KHẢO sát TÍNH CHẤT gây BỆNH và đáp ỨNG MIỄN DỊCH của VIRUS VIÊM não NHẬT bản CHỦNG CTMP 7 TRÊN CHUỘT BẠCH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRẦN THỊ THÙY TRANG

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT GÂY BỆNH VÀ ĐÁP ỨNG
MIỄN DỊCH CỦA VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN
CHỦNG CTMP-7 TRÊN CHUỘT BẠCH

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: BÁC SĨ THÚ Y

Cần Thơ, 5/2009


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: BÁC SĨ THÚ Y

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT GÂY BỆNH VÀ ĐÁP ỨNG
MIỄN DỊCH CỦA VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN
CHỦNG CTMP-7 TRÊN CHUỘT BẠCH

Cán bộ hướng dẫn
TS. HỒ THỊ VIỆT THU

Sinh viên thực hiện
TRẦN THỊ THÙY TRANG
MSSV: 3042845

Lớp Thú Y K30

Cần Thơ, 5/2009


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y


Đề tài: “Khảo sát tính chất gây bệnh và đáp ứng miễn dịch của virus viêm
não Nhật Bản chủng CTMP-7 trên chuột bạch” do sinh viên Trần Thị Thùy Trang
thực hiện tại trại thực nghiệm và phòng thí nghiệm bệnh truyền nhiễm, bộ môn Thú y,
khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ từ tháng 2 đến
tháng 5 năm 2009.

Cần Thơ, ngày tháng
Duyệt Bộ môn

năm 2009

Cần Thơ, ngày tháng năm 2009
Duyệt Giáo viên hướng dẫn

Hồ Thị Việt Thu

Cần Thơ, ngày tháng năm 2009
Duyệt Khoa Nông nghiệp và SHƯD

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những kết quả trình bày trong luận văn này là nghiên cứu của
bản thân tôi. Tất cả số liệu và kết quả hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây.
Tác giả luận văn

Trần Thị Thùy Trang

iii


LỜI CẢM TẠ
Qua 3 tháng thực hiện đề tài đã đạt được những kết quả như mong muốn.
Những thành tựu có được ngày hôm nay chính là nhờ sự giúp đỡ của gia đình, thầy cô
và bạn bè.
Chân thành cảm ơn quý thầy cô bộ môn Thú y - những người đã tận tình truyền
đạt những kinh nghiệm thực tiễn quý báu cho tôi làm hành trang vào đời.
Chân thành cảm ơn cô Hồ Thị Việt Thu - người đã tận tình hướng dẫn và truyền
đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn chị Huỳnh Ngọc Trang và các anh, chị trong phòng thí
nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong các thao tác thí nghiệm và tạo mọi điều kiện
thuận lợi để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này.
Xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người thân và bạn bè tôi, những người luôn bên
tôi và đã hết lòng vì hạnh phúc của tôi.

Trần Thị Thùy Trang

iv


MỤC LỤC
Trang tựa......................................................................................................................................i
Trang duyệt ................................................................................................................................. ii
Lời cam đoan ............................................................................................................................. iii
Lời cảm tạ .................................................................................................................................. iv
Mục lục ....................................................................................................................................... v
Danh mục bảng ......................................................................................................................... vii
Danh mục hình......................................................................................................................... viii
Danh sách chữ viết tắt................................................................................................................ ix
Tóm lược..................................................................................................................................... x
Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1
Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN ..................................................................................................... 2
2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN ........................................................ 2
2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ............................................ 2
2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước .............................................................................. 2
2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước............................................................................... 3
2.3 TÁC NHÂN GÂY BỆNH ................................................................................................ 4
2.3.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc .................................................................................. 4
2.3.2 Đặc điểm lý hóa ......................................................................................................... 5
2.3.3 Đặc tính nuôi cấy và sự nhân lên của virus ............................................................... 5
2.4 DỊCH TỄ HỌC ................................................................................................................. 7
2.4.1 Phân bố địa lí và tính chất mùa của bệnh................................................................... 7
2.4.2 Phân bố bệnh theo tuổi và giới tính ........................................................................... 8
2.4.3 Trung gian truyền bệnh.............................................................................................. 8
2.4.4 Chu trình truyền virus viêm não Nhật Bản trong tự nhiên ........................................ 8
2.5 SINH BỆNH HỌC............................................................................................................ 9
2.6 MIỄN DỊCH HỌC .......................................................................................................... 10

2.7 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH ................................................................................ 10
2.7.1 Triệu chứng .............................................................................................................. 10
2.7.2 Bệnh tích .................................................................................................................. 11
2.8 CHẨN ĐOÁN................................................................................................................. 11
2.8.1 Chẩn đoán phân biệt................................................................................................. 11
2.8.2 Phân lập virus........................................................................................................... 11
2.8.3 Chẩn đoán huyết thanh học...................................................................................... 12
2.9 ĐIỀU TRỊ ....................................................................................................................... 12
2.10 PHÒNG BỆNH............................................................................................................. 12
2.10.1 Phòng chống vectơ truyền bệnh............................................................................. 12
2.10.2 Tiêm phòng ............................................................................................................ 13

v


Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .......................................... 14
3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM..................................................................................... 14
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài..................................................................... 14
3.1.2 Đối tượng thí nghiệm ............................................................................................... 14
3.1.3 Nội dung thí nghiệm ................................................................................................ 14
3.1.4 Vật liệu thí nghiệm................................................................................................... 14
3.2 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ............................................................. 15
3.2.1 Phương pháp nuôi chuột thí nghiệm ........................................................................ 15
3.2.2 Tính LD50 trên chuột ổ 1 tuần tuổi........................................................................... 15
3.2.3 Thí nghiệm trên chuột trưởng thành 3 tháng tuổi .................................................... 16
3.2.4 Phương pháp xét nghiệm huyết thanh...................................................................... 16
3.3 CHỈ TIÊU THEO DÕI.................................................................................................... 19
3.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU............................................................................... 19
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 20
4.1 TÍNH GÂY BỆNH CỦA VIRUS VNNB CHỦNG CTMP-7 TRÊN CHUỘT Ổ 1 TUẦN

TUỔI..................................................................................................................................... 20
4.2 TÍNH GÂY BỆNH VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VIRUS VNNB CHỦNG CTMP7 TRÊN CHUỘT 3 THÁNG TUỔI...................................................................................... 24
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 29
5.1 KẾT LUẬN..................................................................................................................... 29
5.2 ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................................ 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 30

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm tính LD50 trên chuột 1 tuần tuổi .................................................... 15
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm trên chuột 3 tháng tuổi .................................................................. 16
Bảng 4.1 Kết quả LD50 trên chuột ổ 1 tuần tuổi ....................................................................... 20
Bảng 4.2 Tỷ lệ chuột chết theo thời gian sau khi tiêm virus VNNB ........................................ 21
Bảng 4.3 Triệu chứng trên chuột sau khi tiêm virus VNNB .................................................... 21
Bảng 4.4 Bệnh tích đại thể trên chuột sau khi tiêm virus VNNB............................................. 22
Bảng 4.5 Triệu chứng của chuột sau khi tiêm virus VNNB ..................................................... 24
Bảng 4.6 Hiệu giá kháng thể trung bình kháng virus VNNB trên các đường tiêm theo thời gian
.................................................................................................................................................. 25
Bảng 4.7 Hiệu giá kháng thể trung bình kháng virus VNNB theo đường tiêm........................ 26
Bảng 4.8 Hiệu giá kháng thể trung bình kháng virus VNNB theo giới tính............................. 27
Bảng 4.9 Tỷ lệ phần trăm của từng hiệu giá kháng thể ............................................................ 28

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Mô hình cấu trúc Flavivirus......................................................................................... 4
Hình 2.2 Cấu trúc gen và protein của virus viêm não Nhật Bản ................................................ 5

Hình 2.3 Sự nhân lên của virus viêm não Nhật Bản trong tế bào............................................... 6
Hình 2.4 Bản đồ phân bố bệnh viêm não Nhật Bản ................................................................... 7
Hình 2.5 Muỗi Culex tritaeniorhynchus ..................................................................................... 8
Hình 2.6 Muỗi Culex fatigans..................................................................................................... 8
Hình 2.7 Chu trình truyền virus viêm não Nhật Bản trong tự nhiên .......................................... 9
Hình 3.1 Chuột thí nghiệm được đặt trong mùng ..................................................................... 15
Hình 4.1 Chuột co giật .............................................................................................................. 22
Hình 4.2 Chuột chạy hoảng loạn .............................................................................................. 22
Hình 4.3 Màng não tích nước ................................................................................................... 23
Hình 4.4 Tích nước xoang ngực và xoang bụng....................................................................... 23
Hình 4.5 Não xuất huyết ........................................................................................................... 23
Hình 4.6 Phổi và tim sung huyết............................................................................................... 24
Hình 4.7 Phổi xuất huyết .......................................................................................................... 24
Hình 4.8 Hiệu giá kháng thể trung bình kháng virus VNNB trên các đường tiêm theo thời gian
.................................................................................................................................................. 25
Hình 4.9 Hiệu giá kháng thể trung bình kháng virus VNNB theo đường tiêm ........................ 26
Hình 4.10 Hiệu giá kháng thể trung bình kháng virus VNNB theo giới tính ........................... 27
Hình 4.11 Tỷ lệ phần trăm của từng hiệu giá kháng thể ........................................................... 28

viii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
BABS
DGV
DNA
GMT
HA
HI
LD50

Mac-ELISA
PBS
prM
RNA
VAD
VNNB

Bovalbumine buffered saline
Dextrose – Gelatine – Veronal
Desoxyribonucleic acid
Geometric mean titer
Haemagglutination
Haemagglutination inhibition
Lethal dose 50%
IgM antibody capture enzyme linked immunosorbent assay
Phosphate buffered saline
precursor membrane
Ribonucleic acid
Virus adjusting diluent
Viêm não Nhật Bản

ix


TÓM LƯỢC
Đề tài “Khảo sát tính chất gây bệnh và đáp ứng miễn dịch của virus viêm
não Nhật Bản chủng CTMP-7 trên chuột bạch” được thực hiện nhằm tìm hiểu tính
chất gây bệnh của virus viêm não Nhật Bản trên chuột ổ 1 tuần tuổi và chuột trưởng
thành 3 tháng tuổi. Mục tiêu của đề tài là tính LD50 trên chuột ổ 1 tuần tuổi, khảo sát
triệu chứng và bệnh tích trên cả hai đối tượng chuột ổ và chuột trưởng thành, đồng thời

khảo sát đáp ứng kháng thể trên chuột trưởng thành. Trong thời gian thực hiện đề tài,
chúng tôi ghi nhận được các kết quả sau: trong 0,02ml huyễn dịch virus chứa 104,75
LD50 trên chuột ổ 1 tuần tuổi, triệu chứng phổ biến trên chuột ổ 1 tuần tuổi là run chân
và dựng lông, bệnh tích chiếm tỷ lệ cao là não tích nước, não xuất huyết và tích nước
xoang bụng; Đối với chuột trưởng thành 3 tháng tuổi với liều tiêm 200LD50 không gây
bệnh cho chuột, đáp ứng kháng thể trên chuột 3 tháng tuổi cao nhất ở đường tiêm bắp
thịt và thấp nhất ở đường tiêm dưới da, hiệu giá kháng thể trung bình trên chuột đực
cao hơn so với chuột cái, kháng thể tồn tại trong 1 tháng.

x


Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh viêm não Nhật Bản là bệnh truyền nhiễm chung của người và động vật
được lây truyền bởi nhân tố trung gian là muỗi. Bệnh gây viêm não ở người và cũng là
nguyên nhân gây thất bại sinh sản trên heo (Raghava và ctv, 2002; Chu và Joo, 1999).
Trong tự nhiên có nhiều loài động vật cảm nhiễm và đồng thời là nguồn cung cấp virus
cho muỗi để lan truyền mầm bệnh (Vaughn và Hoke, 1992), heo được xem là động vật
cảm nhiễm cao nhất và là ký chủ chính cho sự nhân lên của virus viêm não Nhật Bản
trong tự nhiên. Bệnh viêm não Nhật Bản hiện đang là vấn đề đáng quan tâm ở nhiều
nước châu Á (Solomon và ctv, 2000).
Năm 2006, Hồ Thị Việt Thu và cộng sự đã phân lập được chủng virus gây bệnh
viêm não Nhật Bản (CTMP-7) trên muỗi tại thành phố Cần Thơ. Nhằm tìm hiểu tính
chất gây bệnh của chủng virus này trên chuột ổ và chuột trưởng thành, chúng tôi thực
hiện đề tài: “Khảo sát tính chất gây bệnh và đáp ứng miễn dịch của virus viêm não
Nhật Bản chủng CTMP-7 trên chuột bạch” với mục tiêu:
- Tính liều gây chết 50% trên chuột bạch (lethal dose - LD50 ).
- Theo dõi triệu chứng và khảo sát bệnh tích đại thể trên chuột bạch.
- Khảo sát đáp ứng kháng thể trên chuột bạch trưởng thành.

1


Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN
Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh nhiễm trùng cấp tính do Flavivirus
gây ra. Bệnh lưu hành ở nhiều nước châu Á và là nguyên nhân gây viêm não cấp tính ở
người (Lin và ctv, 1998). Mỗi năm trên thế giới có khoảng 50.000 ca bệnh và 15.000
người tử vong do virus viêm não Nhật Bản gây ra (Solomon và ctv, 2000), 50% số
bệnh nhân sống sót bị di chứng thần kinh suốt đời để lại gánh nặng cho gia đình và xã
hội (Monath, 2002). Có nhiều loài vật nuôi cảm nhiễm với virus viêm não Nhật Bản
như heo, ngựa, lừa, trâu, bò, chó, gà, vịt (Huang, 1982). Trong đó, heo và chim được
xem là vật chủ quan trọng cho sự khuếch đại virus (Endy và Nisalak, 2002).
2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Năm 1934, virus viêm não Nhật Bản được phân lập từ não bệnh nhân chết do
viêm não, virus này được xem như chủng virus mẫu của virus viêm não Nhật Bản và
được đặt tên là Nakayama (Mitamura và ctv, 1936).
Năm 1981, Mathur và cộng sự đã thí nghiệm tiêm truyền virus viêm não Nhật
Bản qua đường phúc mạc của chuột mang thai. Khi gây nhiễm vào tuần đầu tiên của
thời kỳ mang thai, virus tác động gây chết thai và chết chuột sơ sinh (66%) cao hơn so
với gây nhiễm vào tuần thứ 3 của thời kỳ mang thai (13,8%) (Mathur và ctv, 1981).
Năm 1982, Mathur và cộng sự đã chứng minh có thể phân lập được virus từ bào
thai khi tiêm truyền cho chuột mang thai qua đường phúc mạc (Mathur và ctv, 1982).
Năm 1983, Chaturvedi và cộng sự khảo sát vai trò của kháng thể và khả năng
sinh miễn dịch qua trung gian tế bào kháng lại sự nhiễm virus viêm não Nhật Bản trên
chuột trưởng thành. Kháng thể đạt được sau 4-5 tuần không đủ khả năng bảo hộ cho
chuột, mặc dù hiệu giá kháng thể trung hòa cao (Chaturvedi và ctv, 1983).
Năm 1986, Mathur và cộng sự tiếp tục thí nghiệm trên chuột mang thai. Sau khi
tiêm truyền virus viêm não Nhật Bản cho con cái mang thai qua đường phúc mạc, sự

nhiễm virus ở thể ẩn xảy ra trên cả chuột mẹ và chuột con (Mathur và ctv, 1986).
Năm 1996, Krishna và cộng tác viên đã thí nghiệm cấy truyền lympho bào T
gây độc tế bào của virus viêm não Nhật Bản với liều gây chết cho phép qua đường tiêm
xoang não. Kết quả cho thấy trên chuột trưởng thành có kháng thể bảo hộ với virus
viêm não Nhật Bản trong khi đó ở chuột 4 ngày tuổi và chuột 8-14 ngày tuổi thì không
được bảo hộ (Krishna và ctv, 1996).

2


Năm 1998, Lin và cộng sự đã khảo sát đáp ứng miễn dịch trên chuột bằng cách
tiêm DNA plasmid được mã hóa bởi glycoprotein của virus viêm não Nhật Bản có
chứa protein prM (precursor membrane) kết hợp protein E (envelope) và protein không
cấu trúc NS1 qua đường bắp thịt. Kết quả chuột được tiêm DNA plasmid có chứa
protein NS1 có tỷ lệ sống sót (90%) cao hơn so với chuột được tiêm DNA plasmid có
chứa prM kết hợp protein E (70%) (Lin và ctv, 1998).
Năm 2003, Chuang và cộng tác viên đã thực hiện xét nghiệm virus viêm não
Nhật Bản trong tế bào đơn nhân ở máu ngoại vi chuột bằng xét nghiệm RT-PCR. Kết
quả tìm thấy virus trong máu chuột vào ngày thứ nhất và ngày thứ 3, nhưng không tìm
thấy virus vào ngày thứ 5 sau khi tiêm virus viêm não Nhật Bản qua đường tĩnh mạch,
virus chỉ hiện diện trong máu chuột 2-3 ngày sau khi tiêm (Chuang và ctv, 2003).
2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 1953, Puyuelo và Prévot đã báo cáo về việc phân lập được virus viêm não
Nhật Bản trong quân đội viễn chinh Pháp và virus này được định loại ở Tokyo (trích
dẫn Đỗ Quang Hà và Đoàn Xuân Mượu, 1965).
Năm 1960, có 4 chủng virus viêm não Nhật Bản được phân lập trong đó có 3
chủng từ não bệnh nhân và 1 chủng từ não chim liếu điếu là HN-51, HN-59, HN-60,
LĐ-68 (Đỗ Quang Hà và Đoàn Xuân Mượu, 1965).
Từ năm 1975-1988, có 12 chủng virus viêm não Nhật Bản được phân lập từ
muỗi thu thập ở tỉnh Bắc Thái và thành phố Hồ Chí Minh (Vu Thi Que Huong và ctv,

1993).
Năm 1990-1992, Huỳnh Phương Liên đã nghiên cứu thành công việc sản xuất
vaccine viêm não Nhật Bản trên não chuột từ chủng Nakayama (Huỳnh Phương Liên
và ctv, 1990-1992).
Năm 2001-2002, có 5 chủng virus viêm não Nhật Bản được phân lập trong đó
có 3 chủng từ muỗi và 2 chủng từ máu heo (Phan Thi Nga và ctv, 2004).
Năm 2006, Hồ Thị Việt Thu và cộng tác viên đã phân lập được một chủng virus
viêm não Nhật Bản trên muỗi Culex pseudovishnui tại thành phố Cần Thơ và đặt tên là
CTMP-7 (Hồ Thị Việt Thu và ctv, 2006).

3


2.3 TÁC NHÂN GÂY BỆNH
2.3.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc
Virus viêm não Nhật Bản được xếp vào chi Flavivirus, chi duy nhất của họ
Flaviviridae. Có trên 60 loài Flavivirus nhưng chỉ có 3 loài có ý nghĩa trong thú y:
virus gây bệnh viêm não Nhật Bản, virus gây bệnh Louping và virus gây bệnh
Wesselsbron (Chu và Joo, 1992).

Hình 2.1 Mô hình cấu trúc Flavivirus

( />Virus qua lọc, có dạng hình cầu, có vỏ, đường kính khoảng 40nm, nhân chứa
một chuỗi ribonucleic acid đơn dương được bao bọc bởi capsid có 20 mặt. Chuỗi
nucleotide hoàn chỉnh của virus gồm 10.976 nucleotide tương ứng với 3.432 gốc amino
acid (Sumiyoshi và ctv, 1987). Nhân và capsid được bao bọc bởi lớp đôi lipid chứa
protein E và M (Kurane, 2002). Virus có ba protein cấu trúc và nhiều protein không
cấu trúc. Những protein cấu trúc gồm có glycoprotein E (54kDa) của vỏ, protein vỏ
không có glycosylate M (8kDa) và protein capsid C (14kDa). Protein E của vỏ có
những quyết định kháng nguyên (epitope) gây đáp ứng kháng thể trung hòa. Protein E

có ít nhất 8 quyết định kháng nguyên, một ở vị trí N biểu thị tính đặc hiệu của virus
(Kimura-Kuroda và Yasui, 1986). Hai protein của vỏ E và M kết hợp với nhau hình
thành những đầu nhọn (small spikes) khoảng 6nm trên bề mặt vỏ. Protein M tồn tại
như protein prM (precursor membrane) trước khi có sự giải phóng virion trưởng thành
từ tế bào nhiễm bệnh. Những protein không cấu trúc bao gồm NS1, 2A, 2B, 3, 4A, 4B,
5. Protein E và NS1 có liên quan tới khả năng sinh miễn dịch của virus (Kurane, 2002).

4


Protein cấu trúc của virus được mã hóa ở đầu 5’ của bộ gen, còn protein không cấu trúc
được mã hóa ở đầu 3’. Bộ gen mã hóa cho polyprotein được phân cắt trong suốt và sau
quá trình dịch mã bởi enzyme protease của virus và của tế bào (Platt và Joo, 2006).

Hình 2.2 Cấu trúc gen và protein của virus viêm não Nhật Bản

( />2.3.2 Đặc điểm lý hóa
Virus không bền trong môi trường và dễ dàng bị bất hoạt bởi các chất sát trùng.
Virus nhạy cảm với ether, chloroform, desoxycholate natri, những enzyme phân giải
protid hoặc lipid. Ở 56oC virus bị bất hoạt sau 30 phút, virus thích hợp ở pH=8,5 (Chu
và Joo, 1999). Virus tồn tại lâu ở nhiệt độ lạnh -70oC, ở 0oC virus sống được 3 tuần
(Merchant và Packer, 1967).
2.3.3 Đặc tính nuôi cấy và sự nhân lên của virus
Virus có thể nhân lên và gây bệnh tích trên nhiều loại tế bào ký chủ như các tế
bào nguyên phát và nhiều dòng tế bào từ động vật hữu nhũ bao gồm tế bào Vero, tế
bào BMK-21 (baby monkey kidney), tế bào BHK-21(baby hamster kidney) và nguyên
bào sợi chuột nhắt L-M. Những tế bào có nguồn gốc từ muỗi cũng thường được dùng
để nuôi cấy virus như dòng tế bào C6/36 từ ấu trùng Aedes albopictus và dòng tế bào
từ phôi Aedes aegypti (Kedarnath và ctv, 1987).
Sự nhân lên của virus viêm não Nhật Bản trong tế bào gồm các giai đoạn sau:

Hấp phụ và xâm nhập: virus di chuyển trong dịch gian bào để đến bám vào thụ
thể của tế bào, sau đó xâm nhập vào tế bào theo cơ chế nhập bào.
5


Tổng hợp các thành phần: sau khi cởi vỏ, RNA chuỗi dương vừa được dùng để
tổng hợp protein sớm nhờ enzyme RNA-polymerase, vừa làm khuôn để tổng hợp RNA
chuỗi âm nhờ RNA-polymerase phụ thuộc RNA để tạo thành dạng sao chép RF
(reading frame), từ đó tổng hợp RNA dương theo nguyên tắc bán bảo tồn. Đây là
genome mới của virus. Sự tổng hợp RNA xảy ra trong tế bào chất. Các RNA mới tạo
thành được dùng làm mRNA để tổng hợp protein cấu trúc.
Quá trình lắp ráp và hoàn thiện virion diễn ra ở màng sinh chất, capsid hình khối
đa diện bên trong chứa một chuỗi RNA. Các virion tạo thành nằm trong các nang của
lưới nội chất.
Giải phóng: sau khi lắp ráp thành virion hoàn chỉnh, chúng tiến sát màng sinh
chất, phá vỡ tế bào để chui ra ngoài rồi lại tiếp tục chu kỳ nhân lên ở tế bào mới (Phạm
Văn Ty, 2001).

Hình 2.3 Sự nhân lên của virus viêm não Nhật Bản trong tế bào

( />
6


2.4 DỊCH TỄ HỌC
2.4.1 Phân bố địa lí và tính chất mùa của bệnh
Bệnh xảy ra ở hầu hết các nước châu Á như Ấn Độ, Nepal, Sri Lanka, Burma,
Lào, Campuchia, Việt Nam, Malaysia, Singapore, Philippines, Indonesia, Trung Quốc,
Siberia, Hàn Quốc, Nhật Bản (Vaughn và Hoke, 1992). Chu trình truyền virus viêm
não Nhật Bản ở những vùng nhiệt đới diễn ra quanh năm. Ở những nơi dịch bệnh theo

mùa xảy ra, dịch bệnh thường bắt đầu vào mùa mưa khi mật độ muỗi cao nhất.
Ở Lào, Campuchia, Việt Nam, Nam Ấn Độ, Bắc Trung Quốc bệnh xảy ra từ
tháng 5 đến tháng 10. Ở Nepal, Bắc Ấn Độ bệnh xảy ra từ tháng 7 đến tháng 12. Ở các
nước như Malaysia và Singapore bệnh xảy ra rải rác quanh năm (Raghava và ctv,
2002). Ở miền Bắc Việt Nam bệnh tăng vào những tháng hè, trong khi ở miền Nam
bệnh xảy ra vào những tháng mưa nhiều (Vaughn và Hoke, 1992).

Hình 2.4 Bản đồ phân bố bệnh viêm não Nhật Bản

( />
7


2.4.2 Phân bố bệnh theo tuổi và giới tính
Phân bố bệnh theo độ tuổi thay đổi theo từng vùng. Về lý thuyết, trẻ em từ 1-3
tuổi có nguy cơ mắc bệnh cao so với các nhóm tuổi khác do mất kháng thể truyền từ
mẹ, nhưng thực tế trẻ em từ 3-6 tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn do trẻ thường chơi đùa
bên ngoài lúc trời tối nên dễ bị muỗi đốt. Trong khi Culex tritaeniorhynchus là loài
muỗi thích hút máu ở bên ngoài (Huang, 1982). Ở người từ 14 tuổi trở lên, mức độ tấn
công của bệnh giảm do tăng tần số trung hòa kháng thể ở độ tuổi này từ sự phơi nhiễm
tự nhiên và sự xâm nhiễm cận lâm sàng (Hoke và ctv, 1992).
Bệnh không liên quan đến giới tính, nam và nữ chưa có miễn dịch đều có khả
năng mắc bệnh như nhau (Phoon và Lim, 1963). Tuy nhiên, trên thực tế nam có tỷ lệ
bệnh nhiều hơn nữ (Võ Công Khanh, 2005).
2.4.3 Trung gian truyền bệnh
Muỗi Culex tritaeniorhynchus, Cx. gelidius và Cx. pseudovishnui là những
vectơ chính cho sự nhân lên và lan truyền virus viêm não Nhật Bản ở nhiều nước châu
Á (Endy và Nisalak, 2002; Center for Health Protection, 2004). Ở Việt Nam, virus
viêm não Nhật Bản cũng đã được phân lập từ các loài muỗi Cx. tritaeniorhynchus, Cx.
gelidius, Cx. fatigans, Aedes aegypti, Ae. diemmaccus (Vu Thi Que Huong và ctv,

1993).

Hình 2.5 Muỗi Culex tritaeniorhynchus

Hình 2.6 Muỗi Culex fatigans

( />2.4.4 Chu trình truyền virus viêm não Nhật Bản trong tự nhiên
Chu trình lây truyền và duy trì virus trong tự nhiên dựa vào sự lây truyền giữa
các loài động vật có xương sống qua trung gian truyền bệnh là muỗi. Heo và chim
được xem là ký chủ khuếch đại virus vì ở heo và chim có nồng độ virus huyết cao, đây
là nguồn cung cấp virus cho muỗi để truyền sang người và các động vật khác. Người
và ngựa được xem là ký chủ tử vong cuối cùng của virus viêm não Nhật Bản vì nồng
8


độ virus huyết ở người và ngựa không đủ để cung cấp cho muỗi tiếp tục gây nhiễm.
Các loài động vật như chuột, dơi, rắn, ếch cũng cảm nhiễm với virus nhưng vai trò của
những ký chủ này trong sự lan truyền mầm bệnh vẫn chưa được biết (Endy và Nisalak,
2002).

Hình 2.7 Chu trình truyền virus viêm não Nhật Bản trong tự nhiên

( />2.5 SINH BỆNH HỌC
Heo bị nhiễm virus qua vết đốt của muỗi có mang virus. Ở heo bị nhiễm virus sẽ
phát triển virus huyết. Thời gian nhiễm virus huyết ở heo kéo dài từ 12 giờ đến vài
ngày. Virus lan tỏa đến gan, lách và cơ, virus nhân lên làm tăng virus huyết. Virus vào
hệ thần kinh trung ương qua dịch não tủy, tế bào nội bì, đại thực bào, tế bào lympho bị
nhiễm virus hoặc theo đường máu. Ở người và chuột, virus tấn công và phá hủy tế bào
thần kinh một cách chọn lọc, phá hủy hầu hết các phần của não như cuống não, đồi thị,
hạch đáy não và lớp dưới vỏ não (Johnson, 1987).

Ở muỗi, virus nhân lên ở thể thực bào và những tế bào huyết tương của thể mỡ
(fat body) trong 2 ngày đầu sau khi nhiễm virus (Johnson, 1987). Virus đi đến nhiều cơ
quan sau đó đi vào hệ thần kinh trung ương vào ngày thứ 4 sau khi nhiễm virus, 1-2
ngày sau virus hiện diện ở tuyến nước bọt của muỗi (Leake và Johnson, 1987).
Đại thực bào có vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh của bệnh. Sau khi
tiêm truyền virus cho chuột bạch qua đường phúc mạc, virus phát triển trước tiên trong
các đại thực bào phúc mạc, sau 3 ngày virus phát triển trong các đại thực bào lách của
vùng trước thể lách (prefollicular). Virus xâm nhập và nhân lên trong các đại thực bào

9


và tế bào lympho T. Đại thực bào cũng có vai trò quan trọng trong sự phát triển bệnh ở
thể tiềm ẩn (Chu và Joo, 1999).
Sau khi tiêm truyền virus viêm não Nhật Bản cho chuột mang thai qua đường
phúc mạc, sự nhiễm virus ở thể ẩn xảy ra trên cả chuột mẹ và chuột con (Mathur và
ctv, 1986).
Ở heo mang thai, khi tiêm virus qua đường tĩnh mạch, virus được phát hiện ở
thai sau 7 ngày gây nhiễm (Shimizu và ctv, 1954).
Ở người, virus từ nước bọt của muỗi đốt, qua da. Giai đoạn đầu virus nhân lên
tại chỗ và ở hạch lympho vùng, đây là nguồn dẫn đến virus huyết đầu tiên. Từ máu
virus đi đến các tổ chức và nội tạng khác như tổ chức lympho, mô liên kết, cơ vân, cơ
tim, tuyến nội và ngoại tiết. Virus tiếp tục nhân lên tại tổ chức ngoài thần kinh đưa đến
virus huyết lần nữa kéo dài 3-5 ngày với nồng độ thấp. Nếu kháng thể trung hòa tăng
kịp thời thì hiện tượng virus huyết dừng lại. Cơ chế xâm nhập hệ thần kinh trung ương
của virus vẫn chưa được biết nhưng não bộ bị nhiễm lan tỏa chứng tỏ virus xâm nhập
qua đường mạch máu (Võ Công Khanh, 2005).
2.6 MIỄN DỊCH HỌC
Kháng thể IgM được tạo ra rất sớm sau khi nhiễm virus 2-3 ngày và giảm dần
sau 2 tuần (Burke và ctv, 1985). Khi gây nhiễm virus trên heo, hiệu giá kháng thể đạt

320 vào ngày 14 sau khi tiêm và kháng thể duy trì đến ngày thứ 42 (Yang và ctv,
2004).
2.7 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH
2.7.1 Triệu chứng
Heo trưởng thành và heo mang thai đều không biểu hiện triệu chứng bệnh. Tuy
nhiên, những ảnh hưởng của bệnh trên heo mang thai được biểu hiện qua những bất
thường của lứa đẻ như đẻ non, heo con yếu ớt kèm những triệu chứng thần kinh, thai
khô có kích thước khác nhau, heo con chết có biểu hiện phù thũng và tích nước dưới da
(Shimizu và ctv, 1954).
Bệnh không chỉ gây rối loạn sinh sản trên con cái mang thai mà còn ảnh hưởng
đến khả năng sinh sản của con đực. Đực giống bị nhiễm virus có thể bị viêm dịch hoàn,
thủy thũng, mào tinh cứng lại, rối loạn quá trình sinh tinh, tinh trùng bất thường và
virus được bài thải qua tinh dịch trong 5 tuần (Ogasa và ctv, 1977).
Trên chuột virus có thể truyền qua nhau thai gây sẩy thai, đẻ non, chết chuột sơ
sinh (Mathur, 1981).

10


Ở người, bệnh gây viêm não, tiểu não và tủy sống. Người bệnh có triệu chứng
sốt, nhức đầu, nôn mửa, mỏi cơ, cứng gáy, mất trí nhớ, co giật, bại liệt, hôn mê (Oya,
1988; Solomon, 2000).
2.7.2 Bệnh tích
Bệnh tích được ghi nhận trên heo con sinh ra yếu ớt từ những lứa đẻ bất thường
là não tích nước, phù thũng dưới da, tích nước xoang ngực, tích nước xoang bụng, xuất
huyết tương mạc, hạch lâm ba sung huyết, hoại tử điểm ở gan và lách (Burns, 1950).
Bệnh tích vi thể trên heo con 3 tuần tuổi sau khi gây nhiễm với virus viêm não
Nhật Bản là hoại tử và thoái hóa tế bào thần kinh, thực bào thần kinh, hạch thần kinh
đệm phân bố ở đại não, cầu não, não giữa, hành tủy và tiểu não. Hiện tượng hoại tử và
thoái hóa đặc biệt tập trung ở chất xám của thùy trán, thùy thái dương và vùng đồi thị

(Yamada và ctv, 2004).
2.8 CHẨN ĐOÁN
2.8.1 Chẩn đoán phân biệt
Cần phân biệt bệnh viêm não Nhật Bản với những bệnh gây rối loạn sinh sản
khác như bệnh do Parvovirus, bệnh Aujesky, bệnh do Toxoplasma, bệnh dịch tả heo,
bệnh do Leptosprira, bệnh do Brucella suis, hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên
heo (PRRS), bệnh do Coronavirus. Không có triệu chứng lâm sàng ở heo mẹ và heo
con cùng với sự phân bố bệnh theo mùa là đặc điểm được dùng để phân biệt rối loạn
sinh sản do virus viêm não Nhật Bản với các nguyên nhân khác (Chu và Joo, 1999;
The Center for Food Security and Public Health, 2007).
2.8.2 Phân lập virus
Não của thai chết hoặc thai sẩy và nhau là những bệnh phẩm thường dùng trong
phân lập virus. Phân lập virus có thể được thực hiện bằng cách tiêm huyễn dịch bệnh
phẩm vào não chuột ổ từ 1-5 ngày tuổi. Chuột sẽ có triệu chứng thần kinh và chết sau
4-14 ngày, virus trong não chuột có thể được xác định bằng phản ứng trung hòa trên
chuột hoặc trên tế bào một lớp. Các môi trường tế bào có nguồn gốc từ chuột đất vàng
(hamster), thận heo và muỗi thường được sử dụng. Tế bào có nguồn gốc từ muỗi Aedes
albopictus dòng C6/36 là môi trường tốt nhất cho sự nhân lên của virus (Chu và Joo,
1999).

11


2.8.3 Chẩn đoán huyết thanh học
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination inhibition – HI)
HI là xét nghiệm đầu tiên được dùng để đo lường kháng thể đặc hiệu cho một số
virus, trong đó có virus viêm não Nhật Bản. Cho đến nay phương pháp này hầu như
không có thay đổi nhiều và nó vẫn là xét nghiệm cơ bản dùng trong chẩn đoán bệnh
viêm não Nhật Bản. Xét nghiệm này phổ biến và dễ thực hiện, có thể thực hiện trong
những phòng thí nghiệm với điều kiện thiết bị tối thiểu. Bất lợi của xét nghiệm này là

không thể phân biệt với các Flavivirus có đặc tính kháng nguyên gần gũi như virus sốt
xuất huyết và virus West Nile. Mặc dù có hạn chế, nhưng HI vẫn là một xét nghiệm
quan trọng và là một xét nghiệm chuẩn để nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm qua kiểm tra
huyết thanh và chẩn đoán bệnh trong thể cấp tính (Endy và Nisalak, 2002).
Phản ứng Mac-ELISA (IgM antibody capture enzyme-linked immunosorbent
assay)
Phản ứng Mac- ELISA là xét nghiệm tìm kháng thể IgM, một loại kháng thể nói
lên trường hợp mới nhiễm trùng. Phản ứng này giữ vai trò quan trọng trong chẩn đoán
và nghiên cứu dịch tễ học các bệnh truyền nhiễm (Võ Công Khanh, 2005).
2.9 ĐIỀU TRỊ
Hiện không có thuốc điều trị đặc hiệu bệnh viêm não Nhật Bản trên người và
gia súc. Điều trị chủ yếu là hồi sức cấp cứu và điều trị triệu chứng như chống phù não,
trợ tim mạch, trợ hô hấp, cân bằng điện giải.
2.10 PHÒNG BỆNH
2.10.1 Phòng chống vectơ truyền bệnh
Việc sử dụng hóa chất diệt muỗi dễ gây ô nhiễm môi trường và làm tăng tính
kháng thuốc của muỗi (Endy và Nisalak, 2002). Vì vậy, người ta còn sử dụng các biện
pháp sau:
Trại chăn nuôi và khu nhà ở nên cách xa các cánh đồng.
Loại bỏ các bể, hồ chứa nước đọng không còn nơi cho muỗi sinh sản.
Tránh muỗi đốt cho heo bằng cách sử dụng lưới chắn muỗi vào ban đêm, hoặc
có thể sử dụng các thuốc đuổi muỗi, thuốc phun xịt muỗi.
Ở người tránh muỗi đốt bằng cách ngủ mùng, mặc quần áo tay dài, sử dụng các
loại thuốc chống muỗi, phát hoang xung quanh nhà ở, vệ sinh môi trường, chuồng gia
súc nên xây dựng cách xa khu nhà ở, nhất là chuồng heo.

12


2.10.2 Tiêm phòng

Tiêm phòng vaccine cho heo làm giảm và ngăn ngừa sự nhiễm virus. Đồng thời
việc tiêm phòng trên heo làm giảm tỷ lệ mắc bệnh trên người (Center for Health
Protection, 2004). Có nhiều loại vắc xin giảm độc đã được nghiên cứu và được sử dụng
rộng rãi trong việc phòng bệnh viêm não Nhật Bản trên heo. Vắc xin bất hoạt có hiệu
quả kém hơn nên ít phổ biến.
Vaccine hiện nay được sử dụng để tiêm phòng cho người là vaccine vô hoạt
chủng Nakayama hoặc Beijing được sản xuất từ não chuột được sử dụng khá phổ biến
ở nhiều quốc gia châu Á.

13


Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2009.
Địa điểm
Trại thực nghiệm khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng; phòng thí nghiệm
bệnh truyền nhiễm, bộ môn Thú y, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Đối tượng thí nghiệm
Chuột bạch với hai độ tuổi: chuột ổ 1 tuần tuổi và chuột trưởng thành 3 tháng
tuổi.
3.1.3 Nội dung thí nghiệm
Khảo sát tính chất gây bệnh và đáp ứng miễn dịch của virus viêm não Nhật Bản
đối với chuột ổ 1 tuần tuổi và chuột 3 tháng tuổi.
- Chuột ổ 1 tuần tuổi: quan sát triệu chứng và bệnh tích đại thể sau khi tiêm
virus.
- Chuột 3 tháng tuổi: quan sát triệu chứng và bệnh tích đại thể sau khi tiêm
virus, lấy máu chiết huyết thanh kiểm tra kháng thể kháng virus viêm não Nhật Bản

bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu.
3.1.4 Vật liệu thí nghiệm
Dụng cụ: Autoclave, máy ly tâm, máy lắc, máy hematocrite, tuýp nhựa chứa
huyết thanh, micropipette, multi-channelpipette, ống nghiệm, đĩa microplate đáy hình
chữ U có 96 giếng, cồn 70o, kéo, găng tay, khẩu trang, giá ống nghiệm,…
Sinh phẩm: Kháng nguyên virus viêm não Nhật Bản chủng CTMP-7 (nguồn:
phòng thí nghiệm bệnh truyền nhiễm, bộ môn Thú y), dung dịch PBS, hồng cầu
ngỗng,…
Dụng cụ nuôi chuột: hộp nhựa có nắp lưới, thức ăn nuôi chuột, chai nước có đầu
uống, trấu, mùng.

14