ẢNH HƯỞNG của ORYZALIN lên sự SINH TRƯỞNG và PHÁT TRIỂN của CHỒI KHOAI mỡ (dioscorea alata l )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
---  ---

LƯƠNG VŨ MOL

ẢNH HƯỞNG CỦA ORYZALIN LÊN SỰ SINH
TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI
KHOAI MỠ (Dioscorea alata L.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ KHOA HỌC CÂY TRỒNG
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

Cần Thơ, 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
---  ---

LƯƠNG VŨ MOL

ẢNH HƯỞNG CỦA ORYZALIN LÊN SỰ SINH
TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI
KHOAI MỠ (Dioscorea alata L.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ KHOA HỌC CÂY TRỒNG
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

Cán Bộ Hướng Dẫn Khoa Học
PGS. TS. Lâm Ngọc Phương

Cần Thơ, 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp Kỹ Sư
ngành Trồng Trọt, chuyên ngành Công Nghệ Giống Cây Trồng với đề tài:

“ẢNH HƯỞNG CỦA ORYZALIN LÊN SỰ SINH
TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI
KHOAI MỠ (Dioscorea alata L.)”

Do sinh viên Lương Vũ Mol thực hiện
Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2012
Cán bộ hướng dẫn

PGs. Ts Lâm Ngọc Phương

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp Kỹ Sư
ngành Trồng Trọt, chuyên ngành Công Nghệ Giống Cây Trồng với đề tài:

“ẢNH HƯỞNG CỦA ORYZALIN LÊN SỰ SINH

TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI
KHOAI MỠ (Dioscorea alata L.)”

Do sinh viên Lương Vũ Mol thực hiện và bảo vệ trước hội đồng
Ý kiến của Hội Đồng chấm luận văn tốt nghiệp:..... .............................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
Luận văn tốt nghiệp được Hội Đồng đánh giá ở mức:…………………………….
Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2012
Hội đồng

.......................................

..........................................
DUYỆT KHOA
Trưởng Khoa Nông Nghiệp

........................................

ii

.............................


LỜI CẢM TẠ
Chân thành cảm ơn:
 Cô Lâm Ngọc Phương đã tận tình hướng dẫn trong quá trình thực
hiện đề tài.
 Cô Lê Minh Lý và các bạn lớp Công nghệ giống cây trồng K34 đang

thực hiện luận văn tốt nghiệp tại phòng nuôi cấy mô, Bộ Môn Sinh
Lý Sinh Hoá, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng đã có nhiều
hỗ trợ trong quá trình thực hiện đề tài.

iii


QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
I. LÝ LỊCH SƠ LƯỢC
Họ và tên: Lương Vũ Mol

Giới tính: Nam

Năm sinh: 10/08/1990

Dân tộc: Kinh

Nơi sinh: Tỉnh Hậu Giang
Địa chỉ liên lạc: Ấp Bình Hiếu, Xa Long Bình, Huyện Long Mỹ, Tỉnh Hậu
Giang
Điện thoại: 0970362394
E-mail:
II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
1. Tiểu học
Thời gian đào tạo từ năm: 1996 đến 2001
Trường: Tiểu học Long Bình II
2. Trung học cơ sở
Thời gian đào tạo từ năm: 2001 đến 2005
Trường: Trung học cơ sở Long Bình
3. Trung học phổ thông

Thời gian đào tạo từ năm: 2005 đến 2008
Trường: Trung học phổ thông Long Mỹ
Ngày …. tháng …. năm ……
Người khai ký tên

Lương Vũ Mol

iv


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết
quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kỳ công trình nghiên cứu nào trước đây.

Người thực hiện

Lương Vũ Mol

v


LƯƠNG VŨ MOL, 2012. “Ảnh hưởng của oryzalin lên sự sinh trưởng và phát
triển của chồi khoai mỡ (Dioscorea alata L.). Luận Văn tốt nghiệp Đại học,
Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Lâm Ngọc Phương.

TÓM LƯỢC
Đề tài “Ảnh hưởng của oryzalin lên sự sinh trưởng và phát triển của
chồi khoai mỡ (Dioscorea alata L.)” được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng

của thời gian xử lý oryzalin đến sự sinh trưởng của chồi khoai mỡ và sự tạo thành
chồi khoai mỡ (Dioscorea alata L.) đa bội in vitro. Trong đề tài này, giống khoai
mỡ ruột tím đã được sử dụng. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn
ngẫu nhiên một nhân tố với 3 nghiệm thức gồm có đối chứng không xử lý
oryzalin và 2 thời gian xử lý oryzalin 0,004% ở 48 và 60 giờ với 3 lần lặp lại. Kết
quả cho thấy: (i) Việc xử lý oryzalin đã làm ức chế tạm thời sự sinh trưởng của
cụm chồi khoai mỡ in vitro. (ii) Sau 2 tuần xử lý, các cụm chồi được xử lý
oryzalin 0,004% trong 48 giờ đạt được 6,3% cụm tạo chồi có hình thái đa bội,
các cụm chồi được xử lý oryzalin 0,004% trong 60 giờ đạt được 11,1% cụm tạo
chồi có hình thái đa bội. Các chồi có hình thái đa bội có thân to, phát triển nhanh
hơn các cây khác và lá bị biến dạng, kích thước khí khẩu ở cây hình thái đa bội
tăng trong khi mật số khí khẩu giảm. Hàm lượng diệp lục tố a, b và hàm lượng
carotenoid tính trên trọng lượng tươi của lá ở cây hình thái đa bội thấp hơn so với
cây nhị bội. Dựa vào đặc điểm khí khẩu, tỉ lệ cây đa bội đạt được cao nhất là
3,7% ở nghiệm thức xử lý oryzalin trong 60 giờ.

Từ khóa: đa bội, khoai mỡ, in vitro, oryzalin.

vi


MỤC LỤC

Tóm lược
Mục lục
Danh sách bảng
Danh sách hình
Danh sách chữ viết tắt

vi

vii
ix
x
xi

MỞ ĐẦU
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1
Sơ lược về cây khoai mỡ
1.1.1
Nguồn gốc
1.1.2
Đặc tính thực vật
1.2
Giai đoạn chuẩn bị cây mẹ và tiệt trùng mẫu
cấy
1.3
Đột biến đa bội trong chọn giống
1.3.1
Đột biến đa bội
1.3.2
Phương pháp gây đa bội
1.3.3
Sơ lược về oryzalin
1.3.4
Các đặc trưng chủ yếu của cây đa bội
1.4
Một số nghiên cứu đa bội hóa bằng oryzalin
1.5
Phương pháp xác định cây đa bội

1.5.1
Kích thước và mật số khí khẩu
1.5.2
Số hạt lục lạp/cặp tế bào khẩu

1
2
2
2
2

Chương 2

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1
Phương tiện
2.2
Phương pháp
2.2.1
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
2.2.2
Bố trí thí nghiệm
2.2.3
Phương pháp xử lý số liệu

9
9
9
9
9

13

Chương 3

KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1
Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỉ lệ
sống của mẫu cấy khoai mỡ
3.1.1
Tỉ lệ nhiễm
3.1.2
Tỉ lệ chết
3.1.3
Tỉ lệ sống

14

Chương 1

vii

3
3
3
4
5
6
7
7
7

8

14
14
15
15


3.2
3.3

Ảnh hưởng của nồng độ BA lên sự tạo chồi
khoai mỡ
Ảnh hưởng của thời gian xử lý oryzalin lên sự
tạo thành chồi khoai mỡ đa bội in vitro
3.3.1
Số lá gia tăng
3.3.2
Số chồi gia tăng
3.3.3
Chiều cao gia tăng
3.3.4

Chọn lọc cây khoai mỡ đa bội sau khi xử
lý oryzalin

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1
Kết luận
4.2

Đề nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ CHƯƠNG 1
PHỤ CHƯƠNG 2

viii

15
16
16
17
18

19
25
25
25
26


DANH SÁCH BẢNG
Tựa bảng
Bảng 2.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1
Bảng 2.2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2
Bảng 2.3 Các nghiệm thức của thí nghiệm 3
Bảng 3.1 Tỉ lệ nhiễm, tỉ lệ chết và tỉ lệ sống của mẫu cấy khoai mỡ
ở các thời gian khử trùng khác nhau tại thời điểm 2 tuần
sau khi cấy
Bảng 3.2 Số chồi khoai mỡ tạo thành và chiều cao chồi cao nhất ở
các nồng độ BA khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy

Bảng 3.3 Số lá gia tăng của cụm chồi khoai mỡ xử lý oryzalin ở các
thời gian khác nhau sau 1 và 2 tuần xử lý
Bảng 3.4 Số chồi gia tăng của cụm chồi khoai mỡ xử lý oryzalin ở các

Trang
10
11
12

14
16

17
17

thời gian khác nhau sau 1 và 2 tuần xử lý

Bảng 3.5 Chiều cao gia tăng (cm) của cụm chồi khoai mỡ xử lý
oryzalin ở các thời gian khác nhau sau 1 và 2 tuần xử lý
Bảng 3.6 Tỷ lệ cụm chồi xuất hiện chồi có hình thái đa bội và tỉ lệ chồi
có hình thái đa bội ở thời điểm 2 tuần sau khi xử lý oryzalin
Bảng 3.7 Mật số và chiều dài khí khẩu ở lá của khoai mỡ nhị bội và
chồi có hình thái đa bội
Bảng 3.8 Hàm lượng diệp lục tố a, b và carotenoid trong lá của cây
nhị bội và cây có hình thái đa bội
Bảng 3.9 Tỉ lệ cây đa bội dựa vào số lượng và kích thước khí khẩu

ix

18

21
22
23
24


DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1
Hình 2.1
Hình 3.1
Hình 3.2
Hình 3.3

Hình 3.4
Hình 3.5
Hình 3.6

Tựa hình
Công thức hóa học của oryzalin
Thân cây khoai mỡ dùng để lấy mẫu cấy
Các đoạn thân khoai mỡ tại thời điểm 2 tuần sau khi cấy
Mẫu cấy khoai mỡ ở thời điểm 2 tuần sau khi cấy ở các
nồng độ BA khác nhau tại thời điểm 2 tuần sau khi cấy
Cụm chồi với chồi bình thường (A) và cụm chồi với
chồi có hình thái đa bội (B) tại thời điểm 2 tuần sau khi
xử lý oryzalin

Trang
5

11
14
16

19

Đặc điểm thân của chồi khoai mỡ nhị bội (A, C) và chồi có
hình thái đa bội (B, D)

20

Đặc điểm lá của cây khoai mỡ nhị bội và cây khoai mỡ có
hình thái đa bội ở thời điểm 8 tuần sau khi xử lý oryzalin

20

Số lượng khí khẩu cây khoai mỡ nhị bội (A) và cây có
hình thái đa bội (B) ở vật kính 40X

22

x


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
BA
MS

Benzyl Adenine
Murashige and Skoog (1962)

xi


MỞ ĐẦU

Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) là loại cây có củ ít bị sâu hại, có tiềm năng
chế biến lớn. Khoai mỡ có giá trị dinh dưỡng cao nên có thể dùng làm lương thực,
được sử dụng trong nước như một loại rau. Trong công nghiệp chế biến, khoai mỡ
có thể được sấy khô làm món ăn nhanh, làm kem, chế biến thành bột và làm nguyên
liệu sản xuất cồn và rượu (Vũ Linh Chi et al., 2005). Khoai mỡ cũng đã được
nghiên cứu để phối trộn với thức ăn của cá rô phi (Trần Lê Cẩm Tú et al., 2008) và
cá tra (Trần Thị Thanh Hiền, 2009) mà vẫn đảm bảo sự tăng trưởng của cá.. Ở Việt
Nam, khoai mỡ được trồng hầu hết khắp các tỉnh từ Bắc vào Nam. Do thích nghi
được với các vùng đất khó khăn như đất cát, chua phèn nên khoai mỡ là một loại
cây có giá trị kinh tế cao trên các vùng chua phèn thuộc Đồng Tháp Mười (Vũ Linh
Chi et al., 2005).
Theo Trần Thượng Tuấn (1992), đối với các cây sinh sản vô tính mà bộ
phận kinh tế là cơ quan sinh dưỡng thì hướng tạo giống đa bội có nhiều triển vọng.
Thực tế, có nhiều giống đa bội có năng suất cao, có thể chống chịu điều kiện bất lợi
của môi trường đã được tạo ra như cây bạc hà tứ bội có năng suất tinh dầu vượt gấp
đôi so với dạng nhị bội; cỏ ba lá tứ bội, làm thức ăn cho gia súc, có năng suất cao,
chịu lạnh khá, ít bị sâu bệnh phá hại,…Bên cạnh colchicine thì nhiều hóa chất khác
trong đó có oryzalin đã được sử dụng để gây đa bội hóa thành công trên nhiều cây
trồng như Lilium (Van Tuyl et al., 1992), hoa hồng (Kermari et al., 2003), khoai tây
(Baradalla et al., 2006).
Nhằm mục đích tạo giống khoai mỡ đa bội đề tài “Ảnh hưởng của oryzalin
lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi khoai mỡ (Dioscorea alata L.)” được thực
hiện để khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý oryzalin đến sự sinh trưởng của chồi
khoai mỡ và sự tạo thành chồi khoai mỡ đa bội in vitro.

1


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Sơ lược về khoai mỡ
1.1.1 Nguồn gốc
Khoai mỡ (còn được gọi là khoai vạc, củ cái, củ ngà, củ gốc, củ lăn) có tên
khoa học là Dioscorea alata L., thuộc chi Dioscorea, họ củ Nâu Dioscoreaceae. Đa
số quan điểm đều cho rằng khoai mỡ có nguồn gốc ở trung tâm Đông Nam Á, ban
đầu có thể là Mianma sau đó mở rộng đầu tiên tới Malaysia, Indonesia và Việt Nam
(Vũ Linh Chi et al., 2005)
Theo Arnau et al. (2009), Dioscorea alata là một loài đa bội. Từ kết quả
nghiên cứu 110 mẫu Dioscorea alata trong bộ sưu tập nguồn gen CIRAD cho thấy
có 76% mẫu là cây nhị bội với 2n = 40, 7% mẫu là cây tam bội với 2n = 60 và 17%
mẫu là cây tứ bội với 2n = 80 và số nhiễm sắc thể cơ bản của Dioscorea alata là x =
20.
1.1.2 Đặc tính thực vật
Theo Vũ Linh Chi et al. (2005), củ khoai mỡ thuộc dạng thân củ ngầm,
thường là củ đơn nhưng thỉnh thoảng có 2-5 củ mọc thành cụm. Củ có thể phân
nhánh hoặc không. Tùy vào giống và điều kiện trồng trọt mà hình dạng củ có thể
thay đổi: hình trứng, hình ovan, hình trụ dài, hình tù, hình bàn tay và hình chân
tượng. Màu sắc thịt củ có thể thay đổi: trắng, vàng, hồng, tím tùy giống. Thân khoai
mỡ có dạng thân leo, quấn sang phải, màu xanh, có tiết diện vuông và có bốn cánh
mỏng ở bốn góc. Lá khoai mỡ thuộc dạng lá đơn, phần lớn mọc đối, hình tim hay
hình mác, đầu nhọn, dài từ 10-20 cm, có từ năm đến 7 gân hình cung.
Khoai mỡ là loại cây phân tính, có hoa đực và hoa cái riêng rẽ sinh ra ở trên
những cây khác nhau. Trong quần thể, cây có hoa đực luôn nhiều hơn cây có hoa
cái và số hoa đực luôn lớn hơn số hoa cái. Hoa đực nhỏ, khó nhìn thấy, mỗi hoa có

ba lá đài, ba cánh và sáu nhị; cánh và lá đài thường có màu xanh hay trắng. Hoa cái
to hơn hoa đực, thường có màu xanh hay tím. Hoa cái cũng có 3 lá đài, 3 cánh hoa
và bộ nhụy mọc ngắn. Quả khoai mỡ thuộc dạng quả nang. Quả có ba ngăn, mỗi
ngăn có 2 hạt, vỏ dễ nứt, điểm nối của ngăn kéo dài ra thành cánh phẳng. Hạt khoai
mỡ thường nhỏ, dẹt, được bao quanh bởi màng cánh. Hạt thường không nảy mầm
hoặc tỷ lệ nảy mầm rất thấp.

2


1.2 Giai đoạn chuẩn bị cây mẹ và tiệt trùng mẫu cấy
Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc
trong phòng tăng trưởng. Cây mẹ phải được bón phân và phun thuốc trừ sâu bệnh
chu đáo (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Theo Mitchell at al.
(1995) các đoạn thân được cắt từ những dây non, nhỏ hơn 8 tuần và phát triển
nhanh của 3 loài Dioscorea cayenensis, Dioscorea trifida and Dioscorea rotundata
là nguồn mẫu cấy tốt nhất.
Đưa mẫu vật vào môi trường nuôi cấy phải đảm bảo tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ
sống cao và tốc độ sinh trưởng nhanh. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại
tỉ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng
nhanh (Lê Văn Hoàng, 2008).
Khử trùng bề mặt mẫu cấy là cách loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt
mẫu cấy. Mục đích của giai đoạn này là đạt được tỉ lệ mẫu sống cao và không bị
nhiễm. Thông thường khó đạt được 100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu. Các hóa
chất khử trùng mẫu cấy gồm có dung dịch hypochloride, chloramin B, nước
chloride, nước bromide, iodine, cồn, ion kim loại nặng, chất diệt nấm, chất kháng
sinh,... Nồng độ hóa chất và thời gian khử trùng mẫu cực kỳ quan trọng. Nếu nồng
độ quá cao và thời gian quá dài mẫu có thể bị tổn thương và chết. Nếu nồng độ quá
thấp và thời gian khử trùng quá ngắn sẽ không giết được các vi sinh vật. Nồng độ
thấp và thời gian khử trùng dài cũng có hiệu quả cao như nồng độ cao và thời gian

khử trùng ngắn (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).

1.3. Đột biến đa bội trong chọn giống
1.3.1 Đột biến đa bội
Những sinh vật trong tế bào sinh dưỡng có số lượng nhiễm sắc thể tăng theo
một bội số nguyên lần của bộ nhiễm sắc thể đơn bội (từ 3n trở lên) được gọi là đa
bội thể (Nguyễn Văn Hiền, 2000). Đa bội hóa là một trong những hướng tiến hóa
chính của thực vật nói chung, cũng như của cây trồng nói riêng. Gần một nửa số chi
thực vật có các dạng đa bội. Trong tự nhiên, các chi thực vật gồm thể lưỡng bội và
thể đa bội thì các thể đa bội ở mức tiến hóa cao hơn (Trần Thượng Tuấn, 1992). Các
loại hình đa bội thể, đặc biệt là đa bội thể nhân tạo có nhiều giá trị như tăng năng
suất, phẩm chất (Nguyễn Văn Hiền, 2000). Trong sản xuất, đa bội thể cùng nguồn
(hình thành do tăng bội số nhiễm sắc thể của cùng một loài) có nhiều ứng dụng như:
dưa hấu tam bội không hạt, củ cải đường tam bội với củ dài hơn và năng suất đường
cao hơn, nho tứ bội với quả to và ít hạt hơn (Vũ Đình Hòa et al., 2005).

3


1.3.2 Phương pháp gây đa bội
Theo Trần Thượng Tuấn (1992) thì có 3 phương pháp chính để xử lý đa bội
hóa trên cây trồng:
 Gây chấn thương cơ giới: Tạo vết thương bằng cách cắt ngọn, cắt cành, cắt
ngang chỗ ghép lúc cây còn non. Chỗ vết thương thường sẽ hình thành mô
sẹo, từ đó phát sinh tế bào đa bội và sau đó là mầm đa bội.
 Gây sốc nhiệt: Cây được đưa vào môi trường nhiệt độ cao đột ngột trong
một khoảng thời gian nhất định dẫn đến làm rối loạn sự phân chia của tế bào
và có thể gây đa bội.
 Xử lý hóa chất: Một số hóa chất có thế dùng để xử lý đa bội như
colchicine, hyprit, acenapthene, gemaxan,…Trong đó colchicine cho hiệu

quả nhất trên nhiều loại cây trồng. Tuy nhiên, theo Petersen et al. (2003),
colchicine có thể được thay thế bằng oryzalin và trifluralin trong việc xử lý
đa bội.
Theo Phan Cự Nhân et al. (2006), ngoài ba phương pháp trên thì phương
pháp li tâm, phương pháp đa phôi, phương pháp phóng xạ cũng được dùng để gây
đa bội cùng nguồn.
Các tác nhân gây đa bội tác động vào cơ thể sinh vật lúc tế bào đang phân
chia, làm cho chúng phân chia không bình thường và hình thành cây đa bội. Vì thế
khi xử lý đa bội cần xử lý lúc tế bào phân chia nguyên nhiễm và giảm nhiễm mạnh
nhất: tế bào phân chia nguyên nhiễm mạnh ở các mô phân sinh đầu, thân, rễ,... như
lúc hạt nảy mầm, cây phân cành. Tế bào phân chia giảm nhiễm mạnh nhất là lúc
hình thành tế bào mẹ hạt phấn (Nguyễn Văn Hiền, 2000).
Một cây trồng thích hợp với việc cải tiến thông qua nhân đôi số lượng nhiễm
sắc thể cần có các đặc điểm sau:
 Số lượng nhiễm sắc thể thấp.
 Sản phẩm thu hoạch là bộ phận sinh dưỡng.
 Là cây giao phấn.
 Kiểu sinh trưởng lâu năm.
 Có khả năng sinh sản sinh dưỡng.

4


1.3.3 Sơ lược về oryzalin
 Đặc điểm của oryzalin
Oryzalin có công thức hóa học là 3,5-dinitro-N4, N4-dipropylsulfanilamide
và được biết như là dinitroaniline. Oryzalin là một chất rắn kết tinh màu vàng cam,
nóng chảy ở 141oC, bốc hơi ở áp suất nhỏ hơn 10-7 mm Hg và nhiệt độ 30oC.
Oryzalin tan ít trong nước (2,5 ppm ở 25oC) (Committee on Amines, Board on
Toxicology and Environmental Health Hazards, Assembly of Life Sciences,

National Research Council, 1981).

Hình 1.1 Công thức hóa học của oryzalin

 Một số so sánh giữa oryzalin và colchicine
Xét về nguồn gốc, theo Trần Đình Long (1997), colchicine được chiết xuất
từ hạt và củ của cây Colchicum autumnale. Trong khi đó oryzalin được bán dưới
tên thương mại là Surflan, Dirimal và Ryzelan, là những thuốc trừ cỏ tiền nảy mầm
chọn lọc dùng để kiểm soát cỏ hằng niên và cỏ lá rộng (Atland et al., 2003)
Xét về độ độc, colchicine độc đối với người hơn oryzalin (Petersen et al.,
2003). Liều lượng gây chết một nữa (LD50) đối với chuột qua đường miệng của
colchicine là 6 mg/kg (Material Safety Data Sheet) trong khi liều lượng gây chết
một nữa (LD50) đối với chuột qua đường miệng của oryzalin được báo cáo là >
5.000 mg/kg (Extension Toxicology Network, 1996).
Về cơ chế tác động lên tế bào, tác động của oryzalin đến sự phân bào cũng
giống như colchicine nhưng hoạt động gắn kết của colchicine với vi ống yếu hơn
oryzalin (Doležel et al., 2004). Theo Trần Thượng Tuấn (1992) colchicine là chất
độc đối với thoi vô sắc của tế bào vì nó tác động lên liên kết disunphite của protein
và phân tử ribose của acid ribonucleic. Trong quá trình phân bào tác dụng của
colchicine làm thoi vô sắc ngừng hoạt động và tâm động phân chia muộn hơn, trong
khi sự tái bản của nhiễm sắc thể và hình thành cromatit vẫn diễn ra bình thường. Ở
kỳ giữa của nguyên phân, các nhiễm sắc thể không phân bố trên mặt phẳng xích đạo
của thoi vô sắc, nhiễm sắc thể rút ngắn lại và dày lên. Sự phân ly các nhiễm sắc thể
5


về hai cực đối diện ở giai đoạn hậu kỳ không xảy ra, tế bào không phân chia, mặc
dù số lượng nhiễm sắc thể đã tăng gấp đôi. Kích thước của các tế bào này lớn hơn
các tế bào thường. Khi ngưng sự tác động của hóa chất thì tế bào lại có khả năng
phân chia bình thường và tạo nên các tế bào tứ bội. Trong khi đó, oryzalin gắn kết

chặt chẽ với những vi ống tạo thành phức hợp oryzalin – vi ống. Phức hợp này làm
thoi vô sắc ngừng hoạt động và ngăn cản sự phân chia tế bào (Morejohn et al.,
1987).
Van Tuyl (1992) đã kiểm chứng khả năng thay thế colchicine của oryzalin
trong việc ngăn cản sự phân bào, làm nhân đôi số lượng nhiễm sắc thể khi thực hiện
thí nghiệm so sánh khả năng nhân đôi số lượng nhiễm sắc thể của oryzalin và
colchicine trên cây Lilium và Nerine. Kết quả chỉ ra rằng khi sử dụng oryzalin với
nồng độ thấp hơn mười lần colchicine thì cũng tạo được nhiều cây đa bội hơn và ít
ngăn cản sự tái sinh hơn.
Theo Lehrer et al. (2008), khi xử lý đa bội lên hạt của cây Japanese barberry
đã có nhận xét oryzalin độc đối với cây con hơn colchicine do oryzalin có ái lực
mạnh hơn với protein tubulin, protein cấu tạo nên sợi vi ống. Oryzalin còn gây cản
trở những ion calcium, ion liên quan quá trình lắp ráp sợi vi ống. Cũng vì những lí
do trên, oryzalin được sử dụng với nồng độ thấp hơn colchicine trong việc đa bội
hóa ở cây trồng.
1.3.4 Các đặc trưng chủ yếu của cây đa bội
 Về mặt hình thái
Tế bào, thân, cành, lá, hoa, quả, hạt của cây đa bội to hơn cây lưỡng bội. So
với cây lưỡng bội thì lá của cây đa bội dày hơn, xanh đậm và giòn hơn, tỷ lệ dài trên
rộng nhỏ hơn (Vũ Đình Hòa, 2005). Cây hoa hồng tứ bội có số cánh hoa trên một
hoa nhiều hơn cây nhị bội (Kermani et al.,2003). Cây Ocimum basilicum L. tứ bội
có lá với nhiều răng cưa ở mép lá và dày hơn lá cây nhị bội; hạt to hơn, cứng hơn so
với cây nhị bội (Omidbaigi et al., 2010).
Đặc trưng rõ nhất là kích thước khí khổng và hạt phấn của cây đa bội lớn
hơn rõ rệt so với cây lưỡng bội (Phan Cự Nhân, 2006) vì thế người ta thường dựa
vào kích thước khí khổng và hạt phấn để phân biệt dạng đa bội và lưỡng bội (Trần
Thượng Tuấn, 1992).
 Về mặt sinh lí-sinh hóa
Cây đa bội có thời gian sinh trưởng dài hơn cây lưỡng bội tuy nhiên cường
độ đồng hóa các chất của cây đa bội thường mạnh hơn. Cây đa bội còn có khả năng

thích ứng rộng và chống chịu được với các điều kiện bất lợi. Hàm lượng nước,

6


đường, protein, tinh dầu, vitamin,… của thể đa bội thường cao hơn ở thể lưỡng bội
(Phan Cự Nhân, 2006).
Hàm lượng diệp lục tố tổng cộng của 7 giống đậu Hà Lan tứ bội tính trên
đơn vị trọng lượng tươi của lá (mg/g) giảm so với cây nhị bội đã được ghi nhận bởi
Tiwari và Kumar (2003). Tuy nhiên cũng với cây đậu Hà Lan, nếu hàm lượng diệp
lục tố được tính trên đơn vị diện tích lá (mg/cm2) thì hàm lượng diệp lục tố ở cây tứ
bội lại cao hơn so với cây nhị bội.
 Độ hữu dục
Độ hữu dục ở thể đa bội cùng nguồn thường thấp hơn thể lưỡng bội. Mức đa
bội càng cao bất dục càng lớn; đa bội chẵn có độ hữu dục cao hơn đa bội lẻ.

1.4 Một số nghiên cứu đa bội hóa bằng oryzalin
Van Tuyl et al. (1992) đã tiến hành xử lý oryzalin lên cây Lilium in vitro với
các nồng độ 0,005% và 0,01% và thời gian xử lý 4 giờ đã ghi nhận được 4 cây tứ
bội và 10 cây bội tạp ở nồng độ oryzalin 0,005% và 6 cây bội tạp ở nồng độ 0,01%.
Với mẫu cấy là chồi đỉnh hoa hồng, Kermari et al. (2003) đã xử lý oryzalin
in vitro với nồng độ 5 M và 15 M trong 14, 21 và 28 ngày. Kết quả cho thấy tỷ
lệ cây tứ bội đạt cao nhất ở nồng độ oryzalin 5 M và thời gian xử lý 14 ngày là
40%.
Baradalla et al. (2006) đã xử lý oryzalin lên chồi của 6 giống khoai tây ở 2
mức nồng độ (10 mg/l và 2 mg/l) và 2 mức thời gian xử lý (24 và 48 giờ). Kết quả
đạt được 2 cây tứ bội, 3 cây bội tạp, 71 cây nhị bội ở nồng độ oryzalin 10 mg/l và
thời gian xử lý 48 giờ trên giống L37 và 2 cây bội tạp, 28 cây nhị bội ở nồng độ 10
mg/l trong 24 giờ trên giống H84.42/4.
Bằng cách ngâm hạt trong dung dịch oryzalin với các nồng độ khác nhau:

0,002; 0,005; 0,01 và 0,02% và 3 mức thời gian xử lý: 6, 12 và 24 giờ, Lehrer et al.
(2008) tạo được 28% cây Berbersis thumbergii var. atropurpurea tứ bội ở nồng độ
oryzalin 0,002%.
Sakhanokho et al. (2009) đã xử lý oryzalin lên mô sẹo đã có phôi của cây
rừng cảnh (Hedychium muluense R. M. Smith) ở các nồng độ 30, 60, 120 M trong
24, 48, 72 giờ. Tần suất cảm ứng cây tứ bội cao nhất đạt được khi xử lý với 60 M
trong 72 giờ.
Trên cây lan, Miguel và Leonhatdt (2011) đã xử lý oryzalin với các nồng độ
14,4, 28,9 và 57,7 M trong 3 và 6 ngày lên protocorms và protocorm-like bodies.
Miguel và Leonhatdt đã rút ra kết luận nghiệm thức xử lý oryzalin 14,4 M trong 6
7


ngày thì tối ưu cho chi Dendrobium và Odontioda; 57,7 M trong 6 ngày thì tối ưu
cho chi Epidendrum và 14,4 M trong 3 ngày thì thích hợp cho chi Phalaenopsis.
Lê Thanh Thuận (2010) đã xử lý giống dưa hấu Thành Long TN522 với
oryzalin ở nồng độ từ 0,0175 đến 0,035% trong 24 và 48 giờ. Tỷ lệ đa bội hóa đạt
được là 1,6% ở nồng độ oryzalin 0,035% trong 48 giờ.
1.5 Phương pháp xác định cây đa bội
1.5.1 Kích thước và mật số khí khẩu
Sakhanokho et al. (2009) khi nghiên cứu trên cây gừng cảnh (Hedychium
muluense R. M. Smith) đã xác định cây nhị bội có mật số khí khẩu của cây nhị bội
là 50,0  0,4/mm2, chiều dài khí khẩu là 31,6  0,5 m. Cây tứ bội có mật số khí
khẩu là 30,8  0,3/mm2, chiều dài khí khẩu là 45,0  0,9 m.
Khi đa bội hóa cây Lagerstroemia indica L. in vitro, Zhang et al. (2010) đã
nhận thấy chiều dài khí khẩu ở cây nhị bội là 26,8  2,8 µm, trong khi đó ở cây tứ
bội là 32,9  3,7 µm, mật số khí khẩu ở cây nhị bội là 174,3  28,3/mm2 và ở cây
tứ bội là 107,3  22,4/mm2.
Liu et al. (2007) đã xác định được mật số khí khẩu của cây Platanus
acerifolia nhị bội là 344,8  20,2/mm2, cây tứ bội là 173,6  19,0/mm2. Chiều dài

khí khẩu ở cây nhị bội là 31,4  4,9 µm, ở cây tứ bội là 37,1  1,5 µm.
Nguyễn Kim Hằng (2010) đã nghiên cứu trên cây dưa hấu Sugar Baby in
vitro và xác định được mật số khí khẩu của cây nhị bội là 540,6  27,5/mm2, cây
đa bội là 301,2  24,9/mm2. Như vậy, cây tứ bội có kích thước khí khẩu lớn hơn
cây nhị bội nhưng số khí khẩu trên một đơn vị diện tích thì ít hơn cây nhị bội.
1.5.2 Số hạt lục lạp/cặp tế bào khẩu
Sakhanokho et al. (2009). Khi nghiên cứu trên cây gừng cảnh (Hedychium
muluense R. M. Smith) đã xác định cây nhị bội có số hạt lục lạp trên cặp tế bào
khẩu là 22,8  1,1 và cây tứ bội có số hạt lục lạp trên cặp tế bào khẩu là 29,0  0,3.
Sau khi xử lý colchicine ở điều kiện in vitro, Zhang et al. (2010) đã xác định
số hạt lục lạp của cây Lagerstroemia indica L. tứ bội là 22,0  2,4, trong khi đó ở
cây nhị bội là 11,4  0,9.
Cây Ocimum basilicum L. nhị bội có số hạt lục lạp trên cặp tế bào khẩu là
12.80  0.28 trong khi đó cây tứ bội có số hạt lục lạp trên cặp tế bào khẩu là 25.8 
0.33 Omidbaigi et al. (2010).
.
8


CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Phương tiện
Vật liệu: thân khoai mỡ (ruột tím) được ươm từ củ ở nhà lưới bộ môn Sinh
lý-Sinh hóa, khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng.
Thiết bị: Nồi hấp khử trùng, tủ sấy, tủ cấy, keo thủy tinh, kính hiển vi,…
Hóa chất:
 Khoáng đa vi lượng theo công thức của Murashige và Skoog, 1962 (MS)
và vitamin.
 Hóa chất khử trùng: HgCl2.
 Hóa chất gây đa bội hóa: Oryzalin.

 Chất điều hòa sinh trưởng: Benzyl adenin (BA).
 Đường sucrose; than hoạt tính; agar; nước dừa.
Địa điểm và thời gian: Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm nuôi
cấy mô (nhiệt độ 26  20C, cường độ chiếu sáng 1500 lux, thời gian chiếu sáng 16
giờ/ngày) và nhà lưới bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng. Thời gian thực hiện từ ngày 01/07/2011 đến ngày 30/05/2012.
2.2 Phương pháp
2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Môi trường cơ bản theo công thức của Murashige và Skoog, 1962 (MS) có
bổ sung vitamin, đường sucrose 30g/l, nước dừa 100 ml/l. pH môi trường được điều
chỉnh về 5,7 trước khi nấu và rót 40 ml/keo hoặc 12 ml/ống nghiệm. Môi trường
được thanh trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1 atm. trong 20 phút.
2.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỉ lệ sống của mẫu cấy khoai
mỡ.
Mục tiêu: Tìm ra thời gian khử trùng thích hợp để đạt được tỉ lệ mẫu sống
cao cho việc thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên
1 nhân tố với 3 nghiệm thức (Bảng 2.1), mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi lần
lặp lại 10 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cấy 1 mẫu.

9


Bảng 2.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1
Nghiệm thức
Thời gian khử trùng với HgCl2 (phút)
NT1
9
NT2

12
NT3
15
NT: Nghiệm thức

Cách tiến hành: Củ giống khoai mỡ được ủ với tro ẩm ở nhà lưới. Sau 5 tuần,
các chồi khoai mỡ có chiều cao khoảng 1,0-1,2 m sẽ được sử dụng để lấy mẫu cấy.
Chọn phần thân không quá non, cắt tỉa lá, rửa dưới vòi nước chảy 30 phút sau đó
rửa lại với xà phòng trong 2 phút. Cắt dây khoai mỡ thành từng đoạn có chiều dài
khoảng 5 cm, mỗi đoạn mang 1-2 mầm ngủ cho vào keo đã khử trùng trong tủ cấy
vô trùng. Cho dung dịch HgCl2 0,1% vào ngập mẫu, thêm 2 giọt xà phòng vào để
khử trùng ở các mức thời gian 9, 12 và 15 phút. Sau đó, rửa lại bằng nước cất vô
trùng 4 lần.
Các đoạn thân được cắt bỏ phần tổn thương do hóa chất khử trùng có chiều
dài khoảng 2 –2,5 cm được cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường MS + BA 1
mg/l đã chuẩn bị sẵn.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỉ lệ nhiễm nấm, khuẩn.
- Tỉ lệ mẫu chết (mẫu chết là những mẫu không nhiễm và mầm ngủ bị hóa
nâu, không có khả năng tạo chồi).
- Tỉ lệ mẫu sống (mẫu sống là những mẫu không nhiễm và mầm ngủ vẫn
còn xanh, có khả năng tạo chồi).
Chỉ tiêu tỉ lệ nhiễm, tỉ lệ chết, tỉ lệ sống được tính theo công thức: Tổng số
mẫu quan sát (nhiễm, chết hoặc sống)/ tổng số mẫu cấy.
Thời gian theo dõi: 2 tuần sau khi cấy.

10


Hình 2.1 Thân cây khoai mỡ dùng để lấy mẫu cấy

(2 đoạn thân bên trái sẽ được sử dụng để tiến hành thí nghiệm khử trùng).

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA lên sự tạo chồi khoai mỡ
Mục tiêu: Tìm ra nồng độ BA thích hợp cho sự tạo chồi khoai mỡ trong giai đoạn
nuôi cấy vô trùng, tạo nguồn mẫu in vitro làm vật liệu cho thí nghiệm tiếp theo.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên
1 nhân tố với 3 nghiệm thức (Bảng 2.2), mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại, mỗi lần
lặp lại 5 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cấy 1 mẫu.

Bảng 2.2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2
Nghiệm thức
Nồng độ BA (mg/l)
NT1
NT2
NT3

0,5
1
1,5

NT: Nghiệm thức

Cách tiến hành: Các đoạn thân khoai mỡ được chuẩn bị như ở thí nghiệm 1
và khử trùng theo thời gian tốt nhất ở thí nghiệm 1, sau đó được cấy vào môi trường
BA ở 3 nồng độ 0,5; 1; 1,5 mg/l.

11


Chỉ tiêu theo dõi:

 Chiều cao chồi cao nhất (cm).
 Số chồi/nách lá: Đếm các chồi có chiều cao  0,3 cm trên 1 mẫu và chia
cho số nách lá.
Thời gian lấy chỉ tiêu: 2 tuần sau khi cấy.
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thời gian xử lý oryzalin lên sự tạo thành chồi khoai
mỡ đa bội in vitro
Mục tiêu: Tìm thời gian xử lý oryzalin thích hợp cho sự tạo thành cây khoai
mỡ đa bội in vitro từ cụm chồi.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên
1 nhân tố với ba nghiệm thức (Bảng 2.3); mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi lần
lặp lại có 3 keo, mỗi keo cấy 7 mẫu.

Bảng 2.3 Các nghiệm thức của thí nghiệm 3
Nghiệm thức
Thời gian xử lý
NT1
Đối chứng (không xử lý)
NT2
48 giờ
NT3
60 giờ
NT: Nghiệm thức

Cách tiến hành: Các chồi khoai mỡ tạo thành ở giai đoạn nuôi cấy vô trùng
được cấy truyền vào môi trường BA 1 và 1,5 mg/l, sau một thời gian sẽ có các cụm
chồi với các chồi nhỏ li ti ở gốc được hình thành, trung bình mỗi cụm có 6 chồi.
Chọn các cụm chồi cao từ 0,5 – 1 cm chuyển vào môi trường MS có bổ sung BA
0,5 mg/l. Khi mẫu được 2 ngày thì tiến hành xử lý với oryzalin 0,004% vào keo
môi trường có chứa mẫu trong 48 và 60 giờ (Cách xử lý: oryzalin được khử trùng
bằng lọc sau đó dùng pipet rút và bơm vào mỗi keo 6 ml). Sau đó đem chuyển mẫu

vào môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l.
Các chỉ tiêu theo dõi:
 Đếm số chồi/cụm chồi: đếm số chồi đã hình thành và cao  0,3 cm.
 Đếm số lá/cụm chồi: đếm các lá đã mở hoàn toàn.
 Chiều cao cụm chồi (cm): đo từ vị trí thấp nhất đến vị trí cao nhất của cụm
chồi.
Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2 tuần sau khi xứ lý oryzalin.
12