Thí nghiệm Hóa sinh ĐHBK Hà Nội

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Bộ môn Vi sinh-Hóa sinh- Sinh học phân tử
------

TÓM TẮT THỰC HÀNH
THÍ NGHIỆM HÓA SINH
BF 2011

1


Hà nội, 20172018

2


Lịch Thí nghiệm
Kỳ III-Năm học 2017-2018
Tuần 6.29 (25/93-2910/103)
Phổ biến nội qui, an toàn PTN, hướng dẫn sử dụng dụng cụ, thiết bị.
Bài 1: Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl.
Tuần 7 30 (212/103-176/103)
Bài 2: Xây dựng đường chuẩn albumin cho phương pháp Lowry
Bài 3: Xác định hàm lượng protein hoà tan bằng phương pháp Lowry- Phần I. Xây dựng
đường chuẩn albumin cho phương pháp Lowry
Bài 3: Xác định hàm lượng protein hoà tan bằng phương pháp LowryPhần II. Phân tích mẫu
Tuần 8 31 (19/103-1324/103)
Bài 344. Xác định hàm lượng đường khử tổng số theo phương pháp Rodzevich.
Tuần 9 32 (1626/103-2031/103)
Nghỉ giữa kỳ
Bài 45. Xác định hàm lượng saccarose (thủy phân, DNS).

Tuần 10 33 (23/2/104-277/104)
Bài 5. Xác định hàm lượng saccarose (thủy phân, DNS).
Nghỉ giữa kỳ
Bài 6: Phân tích thành phần đường/oligosaccharit bằng sắc ký lớp mỏng.
Tuần 11 34 (309/104-314/114)
Bài 56: Phân tích thành phần đường/oligosaccharit bằng sắc ký lớp mỏng.
Bài 7: Xác định hàm lượng vitamin C bằng 2,6 diclophenolindophenol.
Tuần 12 35 (16/114-1021/114)
Bài 67: Xác định hoạt độ glucoamylase.
Bài 8: Xác định hoạt độ glucoamylase.
Tuần 13 36 (1323/114-1728/114)
Bài 78: Xác định hoạt độ protease theo Anson cải tiến.
Bài 9: Xác định hoạt độ protease theo Anson cải tiến.
Tuần 14 37(2030/114-245/115)
Bài 89: Xác định hàm lượng vitamin C bằng 2,6 diclophenolindophenol.
Bài 10: Xác định chỉ số axit của dầu mỡ.
Bài 11. Xác định chỉ số xà phòng của dầu mỡ.
Bài 12. Xác định chỉ số peroxyt của dầu mỡ.
Tuần 15 38 (277/115-112/125)
Bài 910: Xác định chỉ số axit của dầu mỡ.
Bài 101. Xác định chỉ số xà phòng của dầu mỡ.
Bài 112. Xác định chỉ số peroxyt của dầu mỡ.
3


Ôn thi
Thi kết thúc học phần theo lịch thi
Lịch thí nghiệm:
Buổi sáng: từ 7h30 đến 11h30
Buổi chiều: từ 13h30 đến 17h30

Thời gian

Thứ 3
13h30

GV phụ trách

PGS.Cô Tô Kim Anh

Cán bộ kỹ
thuật

TS. Phùng Thị Thủy

Thứ 4
13h30
TS.Thày Lê Quang
Hòa
Ths. Lê Thị Huyền

Thứ 5
13h30
PGS. Cô Tô Kim
Anh
TS. Phùng Thị Thủy

Địa điểm: Nhà C10- pPhòng 108A và 108B (bắt đầu từ 13h).
Tài liệu:

- Thí nghiệm Hoá sinh công nghiệp - Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Nguyễn Thị

Xuân Sâm. Trường Đại học Bách khoa HN 1997.
- Tài liệu Hướng dẫn thực hành, Bộ môn Hoá sinh- ĐHBK HN 2017.

Yêu cầu:
o Trước khi đến PTN thực hành, sinh viên đọc để nắm được nguyên tắc của phương
pháp, các bước tiến hành thí nghiệm, thiết lập công thức tính toán kết quả thí nghiệm.
o Có mặt đúng giờ, tham gia đầy đủ các bài thí nghiệm.
o Tuân thủ đúng các nguyên tắc an toàn phòng thí nghiệm.
Bài 1. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl

Yêu cầu chuẩn bị: đọc kỹ tài liệu
Mẫu thí nghiệm: các mẫu thực phẩm (thịt, cá, trứng, sữa, nước mắm..), được PTN chuẩn bị
Giai đoạn vô cơ hoá: (xem tài liệu Thí nghiệm Hoá sinh Công nghiệp)
Giai đoạn cất đạm (thực hiện trên bộ cất đạm lượng nhỏ)
1. Phần chuẩn bị


Kiểm tra mức nước trong bình đun (tạo
hơi nước).



Kiểm tra các khoá của bộ cất.



Cho nước máy chạy qua sinh hàn (mở
nhỏ van nước).



Đun sôi nước trong bình đun



Rửa bộ cất đạm (ống sinh hàn, bình cất)

2. Cất đạm
Mẫu thí nghiệm
Chuẩn bị bình hấp thụ NH3: Cho vào bình tam giác (cỡ 100ml, miệng rộng):
4


20 ml H3BO3 3% (dùng ống đong)
2-3 giọt chỉ thị Taxiro
Lắp bình vào bộ cất đạm (đuôi ống sinh hàn ngập trong dung dịch )
Cho vào bầu cất (lần lượt)
5 ml dịch vô cơ hoá (dung dịch dịch đạm thí nghiệm) (dùng pipet)
5 ml NaOH 40% (dùng ống đong)
2 ml H2O (để tráng phễu) (dùng pipet)
đóng khoá bầu cất
Tiến hành cất (khoảng 5-7 phút). Sau khi thấy dung dịch trong bình hấp thụ NH 3 chuyển từ màu
tím hồng xanh màu xanh đợi khoảng 5 phút. Hạ bình, dùng giấy quì tím hứng một giọt nước
ngưng chảy ra từ ống sinh hàn. Thấy giấy đổi màu, đặt bình hứng vào vị trí cũ. Khi không thấy
đổi màu, lấy bình hấp thụ ra khỏi bộ cất, tia nước cất tráng đầu cuối ống sinh hàn).
Mẫu kiểm chứng
Chuẩn bị bình hấp thụ NH3 : Cho vào bình tam giác (cỡ 100ml):
20 ml H3BO3 3% (dùng ống đong)
2-3 giọt chỉ thị Taxiro
Lắp bình vào bộ cất đạm (đầu cuối ống sinh hàn ngập trong dung dịch !)

Cho vào bầu cất:
5 ml NaOH 40% (dùng ống đong)
7 ml H2O (5 mL thay cho dịch vô cơ hoá)
đóng khoá bầu cất
Tiến hành cất (khoảng 5-7 phút) và kiểm tra tương tự như mẫu thí nghiệm, dùng giấy quì tím thử
điểm kết thúc quá trình cất
3. Định phân
Định phân lượng (NH4)2B4O7 tạo ra trong bình hấp thụ NH3 bằng H2SO4 0,1N. Điểm tương
đương của phản ứng được xác định khi dung dịch chuyển từ màu xanh qua màu tím hồng.
Ghi lượng H2SO4 0,1N dùng định phân cho mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng.
4. Yêu cầu tính toán
-

tính tổng hàm lượng nitơ của dịch cất đạm (%) biết rằng 1 ml H 2SO4 0,1N tiêu tốn cho
định phân tương ứng với 1,4 mg nitơ có trong mẫu cất;

-

giả thiết mẫu thí nghiệm là dịch vô cơ hoá protein kết tủa từ 5 g mẫu và được định mức
trong 100 ml. Hãy tính hàm lượng protein (%) trong mẫu đầu.

5


Bài 2: Xác định hàm lượng protein hoà tan bằng phương pháp Lowry
Phần Bài 2I. Xây dựng đường chuẩn albumin cho phương pháp Lowry
1. Dung dịch gốc protein chuẩn: Albumin huyết thanh bò (BSA): 0,5mg/ml (PTN pha sẵn)
2. Tiến hành:
Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm sạch (6 ống).
Hòa lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau:

Ống nghiệm

I

II

III

IV

V

VI

Dung dịch BSA (ml)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Nước cất (ml)

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

Nồng độ BSA làm
việc mg/L

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Trộn đều để yên 10 phút
Chuẩn bị các ống nghiệm (sạch, khô). Thực hiện phản ứng:
Ống nghiệm

1*

2*

3*

4*

5*

6*

Dung dịch BSA làm
việc (mL)

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

2

2

2

2

2

2

Dung dịch C (ml)
Dung dịch Folin (ml)

0,2

Trộn đều để yên 10 phút
0,2
0,2
0,2

0,2

0,2

Trộn đều bằng vortex, để yên 30 phút rồi đo độ hấp thụ tại bước sóng 750nm với mẫu đối
sánh là mẫu trong ống nghiệm số 1.
Yêu cầu: tính toán, đo và điền số liệu vào bảng tiếp theo và vẽ đồ thị đường chuẩn
Nồng độ BSA làm
việc (mg/ml)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

OD750 nm
Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm sạch (6 ống).
Hòa lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau tạo hệ nồng độ BSA (Ci)
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

Dung dịch BSA gốc

(ml)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Nước cất (ml)

Trộn đều bằng vortex,
Thực hiện phản ứng:

Ống nghiệm
Dung dịch BSA làm
việc Ci mg/ml (ml)

7

8

9

10

11

12

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

6

Dung dịch C (ml)

1

1

1

1

1

1

0,1

0,1

0,1

Trộn đều để yên 10 phút
Dung dịch Folin (ml)

0,1

0,1

0,1

Trộn đều bằng vortex, để yên 30 phút rồi đo độ hấp thụ tại bước sóng 750nm (OD750 nm) với
mẫu đối sánh là mẫu trong ống nghiệm số 7.
Yêu cầu: tính toán, đo và điền số liệu vào bảng tiếp theo và vẽ đồ thị đường chuẩn, tính R2
Nồng độ BSA Ci
(mg/ml)
OD750 nm

7


Bài 3. Bài 3: Xác định hàm lượng protein hoà tan bằng phương pháp Lowry
Xác định hàm lượng protein hoà tan bằng phương pháp Lowry
Phần II. Phân tích mẫu
1. Mẫu thí nghiệm: mẫu thực phẩm chứa protein được PTN chuẩn bị
2. Chuẩn bị dịch protein phân tích
- dùng ống đong chuẩn bị 20 ml NaOH 0,1N vào trong cốc dung tích 100 ml
- cân chính xác 0,3 g mẫu.
- chuyển mẫu vào cối, cho một ít dung dịch NaOH 0,1N từ cốc vào để làm ẩm
- nghiền nhuyễn mẫu
- chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác dung tích 100 ml.
- tráng sạch cối chày bằng dung dịch NaOH 0,1N còn lại
- đặt bình mẫu vào nồi đun cách thuỷ để chiết protein trong 15 phút
- lấy mẫu ra, làm nguội, trung hoà tới pH 7 bằng HCl 0,1N, dùng giấy pH làm chỉ thị.
- chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch. Trộn đều.
- lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích.
3. Làm phản ứng màu
Chuẩn bị các ống nghiệm khô, sạch
Mẫu thí nghiệm: Lấy vào ống nghiệm:
0,1 2 ml dịch lọc protein (dùng pipet)
1 2 ml dung dịch C (hỗn hợp dung dịch A:B=50:1 mới pha) (dùng pipet)

Trộn đều. Để yên 10 phút.
Cho tiếp 0,1 2 ml dung dịch Folin. Trộn đều
Để phản ứng 20 phút.
Mẫu kiểm chứng (làm song song với mẫu thí nghiệm ): Lấy vào ống nghiệm khác:
0,1 2 ml H2O, (dùng pipet)
1 2 ml dung dịch C,
Trộn đều. Để yên 10 phút.
Cho tiếp 0, 1 2 ml dung dịch Folin. Lắc đều
Để phản ứng 20 phút.
Đo độ hấp thụ ánh sáng
Đọc kỹ hướng dẫn sử dụng máy đo quang tại PTN
Đo độ hấp thụ của dung dịch màu của các ống thí nghiệm ở 750 nm, với dung dịch đối
sánh là mẫu kiểm chứng. Ghi kết quả.
Sử dụng đường chuẩn protein để xác định hàm lượng protein của dung dịch nghiên
cứu.
4. Yêu cầu:
-

nắm vững các thao tác thí nghiệm
8


-

tính hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm theo % (w/w)

9


Bài 344. Xác định hàm lượng đường khử tổng số theo phương pháp

Rodzevich
Mẫu thí nghiệm: hoa quả
1.
-

Chuẩn bị dịch đường phân tích
Cân chính xác 5 g mẫu cho vào cối nghiền nhỏ với một lượng nhỏ nước cất.
Chuyển mẫu vào bình tam giác 100 ml. Tráng rửa cối, chày (khoảng 30 ml).
Trung hoà mẫu đến pH=7 bằng NaOH 5% với chỉ thị phenolphtalein.
Chiết đường trong bình ổn nhiệt ở 70-80oC trong 15 phút.
Làm nguội, kết tủa protein bằng axetat chì 10%.
Loại chì dư bằng NaH2PO4 bão hoà.
Chuyển hỗn dịch vào bình định mức 100 ml, định mức tới 100 ml bằng nước cất.
Lắc đều, lọc và thu dịch lọc: dịch đường phân tích.

2. Xác định đường khử
Mẫu kiểm chứng: Bình tam giác 1 (bình 50ml):
3 ml nước cất
1 ml Felin 1
1 ml Felin 2
Trộn đều
Đun sôi 2 phút tính từ lúc xuất hiện bọt khí đầu tiên.
Làm nguội
1 ml H2SO425% (bằng ống đong), trộn đều
1 ml KI 30% (bằng pipet), trộn đều
Để phản ứng trong 20 phút.
Chuẩn độ bằng Na2S2O30,1N đến hết màu iốt (màu trắng sữa)
Mẫu thí nghiệm: Bình tam giác 2 (bình 50ml):
1 ml dịch đường phân tích
1 ml Felin 1

1 ml Felin 2
2 ml nước
Đun sôi 2 phút, tính từ lúc sôi.
Làm nguội
1 ml H2SO425% (bằng ống đong), trộn đều
1 ml KI 30% (bằng pipet), trộn đều
Để phản ứng trong 20 phút.
Chuẩn độ bằng Na2S2O30,1N đến hết màu iốt (màu trắng sữa)
Yêu cầu
-

Tính hàm lượng đường khử tổng số (%), biết rằng cứ 1 ml Na2S2O3 0,1N tương đương với 3,3
mg đường khử trong mẫu thử

-

Tham khảo thêm cách xác định đường khử theo các phương pháp khác

10


Bài 455. Xác định hàm lượng saccarose
(theo phương pháp thủy phân, xác định đường khử theo DNS)
PHẦN 1. Xây dựng đường chuẩn glucose cho phương pháp DNS (PTN tiến hành)
1. Dung dịch glucose gốc: 2 mg/ml
2. Tiến hành:


Chuẩn bị dãy dung dịch glucose chuẩn:
-

Chuẩn bị dãy ống nghiệm sạch (6 ống).

-

Hòa lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau:

Ống nghiệm

I

II

III

IV

V

VI

Dung dịch glucose
gốc (ml)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Nước cất (ml)

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

Nồng độ glucose làm
việc (mg/mL)

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

Trộn đều


Thực hiện phản ứng màu:
-

Chuẩn bị các ống nghiệm (sạch, khô).

-

Thực hiện phản ứng màu:

Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

Dung dịch glucose
chuẩn (ml)

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Dung dịch DNS (ml)

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

Trộn đều, đun sôi cách thủy đúng 5 phút , làm lạnh nhanh trong nước lạnh
Trộn đều bằng vortex. Đo độ hấp phụ tại bước sóng 540nm.
Yêu cầu: tính toán, đo và điền số liệu vào bảng tiếp theo và vẽ đồ thị đường chuẩn
Nồng độ glucose
(mg/ml)

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

OD540 nm
Dạng đồ thị đường chuẩn glucose (cần dựng)

11


PHẦN 2 . Phân tích mẫu
Mẫu thí nghiệm: nước ngọt chứa saccarose
1. Thuỷ phân saccarose
Cho vào bình cầu 1 ml mẫu (dùng pipet), thêm 19 ml nước cất (dùng ống đong) và 10 ml
HCl 5% (dùng ống đong). Lắp sinh hàn khí và đun sôi cách thuỷ 30 phút để thuỷ phân
saccarose. Làm nguội và trung hoà mẫu bằng NaOH 5% với giấy chỉ thị pH. Chuyển toàn

bộ hỗn hợp vào bình định mức cỡ 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch mức. Lắc đều,
được dịch đường khử sau thuỷ phân.
2. Dịch đường khử trước thuỷ phân
Dùng pipet cho 1 ml dịch mẫu nước ngọt vào bình định mức cỡ 100 ml. Định mức bằng
nước cất tới vạch mức. Lắc đều, được dịch đường khử trước thuỷ phân.
3. Xác định đường khử theo phương pháp axit dinitro salicylic (DNS)
Mẫu sau thuỷ phân: ống 1
0,5 ml dịch đường khử sau thuỷ phân (pha loãng nếu cần, dùng pipet)
1,5 ml DNS (dùng pipet)
Đun sôi cách thuỷ 5 phút (khi nồi cách thủy sôi mới cho mẫu vào)
Làm nguội nhanh.
Đo mật độ quang ở =540 nm.
Mẫu trước thuỷ phân: ống 2
0,5 ml dịch đường khử trước thuỷ phân(dùng pipet)
1,5 ml DNS
Đun sôi cách thuỷ 5 phút
Làm nguội nhanh.
Đo mật độ quang ở =540 nm.
Mẫu kiểm chứng: ống 3
12


0,5 ml nước cất (dùng pipet)
1,5 ml DNS
Đun sôi cách thuỷ 5 phút
Làm nguội nhanh.
Sử dụng làm mẫu blank khi chuẩn bị máy đo.
Lưu ý: Trong trường hợp hai độ pha loãng của mẫu thủy phân và mẫu trước thủy phân
là như nhau, không cần làm mẫu kiểm chứng. Khi đó, sử dụng mẫu trước
thủy phân làm mẫu blank để chuẩn bị máy đo.

Từ giá trị mật độ quang đo được cho mẫu trước và sau thuỷ phân, tra đồ thị chuẩn giữa hàm
lượng glucose và mật độ quang suy ra hàm lượng đường khử có trong dịch đường trước và sau
thuỷ phân (mg/ml).
Yêu cầu:
-

Tính hàm lượng saccarose theo %

-

Tham khảo thêm cách xác định saccarose theo các phương pháp khác

PHẦN 1. Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp DNS
1. Dung dịch glucose gốc: 2 mg/ml
2. Tiến hành:
Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm sạch (6 ống).
Chuẩn bị hệ nồng độ glucose (Ci) theo bảng sau:
Thực hiện phản ứng: Bổ sung DNS vào các ống nghiệm
1
2
3
Ống nghiệm

4

5

6

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Nước cất (ml)

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Dung dịch DNS (ml)

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

Dung dịch glucose
gốc (ml)

Trộn đều, đun sôi cách thủy 5 phút, làm lạnh nhanh trong nước lạnh
Đo độ hấp phụ tại bước sóng 540nm với mẫu trắng là mẫu trong ống nghiệm 1.
Yêu cầu: tính toán, đo và điền số liệu vào bảng tiếp theo và vẽ đồ thị đường chuẩn
Nồng độ glucose Ci
(mg/ml)
OD540 nm

13


Dạng đồ thị đường chuẩn glucose (cần dựng)

PHẦN 2 . Phân tích mẫu
Mẫu thí nghiệm: nước ngọt chứa saccarose
4. Thuỷ phân saccarose
Cho vào bình cầu 0,1 ml mẫu (dùng pipet), thêm 19 ml nước cất (dùng ống đong) và 10 ml
HCl 5% (dùng ống đong). Lắp sinh hàn khí và đun sôi cách thuỷ 30 phút để thuỷ phân
saccarose. Làm nguội và trung hoà mẫu bằng NaOH 5% với giấy chỉ thị pH. Chuyển toàn

14


bộ hỗn hợp vào bình định mức cỡ 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch mức. Lắc đều,
được dịch đường khử sau thuỷ phân.
5. Dịch đường khử trước thuỷ phân
Dùng pipet cho 0,1 ml dịch mẫu nước ngọt vào bình định mức cỡ 100 ml. Định mức bằng
nước cất tới vạch mức. Lắc đều, được dịch đường khử trước thuỷ phân.
6. Xác định đường khử theo phương pháp axit dinitro salicylic (DNS)
Mẫu sau thuỷ phân: ống 1
0,5 ml dịch đường khử sau thuỷ phân (pha loãng nếu cần, dùng pipet)
1,5 ml DNS (dùng pipet)
Đun sôi cách thuỷ 5 phút (khi nồi cách thủy sôi mới cho mẫu vào)
Làm nguội nhanh.
Đo mật độ quang (=540 nm) với mẫu trắng là nước cất.
Mẫu trước thuỷ phân: ống 2
0,5 ml dịch đường khử trước thuỷ phân (dùng pipet)
1,5 ml DNS
Đun sôi cách thuỷ 5 phút
Làm nguội nhanh.
Đo mật độ quang (=540 nm) với mẫu trắng là nước cất.
Từ giá trị mật độ quang đo được cho mẫu trước và sau thuỷ phân, tra đồ thị chuẩn giữa hàm
lượng glucose và mật độ quang suy ra hàm lượng đường khử có trong dịch đường trước và sau
thuỷ phân (mg/ml).
(cũng có thể đo độ hấp thụ của mẫu thí nghiệm, đối sánh với mẫu kiểm chứng)
Yêu cầu:
-

Tính hàm lượng saccarose theo %

-

Tham khảo thêm cách xác định saccarose theo các phương pháp khác

Bài 566. Phân tích thành phần đường/oligosaccharit
bằng phương pháp sắc kí bản mỏng
- Mẫu phân tích: chế phẩm đường chức năng
- Hệ dung môi: hỗn hợp n-propanol: nitromethan: nước = 7:1:2 (v/v/v)
- Bản sắc ký: Sắc ký bản mỏng, Meck, Silicagel 20x20cm
- Chuẩn bị bản sắc ký: Cắt bản sắc ký theo kích thước ở hình dưới, lưu ý đi găng tay và giữ
sạch bản mỏng
15


.

Đường chấm mẫu
2 cm
- Chấm mẫu
Đánh dấu vị trí và tên mẫu
Các thao tác được thực hiện như sau:
- Lấy 10 l mẫu bằng ống mao quản thuỷ tinh
- Chấm mẫu vào vị trí qui định, đường kính vết loang không vượt quá 5 mm.
- Chạy sắc kí
-

Đặt bản sắc kí đã chấm mẫu vào bình sắc ký có chứa dung môi hữu cơ đã bão hoà hơi dung
môi, mép dưới bản sắc kí được nhúng vào dung môi sao cho không ngâm ngập mẫu trong
dung môi, mặt chấm mẫu hướng xuống phía dưới.

-

quá trình chạy được kết thúc khi vệt chạy của dung môi cách mép trên của tờ sắc kí 1cm

-

lấy bản sắc kí ra, đánh dấu vị trí của vệt dung môi

-

sấy khô bản sắc kí

- Phát hiện mẫu
- phun đều dung dịch H2SO4 5% trong cồn tuyệt đối lên bản sắc kí (hoặc nhúng nhanh bản
sắc kí vào khay đựng dung dịch hiện màu trên)
- sấy khô bản sắc ký ở 110 0C trong 5 phút (hoặc hơ bản mỏng trên bếp điện), xuất hiện dần
các vết màu.
- Ghi kết quả
-

xác định hệ số Rf của các đường/oligosaccharit

-

xác định tên và vị trí của các đường/oligosaccharit có trong mẫu phân tích
Ghi chú: Nguyên tắc chung của phương pháp TLC được trình bày trong chương Lipit

Bài 7. Xác định hàm lượng vitamin C
(phương pháp chuẩn độ bằng 2,6 diclophenolindophenol-2,6DCIP)
Mẫu thí nghiệm: các loại rau, hoa quả, mẫu vitamin

Chuẩn bị dịch chiết vitamin C phân tích
Cân chính xác 10 g mẫu, cho vào cối, nghiền ngập trong axit HCl 1%. Chuyển mẫu vào
bình định mức cỡ 100 ml. Định mức tới vạch bằng HCl 1%. Lắc đều, lọc và thu dịch lọc
vitamin C phân tích.
16


(Lượng mẫu được lấy sao cho nồng độ vitamin C nằm trong khoảng 0,5 mg/ml)
Chuẩn độ
Mẫu thí nghiệm: Bình tam giác 1 (cỡ 50 ml):
10 ml dịch lọc vitamin C phân tích (dùng pipet)
5 ml Oxalatamon bão hoà (dùng pipet)
Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút,
được a ml
Mẫu kiểm chứng: Bình tam giác 2 (cỡ 50ml):
10 ml HCl 1% (dùng pipet)
5 ml Oxalatamon bão hoà
Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút,
được b ml
Xác định hệ số f
Bình tam giác 3 (cỡ 50ml):
5 ml dịch vitamin C tinh khiết pha trong H2SO4 2% (dùng pipet)
2,5 ml Oxalatamon bão hoà
Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút,
được a1 ml
Bình tam giác 4 (cỡ 50ml):
5 ml dịch vitamin C tinh khiết
Vài hạt tinh thể KI
5 giọt hồ tinh bột
Chuẩn bằng KIO3 0,001N cho đến khi dung dịch xuất hiện màu xanh, được b1 ml

Yêu cầu:
- tính hệ số f hoặc xác định nồng độ 2,6 DCIP dùng trong phân tích. Hệ số f được tính : f = b 1 /
a1
- Tính hàm lượng vitamin C trong mẫu thí nghiệm theo mg%
Biết 1 ml 2,6 DCIP 0,001 N tương ứng với 0,088 mg vitamin C

17


Bài 768. Xác định hoạt độ glucoamylase
(Theo phương pháp DNS)
Nguồn enzym: chế phẩm Distillase (Dupont) do PTN cung cấp
Cơ chất: dung dịch hồ tinh bột 1%
Định nghĩa đơn vị hoạt độ glucoamylase: Một đơn vị hoạt độ glucoamylase được định nghĩa
là lượng enzym cần thiết trong thời gian 1 giờ ở 30 oC tác dụng lên tinh bột tan giải phóng được
1 mg glucose.
Xác định hoạt độ enzyme (Làm song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng)
Các bước
tiến hành

Ống nghiệm 1 (mẫu thí nghiệm)

Chuẩn bị

Đun sôi nước trong nồi cách thủy

Ống nghiệm 2 (mẫu kiểm chứng)

Đặt bình Chuẩn bị bình ổn nhiệt ở
300C

Đưa các dung dịch tinh bột và
lọ/ống chứa dung dịch enzym trong
bể ổn nhiệt lên 300C (để vào bình
điều nhiệt đã ở 300C trtrong 10
phút. )
Bước 1:

Phản ứng xúc tác của enzim

Vô hoạt enzyme

- 0,.5ml dịch enzym phân tích (đã ở 30oC)
- 0,.5 ml dung dịch hồ tinh bột 1% (đã ở 30oC)

0.5ml dịch enzym phân tích
3 ml DNS
Trộng đều. Để 10 phút

- Trộn đều và để phản ứng đúng 10
phút ở 30oC
Bước 2

Vô hoạt enzyme
-

Bước 3

-

0,5ml dịch enzym phân tích

Bổ sung 3 ml DNS, trộn đều - 3 ml DNS
(sau đó đặt ống nghiệm vào giá - 0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%,
trong nồi cách thủy)
Trộn đều (sau đó đặt ống nghiệm vào
giá trong nồi cách thủy)

Định lượng sản phẩm tạo thành:

Định lượng sản phẩm

- Đun sôi cách thuỷ 5 phút (khi nồi cách thủy sôi mới cho mẫu vào)

0.5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%,
Trộn đều

-

Đun sôi cách thuỷ 5 phút (khi nồi
cách thủy sôi mới cho mẫu vào)

-

Làm nguội nhanh.

-

Làm nguội nhanh.

18

Bước 4

-

Đo mật độ quang (=540 nm) đối sánh với mẫu kiểm chứng

Yêu cầu:
Sử dụng đường chuẩn glucose đã dựng trong bài 4 5 để tính toán hoạt độ glucoamylase của chế
phẩm (U/ml chế phẩm thô).

19


Bài 978. Xác định hoạt độ protease
(Theo phương pháp Anson cải tiến)
PHẦN 1. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN TYROSIN (PTN tiến hành)
Pha dung dịch tyrosine gốc 0,5 µmol/ml (cân 0,905 mg tyrosine pha trong 10 ml nước cất)
Pha dãy nồng độ theo bảng sau:Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

Dung dịch
tTyrosine
0,.5µmol/ml (ml)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Nước cất (ml)
Trộn đều,
Tổng dịch (ml)

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Làm phản ứng màu
Dung dịch Na2CO3
0,5 M (ml)

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

0,5

0,5

0,5

Trộn đều, để 10 phút
Dung dịch Folin
(ml)

0,5

0,5

0,5

Trộn đều, để 30 phút, đo OD 750 nm, đối sánh với nước cất
Dạng đồ thị đường chuẩn cần dựng

20


PHẦN 2. PHÂN TÍCH MẪU
Mẫu enzym cần phân tích: chế phẩm Alcalase của Novozyme
Cơ chất: dung dịch casein 1% pha trong đệm pH 7 (Cán bộ PTN hướng dẫn SV cách pha)
ĐỊnh nghĩa đơn vị hoạt độ protease: 1 đơn vị hoạt độ protease là lượng enzym cần thiết trong

thời gian 1 phút ở 30oC chuyển hoá được casein thành một lượng sản phẩm không bị kết tủa bởi
axit tricloacetic tương đương với 1 mol tyrosine
Phản ứng enzym với cơ chất (Làm song song ống thí nghiệm và ống kiểm chứng)
Chuẩn bị: Đặt lọ đựng dung dịch casein và ống đựng enzym cần xác định hoạt độ vào trong bình
ổn nhiệt 30oC trong 10 phút
Lấy các ống nghiệm khô, sạch:
Ống thí nghiệm
Ống kiểm chứng
2 ml dung dịch casein 1% pha trong đệm pH 7
2 ml dịch enzym pha trong đệm pH 7
0
(đã ở 30 C)
Bổ sung 4 ml TCA 0,3M
2 ml dịch enzym pha trong đệm pH 7 (đã ở
Trộn đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt
0
30 C)
độ phòng
Trộn đều, để phản ứng trong đúng 10 phút ở
2 ml dung dịch cơ chất casein 1% pha
o
30 C
trong đệm pH 7 (đã ở 30oC)
Dừng phản ứng enzym bằng 4 ml TCA 0,3M
4 ml TCA 0,3M
Trộn đều và để yên hỗn hợp trong 20 phút
2 ml dịch enzym pha trong đệm pH 7
Lọc, thu được dịch lọc thí nghiệm
(đã ủ ở 30oC)
Trộn đều, để yên hỗn hợp trong 20 phút

Lọc, thu được dịch lọc kiểm chứng

Xác định sản phẩm phản ứng enzym
(Làm song song ống thí nghiệm và ống kiểm chứng)
Ống thí nghiệm
0,3 ml dịch lọc thí nghiệm (dùng pipet)
1,5 ml Na2CO3 0,5M (dùng pipet)
Trộn đều, để 10 phút
Thêm 0,3 ml dung dịch Folin.
Trộn đều, đĐể 320 phút.

Ống kiểm chứng
0,3 ml dịch lọc kiểm chứng
1,5 ml Na2CO3 0,5M
Trộn đều, để 10 phút
Thêm 0,3 ml dung dịch Folin.
Trộn đều, đĐể 320 phút.

Đo OD750 nm của dịch trong ống thí nghiệm, đối sánh với dịch kiểm chứng

Tra đồ thị chuẩn giữa hàm lượng tyrosine và mật độ quang.
Yêu cầu:
-

Nắm vững nguyên tắc và cách tiến hành thí nghiệm, trong đó có cách dựng đường chuẩn
tyrosine

-

Thành lập công thức và tính hoạt độ protease của chế phẩm (U/ml ).

21


Bài 89. Xác định hàm lượng vitamin C
(phương pháp chuẩn độ bằng 2,6 diclophenolindophenol-2,6DCIP)
Mẫu thí nghiệm: các loại rau, hoa quả, mẫu vitamin
Chuẩn bị dịch chiết vitamin C phân tích
Cân chính xác 10 g mẫu, cho vào cối, nghiền ngập trong axit metaphosphoric 5%. Chuyển
mẫu vào bình định mức cỡ 100 ml. Định mức tới vạch bằng axit metaphosphoric 5%. Lắc
đều, lọc và thu dịch lọc vitamin C phân tích.
(Lượng mẫu được lấy sao cho nồng độ vitamin C nằm trong khoảng 0,5 mg/ml)
Chuẩn độ
Mẫu thí nghiệm: Bình tam giác 1 (cỡ 50 ml):
10 ml dịch lọc vitamin C phân tích (dùng pipet)
5 ml Oxalatamon bão hoà (dùng pipet)
Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút,
được a ml
Mẫu kiểm chứng: Bình tam giác 2 (cỡ 50ml):
10 ml HCl 1% (dùng pipet)
5 ml Oxalatamon bão hoà
Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút,
được b ml
Xác định hệ số f
Bình tam giác 3 (cỡ 50ml):
5 ml dịch vitamin C tinh khiết pha trong axit metaphosphoric 5% (dùng pipet)
2,5 ml Oxalatamon bão hoà
Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút,
được a1 ml
Bình tam giác 4 (cỡ 50ml):
5 ml dịch vitamin C tinh khiết

Vài hạt tinh thể KI
5 giọt hồ tinh bột
Chuẩn bằng KIO3 0,001N cho đến khi dung dịch xuất hiện màu xanh, được b1 ml
Yêu cầu:
- tính hệ số f hoặc xác định nồng độ 2,6 DCIP dùng trong phân tích. Hệ số f được tính : f = b 1 /
a1
22


- Tính hàm lượng vitamin C trong mẫu thí nghiệm theo mg%
Biết 1 ml 2,6 DCIP 0,001 N tương ứng với 0,088 mg vitamin C

Bài 91010-1212. Xác định các chỉ số axit, xà phòng, peroxyt của dầu thực vật
(Theo sách Thí nghiệm Hoá sinh)

23