Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học ( Luận án tiến sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ TÂM THƯ

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG QUẦN XÃ VI
KHUẨN KỴ KHÍ TRONG CÁC LÔ XỬ LÝ CHẤT
DIỆT CỎ/DIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PHÂN HỦY SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2013


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyễn Thị Tâm Thư

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG QUẦN XÃ VI KHUẨN
KỴ KHÍ TRONG CÁC LÔ XỬ LÝ CHẤT DIỆT
DIỆT CỎ/DIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN
HỦY SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 62 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà
Viện Công nghệ sinh học
2. TS. Đinh Thị Thu Hằng
Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2013


i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Ðặng Thị Cẩm Hà và TS. Đinh
Thị Thu Hằng, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, là những ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện về cơ sở vật
chất giúp tôi thực hiện và hoàn thành đề tài luận án nhạy cảm và thuộc loại khó này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều
kiện cho tôi đƣợc học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án tại Phòng Công nghệ sinh
học tái tạo môi trƣờng, Phòng thí nghiệm trọng điểm, Phòng Kỹ thuật di truyền.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Đại tá Phan Nguyễn Khánh,
Đại tá Tô Văn Thiệp – Thủ trƣởng Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học và Công
nghệ quân sự đã cho phép và tạo điều kiện cho tôi đƣợc thực hiện nguyện vọng của
mình và hoàn thành luận án đúng thời hạn.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Đào Thị Ngọc Ánh, CN Lê Việt Hƣng, NCS.
Phùng Khắc Huy Chú và các đồng nghiệp khác tại phòng Công nghệ Sinh học tái
tạo môi trƣờng đã giúp đỡ và chia sẻ, bàn luận kết quả thu đƣợc với tôi trong suốt
quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà - Chuyên viên phụ trách đào
tạo, Viện Công nghệ sinh học, đã hƣớng dẫn tôi tận tình để hoàn thành mọi thủ tục
trong quá trình làm nghiên cứu sinh.
Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng chí, cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học,

Phòng Công nghệ Hóa sinh và các cán bộ Viện Công nghệ mới đã luôn động viên,
khích lệ, giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ trong thời gian tôi không có mặt ở đơn vị.
Tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến chồng tôi cùng hai bên gia đình đã động
viên, chia sẻ trách nhiệm chăm lo gia đình, con cái để tôi có thêm thời gian thực
hiện tốt nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2013

Nguyễn Thị Tâm Thƣ


ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự cho phép và đồng ý của các
đồng tác giả. Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội ngày tháng năm 2013
Tác giả

Nguyễn Thị Tâm Thư

iii

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn

i

Lời cam đoan

ii

Mục lục

iii

Danh mục các thuật ngữ và ký hiệu viết tắt

viii

Danh mục các bảng

x

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

xi

MỞ ĐẦU

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

5

1.1.

Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo

5

1.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo

5

1.1.2. Ảnh hƣởng của các hợp chất hữu cơ chứa clo tới con ngƣời và môi trƣờng

7

1.2.

Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo

8

1.2.1. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo trên thế giới

8

1.2.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo ở Việt Nam

9

1.3.

1.2.2.1. Ô nhiễm các hợp chất hữu cơ nói chung

9

1.2.2.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Biên Hòa

10

1.2.2.3. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng

11

1.2.2.4. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Phù Cát

11

Phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo

12

1.3.1. Cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo

12

1.3.2. Phân hủy hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin

17

1.3.2.1. Phân hủy hiếu khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy

17

1.3.2.2. Phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin

18

1.3.3.

Phân hủy kỵ khí chất diệt cỏ/dioxin

20

1.3.3.1. Phân hủy sinh học kỵ khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy

20

1.3.3.2. Phân hủy kỵ khí các hợp chất dioxin

21


iv

Đa dạng các vi khuẩn tham gia hô hấp loại khử clo

21

1.4.1. Đặc điểm chung của các vi khuẩn hô hấp loại khử clo

21

1.4.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate

25

1.4.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides

28

1.4.4. Đa dạng vi khuẩn Pseudomonas

30

1.4.

1.5. Đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình loại khử clo

32

1.6. Các phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng vi sinh vật

36

1.6.1. Phƣơng pháp vi sinh vật

36

1.6.2. Phƣơng pháp hóa sinh

37

1.6.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử

37

1.6.4. Phƣơng pháp Metagenomics

38

1.7. Các phƣơng pháp làm sạch nguồn ô nhiễm dioxin và các hợp chất tƣơng tự

42

bằng phân hủy sinh học
1.8. Nghiên cứu về phân hủy sinh học chất diệt cỏ chứa dioxin ở Việt Nam

45

1.8.1. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng

46

1.8.2. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Biên Hòa

48

1.8.3. Các nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa và loại khử clo ở Việt Nam

49

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

52

2.1. Vật liệu

52

2.1.1. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Đà Nẵng

52

2.1.2. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Biên Hòa

52

2.1.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi đã sử dụng

53

2.1.4. Các hóa chất và thiết bị máy móc

54

2.1.5. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy và dung dịch đã sử dụng

55

2.1.5.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy

55

2.1.5.2. Các dung dịch đã sử dụng

56

2.2. Phƣơng pháp

56

2.2.1. Chiết các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin từ đất

56

2.2.2. Tách DNA tổng số

57


v

2.2.3. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí từ các lô xử lý

57

2.2.3.1. Nested-PCR

57

2.2.3.2. DGGE

58

2.2.4. Xác định trình tự nucleotide và xây dựng cây phát sinh chủng loại

59

2.2.5. Đánh giá sự biến động các vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý chất diệt

59

cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa
2.2.6. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí

59

2.2.6.1. Làm giàu vi khuẩn khử sulfate

59

2.2.6.2. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo

60

2.2.7. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên sự sinh trƣởng

61

của quần xã vi khuẩn khử sulfate
2.2.8. Làm sạch vi khuẩn khử sulfate

61

2.2.9. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn

62

2.2.10. Tách dòng đoạn gene mã hóa 16S rRNA

62

2.2.11.Đánh giá khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo (đa) vòng thơm

62

2.2.11.1. Đánh giá khả năng phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ

62

2.2.11.2.Đánh giá khả năng phân hủy các đồng phân dioxin trong mẫu làm giàu

63

2.2.11.3. Xác định 2,4-DCP và 2,4,5-T

64

2.2.12.Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí và gene chức năng trong mẫu làm giàu

65

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

67

3.1. Đa dạng vi khuẩn loại khử clo trong các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

68

3.1.1. Đa dạng vi khuẩn hô hấp loại khử clo nói chung trong các lô xử lý

68

3.1.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý

69

3.1.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides trong các lô xử lý

72

3.2. Sự đa dạng vi khuẩn và các gene chức năng trong mẫu làm giàu
3.2.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trên đất ô nhiễm chất diệt

74
74

cỏ/dioxin
3.2.2. Sự đa dạng vi khuẩn trong mẫu làm giàu
3.3. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý tại Biên Hòa

75
80


vi

3.3.1. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn khử sulfate trong lô xử lý

80

3.3.2. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn kỵ khí sử dụng chất diệt cỏ/dioxin tại lô xử lý

81

3.4. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào

81

3.4.1. Sự có mặt của các gene reductive dehalogenase (rdhA) trong các lô xử lý

81

và trong mẫu làm giàu
3.4.2. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế

82

bào phát hiện bằng Metagenomics
3.4.3. So sánh trình tự một số gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia vào

84

quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm
3.5. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn khử sulfate

87

3.5.1. Làm giàu quần xã vi khuẩn khử sulfate

87

3.5.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến sinh trƣởng của quần xã vi

87

khuẩn khử sulfate
3.5.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ

88

3.5.2.2. Ảnh hƣởng của pH

88

3.5.2.3. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl

89

3.5.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon

90

3.5.2.5. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch chiết đất

91

3.5.2.6. Ảnh hƣởng của một số hợp chất chứa clo hữu cơ

91

3.5.3. Phân lập, phân loại vi khuẩn khử sulfate

92

3.5.3.1. Quan sát hình thái tế bào

93

3.5.3.2. Trình tự đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu cho vi khuẩn khử sulfate

93

3.6. Sự có mặt của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu

94

3.6.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí loại khử clo trên nguồn DCĐ, 2,4,5-T, 2,4-DCP

95

3.6.2. Hình thái một số tế bào vi khuẩn trong mẫu làm giàu trên các chất ô nhiễm

96

3.6.3. Nhân đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu của vi khuẩn Dehalococcoides

97

3.6.4. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu

97

3.7. Khả năng phân hủy hay chuyển hóa các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin
3.7.1. Khả năng phân hủy và chuyển hóa PCDD/Fs trong mẫu làm giàu

99
99


vii

3.7.2. Khả năng phân hủy và chuyển hóa 2,4-DCP, 2,4,5-T

102

3.7.2.1. Khả năng chuyển hóa 2,4,5-T

102

3.7.2.2. Khả năng chuyển hóa 2,4-DCP

103

3.7.3. Khả năng phân hủy các hợp chất chứa clo của vi khuẩn khử sulfate

104

BDN10T đã đƣợc làm sạch
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN

106

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

127

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

129

TÀI LIỆU THAM KHẢO

131

SUMMARY

147


viii

Danh mục các thuật ngữ và ký hiệu viết tắt
2,4,5-T
2,4-D

2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid
2,4-dichlorophenoxyacetic acid

Bộ TN-MT
CDBF

Bộ Tài nguyên và môi trƣờng
Chlorodibenzo-p-furan

CP
Đ/C

Chlorophenol
Đối chứng

DBF

Dibenzo-p-furan

DCB
DCĐ

Dichlorobenzene

DCDD
DCP
DD
DDD
DDT
DGGE
EPA
HCB
HPLC
MCDD
MT
PAH
PCB
PCDD
PCDD/Fs
PCDF
PCE
PeCDD
RdhA
rdhA
TCB
TCDD

Dịch chiết đất
Dichlorodibenzo-p-dioxin
Dichlorophenol
Dibenzo-p-dioxin
1-chloro-4-[2,2-dichloro-1-(4-chlorophenyl)ethyl]benzene
1,1,1-trichloro-2,2-di(4-chlorophenyl)ethane
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
Environmental Protection Agency
Hexachlorobenzene
High Performance Liquid Chromatography
Monochlorodibenzo-p-dioxin
Môi trƣờng
Polyaromatic hydrocarbon
Polychlorobiphenyl
Polychlorodibenzo-p-dioxin
Polychlorodibenzo-p-dioxin/furan
Polychlorodibenzo-p-furan
Tetrachloroethene
Pentachlorodibenzo-p-dioxin
Reductive dehalogenase
Reductive dehalogenase gene
Tetrachlorobenzene
Tetrachlorodibenzo-p-dioxin


ix

TCDF
TCE

Tetrachloro dibenzo-p-furan
Trichloroethene

TCP

Trichlorophenol

TeCB
TEQ

Tetrachlorobenzene
Total toxic equivalent quantity

TrCB

Trichlorobenzene

TrCDD

Trichlorodibenzo-p-dioxin

VK
VK KK
VK KSF

Vi khuẩn
Vi khuẩn kỵ khí
Vi khuẩn khử sulfate

VSV

WHO

Vi sinh vật
World Health Organization


x

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên Bảng

Trang

2.1

Tổng hợp các nghiên cứu đã thực hiện trong luận án

53

2.2

Trình tự các đoạn mồi đã sử dụng trong nghiên cứu

53

2.3

Công thức pha gel DGGE ở các nồng độ biến tính khác nhau

58

2.4

Tổng hợp các phƣơng pháp đã sử dụng trong nghiên cứu

66

3.1

Sự có mặt của một số VK hô hấp loại khử clo trong các mẫu nghiên cứu

68

3.2 Mối quan hệ giữa một số dòng VK KSF tại các lô xử lý và một số VK 71
gần gũi
3.3

Sự tƣơng đồng của các dòng VK loại khử clo trong các lô xử lý với 6

73

chủng VK Dehalococcoides
3.4

Metagenome của VK đƣợc phân tích bởi máy Roche 454 GS Junior bằng 75
Newbler

3.5

Dữ liệu metagenome trong mẫu làm giàu đƣợc bằng phân tích MG-RAST

75

3.6

Tỷ lệ các VSV có mặt trong mẫu làm giàu

77

3.7

Các VK trong metagenome của mẫu làm giàu theo khả năng loại khử clo

78

3.8

Phân loại VK có mặt trong mẫu làm giàu theo khả năng hô hấp

79

3.9

Các enzyme đƣợc mã hóa bởi các gene tham gia vào các quá trình phân hủy 83
và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm

3.10

Sự biến đổi thành phần các chất ô nhiễm giữa mẫu đối chứng (Đ/C) và 100
mẫu làm giàu

3.11

Khả năng chuyển hóa 2,4-DCP bởi tập đoàn VK KK trong các mẫu làm 104
giàu từ Đà Nẵng

3.12

Sự biến đổi thành phần hóa học trong mẫu nuôi cấy chủng BDN10T 105
so với mẫu không có VSV (ĐC)


xi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Tên Hình

Trang

1.1 Một số hợp chất hữu cơ chứa clo điển hình

6

1.2 Quá trình loại clo sản phẩm cắt vòng của lindane và pentachlorophenol ở

13

điều kiện hiếu khí
1.3 Con đƣờng phân hủy 2,4-DCP bởi nấm Phanerochaete chrysosporium

14

1.4 Các con đƣờng loại khử clo của 1,2,3,4-TCDD và 1,2,3,7,8-PeCDD ở

14

chủng D. mccartyi CBDB1
1.5 Sơ đồ khoáng hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm với hợp chất trung

15

gian là chlorocatechol
1.6 Con đƣờng phân hủy hoàn toàn PCDD/Fs bởi các quần xã VK trong quá

16

trình phân hủy sinh học
1.7 Cây phát sinh chủng loại của các vi khuẩn loại khử clo dựa trên trình tự

24

đoạn gene 16S rRNA
1.8 Quá trình chuyển hóa PCE tạo ra ethene ở một số VK khác nhau

29

1.9 Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự axit amin của các enzyme RdhA

34

2.1 Sơ đồ các nghiên cứu thực hiện trong luận án

54

3.1 Điện di đồ DGGE với cặp mồi DCC305f/DSV838r đặc hiệu cho VK KSF

70

từ các mẫu ở lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa
3.2 Cây phát sinh chủng loại của vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý

72

3.3 Điện di đồ DGGE phân tích sự đa dạng VK Dehalococcoides ở các lô xử lý

73

3.4 Cây phát sinh chủng loại của Dehalococcoides trong các lô xử lý

73

3.5 VK KK hô hấp loại khử clo từ đất ở 16 vị trí trong lô chôn lấp tích cực tại

75

Biên Hòa sau 36 tháng xử lý đƣợc làm giàu trên đất ô nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin rất nặng
3.6 Đa dạng VSV trong mẫu làm giàu VK KK trên đất ô nhiễm

76

3.7 Sự biến động số lƣợng VK KSF và VK KK nói chung sử dụng chất diệt

80

cỏ/dioxin từ lô xử lý tại Biên Hòa
3.8 Phân bố và tỷ lệ các gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào

82

3.9 Mối quan hệ của 2 gene haloacid dehalogenase với các gene của

85


xii

Hình

Tên Hình

Trang

Pseudomonas
3.10 Mối quan hệ giữa một số enzyme tham gia vào quá trình phân hủy hợp chất

86

vòng thơm do các gene chức năng có mặt trong mẫu làm giàu mã hóa
3.11 Sinh trƣởng của hai quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa ở các

88

nhiệt độ khác nhau
3.12 Sinh trƣởng của hai quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa ở các pH

89

khác nhau
3.13 Sinh trƣởng của quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa với các nồng

89

độ NaCl khác nhau
3.14 Sinh trƣởng của quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa trên các

90

nguồn carbon khác nhau
3.15 Ảnh hƣởng của nồng độ DCĐ đến sinh trƣởng của quần xã VK KSF ở Đà

91

Nẵng và Biên Hòa
3.16 Ảnh hƣởng của một số hợp chất hữu cơ chứa clo đến sinh trƣởng của

92

quần xã VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa
3.17 Hình thái tế bào chủng VK KSF BDN10T phân lập từ Đà Nẵng

93

3.18 Mối quan hệ gần gũi của các VK KSF với chủng BDN10T

94

3.19 VK KK hô hấp loại khử clo đƣợc làm giàu trên môi trƣờng chứa 2,4-

95

DCP, 2,4,5-T từ các mẫu đất ở Đà Nẵng và Biên Hòa
3.20 Các tế bào VK có mặt trong mẫu P1 làm giàu trên MT chứa 2,4-DCP và

96

P5 làm giàu trên MT chứa 2,4,5-T
3.21 Điện di đồ nhân đoạn gene 16S rRNA của VK Dehalococcoides từ mẫu

97

làm giàu VK hô hấp loại khử clo ở Đà Nẵng
3.22 Cây phát sinh chủng loại của hai dòng VK Dehalococcoides có mặt trong

98

mẫu làm giàu P5T
3.23 Hiệu suất phân hủy, chuyển hóa 2,3,7,8-TCDD, OCDD và 15 đồng phân

99

PCDD/Fs còn lại bởi tập đoàn VK KK ở Biên Hòa
3.24 Phổ sắc ký khả năng chuyển hóa 2,4,5-T ở các mẫu Đà Nẵng và Biên Hòa

103


1

MỞ ĐẦU
Chất diệt cỏ chứa dioxin (chất diệt cỏ/dioxin) là một trong số các chất hữu cơ
chứa clo độc hại không chỉ với môi trường, con người mà còn khó bị phân hủy bởi
vi sinh vật (VSV). Xử lý ô nhiễm các chất hữu cơ chứa clo nói chung và chất diệt
cỏ/dioxin nói riêng bằng biện pháp phân hủy sinh học (bioremediation) đã và đang
được nghiên cứu do chi phí thấp và thân thiện đối với môi trường. Các nghiên cứu
về quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo đã chứng minh có 4
con đường phân hủy, chuyển hóa bởi VSV. Trong số đó có 3 con đường xảy ra với
sự có mặt của oxy bao gồm oxy hóa cắt vòng thơm, loại clo ở sản phẩm cắt vòng và
phân hủy nhờ cơ chế xúc tác bởi enzyme ngoại bào hay các chất tương tự trao đổi
chất hoạt động như enzyme. Quá trình thứ tư là loại khử clo xảy ra ở điều kiện
không có oxy hay thiếu oxy được gọi chung là hô hấp loại khử clo.
Công nghệ phân hủy sinh học đã được áp dụng thành công với quy mô 0,5 m3
đến 100 m3 tại Đà Nẵng và quy mô 3.384 m3 tại Biên Hòa. Hiệu quả xử lý tại Đà
Nẵng đạt 50 – 70% sau gần 2 năm xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005) và tại Biên Hòa
đạt hơn 99% sau 27 tháng xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Để đạt được hiệu quả
xử lý nêu trên có rất nhiều yếu tố liên quan trong đó có vai trò của VSV, các điều

kiện mini sinh thái của mỗi lô xử lý, các nhóm VSV tham gia vào quá trình chuyển
hóa, phân hủy và khoáng hóa các hợp chất là thành phần chất diệt cỏ/dioxin. Đặc
biệt, sự đa dạng và mức độ hoạt động của quần xã vi khuẩn kỵ khí (VK KK) hô hấp
loại khử clo tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy sinh học các chất độc như
thế nào vẫn đang là những câu hỏi cần được giải đáp bằng các nghiên cứu cơ bản
với sự hỗ trợ của các kỹ thuật hiện hành.
Hiện nay, các nghiên cứu về VK hô hấp loại khử clo trên thế giới đã công bố
có 20 chi và thuộc về 3 ngành là Proteobacteria, Chloroflexi và Firmicute. Trong
các lô xử lý ở Đà Nẵng, sự có mặt VK Dehalococcoides thuộc ngành Chloroflexi đã
được xác định bằng phương pháp DGGE (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Một số VK KSF
thuộc ngành Proteobacteria cũng đã được phát hiện tại khu vực này. Đặc biệt,


2

nhóm VK hô hấp loại khử clo theo cơ chế đồng trao đổi chất mà đại diện là
Pseudomonas đã được phát hiện ở hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam (Nguyễn Bá
Hữu, 2009). Chúng không chỉ có mặt trong các mẫu nguyên thủy mà còn luôn được
tìm thấy ở hầu hết các mẫu của quá trình xử lý ở các quy mô khác nhau trong điều
kiện thiếu khí. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sâu nào về nhóm VK KK có khả
năng hô hấp loại khử clo một cách có hệ thống. Đặc biệt, việc làm giàu các VK KK
hô hấp loại khử clo bắt buộc bắt đầu được nghiên cứu nhưng chưa thành công. Để
tìm hiểu sự có mặt và vai trò của nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử
lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, chúng tôi thực hiện đề
tài: “Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt
cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học”.
Luận án được thực hiện với các mục đích và nội dung chính sau đây:
Mục đích nghiên cứu
 Đánh giá sự đa dạng VK KK trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu
làm giàu VK KK hô hấp loại khử clo bằng phương pháp sinh học phân tử.

 Đánh giá sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và
chuyển hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm trong mẫu làm giàu quần xã VK
KK hô hấp loại khử clo từ mẫu đất ở lô xử lý của Biên Hòa.
 Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu bởi quần xã
VK KK hô hấp loại khử clo.
Nội dung nghiên cứu
 Xác định sự có mặt của một số nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử
lý bằng phương pháp nested-PCR.
 Nghiên cứu sự đa dạng VK KSF và Dehalococcoides từ các lô xử lý đất nhiễm
chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa bằng phương pháp DGGE.
 Đánh giá sự biến động số lượng VK KK sử dụng dioxin và VK KSF trong lô xử
lý 3.384 m3 tại Biên Hòa.


3

 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của quần xã VK KSF và một chủng đại
diện được làm giàu, phân lập từ các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam.
 Đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các đồng phân PCDD/Fs và các hợp
chất vòng thơm từ mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo và VK KSF.
 Sử dụng công cụ Metagenomics để nghiên cứu sự đa dạng của quần xã VK KK
cũng như các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa
chất diệt cỏ/dioxin có mặt trong mẫu làm giàu từ đất của 16 vị trí ở lô xử lý khử
độc tại Biên Hòa sau 36 tháng.
Phƣơng pháp nghiên cứu
1. Phương pháp sinh học phân tử: nested-PCR, DGGE, Metagenomics được sử
dụng để đánh giá sự đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô
nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu.
2. Phương pháp nuôi cấy truyền thống: nuôi cấy, làm giàu VK KK trong phòng thí
nghiệm và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh

trưởng của các VK này.
3. Phương pháp hóa học: phân tích các thành phần hóa học trên máy HPLC và
GC/MS để đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các chất là thành phần
của chất diệt cỏ như các đồng phân của dioxin, 2,4,5-T và sản phẩm phân hủy
sinh học của chúng như 2,4-DCP bởi các VK KK trong các mẫu làm giàu từ đất
của lô xử lý ở Đà Nẵng, Biên Hòa.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam làm giàu được quần xã VK KK hô hấp loại
khử clo từ đất chôn lấp tích cực liên quan đến xử lý chất diệt cỏ/dioxin. Các VK
KK có mặt trong mẫu làm giàu bao gồm cả ba nhóm loại khử clo là hô hấp loại
khử clo bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas); hô hấp loại khử clo
không

bắt

buộc

(Desulfitobacterium,

Desulfovibrio,

Desulfococcus,

Anaeromyxobacter v.v.); hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas,
Clostridium, Shewanella v.v.) trong đó Pseudomonas chiếm ưu thế hơn cả.


4

2. Đã đánh giá được khả năng phân hủy và chuyển hóa 55,7% tổng độ độc trên đất
ô nhiễm nặng (41.265 ng TEQ/kg đất khô) bởi quần xã VK KK. Đánh giá được
hiệu suất phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin (17 đồng phân
PCDD/PCDF, 2,4,5-T) và sản phẩm phân hủy sinh học của 2,4,5-T, 2,4-D là
2,4,5-TCP, 2,4-DCP bởi quần xã VK KK cũng như khả năng phân hủy 2,4,5TCP, 2,4-DCP bởi chủng VK KSF đã làm sạch.
3. Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ Metagenomics để đánh giá sự đa dạng
quần xã VK KK và các gene chức năng tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt
cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu một năm từ đất sau 36 tháng xử lý ở Biên Hòa trên
đất ô nhiễm ở mục (2).


5

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1.

Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo

1.1.1.

Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo

Các hợp chất hữu cơ chứa clo được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp như quá
trình sản xuất thuốc trừ sâu, trừ nấm, chất diệt cỏ, các quá trình tẩy rửa, luyện kim
loại, sản xuất bột giấy, dùng làm dung môi v.v., trong nông nghiệp và cả trong chiến
tranh xâm lược. Các hợp chất hữu cơ chứa clo cũng được sinh ra do sự đốt cháy
không hoàn toàn (đốt cháy các chất thải rắn), các hoạt động tự nhiên (cháy rừng, hoạt
động kiến tạo vỏ trái đất như động đất, núi lửa) (Schecter, 2006). Thời gian bán hủy
của các chất hữu cơ chứa clo trong môi trường thường kéo dài hàng tuần đến hàng
năm, thậm chí hàng chục năm như chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng và

Biên Hòa. Đặc biệt, dioxin là một trong số các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm chứa
clo có thể tồn tại hàng trăm năm hay lâu hơn trong môi trường và không bị phân hủy
dưới tác dụng của axit mạnh, kiềm mạnh, các chất có tính oxy hóa.
Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo của các hợp chất hữu cơ chứa clo, các nhà khoa
học phân loại chúng thành 3 nhóm chính là chất hữu cơ chứa clo mạch thẳng, vòng
thơm và đa vòng thơm (Hình 1.1) (Tas, 2009).
(i) Các chất hữu cơ mạch thẳng chứa clo thường được sử dụng làm dung môi
hữu cơ như tetrachloroethene (PCE), trichloroethene (TCE), chloroform và chúng
được thải ra môi trường nhiều nhất (Hiraishi, 2003; Cheng, 2009).
(ii) Các chất hữu cơ vòng thơm chứa clo như hexachlorobenzene, chlorobenzene,
chlorophenol (CP) v.v. Nhóm chất này được sử dụng làm chất bảo quản gỗ, sản xuất
thuốc nhuộm, chất diệt cỏ, diệt nấm (Tas, 2009).
(iii) Các chất hữu cơ đa vòng thơm chứa clo bao gồm các hợp chất có cấu trúc
2-3 vòng thơm và chứa từ 2 đến 8 nguyên tử clo trong phân tử. Đây là các chất có
độ độc cao tùy thuộc vào số lượng và vị trí các nguyên tử clo trong phân tử. Các
chất này được gọi chung là dioxin. Căn cứ vào số nguyên tử clo và vị trí không gian


6

của những nguyên tử này, dioxin có 75 đồng phân polychlorodibenzo-p-dioxin
(PCDD) và 135 đồng phân polychlorodibenzofuran (PCDF) với độc tính khác nhau.
Thành phần của chất diệt cỏ mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh ở Việt
Nam chứa chủ yếu là các hợp chất 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 2,4,5trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) (Hình 1.1) và nhiều hợp chất vòng thơm khác.

cis-1,3dichloropropene

Tetrachloroethene
(PCE)

2,4,5-T

2,4-D

PCDD

Trichloroethene
(TCE)

2,4-dichlorophenol
(2,4-DCP)

-hexachlorocyclohexane
(HCH)

1,2,4,5tetrachlorobenzen

PCDF

2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-pdioxin (2,3,7,8-TCDD)
Hình 1.1. Một số hợp chất hữu cơ chứa clo điển hình

2,4-D, 2,4,5-T thuộc họ chất diệt cỏ phenoxy có tác dụng làm rụng lá, tồn tại ở
dạng axit, muối (chủ yếu là amin), ester. Ở nồng độ thấp, 2,4-D kích thích quá trình
tổng hợp RNA, DNA và protein, trong khi đó ở nồng độ cao, 2,4-D có thể ức chế sự
phân chia và sinh trưởng của tế bào thực vật. 2,4,5-T được tổng hợp từ 2,4,5trichlorophenol (2,4,5-TCP). 2,4,5-T được sử dụng làm tác nhân gây rụng lá trong
nông nghiệp và lâm nghiệp.
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) là sản phẩm phụ của quá
trình sản xuất chất diệt cỏ 2,4,5-T. Đây là chất có độ độc cao nhất với tổng độ độc
tương đương là 1 (Schecter, 2006). Dioxin còn bao gồm nhóm các polychlorinated

biphenyl (PCB) là các chất tương tự dioxin, bao gồm 419 đồng phân trong đó có 29
chất đặc biệt nguy hiểm (Schecter, 2006; Đặng Thị Cẩm Hà, 2005). PCB được sản


Luận án đầy đủ ở file: Luận án Full