Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY
DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don )

LU N ÁN TI N S SINH HỌC

Thái Nguyên - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY
DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don )

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 9 42 01 21

LU N ÁN TI N S SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm
2. GS.TS. Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2018


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của
PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm và GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết quả
trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các tạp chí khoa học
công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

Bùi Thị Hà


ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu và
PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã chỉ bảo, động viên và tận tình hướng dẫn trong
suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn và các cán bộ, nghiên
cứu viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất
để tôi có thể hoàn thành một số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh học hiện
đại và Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học

Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có nhiều góp ý sâu sắc cho tôi
trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô và
các cán bộ bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái
Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Y Dược, chân thành
cảm ơn các đồng nghiệp Khoa Khoa học cơ bản, Trường Đại học Y Dược – Đại
học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và công tác.
Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động
viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.

Thái Nguyên, tháng 02 năm 2018
TÁC GIẢ
Bùi Thị Hà


iii

MỤC LỤC
Lời cam đoan…………………………………………………................. i
Lời cảm ơn………………………………………………………..…....... ii
Mục lục………………………………………………………..………… iii
Danh mục những chữ viết tắt trong luận án……………………………..

vi

Danh mục bảng trong luận án…………………………………………… ix
Danh mục hình trong luận án……………………………………………

xi

MỞ ĐẦU…………………………………………………...…………… 1
1.Đặt vấn đề…………………………………………………………….

1

2. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………….. 2
3. Nôi dung nghiên cứu……………………………………………….....

2

4. Những đóng góp mới của luận án………………………………...…..

3

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án…………………….. 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………..... 4
1.1.Alkaloid ………………………………………………..…………..

4

1.1.1. Vai trò của alkaloid thực vật........................................................... 4
1.1.2. Alkaloid ở cây dừa cạn…………………………………………...

6

1.2. Sinh tổng hợp alkaloid và hoạt động của enzyme DAT ở cây dừa cạn..

10

1.2.1. Quá trình sinh tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn…………...……..

10

1.2.2. Hoạt động của enzyme DAT và gen DAT...................................

16

1.3. Nghiên cứu cải thiện hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn.................... 18
1.3.1. Nâng cao hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn bằng phương pháp


iv

nuôi cấy mô tế bào thực vật……………………......................................

18

1.3.2. Nâng cao hàm lượng alkaloid bằng kỹ thuật chuyển gen……….

21

Chƣơng 2. V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………

27

2.1. Vật liệu nghiên cứu .……………………………………………….

27

2.1.1. Vật liệu thực vật………………………………………………….

27

2.1.2. Chủng vi khuẩn và các loại vector……………………………….

27

2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu………………………...

27

2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu……………………………………

27

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án…………………….

28

2.3. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………..

29

2.3.1. Các phương pháp sinh học phân tử………………………………

29

2.3.2. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT 33

2.3.3. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc lá.....................

37

2.3.4. Tái sinh và chuyển gen gus ở cây dừa cạn......................................

38

2.3.5. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây dừa cạn thông qua
A.tumefaciens............................................................................................. 43
2.3.6. Phương pháp phân tích cây chuyển gen.........................................

45

2.3.7. Phương pháp tính hiệu suất chuyển gen…………………………

49

2.3.8. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu………………………

49

Chƣơng 3. K T QUẢ VÀ THẢO LU N…………………………....

50

3.1. Đặc điểm của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn..........................

50

3.1.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen


v

CrDAT…………………………………………………………………………..

50

3.1.2. So sánh trình tự nucleotite của gen CrDAT.............................

52

3.2. Thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá

56

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT…….

56

3.2.2. Phân tích biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá chuyển gen........ 61
3.2.3. Thảo luận kết quả thiết kế và đánh giá hoạt động của vector
chuyển gen pBI121-CrDAT…………………………………………………

67

3.3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh và xây dựng quy trình chuyển gen ở
cây dừa cạn................................................................................................ 70
3.3.1. Nuôi cấy in vitro cây dừa cạn……………………………………

70

3.3.2. Xây dựng quy trình chuyển gen thông qua gen gus………………... 76
3.3.3. Kết quả chuyển gen gus vào cây dừa cạn .....................................

82

3.4. Kết quả chuyển gen CrDAT và tạo cây dừa cạn chuyển gen...................... 87
3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT và tái sinh cây dừa cạn chuyên gen.. 87
3.4.2. Xác định sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong
hệ gen của các cây dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T0................................. 89
3.4.3. Phân tích biểu hiện protein DAT tái tổ hợp ở thế hệ T1.................

92

3.4.4. Thảo luận về kết quả sự tăng cường biểu hiện gen CrDAT ở cây
dừa cạn chuyển gen……………………………………………………

96

K T LU N VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………...

100

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIỆN QUAN Đ N LU N ÁN….

101

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………

102

PHỤ LỤC……………………………………………………………...

119


vi

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VI T TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

AS

Acetosyringone

A. Tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

A. Rhizogenes

Agrobacterium rhizogenes

BAP

Benzylaminopurine

35S

Promoter CaMV 35S

bp

base pair

Tiếng Việt

Cặp bazơ nitơ
cộng sự

cs

Môi trường đồng nuôi
cấy

CCM

Cocultivation medium

DNA

Deoxyribonucleic acid

cDNA

Complementary DNA

CTAB

Cetyltrimethyl ammonium
Bromide

CrDAT

Cathanthus roseus Deacetyl
vindoline 4-O-acetyltransferase

DEPC

Diethyl pyrocarbonate

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic
acid

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent
assay

Phản ứng ELISA

GM

Germination Medium

Môi trường tái sinh

gus

β-Glucuronidase

IAA

Indole Acetic acid

IPTG

Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside

DNA bổ sung

Gen CrDAT


vii

Kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria Bertami

Môi trường dinh dưỡng
cơ bản nuôi cấy vi khuẩn

MS

Murashige và Skoog

Tên gọi đặt cho môi
trường dinh dưỡng cơ
bản nuôi cấy mô thực vật

mRNA

Messenger ribonucleic acid

NAA

Naphthaleneacetic acid

NptII

Neomycyn phosphatranferaseII

Gen kháng kanamycine

OD

Optical density

Mật độ quang

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi
polymerase

RNA

Ribonucleic acid

RM

Rooting medium

Môi trường tạo rễ

rCrDAT

Recombinant CrDAT protein

Protein DAT tái tổ hợp

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SIM

Shoot Induction Medium

Môi trường tạo đa chồi

SEM

Shoot Elongation Medium

Môi trường kéo dài chồi

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq DNA
polymerase

Thermus aquaticus DNA

polymerase

T-DNA

Transfer DNA

Đoạn DNA được chuyển
vào thực vật

T0, T1

Các thế hệ cây chuyển
gen

T0

Cây chuyển gen tái sinh
từ chồi trong ống nghiệm

T1

Hạt của cây chuyển gen
T0 nảy mầm thành cây


viii

T1
TMB

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine

WT

Wild type

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galacto-pyranoside

WHO

World Health Organization

Cây không chuyển gen

Tổ chức y tế thế giới


ix

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
30
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.........................................
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR............................................................

31

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen CrDAT vào vector tách dòng........

32

Bảng 2.4. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn...................................

32

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt DNA bằng BamHI……………………

33

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI/ NcoI……………….

35

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII...........................

36

Bảng 3.1. Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide của gen
CrDAT...............................................................................................................

52

Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn của protein
DAT ở mẫu dừa cạn TN1, TN2 và protein mang mã số AAC99311 trên Ngân 55
hàng Gen................................................................................................
Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc
lá...................................................................................................................
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ đoạn

thân mang mắt chồi bên……………………………………………………..
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của sự kết hợp BAP 1,0mg l với IBA đến sự phát sinh
chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên………….
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của BAP đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của
chồi từ nách lá mầm……………………………………………………........

63

71

72

74

Bảng 3.7. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 0,5mg l và IBA đến sự phát sinh và
sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm……………………………..….............

75


x

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của mật độ A. tumefaciens đến tỷ lệ biểu hiện gen gus
tạm thời khi lây nhiễm qua nách lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên........
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ biểu hiện tạm
thời gen gus ...................................................................................................

77
78

80

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ Km đến chọn lọc mẫu chuyển gen.......

81

Bảng 3.12. Kết quả chuyển gen gus vào dừa cạn...........................................

83

Bảng 3.13. Kết quả biến nạp cấu trúc CrDAT vào mẫu dừa cạn hoa hồng tím..

89


Luận văn đầy đủ ở file: Luận văn full