ẢNH HƯỞNG của THỜI GIAN xử lý ORYZALIN TRÊN sự SINH TRƯỞNG của các GIỐNG dưa hấu NHỊ bội (citrullus vulgaris schrad )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ THÙY LIÊN

ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN XỬ LÝ ORYZALIN TRÊN
SỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÁC GIỐNG DƯA HẤU NHỊ BỘI
(Citrullus vulgaris Schrad.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ KHOA HỌC CÂY TRỒNG
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

Cần Thơ, 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Tên đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN XỬ LÝ ORYZALIN TRÊN
SỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÁC GIỐNG DƯA HẤU NHỊ BỘI
(Citrullus vulgaris Schrad.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ KHOA HỌC CÂY TRỒNG
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

Cán bộ hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGs.Ts. Lâm Ngọc Phương

Nguyễn Thị Thùy Liên
MSSV: 3083415
Lớp: Công Nghệ Giống Cây Trồng

Cần Thơ, 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN DI TRUYỀN-GIỐNG NÔNG NGHIỆP

Luận văn Tốt nghiệp Kỹ sư Khoa học cây trồng – Chuyên ngành Công nghệ giống
cây trồng với đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN XỬ LÝ ORYZALIN
TRÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÁC GIỐNG DƯA
HẤU NHỊ BỘI (Citrullus vulgaris Schrad.)

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thùy Liên
Ý kiến cán bộ hướng dẫn.............................................................................
....................................................................................................................
....................................................................................................................
....................................................................................................................
....................................................................................................................

Cần Thơ, ngày ... tháng ... năm 2012
Cán bộ hướng dẫn

Lâm Ngọc Phương

ii


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN DI TRUYỀN-GIỐNG NÔNG NGHIỆP

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Khoa
học cây trồng – Chuyên ngành Công nghệ giống cây trồng với đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN XỬ LÝ ORYZALIN
TRÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÁC GIỐNG DƯA
HẤU NHỊ BỘI (Citrullus vulgaris Schrad.)
Do sinh viên Nguyễn Thị Thùy Liên thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm luận
văn.
Ý kiến của Hội Đồng chấm luận văn tốt nghiệp:.............................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
Luận văn tốt nghiệp được Hội Đồng đánh giá ở mức:
Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2012
Hội đồng

........................................

..........................................

DUYỆT KHOA
Trưởng Khoa Nông Nghiệp

iii

.....................................


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả
được trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thùy Liên

iv


THỜI GIAN HỌC TẬP
I. LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Họ và tên: Nguyễn Thị Thùy Liên

Giới tính: Nữ

Ngày sinh: 30/08/1989
Nơi sinh: huyện Tân Châu, tỉnh An Giang
Họ và tên cha: Nguyễn Văn Xiệc

Nghề Nghiệp: Làm ruộng

Họ và tên mẹ: Nguyễn Thị Tuyết

Nghề Nghiệp: Nội Trợ

II. THỜI GIAN HỌC PHỔ THÔNG
1. Tiểu học:
Thời gian: 1996 – 2000
Trường: Tiểu học “B” Tân Châu
Địa chỉ: huyện Tân Châu, tỉnh An Giang
2. Trung học cơ sở:
Thời gian: 2000 – 2004
Trường: Trung học cơ sở Tân Châu
Địa chỉ: huyện Tân Châu, tỉnh An Giang
3. Trung học phổ thông:
Thời gian: 2004 – 2007
Trường: Trung học phổ thông Tân Châu
Địa chỉ: huyện Tân Châu, tỉnh An Giang

v


LỜI CẢM TẠ
Xin kính dâng lời tạ ơn chân thành và sâu sắc đến cha mẹ cùng với những người
thân trong gia đình đã quan tâm, yêu thương, động viên và giúp đỡ con rất nhiều
trên con đường học tập, đã cho con có được ngày hôm nay.
Vô cùng biết ơn cô Lâm Ngọc Phương đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá
trình thực hiện luận văn. Xin cảm ơn cô vì những lời khuyên sáng suốt và bổ ích,
những lần giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu để em có thể hoàn thành tốt luận

văn này.
Chân thành cảm tạ và biết ơn các thầy cô đã tận tình truyền đạt kiến thức, những
kinh nghiệm nghề nghiệp và xin cảm ơn thầy cô đã tận tình dìu dắt em trong suốt
quá trình học tập tại trường trong những năm tháng Đại Học vừa qua.
Xin cảm ơn chị Lê Minh Lý, anh Mai Vũ Duy, và xin cảm ơn các anh chị phòng
thí nghiệm Cấy Mô, bộ môn Sinh Lý – Sinh Hóa đã tận tình hướng dẫn, đưa ra
nhiều lời khuyên đúng đắn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện việc nghiên
cứu, giúp em có nhiều kinh nghiệm đáng quý. Cùng các bạn học trong lớp Công
Nghệ giống Cây Trồng Khoá 34 đã sát cánh ủng hộ, giúp đỡ em rất nhiều trong suốt
thời gian qua.

Xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày.... tháng.... năm 2012

Nguyễn Thị Thùy Liên

vi


NGUYỄN THỊ THÙY LIÊN, 2012. “Ảnh hưởng của thời gian xử lý oryzalin
trên sự sinh trưởng của các giống dưa hấu nhị bội (Citrullus vulgaris
Schrad.)”. Luận văn tốt nghiệp Đại Học, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng
Dụng Trường Đại Học Cần Thơ.
Người hướng dẫn khoa học: PGs.Ts.LÂM NGỌC PHƯƠNG

TÓM LƯỢC

Đa bội hóa có vai trò quan trọng đối với việc sản xuất các giống dưa hấu
không hạt. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro đã được áp dụng để tạo ra cây dưa hấu tứ bội
bằng cách xử lý oryzalin kết hợp nuôi cấy chồi dưa hấu trên môi trường MS có bổ

sung BA từ 0,2 - 2 mg/l. Đề tài “Ảnh hưởng của thời gian xử lý oryzalin trên sự
sinh trưởng của các giống dưa hấu nhị bội (Citrullus vulgaris Schrad.)” được
thực hiện trên bốn giống dưa hấu nhị bội là An Tiêm, Bảo Long, Tiểu Long, Xuân
Lan ở nồng độ oryzalin 0,04% ở 2 mức thời gian: không xử lý, xử lý 48 giờ và 54
giờ. Kết quả cho thấy: (1) Sinh trưởng và phát triền chồi của bốn giống dưa hấu đều
giảm khi có xử lý oryzalin; (2) Bằng quan sát hình thái, tỷ lệ đa bội đạt cao nhất là
29,1% ở nghiệm thức An Tiêm có xử lý 54 giờ; (3) Bằng cách đếm số lượng khí
khẩu tỷ lệ đa bội vẫn đạt cao nhất ở nghiệm thức An Tiêm có xử lý 54 giờ là 15,6%
và không đạt ở giống Bảo Long có xử lý 48 giờ.

Từ khóa: Dưa hấu, đột biến, oryzalin, mật số khí khẩu.

vii


MỤC LỤC

Trang
Tóm lược

vii

Mục lục

viii

Danh sách bảng

x

Danh sách hình

xi

Danh sách chữ viết tắt

xii

MỞ ĐẦU

1

Chương 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2

1.1 Sơ lược về dưa hấu

2

1.1.1 Nguồn gốc

2

1.1.2 Đặc tính thực vật

2

1.1.3 Đặc tính của các giống dưa hấu

3

1.2 Đột biến đa bội trong chọn giống

3

1.2.1 Vai trò của đột biến

3

1.2.2 Một số đặc điểm của cây đa bội

4

1.2.3 Phương pháp tạo đa bội thể

4

1.3 Cơ sở khoa học của việc tạo đa bội thể bằng oryzalin

5

1.3.1 Đặc điểm của oryzalin

5

1.3.2 Tác động của oryzalin lên tế bào

5

1.4 Môi trường nuôi cấy

5

1.5 Một số nghiên cứu đa bội hóa bằng oryzalin trên cây
trồng

9

Chương 2 PHƯƠNG TIỆN - PHƯƠNG PHÁP
2.1 Phương tiện

12
12

2.1.1 Vật liệu

12

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất

12

2.1.3 Thời gian và địa điểm

12

2.2 Phương pháp

13

2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

13

2.2.2 Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm

13

2.2.3 Bố trí thí nghiệm

13

viii


2.3 Xử lý số liệu
Chương 3

16

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

17

3.1 Số chồi dưa hấu gia tăng

17

3.2 Chiều cao chồi dưa hấu gia tăng

18

3.3 Số lá dưa hấu gia tăng

19

3.4 Tỷ lệ cây dưa hấu đa bội dựa vào hình thái

22

3.5 Xác định mật độ khí khẩu và chiều dài khí khẩu

25

3.6 Tỷ lệ cây dưa hấu đa bội dựa vào khí khẩu

28

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

30

4.1 Kết luận

30

4.2 ĐỀ nghỊ

30

TÀI LIỆU THAM KHẢO

31

PHỤ CHƯƠNG 1
PHỤ CHƯƠNG 2

ix


DANH SÁCH BẢNG
Bảng

Tựa bảng

Trang

2.1

Tổ hợp các nghiệm thức của thí nghiệm

14

3.1

Số chồi gia tăng của các giống dưa hấu An Tiêm, Bảo Long,
Tiều Long, Xuân Lan in vitro khi không xử lý và có xử lý
oryzalin ở các thời gian khác nhau

17

3.2

Chiều cao gia tăng (cm) của các chồi dưa hấu An Tiêm, Bảo
Long, Tiều Long, Xuân Lan in vitro khi không xử lý và có
xử lý oryzalin ở các thời gian khác nhau

19

3.3

Số lá gia tăng của các chồi dưa hấu An Tiêm, Bảo Long,
Tiều Long, Xuân Lan in vitro khi không xử lý và có xử lý
oryzalin ở các thời gian khác nhau

20

3.4

Tỷ lệ (%) cây đa bội dựa vào hình thái của các giống dưa
hấu An Tiêm, Bảo Long, Tiểu Long, Xuân Lan

23

3.5

Mật độ khí khẩu và chiều dài khí khẩu của các giống dưa
hấu An Tiêm, Bảo Long, Tiểu Long, Xuân Lan

25

3.6

Tỷ lệ (%) cây đa bội của các giống dưa hấu An Tiêm, Bảo
Long, Tiểu Long, Xuân Lan dựa vào khí khẩu

28

x


DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tựa hình

Trang

2.1

Chồi dưa hấu 1 tuần tuổi trước khi xử lý oryzalin

15

3.1

Sự sinh trưởng của chồi dưa hấu sau 4 tuần nuôi cấy

22

3.2

Hình thái thân và lá của chồi dưa hấu nhị bội và đa bội:

24

3.3

Mật số khí khẩu ở 4 giống dưa hấu An Tiêm, Bảo Long,
Tiểu Bảo, Xuân Lan

27

3.4

Sự sinh trưởng của chồi dưa hấu An Tiêm sau 12 tuần nuôi
cấy: cây nhị bội (A), cây có hình thái đa bội (B)

29

xi


DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

BA

6-benzyladenin

MS

Murashige và Skoog (1962)

TSKC

Tuần sau khi cấy

xii


MỞ ĐẦU
Dưa hấu (Citrullus vulgaris Schrad.) là loại trái cây rất được ưa chuộng trên thế
giới cũng như ở Việt Nam; nó chiếm một vị trí quan trọng trong ngày Tết cổ truyền của
dân tộc. Dưa hấu vừa có giá trị kinh tế, vừa có giá trị dinh dưỡng cao vì trong thịt trái
chín có provitamin A, vitamin C và một số khoáng chất khác (Ca, P, Fe, K) (Tạ Thu
Cúc. 2005). Tuy nhiên, dưa hấu nhị bội có quá nhiều hạt (1000 hạt/trái) nên làm cản
trở trong khi ăn (Donald, 1992).
Hiện nay, dưa hấu tam bội được rất nhiều người ưa thích chẳng những không
hạt mà còn có vị ngọt hơn so với dưa hấu nhị bội. Dưa hấu tam bội (3x = 33) là kết quả
lai giữa cây mẹ tứ bội (2n = 4x = 44) với cây bố nhị bội (2n = 2x = 22) (Andrus và ctv.,
1971; Kihara, 1951). Có nhiều phương pháp đa bội hóa được áp dụng để tạo giống dưa
hấu tứ bội , đặc biệt là phương pháp gây đa bội hóa bằng chất hóa học như colchicin,
oryzalin, gamexan…, trong đó oryzalin là chất có hiệu quả ở nhiều loài cây trồng
(Raza ctv., 2003).
Đề tài “Ảnh hưởng của thời gian xử lý oryzalin trên sự sinh trưởng của các
giống dưa hấu nhị bội (Citrullus vulgaris Schrad.)” được thực hiện nhằm tìm thời
gian xử lý oryzalin thích hợp để tạo cây dưa hấu tứ bội dùng làm nguồn vật liệu để lai
tạo giống dưa hấu không hạt.

CHƯƠNG I
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Sơ lược về cây dưa hấu
1.1.1 Nguồn gốc
Dưa hấu có tên khoa học là Citrullus vulgaris Schrad., thuộc họ bầu bí
Cucurbitaceae. Dưa hấu có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới khô và nóng của Châu Phi và
đã được canh tác rộng rãi trong vùng Địa Trung Hải cách đây hơn 3.000 năm. Ở nước
ta, dưa hấu được biết đến từ thời vua Hùng Vương thứ 18 và cho đến nay dưa hấu được
xem là loại trái cây không thể thiếu vào ngày Tết cổ truyền của dân tộc (Phạm Hồng
Cúc, 2002).
1.1.2 Đặc tính thực vật
Rễ: Rễ của dưa hấu gồm rễ chính và rễ phụ, rễ phụ ăn lan rộng trên mặt đất,
phân bố ở chiều sâu 20-30 cm, bán kính trung bình 50-60 cm (Phạm Hồng Cúc, 2002).
Thân: Dưa hấu thuộc loại cây bò, thân thảo hằng niên, dài 1,5-5 m, thân mềm
có góc cạnh và mang nhiều lông trắng, thân có nhiều mắt, mỗi mắt có một lá, chồi nách
và một vòi bám (Phạm Hoàng Hộ, 1999).
Lá: Lá dưa hấu xẻ thùy sâu, có 3-5 thùy, có màu xanh vàng nhạt, trên mặt lá
thường có lớp phấn trắng, lá đơn, mọc xen, xẻ thùy nhiều hay ít, sâu hay cạn tùy giống,
lá đầu tiên không xẻ thùy sâu. Lá dưa hấu có diện tích càng lớn quang hợp càng cao, lá
có gốc độ nghiêng quang hợp tốt hơn các lá to nhưng nằm ngang (Tạ Thu Cúc, 2005).
Hoa: Hoa dưa hấu có dạng hình chuông, đơn tính, đồng chu. Hoa nhỏ chỉ có
kích thước khoảng 2,5-3 cm, nằm đơn độc ở nách lá. Số lượng hoa đực và hoa cái
không cân đối, thường hoa đực xuất hiện sớm và lớn hơn hoa cái (Tạ Thu Cúc, 2005).
Trái: Trái phì quả, to và chứa nhiều nước. Trái có hình dạng thay đổi từ hình
cầu, hình trứng đến hình bầu dục tùy theo giống, nặng từ 1-2 kg hoặc có khi đến hàng
chục kg. Vỏ trái cứng, màu sắc thay đổi từ đen, xanh đậm đến vàng, có sọc, đường vằn
hoặc những vết đốm. Thịt trái có màu từ đỏ đậm đến vàng, chứa nhiều hạt, hạt nằm lẫn

2

trong thịt trái có trung bình từ 200-700 hạt/trái (Tạ Thu Cúc, 2005 và Phạm Hồng Cúc,
2002).
Hạt: Hạt có màu nâu nhạt, nâu đậm đến đen, kích thước hạt thay đổi tùy theo
giống, trọng lượng hạt trung bình từ 25-30 hạt/gam. Hạt chứa nhiều chất béo từ 2040% nên dùng làm nguyên liệu chế biến có giá trị dinh dưỡng cao, hạt dễ mất sức nảy
mầm (Trần Thị Ba và ctv., 1999).
1.1.3 Đặc tính của các giống dưa hấu
An Tiêm 95: Là dưa hấu lai F1, trái to, tròn, nặng 7-8 kg, vỏ đen có gân đậm,
ruột đỏ, ngon ngọt. Chống chịu tốt với bệnh đốm lá gốc, nứt thân chảy mủ, thu hoạch
70 ngày sau khi gieo, trái đều, năng suất cao.
Bảo Long TN 467 của công ty Trang Nông: Thời gian sinh trưởng 58-60 ngày.
Dạng trái oval, vỏ màu xanh đen sọc đậm thưa, vỏ mỏng, ruột đỏ đậm chắc thịt, rất
ngọt. Năng suất trái trung bình 25-32 tấn/ha. Kháng sâu bệnh tốt, có thể trồng được
quanh năm.
Tiểu Long 246 (F1): Thời gian sinh trưởng 58-62 ngày tùy theo thời tiết. Dạng
trái tròn dài hình oval (hơi giống trái bí đao), vỏ màu xanh nhạt sọc thưa xanh đậm
trung bình. Ruột đỏ, đẹp, chắc thịt, độ đường cao, chất lượng ngon đặc biệt, thích hợp
thị hiếu người tiêu dùng. Trọng lượng trái trung bình 3,5-4 kg. Có sức phát triển mạnh,
kháng sâu bệnh tốt, có thể trồng được trong mùa mưa (mưa ít) và mùa nắng.
Xuân Lan 130 (F1) của công ty Trang Nông: Thời gian sinh trưởng 58-60
ngày. Dạng trái tròn dài, vỏ màu xanh nhạt, có sọc thưa màu xanh đậm, chắc thịt, ngọt.
Trọng lượng trái trung bình 3,5-4 kg. Kháng sâu bệnh tốt, có thể trồng được quanh năm.
1.2 Đột biến đa bội trong chọn giống
1.2.1 Vai trò của đột biến
Đột biến là con đường quan trọng dẫn đến việc làm tăng biến dị. Các tác nhân
vật lý hoặc hóa học tác động vào tế bào làm biến đổi các cấu trúc hay thay đổi số lượng
nhiễm sắc thể (NST) hoặc ion hóa các phân tử protein, DNA, chất vô cơ, nước, làm
thay đổi phản ứng sinh lý, hóa sinh trong tế bào, thay đổi cấu trúc và thành phần của

3


DNA gây ra đột biến gen và sai khác về kiểu hình. Theo Lê Duy Thành (2000), các đột
biến xảy ra trong tự nhiên với tần số rất thấp, trong khi đó tần số xuất hiện đột biến
nhân tạo cao hơn trong tự nhiên 1.000 lần. Từ đó cho thấy đột biến nhân tạo giữ vai trò
rất quan trọng nhằm tạo ra các giống mới với những đặc tính mong muốn của nhà chọn
giống. Kỹ thuật đột biến đã được chọn lọc và giữ vai trò đầy hứa hẹn trong việc tạo ra
nhiều đặc tính theo mong muốn hơn so với biện pháp chọn giống cổ điển.
1.2.2 Một số đặc điểm của cây đa bội
Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2007), đặc điểm cây tứ bội là tế bào to,
khí khẩu to, lá dầy hơn và hiện tượng thụ tinh giảm. Cây đa bội tiến hóa hơn cây đơn
bội vì có sức sống cao, phạm vi thích nghi rộng, chống chịu điều kiện bất lợi tốt.
Trong tự nhiên, cây đa bội thường biểu thị ở thực vật bậc cao. Nghiên cứu chu
kỳ sống từ thực vật bậc thấp đến thực vật bậc cao, người ta thấy rằng: từ sinh sản đơn
tính tiến dần sinh sản hữu tính với các giai đoạn: giai đoạn giao tử (đơn bội thể) và giai
đoạn bào tử (đa bội thể). Thực vật càng tiến hóa, giai đoạn bào tử càng chiếm ưu thế.
Cây đa bội có số lượng nhiễm sắc thể lớn hơn cây lưỡng bội nên có đặc điểm
thân, lá, hoa, quả to hơn, thích nghi rộng, chống chịu nhiều điều kiện bất lợi, nên được
các nhà chọn giống khai thác. Cây đa bội có thể duy trì được ưu thế lai ở các đời sau,
nếu lai giữa cây đa bội và cây lưỡng bội. Cây giao phấn đa bội lúc tự thụ phấn ít thoái
hóa hơn so với cây lưỡng bội. Cây đa bội có thể tạo dạng bất dục để ứng dụng trong
sản xuất quả không hạt như dưa hấu.
1.2.3 Phương pháp tạo đa bội thể
Có nhiều phương pháp tạo đa bội thể, nhưng theo Trần Thượng Tuấn (1992) thì
có một số phương pháp sau:
- Gây thay đổi nhiệt độ: Thay đổi nhiệt độ một cách đột ngột sẽ làm tế bào đang
phân chia bị rối loạn và có thể gây ra đa bội, nhưng tỷ lệ thành công không cao.
- Gây chấn thương cơ giới: Cắt ngang đỉnh sinh trưởng, phần thân ngọn ngay
vết cắt hình thành mô sẹo (callus), sau đó hình thành mầm bất định có thể gây ra hiện

tượng đa bội.
4


- Xử lý bằng hóa chất như: Colchicine, hyprit, acenapthen, gemaxan,… Trong
số đó colchicine là chất cho hiệu quả cao nhất trên nhiều loại cây trồng, nên là chất chủ
yếu được sử dụng vào mục đích gây đa bội nhân tạo. Tuy nhiên, theo Petersen và ctv.
(2003), colchicin có thể được thay thế bằng oryzalin và trifluralin trong việc xử lý đa
bội.
1.3 Cơ sở khoa học của việc tạo đa bội thể bằng oryzalin
1.3.1 Đặc điểm của oryzalin
Oryzalin có công thức hóa học C12H18N4O6S là một loại thuốc cỏ dinitroaniline
và được dùng để kích thích sự đa bội hóa ở nhiều loại cây trồng (Morejohn và ctv.,
1987). Nó còn là loại thuốc cỏ có hoạt động ức chế sự phân bào ở các loài cây trồng.
Oryzalin được đăng ký đầu tiên ở Mỹ năm 1974 và được sử dụng để tiêu diệt các loại
cỏ hằng năm, cỏ lá rộng, cây bụi…
1.3.2 Tác động của oryzalin lên tế bào
Tác động của oryzalin đến sự phân bào cũng giống như colchicin nhưng hoạt
động gắn kết của colchicin với vi ống yếu hơn oryzalin. Những cây trồng được xử lý
với oryzalin ở nồng độ milimol (mM) (Dolezeel và ctv., 2004).
Oryzalin gắn kết chặt chẽ với những vi ống tạo thành phức hợp oryzalin – vi
ống. Phức hợp này làm thoi vô sắc ngừng hoạt động và ngăn cản sự phân chia tế bào
(Morejohn và ctv., 1987).
1.4 Môi trường nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình
thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành
phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài, bộ phận nuôi cấy
và mục đích thí nghiệm mà mô cấy được duy trì ở trạng thái mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ hay
muốn tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Nhìn chung môi trường nuôi cấy bao gồm các thành
phần cơ bản sau: nước, các nguyên tố khoáng đa vi lượng, nguồn carbohydrate, vitamin

và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên,
2002).

5


Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định
(amino acid, EDTA…) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa,
chuối, dịch chiết nấm men…
Các nguyên tố khoáng đa lượng: Khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh
hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và không gây độc (Lê Văn Hòa và Nguyễn
Bảo Toàn, 2005).
Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây
trồng điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần cung cấp: nitrogen, phosphorus,
potassium, calcium, magnesium, sắt (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
Các nguyên tố vi lượng: Các nguyên tố vi lượng là thành phần của enzyme, tuy
chiếm tỷ lệ nhỏ nhưng lại là thành phần không thể thiếu (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo
Toàn, 2005). Hầu hết các nguyên tố khoáng vi lượng cần thiết cho cây đối với mô
nuôi cấy đều được cung cấp vào trong môi trường nhân tạo. Các vi lượng thường
thêm vào môi trường là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu),
Molybden (Mo), Cobalt (Co), Sắt (Fe). Nồng độ khoáng vi lượng sử dụng thường thấp
hơn 30 mg/l. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các
enzym (Nguyễn Xuân Linh, 1998).
Sự hiện diện của nguyên tố sắt đặc biệt quan trọng cho quá trình tạo chồi
và rễ bất định (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Một số muối vi
lượng thường dùng là ZnSO4, CuSO4, CoCl2. Ngoài ra một số môi trường còn có
muối nikel và amonium (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Sắt được sử dụng trong môi trường nuôi cấy ở dạng chelat kết hợp với Na2 Ethylene Diamine Tetra Acetate (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng
từ từ ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy
Tiên, 2002).

Đường: Mô tế bào thực vật được nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương
thức dị dưỡng nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn chất hữu cơ là
điều bắt buộc (Lê Trần Bình, 1997). Đường không chỉ điều hòa áp suất thẩm thấu của
môi trường mà còn là nguồn carbohydrat tốt nhất cung cấp cho mô và tế bào. Nhưng
6


khi hàm lượng đường quá cao sẽ hạn chế hiệu quả hấp thu nước của mô cây. Hai dạng
đường thường gặp trong nuôi cấy in vitro là glucose và sucrose, trong đó sucrose được
sử dụng phổ biến hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Tùy theo mục đích nuôi cấy mà
hàm lượng đường cho vào môi trường khác nhau.
Agar: Là phức hợp polysaccharid tự nhiên được trích từ tảo sống ở biển thuộc
ngành Rhodophyta (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Agar được sử dụng làm chất đông cứng
môi trường để làm giá thể cho môi trường nuôi cấy tế bào thực vật. Tùy đối tượng nuôi
cấy mà hàm lượng agar được thêm vào dao động từ 0,5-1%. Nồng độ agar cao, môi
trường trở nên cứng, sự khuếch tán các chất dinh dưỡng cũng như hấp thu của mô sẽ
gặp khó khăn (Bùi Bá Bổng, 1995). Theo Debergh (1983), nên sử dụng nồng độ agar
vào khoảng 6-8 g/l với pH môi trường được chuẩn từ 5,6-5,8.
Nước dừa: Được đưa vào môi trường nhằm tăng sự sinh trưởng và phát triển của
mô. Qua kết quả phân tích nước dừa từ non đến già cho thấy trong nước dừa có các
amino acid tự do nồng độ đạt từ 191-685 ppm. Ngoài ra nước dừa còn có các amino acid
liên kết, các acid hữu cơ, đường, myo-inositol, một số hợp chất có hoạt tính như auxin,
các cytokinin ở dạng glycosid (Nguyễn Đức Thành, 2000). Những chất này có lợi cho sự
tái tạo phôi, tạo mô sẹo và tái sinh cây (Vũ VănVụ, 1999). Trong nuôi cấy mô, nước dừa
được sử dụng từ 10-20% thể tích môi trường (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
Vitamin: Trong môi trường nuôi cấy đa số mô thực vật, mô cấy chưa có sẵn cấu
trúc tự tổng hợp đủ lượng cần thiết nên phải bổ sung thêm vitamin từ môi trường bên
ngoài vào (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Vitamin đóng vai trò trong hệ thống xúc tác
enzyme và chỉ yêu cầu một lượng nhỏ. Các vitamin thường được sử dụng là thiamin
(B1), nicotinic acid (B3), pyridoxine (B6), và myo-inositol.

Nước: Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nước sử dụng
trong nuôi cấy thường là nước cất một lần. Trong một số trường hợp người ta cũng sử
dụng nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
pH của môi trường: Là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi
trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ
một số chất phụ thuộc vào pH môi trường, đặc biệt mẫn cảm với pH là NAA,
7


Gibbrellin và các vitamin. Sự hấp thụ chất sắt cũng phụ thuộc vào pH (Nguyễn Đức
Thành, 2002). pH của đa số môi trường nuôi cấy được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước
khi hấp khử trùng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Chất điều hoà sinh trưởng: Là yếu tố quan trọng nhất trong điều khiển sự phát
sinh hình thái và tái sinh nguyên vẹn từ tế bào và mô thực vật tách rời trong nuôi cấy in
vitro. Hai nhóm chất được sử dụng nhiều nhất là auxin và cytokinin (Nguyễn Xuân
Linh, 1998). Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, mẫu nuôi cấy
và hoạt tính vốn có của nó (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).
Tỷ lệ cytokinin và auxin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành
lập tạo chồi và rễ. Một tỷ lệ cao cytokinin và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi,
ngược lại tỷ lệ cao auxin và cytokinin thấp thích hợp cho tạo rễ, còn ở mức độ trung
gian thích hợp cho tạo mô sẹo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Auxin: Auxin là thuật ngữ chung đại diện cho lớp hợp chất được đặc tính hoá
bởi khả năng gây ra sự vươn dài trong tế bào chồi trong vùng gần đỉnh. Auxin cũng có
những ảnh hưởng khác bên cạnh sự vươn dài. Trong nuôi cấy in vitro thúc đẩy sinh
trưởng của mẫu qua hoạt hoá sự phân chia mô và kéo dài tế bào. Auxin kết hợp chặt
chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự sinh
trưởng của mô sẹo đặc biệt là khi nó kết hợp sử dụng với cytokinin (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002). Các auxin thường được sử dụng là
Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), Naphthalene acetic acid (NAA), Indol-3-acetic
acid (IAA), Indol-3-butyric acid (IBA).

Cytokinin: Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế, nó kích thích sự
phân chia tế bào. Cytokinin đầu tiên được phân lập từ DNA tinh trùng cá trích được
thanh trùng và được gọi là kinetin (6-furfurylaminopurine) (Nguyễn Minh Chơn, 2010).
Ngày nay có nhiều cytokinin tổng hợp được biết đến, trong đó có 3 chất thông dụng
nhất trong nuôi cấy mô là kinetin (6-furfurylaminopurine), BA (Benzyl adenine), BAP
(benzyl amino purine). Bên cạnh đó một số cytokinin tổng hợp khác cũng được sử
dụng như DPU (Diphenylurea), 2-ip (isopentyl), Thidiazuron (TDZ).
Trong nuôi cấy mô cytokinin được bổ sung vào môi trường nhằm kích thích sự
8


hoạt động của chồi bên và giảm hiện tượng ưu thế chồi ngọn. Việc bổ sung cytokinin
vào môi trường nuôi cấy có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của vài chồi nhỏ của mẫu
cấy sau 4-6 tuần, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều
chồi và những chồi này không thể kéo dài, làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi
chứa nhiều nước (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002). Khi kết hợp với
Auxin sẽ kích thích sự phân chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái. Để kích
thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo mà
người ta phối hợp giữa auxin và cytokinin.
1.5 Một số nghiên cứu đa bội hóa bằng oryzalin trên cây trồng
Van Tuyl và ctv. (1992) đã tiến hành xử lý oryzalin lên cây Lilium in vitro với
các nồng độ 0,005 và 0,01% và thời gian xử lý 4 giờ. Kết quả ghi nhận được 4 cây tứ
bội và 10 cây bội tạp ở nồng độ oryzalin 0,005%, 6 cây bội tạp ở nồng độ oryzalin
0,01%.
Kermani và ctv. (2003) đã xử lý oryzalin trên chồi đỉnh cây hoa hồng in vitro
với 2 mức nồng độ (5 μM và 15 μM) và 3 mức thời gian xử lý (14,21 và 28 ngày). Kết
quả cho thấy, tỷ lệ cây tứ bội đạt cao nhất ở nồng độ oryzalin 5 μM và thời gian xử lý
14 ngày là 40%.
Thao và ctv. (2004) đã tiến hành xử lý oryzalin lên chồi đỉnh của cây Alocasia x
amazonica in vitro với 3 mức nồng độ: 0,005; 0,01 và 0,05% và mức thời gian xử lý:

24, 48, 72 giờ. Kết quả đạt được 4 cây tứ bội, 5 cây bội tạp và 32 cây nhị bội ở nồng độ
oryzalin 0,005% và thời gian xử lý 48 giờ.
Barandalla và ctv. (2006) đã xử lý oryzalin lên của 6 giống khoai tây ở 2 mức
nồng độ 10 mg/l; 20 mg/l và 2 mức thời gian xử lý: 24, 48 giờ. Kết quả đạt được 2 cây
tứ bội, 3 cây bội tạp, 71 cây nhị bội ở nồng độ oryzalin 10 mg/l và thời gian xử lý 48
giờ trên giống L37 và 2 cây bội tạp, 28 cây nhị bội ở nồng độ 10 mg/l trong 24 giờ trên
giống H84.42/4.
Lehrer và ctv. (2008) đã tiến hành tạo cây Berberis thunbergii var. atropurea đa
bội bằng cách ngâm hạt trong dung dịch oryzalin với các nồng độ khác nhau: 0,002;

9


0,005; 0,01 và 0,02% và 3 mức thời gian xử lý: 6, 12, và 24 giờ. Kết quả đạt được 28%
cây tứ bội ở nồng độ oryzalin 0,002%.
Huỳnh Thị Kim Tươi (2010) đã xử lý giống dưa hấu Sugar Baby với oryzalin ở
nồng độ 0,0005 và 0,001% trong 24 và 48 giờ; giống dưa hấu Thành Long với oryzalin
ở nồng độ 0,001 và 0,002% trong 24 và 48 giờ. Tỉ lệ đa bội hóa chỉ đạt được ở giống
Thành Long là 4,7% nồng độ 0,002% trong 48 giờ.
Kích thước khí khẩu và mật số khí khẩu
Hamill và ctv. (1992), xem mật số khí khẩu là tiêu chuẩn để phân biệt sự khác
nhau giữa thể lưỡng bội (2n) và thể tứ bội (4n) của tế bào thực vật.
Sarinee và ctv. (1995) xác định kích thước khí khẩu ở cây nhị bội Morus alba
Var. là 0,23 mm và ở cây tứ bội 0,34 mm. Số lượng khí khẩu ở cây nhị bội là 230 khí
khẩu/mm2 và cây tứ bội 129 khí khẩu/mm2.
Katarzyna (2003) cũng cho thấy sự khác biệt nhau về kích thước khí khẩu trên
cây Chamomilla recutita (L.) Rausch, trung bình chiều dài khí khẩu ở cây nhị bội chỉ
đạt từ 39,05 µm đến 44,28 µm, trong khi đó cây tứ bội đạt từ 53,88 µm đến 59,95 µm.
Kết quả này cũng đã được báo cáo bởi Czabajska (1963) và Letchamo và ctv. (1994).
Silva và ctv. (2000) đã xác định được 106 cây nhị bội và 42 cây tứ bội ở lan Cattleya

intermedia dựa vào mật số khí khẩu.
Sun (2008) đã nghiên cứu trên cây Nepenthes gracilis cho thấy chiều dài khí
khẩu ở cây nhị bội 31,42 μm, trong khi đó ở cây tứ bội 45,39 μm, mật số khí khẩu ở
cây nhị bội có 413,71 mm2 và ở cây tứ bội có 346,15 mm2.
Nilanthi và ctv. (2009) xác định được kích thước khí khẩu của cây Echinacea
purpurea tứ bội 144,810 m, cây nhị bội 104,519 m.
Nguyễn Thị Kim Hằng (2010) xác định được kích thước khí khẩu của cây dưa
hấu Sugar Baby nhị bội 18,13 m trong khi cây tứ bội 25,27 m, mật số khí khẩu ở cây
nhị bội có 540,6 khí khẩu/mm2 và cây tứ bội có 301,2 khí khẩu/ mm2.

10


11


CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Phương tiện
2.1.1 Vật liệu
Sử dụng hạt giống dưa hấu cung cấp bởi công ty Trang Nông, Chánh Nông như:
An Tiêm, Bảo Long, Tiểu Long, Xuân Lan.
2.1.2 Dụng cụ và hóa chất
- Dụng cụ: Các trang thiết bị dùng trong phòng thí nghiệm, Bộ môn Sinh lýSinh hóa (Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ).
- Hóa chất
+ Hóa chất khử trùng mẫu vật: Cồn 700, Ca(OCl)2, HgCl2.
+ Khoáng đa lượng và vi lượng theo công thức MS (Murashige và Skoog, 1962),
vitamin (Thiamin, pyridoxin, acid nicotinic, myo-inositol)
+Chất

điều

hòa

sinh

trưởng

BA

(6-benzyladenin),

Kinetin

(6

furfurylaminopurine), IBA ( Indol butyric acid)
+ Agar 7,2 g/l
+Đường sucrose 30 g/l
+Nước dừa 100 ml/l
+ Hóa chất gây tứ bội hóa: Oryzalin
+ Hóa chất quan sát khí khẩu: Collodion
2.1.3 Thời gian và địa điểm
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 12/2011 đến tháng 05/2012.
- Địa điểm: Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô (nhiệt
độ 26  20 C, cường độ chiếu sáng 1.500 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày) và nhà
lưới của bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường
Đại học Cần Thơ.

12