ẢNH HƯỞNG của một số hóa CHẤT KHỬ TRÙNG TRONG GIAI đoạn tạo mẫu cây và tác ĐỘNG của BA và 2,4 d TRONG GIAI đoạn NHÂN CHỒI IN VITROCÂY HOA THƯỢC dược (dahlia variablis desf)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRẦN THỊ DOÃN XUÂN

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ HÓA CHẤT KHỬ TRÙNG
TRONG GIAI ĐOẠN TẠO MẪU CÂY VÀ TÁC ĐỘNG
CỦA BA VÀ 2,4-D TRONG GIAI ĐOẠN NHÂN
CHỒI IN VITRO CÂY HOA THƯỢC DƯỢC
(Dahlia variablis Desf)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH HOA VIÊN CÂY CẢNH

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: HOA VIÊN VÀ CÂY CẢNH

Tên đề tài:
ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ HÓA CHẤT KHỬ TRÙNG
TRONG GIAI ĐOẠN TẠO MẪU CÂY VÀ TÁC ĐỘNG
CỦA BA VÀ 2,4-D TRONG GIAI ĐOẠN NHÂN
CHỒI IN VITRO CÂY HOA THƯỢC DƯỢC
(Dahlia variablis Desf)

Cán bộ hướng dẫn:
PGs. TS. Lê Văn Hòa
Ths. Nguyễn Văn Ây

Sinh viên thực hiện:
Trần Thị Doãn Xuân
MSSV: 3077430
Lớp: Hoa Viên Cây Cảnh K.33

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG


Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Hoa viên & Cây cảnh với đề tài: “ẢNH HƯỞNG
CỦA MỘT SỐ HÓA CHẤT KHỬ TRÙNG TRONG GIAI ĐOẠN TẠO MẪU CÂY
VÀ TÁC ĐỘNG CỦA BA VÀ 2,4-D TRONG GIAI ĐOẠN NHÂN CHỒI IN VITRO
CÂY HOA THƯỢC DƯỢC (Dahlia variablis Desf)”

Do sinh viên TRẦN THỊ DOÃN XUÂN thực hiện, kính trình lên hội đồng chấm
luận văn tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2011
Cán bộ hướng dẫn

PGs. Ts. Lê Văn Hòa

i

Ths. Nguyễn Văn Ây


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG


Hội đồng chấm luận văn đã chấp thuận Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Hoa viên
& Cây cảnh với đề tài: “ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ HÓA CHẤT KHỬ TRÙNG
TRONG GIAI ĐOẠN TẠO MẪU CÂY VÀ TÁC ĐỘNG CỦA BA VÀ 2,4-D TRONG
GIAI ĐOẠN NHÂN CHỒI IN VITRO CÂY HOA THƯỢC DƯỢC (Dahlia variablis
Desf)”

do sinh viên TRẦN THỊ DOÃN XUÂN thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm
luận văn tốt nghiệp ngày….tháng….năm 2011.

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ....................................
Ý kiến hội đồng: ......................................................................................................
.................................................................................................................................
.................................................................................................................................
.................................................................................................................................

Duyệt khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2011

CHỦ NHIỆM KHOA

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

TRẦN THỊ DOÃN XUÂN

iii


TIỂU SỬ CÁ NHÂN

Họ và tên: TRẦN THỊ DOÃN XUÂN
Ngày sinh: 13/02/1989
Nơi sinh: Vĩnh Long
Họ và tên cha: TRẦN VĂN MỸ PHÚC

Nghề nghiệp: Cán bộ viên chức

Họ và tên mẹ: ROÃN THỊ XUÂN HOA

Nghề nghiệp: Cán bộ viên chức

Chỗ ở hiện nay: 197/6, đường Trần Phú, phường 4, thành phố Vĩnh Long, Vĩnh
Long
Quá trình học tập:
- 1995 – 2000: Học sinh Trường Tiểu học Nguyễn Du, phường 1, TP. Vĩnh
Long, tỉnh Vĩnh Long
- 2000 – 2004: Học sinh Trường Trung học cơ sở Lê Quý Đôn, phường 1, TP.
Vĩnh Long, tỉnh Vĩnh Long
- 2004 – 2007: Học sinh Trường Trung học phổ thông Lưu Văn Liệt, phường
1, TP. Vĩnh Long, tỉnh Vĩnh Long
- 2007 – 2011: Sinh viên Trường Đại Học Cần Thơ, Khoa Nông nghiệp và
Sinh học ứng dụng, Ngành Hoa viên & Cây cảnh, Khóa 33.

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2011
Người khai

Trần Thị Doãn Xuân

iv


LỜI CẢM TẠ

Kính dâng!
Cha mẹ đã sinh ra và suốt đời tận tụy vì con.
Xin chân thành biết ơn!
Thầy Lê Văn Hòa và thầy Nguyễn Văn Ây đã tận tình hướng dẫn và quan
tâm tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Cô Phan Thị Hồng Nhung và chị Lê Minh Lý đã nhiệt tình chỉ bảo, động
viên và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Thầy Lê Văn Bé và cô Lê Hồng Giang - cố vấn học tập lớp Hoa viên & Cây

cảnh khóa 33 đã tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn tôi trong suốt thời gian tôi học tại
trường.
Xin chân thành cám ơn!
Quý thầy cô, anh chị và các bạn đang thực tập tại phòng nuôi cấy mô đã giúp
đỡ tôi thực hiện luận văn.
Thân ái gửi về
Các bạn sinh viên lớp Hoa Viên & Cây Cảnh khóa 33 lời chúc sức khỏe và thành
đạt trong tương lai.

Trần Thị Doãn Xuân

v


MỤC LỤC
TRANG CHẤP NHẬN LUẬN VĂN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

i

TRANG CHẤP NHẬN LUẬN VĂN CỦA HỘI ĐỒNG

ii

LỜI CAM ĐOAN

iii

TIỂU SỬ CÁ NHÂN

iv

LỜI CẢM TẠ

v

MỤC LỤC

vi

DANH SÁCH BẢNG

viii

DANH SÁCH HÌNH

x

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ
TÓM LƯỢC

xii

MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2

1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN BỐ VÀ GIÁ TRỊ CỦA CÂY HOA
THƯỢC DƯỢC

2

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

2

1.1.2 Đặc điểm thực vật

2

1.1.3 Kỹ thuật trồng hoa Thược dược

3

1.1.4 Giá trị kinh tế của cây hoa Thược dược

4

1.2 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

4

1.2.1 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

4

1.2.2 Ưu điểm và khuyết điểm của kỹ thuật nuôi cấy mô tế

bào thực vật

4

1.2.3 Các giai đoạn vi nhân giống

5

1.3 CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG

7

1.3.1 Auxin

8

1.3.2 Cytokinin

8
8

1.4 CÁC YẾU TỐ KHÁC
1.4.1 Nhóm khoáng đa lượng

9

1.4.2 Nhóm khoáng vi lượng

9

1.4.3 Vitamin

9

1.4.4 Agar

10

vi


1.4.5 Nước dừa

10

1.4.6 Giá trị pH

10

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1

2.2

2.3

2.4

ĐỊA ĐIỂM VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

11

2.1.1 Địa điểm thí nghiệm

11

2.1.2 Đối tượng thí nghiệm

11

PHƯƠNG TIỆN

11

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ

11

2.2.2 Hóa chất

12

PHƯƠNG PHÁP

12

2.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ hóa chất và thời
gian khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cây hoa Thược
dược trong giai đoạn tạo mẫu

12

2.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của BA và 2,4-D trong giai
đoạn nhân chồi in vitro cây hoa thược dược

14

XỬ LÝ SỐ LIỆU

15

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1

3.2

11

16

THÍ NGHIỆM 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ HÓA
CHẤT VÀ THỜI GIAN KHỬ TRÙNG ĐẾN TỶ LỆ
SỐNG CỦA MẪU CẤY HOA THƯỢC DƯỢC TRONG
GIAI ĐOẠN TẠO MẪU
3.1.1 Tỷ lệ (%) mẫu sống của cây hoa Thược dược

16

ẢNH HƯỞNG CỦA BA VÀ 2,4-D TRONG GIAI ĐOẠN
NHÂN CHỒI IN VITRO CÂY HOA THƯỢC DƯỢC

20

3.2.1 Chiều cao (cm) của cây hoa Thược dược trong giai
đoạn nhân chồi

20

3.2.2 Số cặp lá hình thành của chồi cây hoa Thược dược
trong giai đoạn nhân chồi

23

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

16

25

4.1

KẾT LUẬN

25

4.2

ĐỀ NGHỊ

25

26

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ CHƯƠNG

vii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng

Tựa bảng

Trang

2.1

Thành phần của môi trường nuôi cấy

13

2.2

Tổ hợp nghiệm thức thí nghiệm 2

15

3.1

Ảnh hưởng của nồng độ hóa chất khử trùng và thời gian khử

16

trùng lên tỷ lệ sống (%) của mẫu cây hoa Thược dược theo thời
gian (tuần sau khi vô mẫu)
3.2

Chiều cao chồi (cm) cây hoa Thược dược gia tăng theo thời
gian (tuần SKC)

21

3.3

Số cặp lá hình thành của chồi Thược dược trong 3 tuần (SKC)

23

viii


DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tựa hình

Trang

1.1

Cây hoa thược dược có hoa màu vàng cam

3

2.1

Cành để lấy mẫu cấy

11

3.1

Mẫu cấy cây hoa Thược dược in vitro vào thởi điểm 1 tuần SKC

17

3.3

Mẫu cấy cây hoa Thược dược in vitro bị nhiễm vi sinh vật (2 tuần
SKC)
Mẫu chồi cây hoa Thược dược in vitro sạch và sống, được bố trí
cho thí nghiệm nhân chồi.

20

3.4

Mẫu cấy chồi cây hoa Thược dược (3 tuần SKC)

22

3.2

ix

18


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ

MS: Murashige và Skoog (1962)
ctv.: Cộng tác viên
ĐHST: Điều hòa sinh trưởng
SKC: Sau khi cấy
BA: Benzyl adenine
2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid
In vitro: Trong ống nghiệm

x


TRẦN THỊ DOÃN XUÂN. “Ảnh hưởng của một số hóa chất khử trùng trong
giai đoạn tạo mẫu cây và tác động của BA và 2,4-D trong giai đoạn nhân chồi in
vitro cây hoa thược dược (Dahlia variablis Desf)”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư
ngành Hoa Viên & Cây Cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng,
Trường Đại Học Cần Thơ. Cán bộ hướng dẫn: PGs. Ts. Lê Văn Hòa và Ths.
Nguyễn Văn Ây

TÓM LƯỢC
Thược dược là một loài hoa thuộc họ Cúc, đa dạng về chủng loại. Nhiều hình dáng

và kích thước, đặc biệt là nhiều màu sắc phong phú, thích hợp trồng ở nhiều nơi. Vì
thế đề tài “Ảnh hưởng của một số hóa chất khử trùng trong giai đoạn tạo mẫu cây
và tác động của BA và 2,4-D trong giai đoạn nhân chồi in vitro cây hoa thược dược
(Dahlia variablis Desf)” được thực hiện, bước đầu góp phần vào công tác nhân
giống cây hoa thược dược. Đề tài được thực hiện tại Phòng Nuôi cấy mô, Bộ môn
Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ. Thời
gian thực hiện từ tháng 11 năm 2010 đến tháng 5 năm 2011. Đề tài gồm hai thí
nghiệm được bố trí ngẫu nhiên một nhân tố. Kết quả thí nghiệm cho thấy: (i) Trong
giai đoạn tạo cấy ban đầu, có thể khử trùng mẫu Thược dược bằng dung dịch HgCl2
0,5‰ (20 phút) hoặc trong dung dịch HgCl2 1‰ (10 phút) cho tỷ lệ chồi in vitro
sạch và sống cao nhất, lần lượt là 53,33% và 52,22%; (ii) Chiều cao của chồi Thược
dược ở nghiệm thức MS + 1 mg/l BA kết hợp với 0,2 mg/l 2,4-D có kết quả tốt nhất
(1,63 cm sau 3 tuần nuôi cấy) so với các nghiệm thức còn lại; (iii) Số cặp lá hình
thành của mẫu chồi cây hoa Thược dược khi nuôi cấy.
Từ khóa: Cây hoa Thược dược, nuôi cấy mô, BA, 2,4-D, in vitro.

xi


Thành phần của môi trường môi cấy
Thành phần môi trường
Hóa chất
NH4NO3
KNO3
Đa lượng MS
MgSO4.7H2O
CaCl2
KH2PO4
H3PO4
MnSO4

ZnSO4.7H2O
Vi lượng
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
KI
FeSO4.7H2O
Fe-EDTA
Na2EDTA.2H2O
Nicotinic acid
Vitamin
Thiamin-HCl
Pyridoxin

xii

Hàm lượng (mg/l)
1650
1900
370
440
170
6,2
22,3
11,5
0,25
0,025
0,83
2,78
37,3
1

1
1


MỞ ĐẦU
Theo đà phát triển của xã hội, thú chơi hoa kiểng của con người đã trở
thành một nhu cầu cấp thiết và là thú vui tao nhã và phổ biến đối với mọi tầng
lớp. Hoa cảnh cũng có loại, nhiều giá cả khác nhau, phù hợp với khả năng của
từng người, nhất là vào dịp lễ tết, hoa kiểng lại càng không thể thiếu để trang
hoàng nhà cửa. Trong các loài hoa thì hoa Thược Dược cũng là một loại hoa
đẹp, nhiều màu sắc tươi sáng, khá dễ trồng, phù hợp với nhiều mục đích sử
dụng.
Song song đó với sự phát triển không ngừng của khoa học thì sự phát
tiển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật mang ý nghĩa to lớn. Nhờ kỹ
thuật này mà nhiều giống cây đã được bảo tồn và cải tạo mang lại nhiều bước
đột phá mời trong công tác giống cây trồng. Nuôi cấy mô là một công cụ nhân
giống tích cực so với các công cụ nhân giống truyền thống là tạo được cây sạch
bệnh, có hệ số nhân cao và thời gian sản xuất ngắn (Dương Công Kiên, 2007).
Theo Ngọc Hà (2011), hoa thược dược được nhân giống chủ yếu bằng
cách giâm cành, một số ít trồng từ củ, và gieo hạt chỉ áp dụng với nhóm hoa
thược dược cánh đơn. Vì thế phương pháp vi nhân giống in vitro hoa thược
dược cho phép nhân nhanh một số lượng lớn cây giống hoa thược dược kép
đồng nhất với giá thành hạ, có thể cung cấp cây giống cho các nhà trồng hoa
thương mại để phát triển trồng hoa trên diện rộng. Có thể sản xuất quanh năm,
góp phần trang trí cảnh quan đô thị, công viên, trưòng học, nhà ở,…
Vì thế, đề tài “Ảnh hưởng của một số hóa chất khử trùng trong giai đoạn
tạo mẫu cây và tác động của BA và 2,4-D trong giai đoạn nhân chồi in vitro cây
hoa Thược Dược (Dahlia variablis Desf)” được thực hiện nhằm tìm ra loại hoá
chất và thời gian khử mẫu hiệu quả nhất và môi trường bổ sung BA và 2,4-D
thích hợp cho giai đoạn nhân chồi in vitro cây hoa thược dược.

1


Chương 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1

Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây hoa Thược Dược
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Cây hoa Thược Dược có tên khoa học là Dahlia variablis Desf, thuộc họ
Cúc (Asteraceae). Tên khoa học của Thược Dược được lấy theo tên của
Andreas Dahl (1751-1798), nhà thực vật học Thụy Điển (Võ Văn Chi, 2003).
Thược Dược du nhập vào Tây Ban Nha từ năm 1788 rồi sang Pháp và
đuợc trồng chính thức tại Pháp năm 1979, từ đó được đem trồng ở nhiều nước
khác. Gồm 28 loài ở các vùng núi Châu Mỹ từ Mexico đến Colombia (Võ Văn
Chi, 2003).
1.1.2 Đặc điểm thực vật
Theo Võ Văn Chi (2003), cây hoa thược dược có một số đặc điểm thực
vật sau:
Rễ: hình thoi hay dạng củ, hợp thành bó ở cổ rễ, chứa đầy chất dự trữ
hydrocarbon (inulin).
Thân: rỗng, phân nhánh, nhẵn hay có lông tơ, cao 0,3-2 m hay hơn.
Lá: dạng lông chim không đều, có lá chét hình trái xoan, có răng, men
theo cuống, có khi nguyên hay xẻ lông chim, màu lục hay màu xanh lục đậm ở
mặt trên, nhạt màu ở mặt dưới, cuống lá rộng.
Hoa: tỏa tròn với cuống dài, đơn hay kép. Quả hình cầu, quả bế trần,
màu nâu đen.

Cây trồng chủ yếu bằng củ, ngọn và hạt. Các vườn hiện nay đã tạo ra
được rất nhiều dạng cây lai cho hoa có nhiều cánh môi hơn (loại hoa kép) và có
màu sắc độc đáo.
Theo Võ Văn Chi (2003) sơ bộ có thể chia hoa thành các dạng màu như
sau:
Thược Dược trắng có:
Trắng sữa: cây thắp hoa to, ít làm thành cụm hình đầu, đường kính 20-30
cm.
Trắng trong: cây cao, hoa to, làm thành cụm hình đầu, đường kính 15-20
cm.
2


Thược Dược vàng, gồm loại vàng đậm, vàng nhạt, cánh môi phẳng và
cuốn (như tai chuột).
Thược Dược đỏ, gồm loại đỏ tươi và đỏ thẵm.
Thược Dược nhung, có cánh môi đỏ đậm phớt đen.
Thược Dược cánh sen, có cánh môi màu hồng đậm, màu hồng nhạt.
Thược Dược vằn có cánh môi màu đỏ viền trắng.
Thược Dược vàng cam, cánh môi rộng, dài, màu da cam (Hình 1.1).
Thược Dược tím: cánh môi tím nhạt đến đậm bóng

Hình 1.1: Cây hoa Thược Dược có hoa màu vàng
1.1.3cam
Kỹ thuật trồng hoa thược dược
Theo Võ Văn Chi (2003) hoa Thược Dược tương đối dễ trồng, cây ưa
nắng nhưng lại thích khí hậu mát mẻ. Nhiệt độ trung bình không cao hơn 300C,
không thấp dưới 100C, độ ẩm 60-70%. Ở độ cao 800-1500 m, đất tốt, đủ phân
và thoát nước tốt thì cây phát triển tốt, hoa nhiều, màu đẹp. Cũng như các loại
cây họ cúc khác, thược dược cũng đòi hỏi nhiệt độ thấp và ánh sáng ngày ngắn

để ra hoa, nên thời vụ chủ yếu là đông xuân (Ngọc Hà, 2011).
3


Hoa thược dược được nhân giống chủ yếu bằng cách giâm cành, một số
ít trồng từ củ, và gieo hạt chỉ áp dụng với nhóm hoa thược dược cánh đơn
(Ngọc Hà, 2011). Nhân giống bằng phương pháp giâm cành là phương pháp
đơn giản, dể làm, không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, có thể tự sản xuất được cây
giống có chất lượng mà vẫn giữ được những đặc tính di truyền tốt của giống
(Ngọc Hà, 2011). Muốn cho cây ra hoa vào đúng dịp tết (từ tháng 11 năm nay
đến tháng 4 năm sau) thì người ta thường trồng cây con vào đầu tháng 10 âm
lịch rồi dựa và giống mà canh ngày bấm ngọn. Theo Ngọc Hà (2011) thì cần
lưu ý cách bấm ngọn, nếu bấm 1 búp và 1 đôi lá là bấm nông, còn bấm 1 búp và
2-3 đôi lá là bấm sâu. Bấm nông sẽ mau cho hoa hơn là bấm sâu, thường áp
dụng cho những năm thời tiết lạnh.
1.1.4 Giá trị kinh tế của cây hoa Thược Dược
Cây cho hoa đẹp, bền thích hợp để trồng trang trí trong công viên, công
trình đô thị, khu vui chơi giải trí. Bên cạnh đó hoa Thược Dược còn được trồng
nhiều trong các dịp tết phục vụ nhu cầu người tiêu dùng. Ở Mexico, hoa thược
dược còn được xem là quốc hoa.

1.2

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

Ở nước ta, nuôi cấy mô và tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) là một
ngành kỹ thuật còn non trẻ được phát triển mạnh và hoàn thiện từ những năm
60 của thế kỷ XX và đem lại nhiều ứng dụng (Nguyễn Như Hiền và Nguyễn
Như Ất, 2001).

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các nuôi cấy
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng
nhân tạo, trong điều kiện vô trùng (Nguyễn Quang Thạch và ctv., 2005). Qua
quá trình nghiên cứu và phát triển của các nhà khoa học trên thế giới, ngày nay
nuôi cấy mô đã có nhiều thành tựu đem lại hiệu quả cao cho con người. Theo
Nguyễn Văn Uyển (1999), thì khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thành công nhất
là lĩnh vực nhân giống và phục tráng giống. Nuôi cấy mô thực vật đã nhanh
chóng hoàn thiện và phát triển đến ngày nay và có nhiều đóng góp quan trọng
trong nông nghiệp, lâm nghiệp và nhiều lĩnh vực khác (Nguyễn Đức Thành,
2000).
1.2.2 Ưu điểm và khuyết điểm của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào
thực vật
Theo Lâm Ngọc Phương (2009) thì phương pháp nhân giống vô tính có
một số ưu nhược điểm như sau:
4


Ưu điểm
- Tỷ lệ nhân giống cao
- Số lượng chồi sinh trưởng lớn là vật liệu ban đầu trong năm so với các
phương pháp khác.
- Một số cây thân gỗ khó nhân giống bằng phương pháp giâm cành, chiết
hoặc ghép thì có thể nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
- Kỹ thuật vi nhân giống dễ dàng tạo được những dòng cây sạch bệnh.
- Vi nhân giống có thể phục tráng và trẻ hóa những dòng, nó có thể dễ
dàng nhân dòng bằng cách giâm cành hay các kỹ thuật thông dụng khác.
- Các phương pháp nuôi cấy mô là nền tảng cơ bản của công nghệ di
truyền.
- Có thể lập trình cho việc nuôi cấy suốt năm không lệ thuộc vào mùa
màng và thiết lập mối quan hệ trực tiếp về các vấn đề sinh lý với sự ngừng tăng

trưởng cây trồng.
Nhược điểm
- Phương pháp vi nhân giống tương đối đắc tiền hơn các phương pháp
nhân giống vô tính khác.
- Không phải loại cây nào cũng có thể vi nhân giống.
- Một số loài có thể biến dị di truyền hoặc không di truyền khi vi nhân
giống.
1.2.3 Các giai đoạn vi nhân giống
Đối với nhân giống vô tính trong ống nghiệm, qui trình nhân giống được
chia thành 4 giai đoạn sau (Lâm Ngọc Phương, 2009)
Giai đoạn I (Vô trùng mẫu cấy)
Mục đích của giai đoạn này là đạt được sự thành công trong cấy vô trùng
các loài thực vật muốn nhân giống. Kết quả thu được có thể là chồi thân lớn lên
hoặc các chồi thân rễ hoặc callus,... Đây là giai đoạn khởi đầu của vi nhân
giống nên cần phải có cây mẹ tốt, khoẻ. Vì vậy, cần phải lựa chọn cây mẹ cẩn
thận, chúng phải đặc trưng cho giống loài, không bị nhiễm bệnh và đang ở giai
đoạn tăng trưởng mạnh nhất, khi nhân giống sẽ đạt kết quả cao (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Theo Dương Công Kiên (2007), việc chọn vật liệu phụ thuộc vào
phương pháp nuôi cấy mô nhưng phổ biến là chọn đoạn thân mang chồi ngủ, vì
5


chọn vật liệu này sẽ có nhiều vật liệu để tiến hành nuôi cấy hơn là chồi ngọn.
Trong thời gian xử lý, mẫu cấy phải được ngập hoàn toàn trong môi trường diệt
khuẩn (đối với các bộ phận có nhiều bụi rác, trước khi xử lý nên rữa kỹ bằng
nước xà phòng và rửa sạch lại bằng nước máy). Khi xử lý xong, mô cấy được
rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu 3 lần). Những phần trên mô cấy
bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra, cần cắt bỏ trước khi đặt mô cấy vào môi
trường.

Để chọn lọc mẫu vật thích hợp trong nuôi cấy khởi đầu cần lưu ý một số
điểm sau:
- Chọn loại cơ quan và vị trí lấy mẫu ở cây.
- Tuổi và tình trạng sinh lý tối ưu của cơ quan.
- Mùa thích hợp để lấy mẫu vật.
- Phẩm chất của cây để lấy mẫu vật.
Để khử trùng mô thực vật người ta thường dùng một số chất hoá học
như: HgCl2, Ca(OCl)2, Na(OCl), H2O2… tuỳ thuộc từng loại mô thực vật mà
lựa chọn loại, nồng độ và thời gian xử lý hoá chất thích hợp (Nguyễn Xuân
Linh, 1998).
Giai đoạn II (Giai đoạn nhân giống)
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nhiều cây con theo ý muốn. Quá
trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ các hợp chất Auxin/Cytokinin
ngoại sinh được đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện
đó cũng cần phải quan tâm đến độ tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường các mô
non chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã
chuyên hoá sâu (Nguyễn Xuân Linh, 1998).
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), có 3 phương
pháp nhân chồi là phát sinh chồi bất định từ mô sẹo nhận được từ mô sinh vật
nuôi cấy, phát sinh chồi bất định trực tiếp từ mô sinh vật không thông qua mô
sẹo và phương pháp nhân chồi bên.
Giai đoạn III (Giai đoạn tạo rễ và tiền thuần dưỡng)
Trong vi nhân giống, sự tạo rễ ở một số đối tượng nhóm cây thân gỗ
thường khó giải quyết do đó theo quan điểm thực tế hiện nay nghiên cứu về sự
tạo rễ bất định rất quan trọng. Sự hiểu biết về tạo rễ, các khía cạnh của tạo cơ
quan bất định và ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Điều này
cho thấy sự tạo rễ ex vitro có thể được cải thiện nhiều bởi điều kiện tạo rễ in
vitro (Lâm Ngọc Phương, 2010)
6

Giai đoạn IV (Giai đoạn thuần dưỡng)
Theo Lâm Ngọc Phương (2009), sự thất bại trong giai đoạn này thường
có nhiều lý do khác nhau nhưng thông thường có 2 lý do chính:
Cây con sinh trưởng trong điều kiện ẩm độ cao, ánh sáng yếu, khí khẩu
không có khả năng đóng lại hoàn toàn khi thiếu nước nên cây con chết rất
nhanh trong môi trường tự nhiên bên ngoài.
Cây con nuôi trong môi trường có đường cao, ánh sáng yếu nên mất
hoặc yếu đi khả năng tự dưỡng.
Kiểm soát các yếu tố của môi trường là rất cần thiết. Giai đoạn trong
bình nuôi cấy có thể cải thiện quá trình thuần dưỡng bằng cách:
Làm giảm ẩm độ của môi trường xung quanh như mang các bình nuôi
cấy ra phòng tăng trưởng hoặc nơi có ẩm độ không khí thấp.
Nới nấp bình nuôi cấy để tăng sự trao đổi khí với môi trường xung
quanh. Có thể làm giảm ẩm độ không khí trong bình cấy.

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những chất có hoạt tính sinh học
lớn, được tạo ra một lượng rất nhỏ để điều hòa các quá trình sinh trưởng và
phát triển của thực vật. Dựa trên hoat tính của những chất này trong tự nhiên,
người ta chia làm hai nhóm chất: nhóm chất kích thích và nhóm chất ức chế
sinh trưởng (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
1.3.1 Auxin
Là các hợp chất kích thích sự giãn nở tế bào, sự hình thành mô sẹo và
tạo rễ bất định (Nguyễn Xuân Linh, 2008). Auxin hiện diện trong các tế bào
thực vật dưới nhiều hình thức khác nhau: auxin tự do, tiền auxin và auxin liên
kết (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Auxin thực vật thường tìm thấy
ở thực vật là indol-3-acetic acid (IAA). Trong kỹ thuật nuôi cấy mô auxin đóng
vai trò quan trọng trong việc kích thích phân chia tế bào và ra rễ.
Theo Nguyễn Đức Thành (2002), auxin có tác dụng làm tăng quá trình

hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzyme và ảnh hưởng mạnh
đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi
trường.
Trên cơ sở hoạt tính sinh học của auxin, ngành công nghiệp hóa chất đã
tổng hợp được các chất hóa học có tác dụng giống IAA. Các chất này được gọi
là auxin tổng hợp, chúng được sử dụng trong nông nghiệp có tác dụng điều hòa
sinh trưởng thực vật (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Theo Nguyễn
7


Văn Uyển và ctv. (1984) các chất điều hòa sinh trưởng gồm 2,4-D; NAA; IBA;
IAA thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô với nồng độ từ 0,1 đến 5
mg/l.
1.3.2 Cytokinin
Theo Đặng Phương Trâm (2001) mặt dù trong thực vật có nhiều nhóm
chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhưng chủ yếu là kiểm soát sự sinh trưởng
và phát triển như auxin và cytokinin. Chức năng chính của cytokinin là kích
thích sự phân chia tế bào. Ngoài ra, cytokinin còn kích thích pha dãn dài lẫn
pha chuyên hóa. Trong đó, BA và kinetin được sử dụng rộng rãi hơn cả. BA là
cytokinin tổng hợp nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin. Kinetin và BA cùng
có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế
bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào cũng như có tác dụng lên
quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein và làm tăng
cường hoạt tính của một số enzyme (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Khi có tác dụng của auxin ở các mức khác nhau, đối với các tế bào tách
rời (nuôi cấy mô) sự cân đối giữa auxin và cytokinin sẽ kích thích sự thành lập
callus, rễ chồi (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Tỷ lệ cytokinin và auxin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự
thành lập chồi và rễ. Một tỷ lệ cao cytokinin và auxin thấp thích hợp cho sự tạo
chồi, ngược lại tỷ lệ thấp cytokinin va auxin cao thích hợp cho việc tạo rễ, còn

mức độ trung gian thì thích hợp cho tạo mô sẹo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).

1.4

Các yếu tố khác
1.4.1 Nhóm khoáng đa lượng

Theo Lê Văn Hòa và ctv. (1999), khoáng đa lượng rất cần thiết cho cây
và có ành hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và không gây độc. Các
nguyên tố khoáng đa lượng cần phải cung cấp cho mô cấy là Nitrogen (N),
Phospho (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Lưu huỳnh (S).
Đối với cây trồng, nguồn chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng, nguồn nitrogen
thường được sử dụng dưới dạng NO3- và NH4+ với nồng độ thay đổi từ 3-6 mM,
thường vào khoảng 20 mM. Nitrit và amoniac ít được dùng vì ở nồng độ thấp
không đủ mà nồng độ cao thì gây độc. Một số acid amin như alanin, glutamic
acid, asparagic acid cũng được sử dụng như nguồn cung cấp nitơ. Tuy nhiên,
kết quả nghiên cứu cho thấy nếu chỉ dùng acid amin làm nguồn nitơ thì mô phát
triển rất yếu, acid amin phải được sử dụng cùng với nitrate thì mới cho kết quả
tốt (Nguyễn Đức Thành, 2000).

8


1.4.2 Nhóm khoáng vi lượng
Khoáng vi lượng là nhóm khoáng mà cây trồng cần một lượng rất ít, tuy
nhiên không thể thiếu cho quá trình sinh trưởng và phát triển. Vì thế, trong
công tác nuôi cấy mô chúng ta cũng cần phải bổ sung một lượng khoáng vi
lượng vào môi trường nuôi cấy để giúp mô hay tế bào thực vật có thể phát triển
tốt. Các loại khoáng vi lượng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy là
Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Molyden (Mo), Cobalt

(Co), Sắt (Fe).
Theo Nguyễn Văn Uyển (1993), trong nuôi cấy mô thường sử dụng sắt
vi lượng ở dạng phức hợp chelate (Fe-EDTA) vì ở dạng này sắt không bị tủa
mà được phóng thích từ từ vào môi trường nuôi cấy theo nhu cầu của mô thực
vật.
1.4.3 Vitamin
Theo Nguyễn Minh Chơn (2010), vitamin hay sinh tố là những phân tử
hữu cơ cần thiết cho hoạt động chuyển hóa bình thường của cơ thể sinh vật với
lượng rất nhỏ, nếu thiếu chúng sinh vật sẽ mắc phải một số bệnh sinh lý mà
những bệnh lý này không do các tác nhân bên ngoài gây ra. Trong môi trường
nuôi cấy đa số mô chưa có cấu trúc để tự tổng hợp đủ lượng vitamin cần thiết
nên cần phải bổ sung thêm vitamin bên ngoài vào (Lê Văn Hòa và ctv., 1999).
Các vitamin đóng vai trò như cofactor trong enzyme của tế bào (Nguyễn Xuân
Linh, 1998). Các vitamin thường được sử dụng nhiều trrong nuôi cấy mô là:
Thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Trong đó,
thiamine là một loại vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các
loại tế bào thực vật (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
1.4.4 Agar
Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), chất đông cứng để làm giá thể cho môi
trường nuôi cấy mô tế bào thực vật thường sử dụng là agar. Đó là một loại
polysacharide của tảo biển. Ở 800C thạch ngậm nước thành trạng thái lỏng,
nhưng ở 400C thì trở về trạng thái rắn. Do không phản ứng với các chất trong
môi trường nuôi cấy và không bị thủy phân bởi enzyme nên thường được sử
dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy
Tiên, 2002). Nồng độ agar thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô
thực vật là 0,5-10% (w/v) tùy theo chất lượng của chúng. Nếu nồng độ agar
cao, môi trường trở nên cứng, sự khuếch tán các chất dinh dưỡng cũng như sự
hấp thụ của mô sẽ gặp khó khăn (Bùi Bá Bổng, 1995).

9

1.4.5 Nước dừa
Theo Hoàng Đức Cự (2006) trong thành phần nước dừa có chứa các
nhân tố dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của mô thực vật,
nó không chỉ giàu acid amin và các hợp chất nitơ khử cần thiết mà còn chứa
cytokinin. Lượng nước dừa trong môi trường nuôi cấy khá lớn chiếm 10-20%
thể tích môi trường. Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện nay đã được chứng
minh là myo-inositol và một số amino acid khác, tốt nhất là nên sử dụng nước
dừa tươi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thủy Tiên, 2002).
1.4.6 Giá trị pH
Theo Nguyễn Đức Thành (2002) giá trị pH của môi trường cũng là một
trong những yếu tố quan trọng trong quá trình nuôi cấy mô. Sự ổn định pH môi
trường là yếu tố duy trì sự trao đổi chất trong tế bào. Giá trị pH ảnh hưởng đến
khả năng hòa tan các ion trong môi trường khoáng, khả năng đông agar và sự
tăng trưởng của tế bào.

10


Chương 2
PHƯƠNG TIỆN & PHƯƠNG PHÁP

2.1

Địa điểm và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Nuôi
cấy mô, Bộ môn Sinh lý - Sinh hóa, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD, Trường Đại
học Cần Thơ. Thời gian thực hiện từ tháng 11 năm 2010 đến tháng 5 năm 2011.

2.1.2 Đối tượng thí nghiệm: chồi non cây hoa thược dược (Hình 2.1)
không sâu bệnh và phát triển tốt được chăm sóc trong nhà lưới của Bộ môn
Sinh lý - Sinh hóa, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ.

Hình 2.1 Cành để lấy mẫu cấy (a) và các mẫu cấy của
cây hoa Thược dược trong giai đoạn tạo mẫu (b)

2.2

Phương tiện
2.2.1 Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị cần sử dụng: tủ sấy, nồi hấp khử trùng, microwave, máy đo
pH, cân phân tích, tủ cấy,…
Các dụng cụ: kẹp, dao, kéo, bông gòn, ống đong, đũa thủy tinh,
micropipette, keo, lọ, ca,...
Điều kiện thí nghiệm: phòng nuôi cấy mô có điều kiện nhiệt độ là
26±2 C, cường độ chiếu sáng là 1.500 lux, thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày.
0

11