESC, ADH, RIP → GLYG. Không đọc lại kết quả các ô
HIP, PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP.

Phương pháp lập kháng sinh đồ (theo Geert Huys, 2002)
Lập kháng sinh đồ với 12 loại kháng sinh là Neomycin (N/30µg), Florfenicol
(FFC/30 µg), Ciprofloxacin (CIP/5µg), Gentamicin (GM/10µg), Doxycycline
(DO/30µg), Cefazolin (CZ/30µg), Ampicillin (AMP/25µg), Amoxicillin
(AML/25µg), Trimethoprim + sulfamethoxazole (SXT/1.25/23.75 µg),
Tetracycline (TE/30 µg), Norfloxacin (NOR/5 µg), Enrofloxacine (ENR/5 µg).
Phương pháp xác định mật số vi khuẩn dựa vào ống chuẩn McFarland số
3 (9x10 8 cfu/ml)
-

Vi khuẩn sau khi được phục hồi và đã thuần thì tiến hành kiểm tra kháng
sinh đồ.

-

Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm
chứa 5ml nước muối sinh lý (0,85% Nacl) đã tiệt trùng. Trộn đều và so sánh
độ đục với ống McFarland số 3 (9,7ml 1% H2SO4 và 0,3ml 1% BaCl2). Nếu
độ đục thấp hơn ống chuẩn McFarland thì tiếp tục cho khuẩn lạc vào, ngược
lại độ đục cao hơn thì cho nước muối sinh lý vào cho đến khi độ đục ngang
bằng với ống chuẩn McFarland . Khi đó mật độ vi khuẩn trong ống nghiệm
khoảng 9 x 10 8 cfu/ ml.
Sau khi đã xác định mật số vi khuẩn thì cho dung dịch vi khuẩn lên môi
trường thạch bằng cách dùng pipet tiệt trùng hút lần lượt 0.1ml dung dịch vi
khuẩn cho lên môi trường thạch MHA có bổ sung 1.5% NaCl . Dùng que
trãi thủy tinh tiệt trùng trãi đều đến vừa khô. Sau đó để yên khoảng 1 phút
rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri sao cho khoảng
cách giữa hai tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24mm và khoảng cách
giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri khoảng 10-15mm. Mỗi đĩa thạch
dán tối đa 6 đĩa kháng sinh. Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh
thì đặt đĩa vào tủ ấm ở 30 ºC. Đọc kết quả sau 24 – 48 giờ.

14


Bảng 3.1. Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ

Kháng sinh
(Công ty Biorad & Oxoid)

Chuẩn đường kính vòng vô trùng
Kháng

Trung bình

Nhạy

Neomycin (N/30µg)

≤12

13 – 16

≥17

Florfenicol (FFC/30 µg)

≤16

17 – 19

≥20

Ciprofloxacin (CIP/5µg)

≤15

16 – 20

≥21

Gentamicin (GM/10µg)

≤12

13 – 14

≥15

Doxycycline (DO/30µg)

≤12

13 – 15

≥16

Cefazolin (CZ/30µg)

≤14

15 – 17

≥18

Ampicillin (AMP/25µg)

≤13

14 – 17

≥18

Amoxicillin (AML/25µg)

≤13

14 – 17

≥18

Trimethoprim+Sulfamethoxazole

≤10

11 – 15

≥16

Tetracycline (TE/30µg)

≤14

15 – 18

≥19

Norfloxacin (NOR/5µg)

≤12

13 – 16

≥17

Enrofloxacine (ENR/5µg)

≤16

17 – 22

≥23

(SXT/1.25/23.75µg)

(Nguồn: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011)

Đọc kết quả: Đo đường kính vô trùng (mm) và dựa vào chuẩn đường kính
vòng vô trùng của nhà sản xuất (Bảng 3.1) để xác định loại thuốc kháng sinh
nhạy, trung bình nhạy và kháng.

15


3.3.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc
kháng sinh lên vi khuẩn.
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được thực hiện với 3
loại kháng sinh Enrofloxacine, Trimethoprim+Sulfamethoxazole, Cefalexin.
Ngày thứ nhất và thứ hai

Chuẩn bị: Đĩa TSA (Tryptic soy agar) + 1.5%NaCl, Ống nghiệm 10 ml TSB
(Trytic soya broth) + 1.5%NaCl; Chai 50 ml TSB (Trytic soya broth) +
1.5%NaCl; Nước muối sinh lý (dung dịch 0.85 % NaCl). Nuôi vi khuẩn trên
môi trường TSA +1.5%NaCl 24 giờ ở nhiệt độ 30°C bao gồm vi khuẩn cần xác
định MIC và vi khuẩn đối chứng (E. coli LMG 8223).
Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn bằng cách quan sát sự đồng nhất về hình
dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và nhuộm Gram. Chọn 5 khuẩn lạc
riêng lẻ trên đĩa TSA + 1.5% NaCl cho vào ống nghiệm chứa 10 ml TSB +
1.5% NaCl, ủ ở 30°C, 24 giờ (có thể ủ lâu hơn nếu thấy vi khuẩn chưa phát
triển).
Mỗi lần xác định MIC có 10 chủng vi khuẩn trong đó có chủng đối chứng.
Ngày thứ ba
Pha thuốc: Pha 2 ống nghiệm thuốc gốc, mỗi ống 50ml (là kháng sinh hay
thuốc cần thí nghiệm), ống thứ nhất có hàm lượng thuốc là 1024ppm và ống
thứ hai có hàm lượng thuốc là 256ppm. Thuốc phải được pha bằng dung môi
phù hợp (theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Pha loãng thuốc với độ pha loãng 2
lần từ 4- 1024ppm trong ống nghiệm 50ml (Bảng 3.2). Hàm lượng thuốc 512
và 256ppm phải được pha từ ống thuốc gốc thứ nhất (1024ppm) bằng cách
thêm nước muối sinh lý. Hàm lượng thuốc 128, 64, 32,16,8 và 4 ppm được pha
từ ống gốc thứ hai (256 ppm).

16


Bảng 3.2. Thao tác pha loãng kháng sinh (thể tích dùng cho 10 chủng vi khuẩn)
Ống
nghiệm

Nồng độ cần
đạt

Thể tích của dung dịch
kháng sinh

Thể tích nước
muối sinh lý

1

1024 ppm

25ml ( dung dịch thuốc gốc 1)

-

2

512 ppm

25ml (1024 ppm)

25ml

3

256 ppm

25ml (512 ppm)

25ml

4

128 ppm

25ml (dụng dịch thuốc gốc 2)

25ml

5

64 ppm

25ml (128 ppm)

25ml

6

32 ppm

25ml (64 ppm)

25ml

7

16 ppm

25ml (32 ppm)

25ml

8

8 ppm

25ml (16 ppm)

25ml

9

4 ppm

25ml (8 ppm)

25ml

Ghi chú: Dung dịch thuốc gốc 1 = 1024 ppm; Dung dịch thuốc gốc 2 = 256
ppm
Phải lắc đều dung dịch trước khi pha loãng ở nồng độ tiếp theo. Điều cần chú ý
là ở mỗi độ pha loãng, hàm lượng thuốc sẽ giảm đi phân nữa sau khi cho dung
dịch vi khuẩn vào (Bảng 3.3).

17