Thí nghiệm hóa sinh và thực hành MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN (Tải: https://link1s.com/yHqvN)

KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN
I. Phương pháp tủa bằng các tác nhân gây tủa là dung môi hữu cơ (Ethanol 80%,
Aceton)
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó
là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện
môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử
protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các
dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân
tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết
tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách
thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein. Sự tủa bằng
aceton hoặc ethanol 80% có nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết
với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi
thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt
gió.
II. Phương pháp tủa bằng muối
Người ta có thể dùng muối (NH
4
)
2
SO
4
, NaCl… để tủa protein vì các muối này vừa
làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại
bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ
muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của
chúng.
Phần thí nghiệm
1. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ

Pipet 5ml, 10ml
Becher 50ml, 100ml, 250ml
Bình tia
Máy ly tâm
Hóa chất
Nguyên liệu thơm (dứa)
Etanol 96%
Muối (NH
4
)
2
SO
4
2. Thực hành
Cân khoảng 80g đến 100g thơm, giã nát vắt lấy nước rồi ly tâm ở 6000 vòng/phút
trong 15 phút rồi đong xem thể tích của nước thơm là bao nhiêu, ghi nhận thể tích V. Sau đó
chia đôi thể tích V nước thơm vùa thu được thành hai phần bằng nhau rồi tiến hành tủa
protein bắng hai tác nhân tủa khác nhau: Ethanol 80% và muối (NH
4
)
2
SO
4
1
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Quy trình kết tủa enzym Bromelin bằng cồn 80%

Lưu ý: Phối trộn cồn với dịch dứa theo tỉ lệ 4:1 (1 dứa : 4 cồn)
2
Làm sạch

Nghiền ép, xay nhuyễn
Lọc
Ly tâm 6000 v/p, trong
15 phút
Dịch trong
Chồi ngọn, vỏ quả
Bã
Bã
Tủa cồn 4
o
C / 2 giờ
Ly tâm 6000 v/p, trong
20 phút
Thu tủa
Sấy khô
Bromelin
Bỏ
dịch
trong
cồn 80%, làm
lạnh 4
0
C
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Quy trình thu nhận enzym Bromelin bằng muối (NH
4
)
2
SO
4

Lưu ý: Để có muối(NH
4
)
2
SO
4
bão hòa 70% ta phối trộn với tỷ lệ 47,2g muối trong 100ml
nước thơm.
3
Làm sạch
Nghiền ép, xay nhuyễn
Lọc
Ly tâm 6000 v/p, 15 –
20phút
Bã
Bã
Chồi ngọn, vỏ quả
Hỗn hợp dịch dứa, để ở
nhiệt độ phòng 30 phút
Ly tâm 6000 v/p, trong
15 phút
Thu tủa
Bỏ
dịch
trong
Sấy khô
Bromelin
Dịch trong
Ammonium
sulfate 70%

bão hòa
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
3. Kết quả: Hãy tính hàm lượng protein có trong 100g nguyên liệu ban đầu.
III. Phương pháp tủa protein bằng điểm đẳng điện.
1. Nguyên tắc
Giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa điện gọi là điểm đẳng điện của protein
(pI), ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện sẽ không chuyển dịch trong điện
trường, phân tử protein sẽ kém bền nhất dễ kết tủa.
Người ta lợi dụng tính chất này để kết tủa protein.
2. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ
Máy khuất từ
Máy ly tâm
Cân phân tích
Bercher 100ml, 250ml
Pipet 5ml, 10ml
Hóa chất
Dung dịch NaOH 20%
Dung dịch HCl 10%
Ete
Etanol
Giấy pH
3. Thực hành
Tách chiết protein cá:
Cân 100g cá đã xay nhuyễn trong một bercher rồi cho 4 lần nước. (1 cá : 4 nước, g/l)
Khuấy đều rồi cho từ từ NaOH 20% vừa cho vừa khuấy cho đến pH 11 thử bằng giấy pH,
khuấy khoảng 45 phút rồi ly tâm, giữ lại dịch chiết trong một bercher 250ml, bã còn lại thêm
nước chiết tiếp lần hai rồi ly tâm lấy dịch bỏ bã. Dịch thu được cho vào bercher 250ml gộp
chung với phần dịch chiết bên trên.
Cho từ từ HCl 100% vào dịch chiết vừa cho vừa khuấy đến pH thích hợp là 6 sẽ thấy

kết tủa, ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút, rồi bỏ dịch thu tủa protein, rửa tủa với ete :
ethanol với tỷ lệ 2:1, tủa protein sạch khi rửa tủa vài lần với ete : ethanol. Cân lượng tủa
protein thu được (mg tủa) để tính ra hiệu suất protein có trong 100g cá.
4
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYM BROMELIN
(Xác định hoạt tính enzym Bromelin bằng phương pháp Anson cải tiến)
1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym Bromelin có
trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng
dung dịch acid trichloracetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy
phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để tính
lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên.
2. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ
Ống nghiệm
Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml
Máy quang phổ
Becher 50ml, 250ml, 500ml
Bình tia
Hóa chất
Dung dịch Casein 1%
Dung dịch TCA 5%
Dung dịch NaOH 0,5N
Thuốc thử Folin
Dung dịch HCl 0,2N
Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 mM/l trong
dung dịch HCl 0,2N
3. Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin
Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1 2 3 4 5 6
Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0
Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10
Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3
Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm
Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường
chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = OD
TN
– OD
TK
).
5
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
4. Phương pháp tiến hành
Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không
Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính
Dung dịch hóa chất
Ống nghiệm
Thử thật Thử không
Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10
Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 35,5
o
C trong 20 phút
Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0
Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong

Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật và
cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không.
Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau
10 phút đo OD ở bước sóng 660nm. Tính ΔOD = OD
TT
– OD
TK
, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn
suy ra được số µM Tyrosin.
5. Tính kết quả
Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều
kiện thí nghiệm (35,5
0
C: pH 7,6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa
tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm
tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn.
Hđ Protease =
)(
**
*sin*
UI
vmt
LVTyroM
µ
Với: Hđ Protease : hoạt độ enzym protease (UI/g)
V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)
v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)
t : thời gian thủy phân (phút)
m : khối lượng mẫu enzym đem đi xác định hoạt tính (g)
L: độ pha loãng enzym

µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH INVERTASE
6
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
I. Nguyên tắc:
Invertase là một enzym thủy giải saccharose thành glucose và fructose.
Trong bài này ta dùng enzym invertase trích trong men bia để cho thủy giải
saccharose, từ đó tính được hoạt tính của enzym này.
II. Dụng cụ và thuốc thử
Dụng cụ
Becher 100ml – 250ml
Erlen 250ml
Ống nghiệm 50ml
Pipet 5ml – 10ml
Buret 25ml
Phễu lọc
Hóa chất
dung dịch saccharose 10%
dung dịch NaOH N/10
Dung dịch Iod N/10
Dung dịch H
2
SO
4
N
Hồ tinh bột 1%
Dung dịch Na
2
S
2

O
3
N/20
III. Cách tiến hành
Điều chế dung dịch invertase: cân 0,5g men bia hòa tan trong 50ml nước cất. Khuấy
đều trong 5 phút. Để lắng đem lọc lấy dịch lọc.
Thực hiện ba ống nghiệm như sau:
Số ống 1 2 3
ml dung dịch saccharose 10%
ml nước cất
ml enzym invertase
ml enzym invertase đã đun sôi
10
10
10
10
10
10
Để thủy giải trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp đó, đem tất cả các ống đun cách
thủy trong 2 phút, làm lạnh dưới vòi nước.
Hút 5 ml của hỗn hợp cho vào một erlen 250ml và định phân đường glucose như sau:
cho thêm vào bình 10ml dung dịch Iod N/10 và 15 ml dung dịch NaOH N/10. Thời gian nhỏ
NaOH phải kéo dài khoảng 2 phút (nhỏ từng giọt). Để yên trong bóng tối 15 -20 phút. Lấy ra
thêm vào 2ml dung dịch H
2
SO
4
N. Định phân lượng iod thêm còn thừa bằng dung dịch
Na
2

S
2
O
3
N/20 (dùng hồ tinh bột cho thêm vào lúc cuối phản ứng để làm chất chỉ thị màu).
IV. Kết quả
7
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Hoạt tính của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose thủy giải bởi lượng
enzym invertase có trong 1g men bia trong 1 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Gọi V
1
và V
2
là số ml Na
2
S
2
O
3
N/20 dùng định phân ống số 1 và số 2.
Có nhận xét gì về kết quả định phân trong ống số 3?
Hoạt tính invertase được tính theo công thức sau:
phútgmol
mtba
BAVV
//
**22010
**)(
3

21
∗∗∗∗
−
a: thể tích lấy ra trong mỗi ống để định đường glucose (ml)
A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống (ml)
b: thể tích dung dịch enzym cho vào mỗi ống (ml)
B: tổng thể tích dung dịch enzym có được từ m
g
– men (ml)
t: thời gian thủy giải tính bằng phút.
XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM ALPHA – AMYLASE
8
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
(THEO PHƯƠNG PHÁP SMITH & ROE)
I. Nguyên tắc:
Hoạt tính α - amylase biểu thị khả năng của enzym amylase xúc tác phản ứng thủy
phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50
0
C và được thể hiện bằng số đơn vị của enzym
trong 1g mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được thủy
phân hủy sẽ tạo phản ứng màu với iod và được so màu bằng máy so màu quang học ở bước
sóng 620 nm.
II. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ
Bình định mức 50ml, 100ml, 250ml
Bếp ổn nhiệt
Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml
Becher 50ml, 100ml, 250ml
Máy quang phổ
Hóa chất

Cồn 96
0

Dung dịch tinh bột 1% trong đệm pH 5,6
Dung dịch HCl 1N
Dung dịch NaCl 3%
Thuốc thử Lugol
III. Thực hành
1. Ly trích Amylase
Amylase là 1 tạp chất protein không tan trong rượu mạnh. Cân 10g lúa nảy mầm cho
vào cối với 30ml nước cất, giã nát lúa dưới nước. Để yên trong 15 phút, đem lọc. Lấy tất cả
nước qua lọc, thêm 4 lần thể tích cồn 96
0
. Khuấy đều, ta sẽ thấy amylase và các protein khác
tủa dưới dạng nùi lớn.
Để lắng, ly tâm lấy tủa. Hòa tan tủa trong 20ml nước cất. Ta có dung dịch amylase
khá tinh sạch. Đặc biệt dung dịch này không có chất đường khử (thử 1ml dung dịch thuốc
thử Fehling, đun cách thủy 3 phút, ta không có kết tủa đỏ xuất hiện)
2. Khảo sát hoạt tính α-amylase
9
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Lấy sáu ống nghiệm chia thành 2 lô, mỗi lô 3 ống nghiệm gồm thử thật và thử không
để lấy trung bình.
Tiến hành thí nghiệm theo bảng sau:
Dung dịch hóa chất
Ống nghiệm
Ống thử thật (t) Ống thử không (o)
Nước cất (ml) 0 1
Dịch chiết α - amylase 1 0
Dung dịch đệm (ml) 1 1

Dung dịch tinh bột 1% (ml) 1 1
Dung dịch NaCl 3% (ml) 0,5 0,5
Dung dịch HCl 1N (ml) 0 1
Đem ủ ở 50
0
C trong 30 phút
Dung dịch HCl 1N (ml) 1 0
Nước cất (ml) 5,5 5,5
Thuốc thử Lugol (ml) 0,5 0,5
Lắc đều hỗn hợp trong ống nghiệm rồi mang đi so màu ở bước sóng 620nm
IV. Kết quả:
Hđ A=
)(
*
**)(
0
0
UI
tOD
LCODOD
t
−
Với OD
0
: mật độ quang của ống thử không
OD
t:
mật độ quang của ống thử thật
C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (mg)
T: thời gian phản ứng (phút)

L: hệ số pha loãng mẫu enzym.
XÁC ĐỊNH ĐẠM TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL
I. Vô cơ hóa:
10
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
• Nguyên tắc: Sự vô cơ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù nằm dưới dạng
nào (hữu cơ, vô cơ, protein) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfat (NH
4
)
2
SO
4
bằng
cách đun sôi với H
2
SO
4
đậm đặc và chất xúc tác.
• Thực hành: hút chính xác 1ml nếu là nguyên liệu lỏng hay cân chính xác 1g nếu là
nguyên liệu khô đã nghiền nhuyễn để cho đồng nhất, cho vào một bình cổ cao có dung
tích từ 60ml đến 100ml (bình kjeldahl). Thêm vào đó 5ml H
2
SO
4
đậm đặc và khoảng
0,5g chất xúc tác. Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc từ 2 đến 3 giờ cho đến khi dung
dịch trở thành trong suốt và có màu xanh do trời nhạt. Để nguội và pha loãng thành
100ml với nước.
Chất xúc tác dùng ở đây là hỗn hợp đã xay nhuyễn của: K
2

SO
4
và CuSO
4
có tỷ lệ theo
trọng lượng là 9: 1
Thực hiện 3 sự thử thật (có chất đạm) và 3 sự thử không có chất đạm (thay chất đạm
bằng nước cất)
II. Phương pháp kjeldahl:
• Nguyên tắc: Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng Amonium sulfat đem cho tác
dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac
Sau đó lượng amoniac được hơi nước nôi cuốn bằng một dụng cụ máy Parnas – Wargner
và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H
2
SO
4.
Từ đây cho phép chúng
ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có
trong mẫu nguyên liệu.
• Dụng cụ và hóa chất:
Dụng cụ:
- Máy cất đạm Parnas – Wargner
- Bình kjeldahl
- Bếp đun
11
Chất đạm (NH
4
)
2
SO

4
H
2
SO
4
đậm đặc
Xúc tác, t
0
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH 2NH
4
OH + Na
2
SO
4
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
- Bình xịt nước cất
- Becher 250 ml, 100ml, 50ml
- Erlen 250ml
- Bình định mức 100ml, 50ml
- Buret 25ml
- Pipet 1ml, 5ml, 10ml, 20ml.
- ống đong 25ml

Hóa chất:

- Dung dịch NaOH đậm đặc (10N)
- Dung dịch H
2
SO
4
N/100
- Dung dịch NaOH N/100 (dung dịch
này sau khi pha xong dùng ngày thì
đúng nồng độ, nhưng để lâu sẽ bị
carbonat hóa nên nồng độ không còn
đúng như ban đầu, vì thế phải xác
định lại hệ số chỉnh lý x bằng cách
định phân nó với dung dịch acid
chuẩn (acid oxalic, acid phtalic…)
- Dung dịch đỏ metil 0,5% pha trong
rượu etylic.
• Cách thực hành:
Đun sôi bình nước máy Parnas – Wargner. Đặt erlen có chứa 25ml H
2
SO
4
N/100 và vài
giọt đỏ metil vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng chìm vào dung dịch. Hút
10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng thành 100ml, đem đổ vào máy Parnas – Wargner;
thêm vào đó 10ml NaOH đậm đặc ( ghi nhó là khi cho mẫu cũng như NaOH đậm đặc vào
máy, phải cho xuống từ từ bằng kẹp Mohr, nếu cho chảy xuống quá nhanh thì dung dịch sẽ
bị máy hút ra ngoài). Tiếp tục đun sôi bình nước và để cho hơi nước lôi cuốn amoniac sang
erlen trong 3 phút, hạ erlen xuống và tiếp tục đun thêm 2 phút nữa, tráng vòi của máy bằng
một tia nước cất, tất cả đều cho chảy vào erlen đựng H
2

SO
4
N/100. Lấy erlen ra và định phân
H
2
SO
4
thừa bằng dung dịch NaOH có chuẩn độ là x N/100 cho đều. Khi dung dịch đổi màu
(từ màu hồng nhạt sang màu da cam): thực hiện 3 sự thử thuật và 3 sự thử không để lấy trị số
trung bình.
• Cách tính:
Nếu nguyên liệu là chất lỏng, thông thường lượng đạm được tính bằng số gam đạm trong
1 lít, nếu nguyên liệu là chất rắn, thì trước hết phải tính độ ẩm, sau đó lượng đạm đươc tính
bằng phần trăm (số gam đạm có trong 100g nguyên chất liệu) theo độ khô tuyệt đối)
Giả sử nguyên liệu là chất lỏng. Lấy 1ml nguyên liệu đem vô cơ hóa và pha loãng thành
100ml, sau đó hút 10ml đem chưng cất bằng máy Parnas – Wargner.
Gọi V
0
là thể tích dung dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử không).
Gọi V
t
thể tích dụng dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử thật).
Vậy:
t
VVV −=∆
0
12
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
là lượng NaOH tương đương với lượng amoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vô cơ hóa
đã pha loãng.

1mol amoniac tương đương với 1mol NaOH.
Do đó số mol amoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là:
molVxmol
Vx
C
M
5
10
1000
)100/1(
−
∆=
∆
=
Số gam đạm có trong 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là:
gxV
5
10 14
−
∆
Số gam đạm có trong 1000gl dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng hay trong 1ml nguyên liệu
gVx
Vx
4
5
10.14
10
100.10 14
−
−

∆=
∆
Số gam đạm có trong 1 lít nguyên liệu:
lítxgVlítgxV / 4,1/1000.10 14
4
∆=∆
−
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐƯỜNG
13
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
I. Phản ứng màu tổng quát (phản ứng Molish)
Tất cả các chất đường đều cho màu tím đối với dung dịch α – Naphthol trong H
2
SO
4
đậm đặc. Đổ trong ống nghiệm 1 ml dung dịch đường 1% và 2 giọt dung dịch α – Naphthol
15% trong rượu. Lắc đều, nghiêng ống và cho H
2
SO
4
đậm đặc từ từ theo thành ống. Có sự
tạo thành một lớp màu tím hiện ra ở mặt ngăn cách 2 chất lỏng.
II. Phân biệt giữa monosaccharid và disaccharid (phản ứng Barfoed)
Khả năng khử của những monosaccharid có thể lớn hơn nhiều khả năng khử của
disaccharid cho nên, thay vì sử khử ở môi trường base, sự khử ở môi trường acid yếu có thể
giúp ta phân biệt được monosaccharid và disaccharid.
Trong ống nghiệm đựng 2ml thuốc thử Barfoed, ta thêm vào 1ml dung dịch đường
muốn khảo sát.
Ta thực hiện đồng thời ba sự thử chứng với các dung dịch glucose 1% , lactose 1% và
nước cất. Đun sôi cách thủy trong 5 phút. Làm lạnh, quan sát ống có trầm hiện đỏ. Đun tiếp

tục 8 phút, quan sát ống có trầm hiện đỏ.
Giải thích hiện tượng.
III. Phản ứng với thuốc khử Fehling
Thuốc khử này là dung dịch CuSO
4
với dung dịch soude đậm đặc và tartrat kép
natrium và kalium. Tác dụng của dung dịch soude đậm đặc lên CuSO
4
cho hydroxyd đồng
(CuO, H
2
O) tan trong dung dịch nhờ sự hiện diện của tartrat.
Trong một ống nghiệm, đổ 1ml thuốc thử Fehling và 1ml dung dịch glucose. Đun sôi
cách thủy trong 5 phút có trầm hiện đỏ gạch Cu
2
O nhờ sự khử đồng nhị thành đồng nhất bởi
glucose.
KHẢO SÁT LIPID
14
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
I. Khảo sát tính hòa tan của lipid
1. Nguyên tắc:
Lipid không hòa tan trong nước do có sức căng bề mặt rất cao. Nếu dùng lực cơ học
tác động vào hỗn hợp lipid nước thì chúng phân tán thành từng hạt nhỏ, nhưng ngưng tác
dụng chúng lại phân thành 2 lớp: lipid ở trên và nước ở dưới. Nếu ta thêm vào hỗn hợp các
chất muối kiềm, xà phòng, mật sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của các hạt lipid
do đó việc trở lại hai lớp khó hơn và dung dịch lúc này sẽ có màu trắng đục như sữa (nhũ
tương), lipid ở dưới dạng các hạt nhỏ liti các micell đấy là hiện tượng nhũ hóa mỡ. Nếu thay
nước bằng các dung môi hữu cơ: acetone, ether, chloroform, benzen thì lipid sẽ hòa tan vào
các dung môi nói trên.

2. Hóa chất
Dầu thực vật hay mỡ động vật
Dung môi hữu cơ: alcohol, acetone, bezen
3. Cách làm
Cho vào ba ống nghiệm:
Ống 1: 2ml alcohol
Ống 2: 2ml acetone
Ống 3: 2ml benzen
Nhỏ thêm vào mỗi ống 1 giọt dầu hoặc mỡ, lắc nhẹ, quan sát sự hòa tan của lipid
trong ba dung môi hữu cơ.
II. Khảo sát một số chỉ số đặc trưng của chất béo
1. Chỉ số acid:
Là số mg KOH dùng trung hòa các acid béo tự do trong 1g chất béo.
Nguyên tắc
Dùng KOH 0,1N trong rượu để trung hòa các chất béo tự do trong 1g nguyên liệu,
chất chỉ thị màu là phenolphtalein.
Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ
Erlen 100ml
Pipet 10ml
Becher 100ml
Bình tia
Hóa chất
KOH 0,1N
Ether ethylic
Phenolphtalein 0,5% trong alcohol
Dầu để khảo sát
Cách làm
15
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Cân 1g (1ml) chất béo cho vào erlen, thêm 10ml ether ethylic, lắc đều cho tan chất
béo. Cho 1 giọt phenolphtalein và chuẩn độ bằng KOH 0.1N cho đến khi xuất hiện màu
hồng bền trong 30 giây.
Tính toán kết quả:
Chỉ số acid = 5.61 * V/m
5,61 là số mg KOH tương ứng 1ml KOH 0.1N
V là số ml KOH
m là trọng lượng lipid đã cân (gram)
2. Chỉ số savon
Là số mg KOH cần thiết để savon hóa các ester chứa trong 1g chất béo.
Nguyên tắc:
Cho nguyên liệu kết hợp với 1 lượng thừa KOH để savon hóa chất béo. Định lượng
KOH thừa bằng HCl giúp suy ra chỉ số savon.
Dụng cụ và hóa chất:
Dụng cụ
Erlen
Pipet 10ml
Becher 100ml
Bộ chưng cất hoàn lưu
Hóa chất
KOH 0.5N trong rượu
HCl 0.5N
Ethanol tuyệt đối
Phenolphtalein 0,5% trong alcohol
Chất béo để khảo sát
Cách làm:
Cân chính xác 500mg chất béo cho vào erlen, thêm 10ml KOH 0.5N. Đun sôi hoàn
lưu 45’, định phân KOH bằng HCl 0.5N với chất chỉ thị màu là phenolphtalein. Thực hiện
một bình đối chứng thay 500mg chất béo bằng 500mg nước.
Tính toán kết quả:

Chỉ số savon = 28.05 * (V
0
– V
1
)/m
28.05 là số mg KOH tương ứng 1ml HCl 0.5N
V
0
là thể tích dung dịch HCl 0.5N của bình đối chứng
V
1
là thể tích dung dịch HCl 0.5N của bình thí nghiệm
m là trọng lượng chất béo đã cân (gram)
ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C
16
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
(Phương pháp định lượng vitamin C bằng IOD)
1. Nguyên tắc
Để xác định nhanh chóng hàm lượng vitamin C trong nguyên liệu khi có chất màu
người ta thường dùng phương pháp chuẩn độ iod. Tất cả acid ascorbic bị oxi hóa bởi iod.
Phần iod thừa sẽ cho màu xanh với dung dịch tinh bột. Điều đó nói lên là phản ứng đã kết
thúc.
2. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ
- Erlen 100ml
- Pipet 5ml, 10ml
- Buret
- Bình định mức 50ml
- Becher
- Cối chày sứ

- Phễu thủy tinh
Hóa chất
- Dung dịch HCl 5%
- Dung dịch Na
2
S
2
O
3
0,01N
- Dung dịch tinh bột 1%
- Dung dịch iod 0,01N
3. Cách thực hành
a. Chuẩn bị mẫu vật:
Cân N (g) mẫu vật và nghiền nhanh chóng trong cối sứ với 5ml HCl 5%. Vitamin C
rất dễ bị oxi hóa trong không khí nhất là khi có sự hiện diện của các ion kim loại (Fe, Cu).
Vì vậy trong khi chuẩn bị mẫu phải cắt hoặc nghiền bằng dao không rỉ và làm nhanh.
Dịch chiết thu được cho vào bình định mức 50ml và thêm nước cất (rửa cối chày và
bã vài lần bằng nước cất rồi đổ vào bình), khuấy đều rồi lọc.
b. Định phân:
- Định chuẩn lại dung dịch iod N/100 với dung dịch Na
2
S
2
O
3
0,01N để tính hệ số hiệu
chỉnh T của dung dịch iod.
- Chuẩn bị hai erlen. Hút vào mỗi bình 20ml dịch chiết có chứa vitamin C, 5 -10 giọt
dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn độ ngay bằng dung dịch iod 0,01N đến khi có màu xanh

4. Kết quả
17
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Số mg vitamin C trong 1g mẫu vật được tính như sau:
Nv
VTa
x
.
100 00088,0
% =
a: thể tích (ml) dung dịch iod 0,01N dùng khi chuẩn độ.
T: hệ số hiệu chỉnh dung dịch iod 0,01N với dung dịch Na
2
S
2
O
3
0,01N
V: thể tích chung của dịch chiết (50ml)
v: thể tích dịch chiết lấy để chuẩn độ (20ml)
N: trọng lượng mẫu phân tích
0,00088: số gram vitamin C tương ứng với 1ml dung dịch iod 0,01N
18