XÁC ĐỊNH độc lực và TÍNH gây đáp ỨNG MIỄN DỊCH của VIRUS VIÊM não NHẬT bản CHỦNG CTMP 7 TRÊN HEO, gà và vịt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: THÚ Y
Tên đề tài:

XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VÀ TÍNH GÂY ĐÁP ỨNG
MIỄN DỊCH CỦA VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN
CHỦNG CTMP-7 TRÊN HEO, GÀ VÀ VỊT

Giáo viên hướng dẫn:
TS. Hồ Thị Việt Thu

Sinh viên thực hiện:
Trần Anh Tài
MSSV: 3042920
Lớp: Thú Y K30

Cần thơ, 2009

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “ Xác định độc lực và tính gây đáp ứng miễn dịch của virus viêm
não Nhật Bản chủng CTMP-7 trên heo gà và vịt”, do sinh viên Trần Anh Tài
thực hiện tại xã Ngãi Tứ, huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long và phòng thí nghiệm

Bệnh Truyền Nhiễm, Bộ Môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng,
trường Đại Học Cần Thơ.

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2009
Duyệt bộ môn

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2009
Duyệt giáo viên hướng dẫn

Hồ Thị Việt Thu

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2009

Duyệt khoa Nông Nghiệp & SHƯD

ii


LỜI CẢM TẠ
Kính dâng lòng biết ơn đến Ba – Mẹ, người suốt đời hi sinh, nuôi dạy cho
chúng con nên người. Anh Ba là người đi trước đã dạy bảo, chăm lo tôi về mặt tinh
thần lẫn vật chất.
Xin chân thành cảm ơn:
Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn
này.
Cô Trần Thị Minh Châu, cố vấn học tập đã dìu dắt tôi trong suốt 5 năm dưới
mái trường đại học.
Quý thầy, cô tham gia giảng dạy lớp Thú Y 30 đã cung cấp những kiến thức
quý báu trong suốt 5 năm học qua.
Gia đình anh Nguyễn Tiến Sĩ đã chăm lo và giúp đỡ tôi trong thời gian theo dõi

thí nghiệm.
Chị Huỳnh Ngọc Trang đã tận tình giúp đỡ và chỉ dạy tôi trong thời gian làm
luận văn.
Các anh, chị và các bạn lớp Thú Y 30 đã động viên và giúp đỡ tôi trong 5 năm
học qua.

Trần Anh Tài

iii


MỤC LỤC
Trang tựa................................................................................................................. i
Trang duyệt ............................................................................................................ ii
Lời cảm tạ .............................................................................................................iii
Mục lục ................................................................................................................. iv
Danh mục bảng ..................................................................................................... vi
Danh mục hình ..................................................................................................... vii
Danh sách chữ viết tắt ......................................................................................... viii
Tóm lược............................................................................................................... ix
Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................1
Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN ..................................................................................2
2.1 Giới thiệu về bệnh viêm não Nhật Bản...........................................................2
2.2 Tình hình nghiên cứu về bệnh VNNB trên thế giới và trong nước..................2
2.2.1 Một số nghiên cứu về bệnh VNNB trên thế giới ......................................2
2.2.2 Một số nghiên cứu về bệnh VNNB trong nước ........................................3
2.3 Tác nhân gây bệnh .........................................................................................3
2.3.1 Đặc điểm hình thái học của virus VNNB .................................................3
2.3.2 Sức đề kháng ...........................................................................................4
2.3.3 Đặc tính ngưng kết hồng cầu ...................................................................4

2.3.4 Đặc tính nuôi cấy.....................................................................................4
2.4 Dịch tễ học.....................................................................................................4
2.4.1 Phân bố bệnh theo mùa và địa lý..............................................................5
2.4.2 Nhân tố trung gian truyền bệnh................................................................6
2.5 Sinh bệnh học ................................................................................................7
2.6 Miễn dịch học ................................................................................................8
2.7 Triệu chứng và bệnh tích................................................................................8
2.7.1 Triệu chứng .............................................................................................8
2.7.2 Bệnh tích .................................................................................................9
2.8 Chẩn đoán ....................................................................................................10
2.8.1 Chẩn đoán phân biệt ..............................................................................10
2.8.2 Phân lập virus ........................................................................................10
2.8.3 Chẩn đoán huyết thanh học....................................................................11
2.9 Phòng và điều trị ..........................................................................................12
2.9.1 Phòng bệnh............................................................................................ 12
2.9.2 Điều trị bệnh..........................................................................................13
Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM.........................14
3.1 Phương tiện thí nghiệm ................................................................................14
3.1.1 Thời gian và địa điểm ............................................................................14
3.1.2 Đối tượng thí nghiệm.............................................................................14
iv


3.1.3 Nội dung thí nghiệm ..............................................................................14
3.1.4 Vật liệu thí nghiệm ................................................................................14
3.2 Phương pháp thí nghiệm ..............................................................................14
3.2.1 Phương pháp nuôi heo ...........................................................................14
3.2.2 Phương pháp nuôi gà và vịt ...................................................................14
3.2.3 Bố trí thí nghiệm....................................................................................15
3.2.4 Chỉ tiêu theo dõi ....................................................................................16

3.2.5 Thực hiện phản ứng HI để khảo sát sự đáp ứng kháng thể của động vật
sau khi gây nhiễm...........................................................................................16
3.2.6 Xử lý số liệu .......................................................................................... 19
Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ....................................................................20
4.1 Kết quả theo dõi triệu chứng và bệnh tích sau khi tiêm virus........................20
4.2 Kết quả khảo sát sự đáp ứng kháng thể kháng virus VNNB của heo.............20
4.3 Kết quả khảo sát sự đáp ứng kháng thể kháng virus VNNB của gà...............22
4.4 Kết quả khảo sát sự đáp ứng kháng thể kháng virus VNNB của vịt ..............23
4.5 Kết quả khảo sát kháng thể kháng virus VNNB trên từng đối tượng thí
nghiệm...............................................................................................................26
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................27
5.1 Kết luận .......................................................................................................27
5.2 Đề nghị ........................................................................................................27
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................28
PHỤ CHƯƠNG.....................................................................................................32

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm đối với heo ................................................................. 15
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm đối với gà................................................................... 15
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm đối với vịt................................................................... 16
Bảng 4.1 Kết quả đáp ứng kháng thể và hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) của
heo đối với virus VNNB (CTMP-7) qua các tuần theo đường tiêm....................... 20
Bảng 4.2 Phân bố hiệu giá kháng thể của gà sau khi gây nhiễm virus qua các đường
tiêm khác nhau ..................................................................................................... 22
Bảng 4.3 Hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) qua các tuần theo đường tiêm của
gà ......................................................................................................................... 22
Bảng 4.4 Phân bố hiệu giá kháng thể của vịt sau khi gây nhiễm virus VNNB

(CTMP-7) qua các đường tiêm khác nhau ............................................................ 24
Bảng 4.5 Hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) qua các tuần theo đường tiêm của
vịt......................................................................................................................... 25
Bảng 4.6 Kết quả khảo sát hiệu giá kháng thể trung bình khánh virus VNNB
(CTMP-7) trên từng đối tượng thí nghiệm ............................................................ 26

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Cấu trúc Flavivirus .................................................................................. 4
Hình 2.2 Vùng dịch tễ chịu ảnh hưởng của bệnh VNNB......................................... 5
Hình 2.3 Muỗi Culex pseudovishnui....................................................................... 6
Hình 2.4 Chu trình truyền bệnh VNNB trong tự nhiên............................................ 7
Hình 2.5 Thai chết với nhiều kích thước khác nhau ................................................ 9
Hình 2.6 Tụ huyết và phù ở bìu lợn đực.................................................................. 9
Hình 2.7 Tràn dịch trong não thấy ở thai gỗ.......................................................... 10
Hình 2.8 Vắc xin VNNB ...................................................................................... 12
Hình 4.1 Hiệu giá kháng thể trung bình ở từng đường tiêm .................................. 21
Hình 4.2 Hiệu giá kháng thể trung bình kháng virus VNNB (CTMP-7) qua các tuần
theo đường tiêm.................................................................................................... 23
Hình 4.3 Hiệu giá kháng thể trung bình kháng virus VNNB (CTMP-7) qua các tuần
theo đường tiêm.................................................................................................... 25
Hình 4.4 Hiệu giá kháng thể trung bình kháng virus VNNB (CTMP-7) giữa các đối
tượng thí nghiệm .................................................................................................. 26

vii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

BABS
DGV
DNA
ELISA
GMT
HA
HI
LD50
PBS
PCR
RNA
SMIC
VAD
VNNB

Bovalbumine Buffered Saline
Dextrose – Gelatine – Veronal
Desoxyribonucleic acid
Enzyme linked immunosorbent assay
Geometric mean titer
Haemagglutination
Haemagglutination inhibition
Lethal dose 50%
Phosphate buffered saline
Polymerase chain reaction
Ribonucleic acid
Suckling mouse intracranial
Virus adjusting diluent
Viêm não Nhật Bản

viii


TÓM LƯỢC
Trong nghiên cứu này thí nghiệm được được tiến hành trên các đối tượng là heo,
gà và vịt. Ở heo được gây nhiễm qua 4 đường tiêm là tĩnh mạch, phúc mạc, bắp thịt
và dưới da. Ở gà và vịt được gây nhiễm qua 3 đường tiêm là phúc mạc, da cánh và
bắp thịt. Kết quả được ghi nhận như sau:
Không có triệu chứng và bệnh tích trên các đối tượng thí nghiệm.
Có sự đáp ứng kháng thể của các đối tượng thí nghiệm.
Ở heo hiệu giá kháng thể cao nhất vào tuần 2, sau đó giảm dần qua các tuần. Có
sự đáp ứng kháng thể khác nhau giữa các đường tiêm, ở đường tiêm tĩnh mạch và
dưới da hiệu giá kháng thể trung bình là 40, ở đường tiêm phúc mạc là 22,45 và
đường tiêm bắp thịt là 23,84.
Ở gà cũng có sự đáp ứng kháng thể khác nhau giữa các đường tiêm, đường tiêm
phúc mạc có hiệu giá 40 chiếm tỷ lệ 45,45%, ở đường tiêm bắp thịt hiệu giá 10
chiếm tỷ lệ 66,66%, và đường tiêm da cánh hiệu giá 10 chiếm tỷ lệ cao nhất 33,33%
trong cùng đường tiêm.
Ở vịt sự đáp ứng kháng thể ở hiệu giá 320 của 2 đường tiêm phúc mạc và da
cánh chiếm tỷ lệ 40,0% so với các hiệu giá khác trong cùng đường tiêm. Ở đường
tiêm bắp thịt hiệu giá 80 chiếm tỷ lệ 30,0% cao hơn các hiệu giá khác trong cùng
đường tiêm.
Hiệu giá kháng thể trung bình ở vịt cao nhất (133), kế đến ở heo (31,43) thấp
nhất ở gà (25,94).

ix


Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) là bệnh truyền nhiễm chung cho người và

động vật, thông qua trung gian truyền bệnh là muỗi (chủ yếu giống Culex). Đây là
một trong những bệnh gây thất bại sinh sản trên heo. Heo nái bị nhiễm bệnh trong
thời gian mang thai có thể có những biểu hiện bất thường ở lứa đẻ như thai khô với
nhiều kích thước khác nhau, heo con chết trước lúc sinh với biểu hiện phù thũng ở
da và não hoặc con heo sinh ra yếu ớt với những triệu chứng thần kinh, hiện tượng
sẩy thai ít được ghi nhận (Chu và Joo, 1996).
Trong tự nhiên có rất nhiều loài gia súc và động vật hoang là nguồn cung cấp
virus cho chu trình truyền bệnh, đặc biệt heo và chim. Do đó, việc phòng chống
bệnh trở nên phức tạp.
Năm 2006, Hồ Thị Việt Thu và cộng tác viên đã phân lập được chủng virus gây
bệnh viêm não Nhật Bản (CTMP-7) trên muỗi tại thành phố Cần Thơ. Để biết rõ
hơn về độc lực của chủng virus này, tôi đã thực hiện đề tài: “Xác định độc lực và
tính gây đáp ứng miễn dịch của virus viêm não Nhật Bản chủng CTMP-7 trên
heo, gà và vịt” với mục tiêu là:
Khảo sát triệu chứng và bệnh tích trên các đối tượng thí nghiệm heo, gà và
vịt.
Khảo sát khả năng đáp ứng kháng thể trên các đối tượng thí nghiệm.

1


Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN
Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) là bệnh truyền nhiễm chung của người và
động vật, lây truyền qua muỗi do một Flavivirus gây ra. Hầu hết các loài gia súc
đều cảm thụ với bệnh bao gồm ngựa, heo, trâu, bò, dê và cừu. Những động vật khác
như thỏ, chuột, bồ câu (Chang và ctv,1984), chó, vịt, gà (Huang, 1982), chim hoang
(Kual và ctv, 1976) và bò sát cũng cảm nhiễm (Doi và ctv, 1983).
Bệnh VNNB lần đầu tiên được mô tả ở Nhật Bản năm 1871, nhưng trận dịch đầu
tiên được nói đến vào năm 1924 với hơn 6.000 ca bệnh. Những trận dịch lớn được

ghi nhận vào năm 1935 và nổ ra hàng năm từ năm 1946 đến năm 1952 (Pond và
Smadel, 1954).
Sau đó bệnh VNNB được phát hiện ở Triều Tiên (1949), ở Ấn Độ và Nepal
(1978). Các nhà khoa học đã xác định vai trò làm lây lan mầm bệnh của loài muỗi
Culex tritaeniorhynchus, loài muỗi này phát triển theo mùa và có ở nhiều nước trên
thế giới có lưu hành bệnh VNNB. Đặc điểm bệnh VNNB ở người là triệu chứng
lâm sàng không rõ ở người lớn, nhưng ở trẻ em thì hội chứng viêm não rất điển hình
và tỷ lệ tử vong cao. Đặc biệt virus còn gây hiện tượng sẩy thai ở phụ nữ
(Chaturvedi, 1980).
2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH VNNB TRÊN THẾ GIỚI VÀ
TRONG NƯỚC
2.2.1 Một số nghiên cứu về bệnh VNNB trên thế giới
Năm 1934, virus VNNB được phân lập từ não bệnh nhân chết do viêm não, virus
này được xem như chủng virus mẫu của virus VNNB và được đặt tên là Nakayama
(Mitamura, 1936).
Năm 1954, Shimizu và ctv gây nhiễm trên heo nái mang thai. Kết quả heo nái
không có triệu chứng bệnh nhưng có lứa đẻ bất thường với những thai khô và thai
chết với nhiều kích cỡ, heo sinh ra yếu ớt với biểu hiện phù ở da và não (Shimizu,
1954).
Năm 1976, Hashimura đã phân lập virus VNNB từ tinh hoàn heo nọc bị viêm
(Hashimura, 1976).
Năm 1977, Ogasa đã chứng minh khi các heo nọc mẫn cảm bị nhiễm virus
VNNB, virus xâm nhập vào cơ quan sinh dục gây biến đổi bệnh lý như thủy thũng
và gây sung huyết dịch hoàn, mào tinh cứng lại, giảm tính dục và làm rối loạn quá
trình sinh tinh, số lượng tinh trùng di động giảm, gia tăng nhiều tinh trùng kỳ hình
(Ogasa, 1977).
Năm 1981, Mathur và ctv đã gây nhiễm thực nghiệm trên chuột mang thai, khi
tiêm truyền virus VNNB vào màng phúc mạc của chuột cái mang thai. Virus tác

2

động trên thai khác nhau tùy từng giai đoạn của thai kỳ. Sự nhiễm virus VNNB
trong suốt tuần đầu tiên của thai kì gây ra số lượng chết thai và chết chuột thí
nghiệm sơ sinh (66%) cao hơn khi gây nhiễm vào tuần thứ ba của thai kì (13,8%).
Số chuột sẩy thai, chết thai và chết chuột sơ sinh cao hơn ở những chuột đối chứng
(Mathur, 1981).
2.2.2 Một số nghiên cứu về bệnh VNNB trong nước
Năm 1960, có 4 chủng virus VNNB được phân lập trong đó có 3 chủng từ não
bệnh nhân và 1 chủng từ não chim Liếu Điếu (Garrulex persipillatus gmedi) là HN51, HN-59, HN-60, LF-68 và năm 1975 phân lập được chủng TH-L-560 trên heo.
Từ năm 1965 đến năm 1975 phát hiện nhiều chủng mới nâng tổng số chủng virus
phân lập lên 18 chủng, trong đó có 1 chủng từ não heo và 1 chủng từ muỗi Culex
tritaeniorhynchus bắt từ khu dân cư quanh các trại chăn nuôi heo (Đỗ Quang Hà và
Đoàn Xuân Mượu, 1965).
Từ năm 1978 đến năm 1995 ở các tỉnh phía Nam, các trung tâm nghiên cứu đã
phân lập được 29 chủng virus VNNB, trong đó có 10 chủng từ máu bệnh nhân, 7
chủng từ não tủy bệnh nhân và 12 chủng từ muỗi ở các địa phương ngoại thành
Thành Phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp, Đồng Nai, Long An (Hạ Bá Khiêm, 1998).
Năm 1990-1992, Huỳnh Phương Liên đã nghiên cứu thành công trong việc sản
xuất vắc xin VNNB trên não chuột từ chủng Nakayama (Huỳnh Phương Liên,
1990-1992).
Năm 2006, Hồ Thị Việt Thu và cộng tác viên đã phân lập được 1 chủng virus
VNNB trên muỗi Culex pseudovishnui tại thành phố Cần Thơ và đặt tên là CTMP-7
(Hồ Thị Việt Thu và ctv, 2006).
2.3 TÁC NHÂN GÂY BỆNH
Virus VNNB (Japannese encephalitis virus-JEV) là một Flavivirus, trước đây
được xếp vào họ Togaviridae, thuộc nhóm B của Arbovirus. Hiện nay có trên 60
loài Flavivirus nhưng chỉ có 3 loài có ý nghĩa trong thú y: virus gây bệnh VNNB,
virus gây bệnh Louping và virus gây bệnh Wesselsbron (Chu và Joo, 1996).
2.3.1 Đặc điểm hình thái học của virus VNNB

Virus có dạng hình cầu, đường kính khoảng 40nm, cấu trúc di truyền là một
chuỗi RNA đơn dương được bao bọc bởi capxit có 20 mặt. Khi giải mã hoàn toàn
cấu trúc di truyền có chứa 10.976 nucleotit tương ứng với 3.432 gốc axit amin.
Virus có 3 protein cấu trúc và nhiều protein không cấu trúc. Những protein cấu trúc
bao gồm glycoprotein E của vỏ (54kD), protein vỏ không có glycosylate M (8kD)
và protein capxit C (14kD). Protein E của vỏ có những quyết định kháng nguyên
(epitope) gây đáp ứng kháng thể trung hòa. Protein E có ít nhất 8 đơn vị kháng
nguyên, một ở vị trí N biểu thị tính đặc hiệu của virus (Kimura-Kuroda và Yasui,
1986).

3


Chuỗi đơn RNA

Capxit
protein

Vỏ lipid

Hình 2.1: Cấu trúc Flavivirus

(www.hc-sc.gc.ca/dhp-mps/brgtherap/images/wnv_peyton_img5_e.gif)
2.3.2 Sức đề kháng
Virus VNNB tương đối bền ở pH= 7-9. Ở pH= 9 là điều kiện cần thiết để giữ
khả năng ngưng kết hồng cầu của virus. Virus không chịu nhiệt, chúng bị bất hoạt ở
50oC trong 30 phút, ở 70 oC trong 10 phút, ở 100 oC trong 2 phút. Trong trạng thái
đông lạnh virus có thể tồn tại trong vài năm. Dưới tác dụng của aceton, cồn và ete
virus chết sau 3 ngày. Dung dịch lysol 5% diệt virus trong 1 phút (Bùi Đại và ctv,
2002).

2.3.3 Đặc tính ngưng kết hồng cầu
Virus VNNB có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, ngỗng, bồ câu, cừu, thỏ,
chuột lang,… nhưng tốt nhất là hồng cầu gà con 1 ngày tuổi (Kobayashi và ctv,
1984) và hồng cầu ngỗng (Clarke và Casals, 1958).
2.3.4 Đặc tính nuôi cấy
Khi nuôi cấy trên tế bào thận chuột, sau 60 phút đã có virus tiếp cận với màng tế
bào, sau hơn 3 giờ virus tiếp cận trong nguyên sinh chất của một số tế bào, còn hầu
hết các tế bào khác chưa có thay đổi, sau 3-4 ngày hầu hết các tế bào đã thoái hóa
hoặc bong ra khỏi thành chai, lúc này virus đã nhân lên ở mức độ cao và tập trung
thành những đám lớn hoặc rải rác trong nguyên sinh chất tế bào (Đỗ Quang Hà và
ctv, 1971).
Có thể gây bệnh thực nghiệm trên chuột bạch và khỉ bằng cách tiêm vào xoang
não, sau 3-8 ngày chuột sẽ bị liệt, co giật rồi chết (Dương Đình Thiện, 2001).

4


2.4 DỊCH TỄ HỌC
2.4.1 Phân bố bệnh theo mùa và địa lý
Theo mùa
Tính chất mùa của bệnh VNNB thể hiện rõ trên người. Ở những vùng ôn đới,
bệnh có tính chất dịch với phần lớn các ca bệnh tập trung vào một vài tháng mùa hè
hoặc gió mùa. Ngược lại ở những vùng nhiệt đới, bệnh có tính chất địa phương với
số ca bệnh rải rác suốt năm, mật độ muỗi có vai trò quyết định trong việc lây truyền
bệnh (Innis, 1995).
Ở nước ta, khoảng thời gian từ tháng 5 đến tháng 8 và 9 âm lịch là thời điểm
phát triển bệnh VNNB ở trẻ em. Đỉnh cao dịch bệnh là tháng 6 và tháng 7. Từ tháng
10 trở đi, mật độ muỗi giảm và bệnh cũng giảm. Vào mùa mưa và mùa hè thời tiết
nóng, nhiệt độ từ 27oC-30 oC, virus thường phát triển tốt trong cơ thể muỗi. Nếu
dưới 20oC thì sự phát triển của virus dừng lại. Đó là lý do tại sao mô hình dịch tễ

khác nhau giữa 2 miền Nam và Bắc Việt Nam. Tại miền Bắc bệnh giảm vào những
tháng lạnh, tăng vào những tháng hè và đỉnh cao vào tháng 5-7. Còn ở miền Nam,
thời tiết nóng bệnh rải rác quanh năm (Võ Công Khanh, 2005).
Theo địa lý
Bệnh VNNB có phân phối địa lý tại các khu vực Đông Nam Á, sự lây nhiễm
được ghi nhận ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc, Philippines,
Singapore, Indonesia, Malaysia, Việt Nam, Lào, Thái Lan, Bruney, Sri Lanka, Ấn
Độ, Bangladesh và các quần đảo ở Thái Bình Dương (Chu và Joo, 1996).
Ở Việt Nam bệnh lưu hành ở nhiều nơi nhưng bệnh thường tập trung ở các tỉnh
phía Bắc như Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Hải Hưng, Hà Bắc,…(Nguyễn Chương,
1996).

Hình 2.2 Vùng dịch tễ chịu ảnh hưởng của bệnh VNNB (đỏ)

(www.Jyi.org/articleimages/605/orignal/img1.jpg)

5


2.4.2 Nhân tố trung gian truyền bệnh
Vai trò của muỗi trong truyền bệnh VNNB
Muỗi là nhân tố quan trọng đối với sự nhiễm bệnh ở người và là yếu tố quan
trọng trong chu trình truyền bệnh VNNB. Muỗi Culex tritaeniorhynchus là loài
muỗi quan trọng nhất cho sự nhân lên của virus VNNB. Do đó, loài muỗi này được
xem là véc tơ chính truyền bệnh ở hầu hết các nước Châu Á. Khi Culex
tritaeniorhynchus bị nhiễm virus VNNB ở nồng độ thấp, virus có thể nhân lên
nhanh chóng trong cơ thể loài muỗi này và tiếp tục gây nhiễm cho nhiều loài động
vật thích hợp như heo, chim. Trong cơ thể heo và chim, virus được khuếch đại và
gây nhiễm cho muỗi, kết quả lượng lớn virus VNNB được duy trì trong tự nhiên,
trong quần thể Culex tritaeniorhynchus bị nhiễm (Endy và Nisalak, 2002).

Muỗi Culex tritaeniorhynchus sinh sản và phát triển ở đồng ruộng, xuất hiện
nhiều vào mùa nóng, mật độ cao nhất vào tháng 3-4 đến tháng 7, thích hợp ở nhiệt
độ 22oC-28 oC, ẩm độ 80-90%. Muỗi thích hút máu súc vật (chiếm 86% còn lại
khoảng 14% hút máu người). Ban ngày, muỗi ít hoạt động và sống trong các bụi cây
ngoài vườn, ban đêm bay vào hút máu người và gia súc, thời gian hút máu về đêm
từ 18 giờ đến 20-22 giờ, giảm dần và ngừng hoạt động khoảng 8 giờ sáng (Nguyễn
Duy Thanh, 1992).
Ngoài Culex tritaeniorhynchus, virus VNNB còn có thể phân lập được trên
nhiều muỗi khác như: Cx. pseudovishnui, Cx. vishnui, Ae. subpictus và Cx.
whitmorei ở Ấn Độ; nhóm Anopheles hycarcanus và An. barbirostris ở Pakistan;
Ae. albopictus và Armigeres obturans ở Trung Quốc; Cx. fucocephala, Cx.
whitmorei và Mansonia uniformis ở Sri Lanka (Huang, 1982).

Hình 2.3 Muỗi Culex pseudovishnui

(www.fehd.gov.hk/safefood/risk-pest-mosquito.html)
Chu trình truyền virus VNNB trong tự nhiên
Trong tự nhiên, virus được duy trì và lây truyền qua chu trình bao gồm: muỗi-nhân
tố trung gian (chủ yếu là giống Culex), chim và động vật hữu nhũ. Sự tồn tại của
virus chủ yếu nhờ vào những động vật mà sự nhiễm trùng không có biểu hiện triệu
chứng lâm sàng.

6


Heo được xem là động vật cảm nhiễm cao nhất đối với bệnh VNNB. Sau heo là
chim, một số động vật khác như bò, dê, cừu, khỉ cũng cảm nhiễm với virus VNNB
nhưng với tỷ lệ thấp. Vì vậy, heo và chim được xem là nguồn quan trọng chứa virus
để truyền cho muỗi khi muỗi hút máu chúng. Heo và chim có vai trò như một ổ
chứa virus đáng kể trong tự nhiên.

Sau khi muỗi đốt vật chủ mang mầm bệnh và tiếp tục đốt người, người sẽ bị
nhiễm virus và trở thành vật chủ ngẫu nhiên có chứa virus. Sự tồn tại của virus ở
người trong thời gian ngắn, và lượng virus thấp nên khả năng muỗi hút máu người
có chứa virus, rồi truyền sang cho người khác là cực kì hiếm nếu không muốn nói là
không có. Cho nên người được xem là vật chủ cuối cùng trong dây chuyền bệnh
VNNB (Hạ Bá Khiêm, 1998).
Muỗi mang
virus đốt động
vật và truyền
virus VNNB

Muỗi đốt
chim và
mang virus
VNNB

Vật mang
mầm bệnh
Muỗi đốt
chim và chim
mang mầm
bệnh

Muỗi đốt động
vật chứa mầm
bệnh

Muỗi mang virus đốt người

`

Hình 2.4 Chu trình truyền bệnh VNNB trong tự nhiên

(www.rfa.org.TheJapaneseMeningitis)
2.5 Sinh bệnh học
Trong tự nhiên heo bị nhiễm virus VNNB do muỗi đốt, hiện tượng virus huyết
xảy ra sau 12 giờ đến vài ngày. Sự nhân lên của virus trên heo chưa được biết rõ.
Tuy nhiên, đã có một số nghiên cứu được ghi nhận trên người, khỉ và chuột (Chu và
Joo, 1996).
Sau khi nhiễm virus huyết, virus phân tán đến các mô mềm có nhiều mạch máu
đi qua như gan, lách và bắp cơ, tại đây virus được nhân lên. Virus sinh sản ở hệ
thống tế bào thần kinh trung ương, thần kinh tủy sống, màng tế bào, đại thực bào và
tế bào lympho. Ở người và chuột, virus xâm nhiễm có tính hướng thần kinh, chủ
yếu là vùng cuống não, hạch thần kinh và phía dưới vỏ não (Johnson, 1987).

7


Ở muỗi, virus được nhân lên ở đại thực bào và các tế bào hồng cầu trong 2 ngày
(Johnson, 1987). Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể, virus sẽ lan rộng đến nhiều cơ
quan và có tính hướng thần kinh trung ương. Virus hiện diện ở hệ thần kinh vào
ngày thứ 4, 5 hoặc ngày thứ 6 có thể tìm thấy virus ở tuyến nước bọt (Leake và
Johnson,1987).
Đại thực bào có vai trò quan trọng trong quá trình bệnh lý của bệnh. Thí nghiệm
tiêm truyền virus cho chuột bạch qua đường phúc mạc, virus phát triển trước tiên
trong các đại thực bào phúc mạc, sau 3 ngày phát triển trong đại thực bào của vùng
trước thể lách (prefollicular). Virus gây nhiễm và nhân lên trong các đại thực bào và
tế bào lympho T. Đại thực bào cũng có vai trò trong sự phát triển các thể nhiễm
bệnh tiềm ẩn (Chu và Joo, 1996).
2.6 Miễn dịch học

Sau khi tiêm ngừa vắc xin bằng những chủng virus giảm độc, hiệu giá kháng thể
HI đạt khoảng 40-640 được phát hiện sau 4 tuần và hiệu giá 160 được duy trì ít nhất
6 tuần (Kodama và ctv, 1968).
Khi gây nhiễm cho heo mẫn cảm với virus VNNB, sau 1 tuần cả kháng thể HI và
kháng thể trung hòa có thể phát hiện cùng một lúc, các kháng thể này có thể đạt
nồng độ cao nhất ở 2-4 tuần sau khi nhiễm. Đôi khi kháng thể HI xuất hiện trước
kháng thể trung hòa (Scherer và ctv, 1959). Những mẫu huyết thanh heo được lấy ở
4 tuần sau khi gây nhiễm, được xử lý với 2-mercaptoethanol, hiệu giá kháng thể
giảm, chứng tỏ kháng thể này thuộc nhóm IgM. Kháng thể thụ động đề kháng với 2mercaptoethanol được phát hiện ở heo con theo mẹ và có thể tồn tại 4-6 tháng tuổi
(Otsuka và ctv, 1966).
2.7 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH
2.7.1 Triệu chứng
Trên heo
Thời gian nung bệnh chưa được xác định.
Qua gây nhiễm thực nghiệm trên heo con cho thấy nhiệt độ tăng từ 40-42 oC
trong 3 ngày, suy nhược, hai chân sau run (Yamada và ctv, 2004).
Heo trưởng thành và heo nái bị nhiễm virus VNNB không có triệu chứng đặc
trưng. Tuy nhiên, có một số biểu hiện khác thường ở các lứa đẻ như trong lứa đẻ có
nhiều thai khô, thai chết, heo con yếu ớt với triệu chứng thần kinh như run, co giật
và chết. Thai khô thường có nhiều kích thước khác nhau, thai chết có biểu hiện phù
thũng dưới da, heo con yếu ớt, run, ứ nước dưới da, ở não và chết sau một vài ngày
(Shimizu và ctv, 1954).

8


Hình 2.5 Thai chết với nhiều kích thước khác nhau

(JICA, 2001)
Trên heo nọc, bệnh có liên quan đến hiện tượng vô sinh trong mùa hè, heo nọc có

thể bị viêm dịch hoàn, thủy thũng, mào tinh cứng và giảm tính dục. Nhiều nghiên
cứu đã phân lập virus từ heo nọc bị viêm dịch hoàn, chứng minh sự xâm nhập của
virus vào cơ quan sinh dục gây rối loạn quá trình sinh tinh. Những rối loạn trên chỉ
tạm thời và con vật có thể bình phục, nhưng trong những trường hợp nặng heo nọc
có thể bị vô sinh vĩnh viễn (Ogasa và ctv, 1977).

Hình 2.6 Tụ huyết và phù ở bìu lợn đực

(JICA, 2001)
Trên người
Bệnh phổ biến ở trẻ em dưới 14 tuổi. Bệnh gây viêm não, tiểu não và tủy sống.
Bệnh nhân có triệu chứng sốt, nhức đầu, cứng gáy, thay đổi cảm giác, mắt mờ, mất
ngủ hoặc ngủ li bì. Tỷ lệ chết khoảng 10-30% đáng lo ngại là có đến 50% bệnh
nhân khỏi bệnh mắc di chứng thần kinh. Hiện tượng sẩy thai cũng được ghi nhận
trên phụ nữ có mang (Nguyễn Chương, 1996).
2.7.2 Bệnh tích
Bệnh tích không được ghi nhận ở heo nái bị nhiễm bệnh. Tuy nhiên, bệnh lý
được ghi nhận chủ yếu là những bất thường của lứa đẻ từ những heo nái bị nhiễm
virus trong suốt thời gian mang thai. Bệnh tích đại thể đáng chú ý là thai chết hoặc
heo con sinh ra yếu ớt do viêm não tích dịch, phù thũng ở da, tích nước xoang ngực,
xoang bụng, xuất huyết ở tương mạc, hạch lâm ba sung huyết, hoại tử điểm ở gan,
9


lách, sung huyết màng não và tủy sống (Burns, 1950). Nếu quan sát kỹ có thể thấy
hệ thống thần kinh trung ương giảm sản ở một số vùng, với biểu hiện vỏ não cực
mỏng ở những heo con bị viêm não tích dịch (Shimizu và ctv, 1954).

Hình 2.7 Tràn dịch trong não thấy ở thai gỗ

(JICA, 2001)
Ở heo nọc, dịch hoàn viêm có nhiều dịch nhày ở màng bao dịch hoàn, đồng thời
có lớp tơ huyết dày ở mào tinh cũng như màng trong của bao dịch hoàn. Bệnh tích
vi thể là ứ nước, viêm với sự xâm nhiễm của nhiều tế bào ở mô kẽ của mào tinh và
màng bao dịch hoàn. Hiện tượng thâm nhiễm và xuất huyết cũng được ghi nhận ở
mô kẽ của dịch hoàn. Biểu mô ống sinh tinh bị thoái hóa (Hashimura và ctv, 1976).
2.8 CHẨN ĐOÁN
2.8.1 Chẩn đoán phân biệt
Cần phân biệt bệnh VNNB với những bệnh gây rối loạn sinh sản khác như hội
chứng rối loạn sinh sản và hô hấp, bệnh rối loạn sinh sản do Parvovirus, Aujeszky,
bệnh do Toxoplasma, bệnh dịch tả heo, bệnh do xoắn khuẩn Leptospira,…Không có
triệu chứng ở heo mẹ và sự phân bố bệnh theo mùa là đặc điểm riêng được dùng để
phân biệt rối loạn sinh sản do virus VNNB với các nguyên nhân khác (Chu và Joo,
1996).
2.8.2 Phân lập virus
Não của thai chết hoặc thai sẩy và nhau là những bệnh phẩm thường dùng trong
phân lập virus, bệnh phẩm cần được bảo quản lạnh và phải được vận chuyển ngay
về phòng thí nghiệm. Bệnh phẩm não cần được chia làm đôi cho việc thực hiện
phiến đồ tổ chức, đồng thời cần thu thập mẫu huyết thanh từ thai chết, thai sẩy và cả
huyết thanh của con mẹ. Huyết thanh của những heo mẹ trong những lứa đẻ bất
thường do virus VNNB có hàm lượng cao kháng thể thường không bền với với 2mercaptoethanol (Otsuka và ctv, 1966).

10


2.8.3 Chẩn đoán huyết thanh học
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu
Haemagglutination inhibition (HI) là xét nghiệm đầu tiên được dùng để đo lường
kháng thể đặc hiệu cho một số virus, trong đó có virus VNNB, phản ứng được xây
dựng bởi Clarke và Carsals năm 1958. Cho đến nay phương pháp này hầu như

không có thay đổi nhiều và nó vẫn là xét nghiệm cơ bản dùng trong chẩn đoán bệnh
VNNB. Tiền thân của xét nghiệm này là phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA), khi
Sabin và ctv phát hiện Arbovirus, đặc biệt là virus VNNB có đặc tính ngưng kết một
số loại hồng cầu. Phản ứng HA cho phép định lượng và chuẩn độ kháng nguyên
virus VNNB sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau, chủ yếu từ não chuột ổ. Kháng thể
đặc hiệu kháng Arbovirus có thể ức chế sự ngưng kết hồng cầu, xét nghiệm này
tương đối đơn giản, ít tốn kém lại có khả năng định lượng được kháng thể virus
VNNB. Trong xét nghiệm này những yếu tố ức chế ngưng kết không đặc hiệu trong
huyết thanh được loại bỏ bằng cách xử lý với aceton, ether hoặc kaolin trước khi
thực hiện phản ứng HI. Huyết thanh xét nghiệm với độ pha loãng bậc 2, đối chứng
dương và âm được cho vào mỗi giếng, sau đó cho thêm 25µl dung dịch chứa 8 đơn
vị HA của kháng nguyên virus VNNB. Hiệu giá HI được tính bằng độ pha loãng
cao nhất của huyết thanh có khả năng gây ức chế ngưng kết hồng cầu hoàn toàn. Sự
gia tăng hiệu kháng thể kháng virus VNNB gấp 4 lần trong xét nghiệm lần 2 chứng
tỏ người hoặc động vật mới nhiễm bệnh (Clarke và Casal, 2002).
Xét nghiệm này có giá trị là ít tốn kém, có thể thực hiện trong những phòng thí
nghiệm với điều kiện thiết bị tối thiểu. Bất lợi của xét nghiệm này là không thể phân
biệt với các Flavivirus có đặc tính kháng nguyên gần gũi như virus sốt xuất huyết
và virus West Nile. Mặc dù có hạn chế, nhưng HI vẫn là một xét nghiệm quan trọng
và là một xét nghiệm chuẩn để nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm qua kiểm tra huyết thanh
và chẩn đoán bệnh trong thể cấp tính (Endy và Nisalak, 2002).
Phản ứng hấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA-Enzyme linked
immunosorbent assay)
Phản ứng ELISA được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiều bệnh do virus vì dễ
thực hiện, xét nghiệm được nhiều mẫu cùng một lúc nhờ hệ thống máy rửa và máy
đọc. Việc phát hiện IgM trong giai đoạn bệnh cấp tính dựa trên kháng thể đơn dòng
đặc hiệu, giúp khắc phục hiện tượng phản ứng chéo giữa kháng thể IgG của các
Flavivirus (Endy và Nisalak, 2002).

11

2.9 PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ
2.9.1 Phòng bệnh
Trên heo, bệnh thường không được điều trị. Phá vỡ chu trình truyền bệnh trong
tự nhiên là biện pháp tốt nhất trong việc phòng chống bệnh.
Kiểm soát nhân tố trung gian (muỗi) truyền bệnh
Điều này rất khó thực hiện vì bao gồm nhiều loại muỗi và tính chất của bệnh còn
tùy thuộc vào điều kiện sinh thái của từng vùng.
Việc sử dụng các thuốc diệt côn trùng một cách hợp lý để diệt muỗi Culex và các
véc tơ gặp nhiều khó khăn vì các véc tơ này sinh sản trên những ruộng lúa mênh
mông luôn ngập nước có nhiều chất hữu cơ. Muỗi lại có khả năng bay và tìm mồi
rất xa (Wada, 1989).
Xây dựng trại chăn nuôi và khu nhà ở cách xa các cánh đồng.
Loại bỏ các bể, hồ chứa nước đọng không còn nơi cho muỗi sinh sản.
Tránh muỗi đốt cho heo bằng cách sử dụng lưới chắn muỗi vào ban đêm, hoặc
có thể sử dụng các thuốc đuổi muỗi, thuốc phun xịt muỗi.
Ở người tránh muỗi đốt bằng cách ngủ mùng, mặc quần áo tay dài, sử dụng các
loại thuốc xoa đuổi muỗi, phát hoang xung quanh nhà ở, vệ sinh môi trường,
chuồng gia súc nhất là chuồng heo nên xây dựng cách xa khu nhà ở.
Tiêm phòng vắc xin cho heo
Tiêm ngừa vắc xin cho đàn heo giống là biện pháp được áp dụng trong các
phương sách phòng chống bệnh. Heo nọc và cái hậu bị cần được tiêm ngừa 2 lần
cách nhau 2-3 tuần trước mùa muỗi và trước khi phối giống. Vắc xin này có thể
tiêm đồng thời với các vắc xin phòng bệnh khác như vắc xin dịch tả heo và vắc xin
parvovirus (Chu và Joo, 1996).

Hình 2.8 Vắc xin VNNB

(www.vabiotechvn.com/upload/images/thumb_produ...)

12


2.9.2 Điều trị bệnh
Việc sử dụng kháng nhiễm tố Alpha A (Interferon-alpha A) đem lại kết quả tốt
trong điều trị bệnh VNNB ở người, nhưng lại không có kết quả trong điều trị bệnh ở
heo.
Ở người không có thuốc điều trị đặc hiệu. Biện pháp điều trị thường là nâng cao
sức chống đỡ của cơ thể đối với virus, làm cho cơ thể tự tạo ra miễn dịch chống lại
virus. Do vậy, thời gian điều trị phải kéo dài từ 1-2 tháng.
Đối với súc vật mắc bệnh biện pháp tốt nhất là không điều trị, xử lý để diệt mầm
bệnh, tránh lây lan trong đàn (Phạm Sỹ Lăng và ctv, 2002).

13


Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2009 đến 4/2009.
Địa điểm
- Xã Ngãi Tứ, huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long.
- Phòng thí nghiệm bệnh truyền nhiễm, bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp và
Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Đối tượng thí nghiệm
Heo con sau cai sữa, số lượng 9 con.
Gà con 2 tuần tuổi, số lượng 24 con.
Vịt con 1 tuần tuổi, số lượng 20 con.

3.1.3 Nội dung thí nghiệm
Khảo sát triệu chứng, bệnh tích và tính gây đáp ứng miễn dịch trên heo, gà và vịt
sau khi gây nhiễm với virus VNNB chủng CTMP-7.
Hàng tuần lấy máu tĩnh mạch tai heo, đối với gà lấy máu tĩnh mạch cánh và vịt
lấy máu tim. Sau đó chiết lấy huyết thanh kiểm tra kháng thể kháng virus VNNB
bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu.
3.1.4 Vật liệu thí nghiệm
Vật liệu dùng trong lấy mẫu và xét nghiệm: ống nghiệm vô trùng, ống tiêm 8ml,
găng tay, bông gòn, cồn, kéo, dao mổ, thùng trữ lạnh, máy ly tâm, hematorit, týp
nhựa chứa huyết thanh, đĩa micoplate đáy hình chữ U có 96 giếng, micropipet.
Sinh phẩm
Virus viêm não Nhật Bản chủng CTMP-7 (phòng thí nghiệm virus , bộ môn
Thú Y, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học cần Thơ).
Kháng nguyên viêm não nhật Bản chủng Nakayama (viện Pasteur, thành phố
Hồ Chí Minh).
Dung dịch PBS.
3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.2.1 Phương pháp nuôi heo
Heo thí nghiệm được nuôi trong chuồng, lợp bằng lá. Heo được cho ăn, uống
đầy đủ, ngoài ra còn bổ sung rau. Heo được che chắn cẩn thận, có mùng để tránh
muỗi đốt nhằm ngăn ngừa sự phát tán virus.
3.2.2 Phương pháp nuôi gà và vịt
Gà và vịt được nuôi trong chuồng lồng bằng lưới sắt và được úm bằng đèn 75W,
trong chuồng có máng ăn, máng uống đầy đủ, và được cho ăn tự do.

14


Gà và vịt được phủ mùng che chắn tránh muỗi đốt, tránh làm phán tán mầm bệnh
ra xung quanh sau khi gây nhiễm. Tất cả gà, vịt thí nghiệm được nuôi dưỡng, chăm

sóc trong cùng điều kiện.
3.2.3 Bố trí thí nghiệm
Trước khi gây nhiễm cho heo, gà vịt phải lấy máu kiểm tra kháng thể thụ động bằng
phản ứng HI. Chỉ chọn những động vật âm tính với kháng thể kháng virus VNNB.
Đối với heo
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, trong đó có 1
nghiệm thức đối chứng và 4 nghiệm thức được gây nhiễm tương ứng với 4 đường
tiêm khác nhau: tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, phúc mạc và dưới da. Heo được tiêm 1ml
huyễn dịch chứa 5.000 liều gây chết 50% chuột ổ (5.000LD50SMIC/1ml).
Heo được đánh số tai theo thứ tự từ 1 đến 9.
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm virus VNNB chủng CTMP-7 trên heo

Đường tiêm
Tĩnh mạch
Bắp
Phúc mạc
Dưới da
Đối chứng

Số lượng (con)
2
2
2
2
1

Liều/con
5.10 LD50SMIC/1ml
5.10 3LD50SMIC/1ml
5.10 3LD50SMIC/1ml

5.10 3LD50SMIC/1ml
PBS/1ml
3

Đối với gà
Thí nghiệm cũng được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức, trong đó
có 1 nghiệm thức đối chứng và 3 nghiệm thức gây nhiễm tương ứng với 3 đường
tiêm khác nhau là tiêm bắp, tiêm dưới da cánh, tiêm phúc mạc. Gà được tiêm 0,5ml
huyễn dịch chứa 5000 liều gây chết 50% chuột ổ (5.000LD50/0,5ml).
Gà được đeo số ở chân để phân biệt giữa các cá thể trong cùng nghiệm thức. Qui
ước đánh số như sau:
Kí hiệu chữ cái đầu chỉ đường tiêm và chữ số sau chỉ số thứ tự của từng con.
Ví dụ: đường tiêm bắp có số thứ tự là 1 thì sẽ là B1, tiếp theo sẽ là B2, B3…B6.
Tương tự cho 2 đường còn lại. Dưới da cánh là D1, D2… D6, tiêm phúc mạc sẽ là
P1, P2 … P6.
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm virus VNNB chủng CTMP-7 trên gà

Đường tiêm
Bắp thịt
Da cánh
Phúc mạc
Đối chứng

Số lượng (con)
6
6
6
6

15

Liều/con
5.10 LD50SMIC/0,5ml
5.103LD50SMIC/0,5ml
5.103LD50SMIC/0,5ml
PBS/0,5ml
3


Đối với vịt
Vịt thí nghiệm được bố trí và đánh số tương tự như gà.
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm virus VNNB chủng CTMP-7 trên vịt

Số lượng (con)
5
5
5
5

Đường tiêm
Bắp thịt
Da cánh
Phúc mạc
Đối chứng

Liều/con
5.10 LD50SMIC/0,5ml
5.103LD50SMIC/0,5ml
5.103LD50SMIC/0,5ml
PBS/0,5ml

3

3.2.4 Chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ động vật thí nghiệm chết.
Tỷ lệ động vật thí nghiệm có triệu chứng.
Tỷ lệ đáp ứng kháng thể.
Hiệu giá kháng thể trung bình (GMT).
Công thức tính hiệu giá kháng thể trung bình (GMT)
GMT = Antilog [

 log10 (mshg)/n ]

mshg: mẫu số hiệu giá
n : số mẫu dương tính
3.2.5 Thực hiện phản ứng HI để khảo sát sự đáp ứng kháng thể của động vật
sau khi gây nhiễm
Chuẩn bị hóa chất
Dung dịch Alsever (chất chống đông)
Dung dịch DVG (Dextrose-gelatin-veronal)
Dung dịch borat (pH=9)
Dung dịch BABS 0,4%
Dung dịch VAD (virus adjusting diluent)
Kháng nguyên được sử dụn với 8 đơn vị ngưng kết hồng cầu, pha loãng trong dung
dịch BABS 0,4%, để ở 4oC trong 1 giờ.
Lấy máu và chiết lấy huyết thanh
Đối với heo máu được lấy ở tĩnh mạch tai, gà lấy máu ở tĩnh mạch cánh và vịt lấy
máu tim hàng tuần, bảo quản đem về phòng thí nghiệm ly tâm chiết lấy huyết thanh.
Dùng micropipette hút lấy huyết thanh cho vào týp nhựa bảo quản ở -20oC.
Lấy máu ngỗng
Ngỗng được giữ chặt, dùng bông gòn tẩm cồn sát trùng mặt trong cánh tại vị trí

cần lấy máu, dùng ống tiêm 10ml và kim tiêm 20G vô trùng, hút 1,5ml dung dịch
alsever cho vào ống nghiệm. Sau đó lấy 8,5ml máu tĩnh mạch cánh cho vào ống
nghiệm đựng dung dịch alsever, lắc nhẹ cho tan đều.
16