Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học

1
MỞ ĐẦU
Chất diệt cỏ chứa dioxin (chất diệt cỏ/dioxin) là một trong số các chất hữu cơ
chứa clo độc hại không chỉ với môi trường, con người mà còn khó bị phân hủy bởi
vi sinh vật (VSV). Xử lý ô nhiễm các chất hữu cơ chứa clo nói chung và chất diệt
cỏ/dioxin nói riêng bằng biện pháp phân hủy sinh học (bioremediation) đã và đang
được nghiên cứu do chi phí thấp và thân thiện đối với môi trường. Các nghiên cứu
về quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo đã chứng minh có 4
con đường phân hủy, chuyển hóa bởi VSV. Trong số đó có 3 con đường xảy ra với
sự có mặt của oxy bao gồm oxy hóa cắt vòng thơm, loại clo ở sản phẩm cắt vòng và
phân hủy nhờ cơ chế xúc tác bởi enzyme ngoại bào hay các chất tương tự trao đổi
chất hoạt động như enzyme. Quá trình thứ tư là loại khử clo xảy ra ở điều kiện
không có oxy hay thiếu oxy được gọi chung là hô hấp loại khử clo.
Công nghệ phân hủy sinh học đã được áp dụng thành công với quy mô 0,5 m
3

đến 100 m
3
tại Đà Nẵng và quy mô 3.384 m
3
tại Biên Hòa. Hiệu quả xử lý tại Đà
Nẵng đạt 50 – 70% sau gần 2 năm xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005) và tại Biên Hòa
đạt hơn 99% sau 27 tháng xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Để đạt được hiệu quả
xử lý nêu trên có rất nhiều yếu tố liên quan trong đó có vai trò của VSV, các điều
kiện mini sinh thái của mỗi lô xử lý, các nhóm VSV tham gia vào quá trình chuyển
hóa, phân hủy và khoáng hóa các hợp chất là thành phần chất diệt cỏ/dioxin. Đặc
biệt, sự đa dạng và mức độ hoạt động của quần xã vi khuẩn kỵ khí (VK KK) hô hấp
loại khử clo tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy sinh học các chất độc như
thế nào vẫn đang là những câu hỏi cần được giải đáp bằng các nghiên cứu cơ bản
với sự hỗ trợ của các kỹ thuật hiện hành.
Hiện nay, các nghiên cứu về VK hô hấp loại khử clo trên thế giới đã công bố

có 20 chi và thuộc về 3 ngành là Proteobacteria, Chloroflexi và Firmicute. Trong
các lô xử lý ở Đà Nẵng, sự có mặt VK Dehalococcoides thuộc ngành Chloroflexi đã
được xác định bằng phương pháp DGGE (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Một số VK KSF
thuộc ngành Proteobacteria cũng đã được phát hiện tại khu vực này. Đặc biệt,
2
nhóm VK hô hấp loại khử clo theo cơ chế đồng trao đổi chất mà đại diện là
Pseudomonas đã được phát hiện ở hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam (Nguyễn Bá
Hữu, 2009). Chúng không chỉ có mặt trong các mẫu nguyên thủy mà còn luôn được
tìm thấy ở hầu hết các mẫu của quá trình xử lý ở các quy mô khác nhau trong điều
kiện thiếu khí. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sâu nào về nhóm VK KK có khả
năng hô hấp loại khử clo một cách có hệ thống. Đặc biệt, việc làm giàu các VK KK
hô hấp loại khử clo bắt buộc bắt đầu được nghiên cứu nhưng chưa thành công. Để
tìm hiểu sự có mặt và vai trò của nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử
lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, chúng tôi thực hiện đề
tài: “Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt
cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học”.
Luận án được thực hiện với các mục đích và nội dung chính sau đây:
Mục đích nghiên cứu
 Đánh giá sự đa dạng VK KK trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu
làm giàu VK KK hô hấp loại khử clo bằng phương pháp sinh học phân tử.
 Đánh giá sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và
chuyển hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm trong mẫu làm giàu quần xã VK
KK hô hấp loại khử clo từ mẫu đất ở lô xử lý của Biên Hòa.
 Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu bởi quần xã
VK KK hô hấp loại khử clo.
Nội dung nghiên cứu
 Xác định sự có mặt của một số nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử
lý bằng phương pháp nested-PCR.
 Nghiên cứu sự đa dạng VK KSF và Dehalococcoides từ các lô xử lý đất nhiễm
chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa bằng phương pháp DGGE.

 Đánh giá sự biến động số lượng VK KK sử dụng dioxin và VK KSF trong lô xử
lý 3.384 m
3
tại Biên Hòa.
3
 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của quần xã VK KSF và một chủng đại
diện được làm giàu, phân lập từ các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam.
 Đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các đồng phân PCDD/Fs và các hợp
chất vòng thơm từ mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo và VK KSF.
 Sử dụng công cụ Metagenomics để nghiên cứu sự đa dạng của quần xã VK KK
cũng như các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa
chất diệt cỏ/dioxin có mặt trong mẫu làm giàu từ đất của 16 vị trí ở lô xử lý khử
độc tại Biên Hòa sau 36 tháng.
Phƣơng pháp nghiên cứu
1. Phương pháp sinh học phân tử: nested-PCR, DGGE, Metagenomics được sử
dụng để đánh giá sự đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô
nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu.
2. Phương pháp nuôi cấy truyền thống: nuôi cấy, làm giàu VK KK trong phòng thí
nghiệm và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh
trưởng của các VK này.
3. Phương pháp hóa học: phân tích các thành phần hóa học trên máy HPLC và
GC/MS để đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các chất là thành phần
của chất diệt cỏ như các đồng phân của dioxin, 2,4,5-T và sản phẩm phân hủy
sinh học của chúng như 2,4-DCP bởi các VK KK trong các mẫu làm giàu từ đất
của lô xử lý ở Đà Nẵng, Biên Hòa.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam làm giàu được quần xã VK KK hô hấp loại
khử clo từ đất chôn lấp tích cực liên quan đến xử lý chất diệt cỏ/dioxin. Các VK
KK có mặt trong mẫu làm giàu bao gồm cả ba nhóm loại khử clo là hô hấp loại
khử clo bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas); hô hấp loại khử clo

không bắt buộc (Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus,
Anaeromyxobacter v.v.); hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas,
Clostridium, Shewanella v.v.) trong đó Pseudomonas chiếm ưu thế hơn cả.
4
2. Đã đánh giá được khả năng phân hủy và chuyển hóa 55,7% tổng độ độc trên đất
ô nhiễm nặng (41.265 ng TEQ/kg đất khô) bởi quần xã VK KK. Đánh giá được
hiệu suất phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin (17 đồng phân
PCDD/PCDF, 2,4,5-T) và sản phẩm phân hủy sinh học của 2,4,5-T, 2,4-D là
2,4,5-TCP, 2,4-DCP bởi quần xã VK KK cũng như khả năng phân hủy 2,4,5-
TCP, 2,4-DCP bởi chủng VK KSF đã làm sạch.
3. Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ Metagenomics để đánh giá sự đa dạng
quần xã VK KK và các gene chức năng tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt
cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu một năm từ đất sau 36 tháng xử lý ở Biên Hòa trên
đất ô nhiễm ở mục (2).

5
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo
1.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo
Các hợp chất hữu cơ chứa clo được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp như quá
trình sản xuất thuốc trừ sâu, trừ nấm, chất diệt cỏ, các quá trình tẩy rửa, luyện kim
loại, sản xuất bột giấy, dùng làm dung môi v.v., trong nông nghiệp và cả trong chiến
tranh xâm lược. Các hợp chất hữu cơ chứa clo cũng được sinh ra do sự đốt cháy
không hoàn toàn (đốt cháy các chất thải rắn), các hoạt động tự nhiên (cháy rừng, hoạt
động kiến tạo vỏ trái đất như động đất, núi lửa) (Schecter, 2006). Thời gian bán hủy
của các chất hữu cơ chứa clo trong môi trường thường kéo dài hàng tuần đến hàng
năm, thậm chí hàng chục năm như chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng và
Biên Hòa. Đặc biệt, dioxin là một trong số các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm chứa
clo có thể tồn tại hàng trăm năm hay lâu hơn trong môi trường và không bị phân hủy
dưới tác dụng của axit mạnh, kiềm mạnh, các chất có tính oxy hóa.
Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo của các hợp chất hữu cơ chứa clo, các nhà khoa
học phân loại chúng thành 3 nhóm chính là chất hữu cơ chứa clo mạch thẳng, vòng
thơm và đa vòng thơm (Hình 1.1) (Tas, 2009).
(i) Các chất hữu cơ mạch thẳng chứa clo thường được sử dụng làm dung môi
hữu cơ như tetrachloroethene (PCE), trichloroethene (TCE), chloroform và chúng
được thải ra môi trường nhiều nhất (Hiraishi, 2003; Cheng, 2009).
(ii) Các chất hữu cơ vòng thơm chứa clo như hexachlorobenzene, chlorobenzene,
chlorophenol (CP) v.v. Nhóm chất này được sử dụng làm chất bảo quản gỗ, sản xuất
thuốc nhuộm, chất diệt cỏ, diệt nấm (Tas, 2009).
(iii) Các chất hữu cơ đa vòng thơm chứa clo bao gồm các hợp chất có cấu trúc
2-3 vòng thơm và chứa từ 2 đến 8 nguyên tử clo trong phân tử. Đây là các chất có

độ độc cao tùy thuộc vào số lượng và vị trí các nguyên tử clo trong phân tử. Các
chất này được gọi chung là dioxin. Căn cứ vào số nguyên tử clo và vị trí không gian
6
của những nguyên tử này, dioxin có 75 đồng phân polychlorodibenzo-p-dioxin
(PCDD) và 135 đồng phân polychlorodibenzofuran (PCDF) với độc tính khác nhau.
Thành phần của chất diệt cỏ mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh ở Việt
Nam chứa chủ yếu là các hợp chất 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 2,4,5-
trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) (Hình 1.1) và nhiều hợp chất vòng thơm khác.




cis-1,3-
dichloropropene
Tetrachloroethene
(PCE)
Trichloroethene
(TCE)
-hexachlorocyclohexane
(HCH)




2,4,5-T
2,4-D
2,4-dichlorophenol
(2,4-DCP)
1,2,4,5-
tetrachlorobenzen

PCDD
PCDF
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-
dioxin (2,3,7,8-TCDD)
Hình 1.1. Một số hợp chất hữu cơ chứa clo điển hình
2,4-D, 2,4,5-T thuộc họ chất diệt cỏ phenoxy có tác dụng làm rụng lá, tồn tại ở
dạng axit, muối (chủ yếu là amin), ester. Ở nồng độ thấp, 2,4-D kích thích quá trình
tổng hợp RNA, DNA và protein, trong khi đó ở nồng độ cao, 2,4-D có thể ức chế sự
phân chia và sinh trưởng của tế bào thực vật. 2,4,5-T được tổng hợp từ 2,4,5-
trichlorophenol (2,4,5-TCP). 2,4,5-T được sử dụng làm tác nhân gây rụng lá trong
nông nghiệp và lâm nghiệp.
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) là sản phẩm phụ của quá
trình sản xuất chất diệt cỏ 2,4,5-T. Đây là chất có độ độc cao nhất với tổng độ độc
tương đương là 1 (Schecter, 2006). Dioxin còn bao gồm nhóm các polychlorinated
biphenyl (PCB) là các chất tương tự dioxin, bao gồm 419 đồng phân trong đó có 29
chất đặc biệt nguy hiểm (Schecter, 2006; Đặng Thị Cẩm Hà, 2005). PCB được sản
7
xuất rất nhiều trong những năm 1930-1970 ở phía Bắc Bán cầu và được sử dụng trong
máy biến áp, chất lỏng thủy lực, chất dẻo và trong một số ngành công nghiệp khác
(Angelo, 2010).
Nhìn chung, các hợp chất hữu cơ chứa clo thường kỵ nước (do hệ số octan –
nước cao) nên chúng bị lắng đọng trong bùn và trầm tích. Đây là các hợp chất độc,
tồn tại lâu dài trong môi trường, tích lũy trong các chuỗi thức ăn và gây bệnh cho
người và động vật (Smidt, 2000; Schecter, 2006; Tas, 2009; Wagner, 2009).
1.1.2. Ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ chứa clo tới con người và môi trường
Các hợp chất hữu cơ chứa clo đều là các chất có độ độc cao không những đối
với người, động thực vật mà còn với cả VSV. Hầu hết các chất hữu cơ chứa clo có

thể gây ung thư cho người. Tuy nhiên, các chất hữu cơ mạch thẳng chứa clo thường
ít độc hơn và thời gian bán hủy ngắn hơn so với các hợp chất vòng thơm chứa clo.
Các hợp chất PCDD, PCDF và PCB là những chất hữu cơ bền vững, độc hại và khó
phân hủy (POP) trong môi trường tự nhiên. Hai đồng phân của dioxin có độ độc cao
nhất là 2,3,7,8-TCDD và 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin (PeCDD) với tổng
độ độc tương đương là 1. Các chất có độ độc thấp hơn như hexachlorodibenzo-p-
dioxin (HxCDD), tetrachlorodibenzo-p-furan (TCDF), PCB. Các chất có độ độc
thấp nhất là octachlorodibenzo-p-dioxin (OCDD), octachlorodibenzo-p-furan
(OCDF), trichlorobenzene (TrCB) với tổng độ độc tương đương là 0,0001.
Ở Việt Nam, độ tồn lưu của các chất là thành phần của chất diệt cỏ tại các căn
cứ quân sự cũ của Mỹ vẫn ở mức cao. Trong đó, 2,3,7,8-TCDD có thể chiếm tới
99% tổng độ độc ở tại hai sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa (Hatfield, 2011).
EPA đã công nhận dioxin là một chất gây ung thư nhóm 1 cho con người.
Không có một liều lượng nào là an toàn hoặc ngưỡng dioxin mà dưới nó thì không
gây ung thư (Van den Berg, 2006). Ở hàm lượng cao, dioxin có thể gây chết người.
Khi ở nồng độ thấp, dioxin gây ra các đột biến và di truyền qua nhiều thế hệ khác
nhau. Dioxin còn có thể liên quan đến một số bệnh nguy hiểm khác như bệnh rám
da, bệnh đái tháo đường, bệnh ung thư trực tràng không Hodgkin, thiểu năng sinh
dục cho cả nam và nữ, sinh con quái thai hoặc thiểu năng trí tuệ, đẻ trứng (ở nữ)
8
v.v. Theo WHO 2002, mức phơi nhiễm dioxin cho phép qua thức ăn của mỗi người
là 1-10 pg đương lượng độc (TEQ/ngày) (Van den Berg, 2006). Theo Angelo và đtg,
PCB có thể ảnh hưởng đến gan, đường ruột, máu, hệ nội tiết, miễn dịch, hệ thần kinh
và hệ sinh sản (Angelo, 2010).
Theo Bộ Tài nguyên và Môi trường (TN-MT), ngưỡng dioxin cho phép trong
vùng đất và trầm tích bị ô nhiễm nặng dioxin tương ứng là 1.000 và 150 ng TEQ/kg
đất. Cao hơn mức độ này, khu vực đó cần được khoanh vùng, xử lý và hạn chế hay
ngừng hoàn toàn việc tiếp xúc của người, động vật cũng như các hoạt động canh tác
nông nghiệp, thủy sản (QCVN2012/BTNMT).
Tóm lại, các hợp chất hữu cơ chứa clo mà đặc biệt là các hợp chất đa vòng thơm

có thể gây các bệnh về da, nội tiết, thần kinh, tim mạch, tiêu hóa cho con người.
Chúng có thể di truyền cho nhiều thế hệ sau qua sinh sản, thậm chí gây tử vong và là
nguyên nhân gây một số bệnh ung thư. Trong môi trường, chúng tồn tại bền vững qua
nhiều năm, gây ô nhiễm đất, nước ngầm, trầm tích, được tích lũy qua các mắt xích
của chuỗi thức ăn vào các động thực vật khác và cuối cùng là vào con người.
1.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo
1.2.1. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều biện pháp để kiểm soát tốc độ thải ra môi trường của
các chất hữu cơ chứa clo nhưng các chất độc này vẫn được thải ra môi trường rất
nhiều, gây ô nhiễm đất và bùn trầm trọng (Fennell, 2004). Tính đến năm 2003,
trong môi trường có khoảng 3.500 chất hữu cơ chứa clo có nguồn gốc tự nhiên và từ
các hoạt động sống của con người (Smidt, 2004). Theo EPA, chỉ tính riêng năm
2001 đã có 150 kg dioxin và các hợp chất tương tự dioxin, 1,13 triệu kg PCB và
16.000 kg hexachlorobenzene (HCB) giải phóng vào môi trường do các hoạt động
công nghiệp (EPA, 2006). Tổng số PCB thải vào môi trường trên toàn thế giới tính
đến năm 2003 là 900-1800 triệu kg (Fennell, 2004). Theo Wagner và đtg (Wagner,
2009), tổng số PCDD/Fs trong khí quyển trên toàn thế giới hàng năm vào khoảng
13.000 kg/yard. Lượng các chất PCB và PCDD gây ô nhiễm các thủy vực ở Mỹ
khoảng 1,2 tỷ m
3
(Fennell, 2004). Theo Tas và đtg (Tas, 2009), các hợp chất hữu cơ
9
chứa clo là các chất gây ô nhiễm môi trường với phạm vi rộng nhất. Từ những năm
1980, hàng nghìn tấn HCB được sử dụng làm chất diệt cỏ, diệt nấm, chất bảo quản
gỗ và sản xuất thuốc nhuộm. Do HCB có độ độc rất cao nên nó đã bị cấm sử dụng
trên toàn thế giới. Tuy nhiên, HCB vẫn bị thải vào môi trường hàng năm do các quá
trình hóa học xảy ra không kiểm soát được như quá trình đốt cháy không hoàn toàn.
HCB gây ô nhiễm sông, hồ, biển gần các khu vực có công nghiệp phát triển. Nồng
độ HCB trong đất cao nhất là ở Châu Âu (Tas, 2009). Hàng năm, có khoảng 3,9.10
5

tấn PCB bị thải ra môi trường trên toàn thế giới (Angelo, 2010). Ở nhiều khu vực
biển và hệ thủy vực nước ngọt thuộc Bắc Mỹ, Châu Âu và Nhật Bản chứa PCDD
với nồng độ từ 36 đến 8.560 g/kg (Ewald, 2007). Tại vịnh Thurston và vịnh
Napoleon cũng phát hiện được 15 đồng phân PCDD/Fs và 11 chất PCB giống
dioxin với tổng độ độc cao nhất từ 44 đến 136 pg TEQ/g đất khô (Ssebugere, 2013).
Ngoài ra, tại các nhà máy sản xuất và sử dụng PCE, TCE cũng bị ô nhiễm các chất
này ở phạm vi và nồng độ lớn.
Hai hợp chất 2,4-D và 2,4,5-T là thành phần của chất diệt cỏ cũng đã được sử
dụng ở rất nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là sử dụng trong chiến tranh Việt Nam,
gây ô nhiễm đất và trầm tích trầm trọng. Ở những năm 40 - 50 của thế kỷ trước,
công nghệ sản xuất chất diệt cỏ còn lạc hậu nên sản phẩm phụ của quá trình sản
xuất là dioxin có hàm lượng rất cao. Ngày nay, công nghệ và khoa học hiện đại đã
làm giảm đi rất nhiều tạp chất của quá trình sản xuất này. Tuy hai chất diệt cỏ trên
và nhiều hợp chất hữu cơ chứa clo là thành phần của thuốc bảo vệ thực vật đã bị
cấm sử dụng ở nhiều nước trong đó có Việt Nam nhưng một số nước vẫn còn sử
dụng trong nông nghiệp (Bộ TN-MT, 2006, Nguyen, 2007).
1.2.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo ở Việt Nam
1.2.2.1. Ô nhiễm các hợp chất hữu cơ nói chung
Ở Việt Nam, tại các nhà máy sản xuất thuốc trừ sâu, thuốc bảo vệ thực vật (Nhà
máy Hóa chất Lâm Thao), sản xuất giấy (Nhà máy Giấy Bãi Bằng) cũng bị ô nhiễm
trầm trọng các chất hữu cơ chứa clo này. Theo các số liệu đã công bố (Bộ TN-MT,
10
2006), Việt Nam còn khối lượng dầu có chứa PCB có thể lên tới 19.000 tấn, chủ yếu
từ các máy biến thế điện kiểu cũ. Tổng lượng chất thải nguy hại ước tính năm 2003 là
160.000 tấn mỗi năm, trong đó 130.000 tấn từ các chất thải công nghiệp, 21.000 tấn
từ các chất thải y tế của các bệnh viện, trạm xá, viện điều dưỡng và 8.600 tấn từ sản
xuất nông nghiệp. Việt Nam đã và đang sử dụng khoảng 300 loại thuốc trừ sâu, 200
loại thuốc trừ bệnh, gần 150 loại thuốc trừ cỏ, 6 loại thuốc diệt chuột và 23 loại thuốc
kích thích sinh trưởng cây trồng. Các hoá chất bảo vệ thực vật này nhiều về cả số

lượng và chủng loại, trong đó có một số loại thuộc danh mục cấm sử dụng, hạn chế
sử dụng và hết hạn sử dụng.
Các chất hữu cơ ô nhiễm khó phân huỷ sử dụng trong nông nghiệp chủ yếu là
DDT và HCB hiện còn ở các địa phương chờ được xử lý, còn trong công nghiệp
phần lớn là PCB. Các hợp chất này đều có tính bền vững và nguy hại đối với môi
trường và con người nên đã bị cấm sử dụng (Bộ TN-MT, 2006).
Trong những năm 1961-1971, quân đội Mỹ đã rải xuống miền Trung và miền
Nam Việt Nam hàng trăm triệu lít chất diệt cỏ có chứa dioxin. Mặc dù chất diệt cỏ
được tồn chứa và phân phối cho các vụ phun rải đã trải qua hơn 40 năm nhưng hàm
lượng của chúng ở ba sân bay quân sự cũ là Biên Hòa, Đà Nẵng và Phù Cát vẫn ở
mức cao và rất cao. Mức độ ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sẽ được trình bày chi tiết
dưới đây.
1.2.2.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Biên Hòa
Sân bay Biên Hòa được chia làm 3 khu vực có mức độ ô nhiễm khác nhau.
* Khu vực Nam sân bay: nhiều vị trí có nồng độ dioxin lớn hơn 1.000 ppt trong
đó TCDD chiếm từ 75% đến 99% tổng độ độc (Hatfield, 2011).
* Khu vực phía Tây Nam đường băng: ở các hồ, ao và rãnh thoát nước đều có
nồng độ dioxin trong các mẫu trầm tích lớn hơn giá trị cho phép của Việt Nam và quốc
tế (1000 ppt đối với đất phi nông nghiệp) và cao nhất là 5.970 ppt. Vị trí ô nhiễm cao
nhất có nồng độ dioxin là 22.300 ppt trong đó TCDD chiếm hơn 90% tổng độ độc
(Hatfield, 2011).
* Khu vực Z1: Kết quả phân tích cho thấy nồng độ TCDD tăng dần theo độ sâu:
ở độ sâu 0-30 cm nồng độ TCDD là 36.800 ppt, độ sâu 30 – 60 cm nồng độ là
11
144.000 ppt, độ sâu 60 – 90 cm nồng độ là 259.000 ppt, độ sâu 150 – 180 cm nồng
độ là 184.000 ppt. Hàm lượng TCDD chiếm tới 99% tổng độ độc trong tất cả các
mẫu lấy tại khu vực này (Hatfield, 2011). Đây là khu vực có các lô xử lý bằng biện
pháp phân hủy sinh học của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam. Trong lô xử lý 3.384 m
3

, tổng độ độc trước khi xử lý dao
động khoảng 10.000 ng TEQ/kg đất (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012).
1.2.2.3. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng
* Trong Báo cáo tổng kết của Văn phòng 33 cho thấy khu vực ô nhiễm tại đầu
Bắc sân bay (khu vực pha trộn và đóng nạp) có nồng độ TCDD cao nhất xác định
được là 361.000 ppt ở độ sâu từ 0 – 10 cm và tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm
tới trên 99%. Ở độ sâu từ 10 – 30 cm, nồng độ TCDD là 330.000 ppt và những mẫu
khác ở khu vực này nằm trong khoảng 1.190 đến 36.800 ppt (Báo cáo tổng thể,
2011). Đây là khu vực mà Viện Công nghệ sinh học đã tiến hành xử lý thử nghiệm ở
quy mô 10 m
3
và 100 m
3
bằng biện pháp chôn lấp tích cực. Tổng độ độc ban đầu
trong đất dao động khoảng 899 – 365.000 ppt TEQ, trung bình khoảng 105.080 ppt
TEQ. Tổng độ độc của mẫu trầm tích tại hồ A dao động khoảng 68,6 – 6.820 ppt
TEQ (Báo cáo tổng thể, 2011).
* Ở khu vực phía Nam sân bay, nồng độ TCDD cao nhất phân tích được là
20.600 ppt ở độ sâu 0-10 cm nhưng tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-TCDD chỉ chiếm có
65%. Ở các độ sâu lớn hơn nồng độ TCDD vẫn cao, ở độ sâu 10-30 cm nồng độ
TCDD dao động trong khoảng 3.500 đến 5.120 ppt và tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-
TCDD chiếm 68,4%. Ở độ sâu 30-115 cm, nồng độ TCDD giảm dần theo độ sâu từ
123 đến 4,15 ppt.
* Tại khu vực đóng thùng khi thu hồi, các mẫu phân tích trên bề mặt với độ sâu
từ 0-10 cm nằm trong khoảng 5,2 ppt đến 99,7 ppt và tỷ lệ đồng phân độc 2,3,7,8-
TCDD chiếm trên 80%. Tại khu pha trộn và đóng nạp, nồng độ chất ô nhiễm vẫn ở
mức độ cao và nằm trong khoảng 64 đến 11.700 ppt. Tất cả các mẫu tại khu vực này
có tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm tỷ lệ cao 94,9 - 95,7 % (Hatfield, 2009).
1.2.2.4. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Phù Cát
12

Khu vực nhiễm độc và hướng lan tỏa trong sân bay Phù Cát có nồng độ ô
nhiễm giảm dần theo độ sâu và được chia thành các khu sau:
* Khu nhiễm độc cao: khu chứa chất độc hóa học và nạp chất độc lên phương tiện
phun rải. Khu vực này có độ ô nhiễm cao nhất với nồng độ khoảng 11.400 – 49.500 ppt.
* Khu rửa phương tiện (sau khi phun rải chất phát quang): khu vực này có độ ô
nhiễm thấp nhất, chỉ 18 - 270 ppt.
* Khu vùng đệm: vùng đệm nằm trên vùng đất từ khu chứa, nạp rửa đến cửa
cống qua đường liên khu chảy vào hồ A và có nồng độ ô nhiễm 210 – 2450 ppt.
1.3. Phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo
Nhiều nghiên cứu về quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ
chứa clo đã được công bố. Trong phần này sẽ đề cập chi tiết về cơ chế phân hủy và
chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo bởi VSV, các nghiên cứu về phân hủy
chất diệt cỏ, dioxin bởi các VSV hiếu khí và kỵ khí.
1.3.1. Cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo
Có 4 con đường phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo bởi các
VSV hiếu khí và kỵ khí (Reineke, 2001; Fennell, 2004; Yoshida, 2005) như sau:
(i) Oxy hóa cắt vòng thơm bởi các enzyme hydrocarbon dioxygenase vòng
thơm của các VSV hiếu khí.
(ii) Loại clo của các sản phẩm cắt vòng bởi các VSV hiếu khí (Hình 1.2).
(iii) Phân hủy nhờ xúc tác bởi các enzyme ngoại bào như laccase, mangan
peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP) chủ yếu do nấm và xạ khuẩn sinh ra
(Hình 1.3).
(iiii) Loại khử clo bởi các VK KK (Hình 1.4).
Dưới đây là các cơ chế chuyển hóa bởi một số đại diện của một số nhóm VSV
khác nhau đã được chứng minh.
13

Hình 1.2. Quá trình loại clo sản phẩm cắt vòng của lindane và pentachlorophenol ở
điều kiện hiếu khí (Reineke, 2001)
Quá trình loại clo ở VSV hiếu khí đối với các hợp chất hữu cơ vòng thơm

chứa nhiều clo xảy ra theo hai cơ chế là cơ chế loại clo sớm và cơ chế loại clo
muộn. Ở cơ chế loại clo sớm, các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa nhiều clo được
tạo thành các hợp chất vòng thơm không chứa hoặc chứa rất ít clo, sau đó các hợp
chất này bị phân hủy theo con đường ortho hay meta và cuối cùng đi vào chu trình
Krebs. Cơ chế loại clo muộn sẽ tạo ra các hợp chất đã bị cắt vòng vẫn chứa clo như
chlorocatechol, chloroprotocatechuate hay chlorohydroquinone. Sau đó, các hợp
chất này bị phân hủy theo con đường ortho biến đổi (Reineke, 2001) (Hình1.5).
Khác với vi khuẩn, nấm không sử dụng các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa
clo làm nguồn carbon và năng lượng mà quá trình phân hủy các hợp chất này xảy ra
nhờ một hệ thống enzyme ngoại bào được tiết ra môi trường bao gồm phenol
oxidase, LiP, MnP và laccase ở các nấm phân hủy gỗ. Các enzyme này có phổ đặc
hiệu cơ chất rộng, chúng có thể xúc tác quá trình phân hủy các hợp chất như
chloroaniline, chlorobenzene, chlorophenol, chlorobiphenyl hay dibenzo-p-dioxin.
Các chủng nấm có khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy các hợp chất này bao
gồm chi Phenarochaete, Pleurotus, Trametes, Sphingomonas, Cordyceps,
Pennicilium. v.v. (Reineke, 2001, Cvančarová, 2013).
14

Hình 1.3. Con đường phân hủy 2,4-DCP bởi nấm Phanerochaete chrysosporium
(Reineke, 2001). LiP/MnP: sự tham gia của 1 hay cả 2 enzyme LiP và MnP

Hình 1.4. Các con đường loại khử clo của 1,2,3,4-TCDD (A) và 1,2,3,7,8-PeCDD
(B) ở chủng D.mccartyi CBDB1 (Hiraishi, 2003)
Ở điều kiện kỵ khí, quá trình loại khử clo là quá trình phân hủy hay chuyển
hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo xảy ra nhờ các enzyme nội bào trong điều kiện
thiếu oxy và hoàn toàn không có oxy. Quá trình này xảy ra với các chất chứa nhiều
15
clo nhanh hơn các hợp chất chứa ít clo và có tính chọn lọc với các hợp chất, chi và
loài vi khuẩn. Vị trí các nguyên tử clo trong phân tử cũng ảnh hưởng đến quá trình
loại khử clo. Ví dụ, quá trình loại khử clo của monochlorobenzoate sẽ ưu tiên ở vị

trí meta-, rồi đến vị trí para- và cuối cùng là vị trí ortho- nhưng quá trình loại khử
clo của các hợp chất chứa nhiều clo lại ưu tiên ở vị trí para- hay nguyên tử clo nằm
giữa hai nguyên tử clo khác trong phân tử (Reineke, 2001).
Các VK KK tham gia vào quá trình loại khử clo cũng khá đa dạng, bao gồm
nhóm VK KSF (Desulfovibrio, Desulfitobacterium, Desulfomonile) và một số VK
khác (Dehalobacter, Dehalococcoides, Dehalogenimonas). Quá trình loại khử clo của
một số hợp chất đa vòng thơm ở D. mccartyi CBDB1 được trình bày ở Hình 1.4.

Hình 1.5. Sơ đồ khoáng hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm với hợp chất trung gian là
chlorocatechol (Reineke, 2001)
16
Các cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo đã trình bày
(Hình 1.2 – 1.5) cho ta thấy tiềm năng và sự loại bỏ clo ở những hợp chất này bởi
những VSV khác nhau trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Ở mỗi con đường đều có
sự tham gia của các đại diện thuộc rất nhiều chi VSV khác nhau. Cho đến nay, các
nhà khoa học cần rất nhiều nghiên cứu sâu sắc bằng các công nghệ cao, hiện đại mới
có thể làm rõ hiệu quả phân hủy và cơ chế phân hủy các hợp chất clo. Quá trình phân
hủy sinh học có thể triệt để chỉ khi trong công nghệ xử lý có sự kết hợp nhiều cơ chế
khác nhau. Quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo thường
tạo ra hợp chất trung gian là chlorocatechol như ở Hình 1.5. Quá trình chuyển hóa
hoàn toàn các hợp chất hữu cơ chứa nhiều clo có thể được tóm tắt trên Hình 1.6.
Qua một số cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo ở trên, một
lần nữa khẳng định vai trò của việc kết hợp nhiều nhóm VSV hiếu khí và kỵ khí
trong quá trình chuyển hóa hay khoáng hóa hoàn toàn các hợp chất hữu cơ chứa clo,
trong đó không thể không có sự tham gia của các VK KK hô hấp loại khử clo.

Hình 1.6. Con đường phân hủy hoàn toàn PCDD/Fs bởi các quần xã VK trong quá trình
phân hủy sinh học (Hiraishi, 2003)
Trong quá trình phân hủy sinh học các chất hữu cơ chứa clo, quá trình loại khử
clo là bước mở đầu, bước khử độc ở điều kiện kỵ khí tạo điều kiện cho sự khoáng hóa

hoàn toàn các hợp chất này ở điều kiện hiếu khí. Tuy nhiên, một số VSV vẫn có khả
17
năng chuyển hóa hay phân hủy các hợp chất như 2,4-D, 2,4,5-T trong điều kiện hiếu
khí. Để có bức tranh tổng thể về quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu
cơ chứa clo nói chung và các hợp chất dioxin nói riêng, sự đa dạng các VSV tham gia
vào quá trình chuyển hóa, phân hủy chất diệt cỏ/dioxin ở điều kiện hiếu khí và vai trò
của các VK KK trong quá trình loại khử clo sẽ được đề cập.
1.3.2. Phân hủy hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin
1.3.2.1. Phân hủy hiếu khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về phân hủy hiếu khí các hợp
chất chứa clo nói chung, các chất là thành phần chính của chất diệt cỏ như 2,4-D,
2,4,5-T nói riêng. Các nhân tố ảnh hưởng đến phân hủy sinh học 2,4-D, 2,4,5-T bao
gồm nồng độ, cấu trúc hóa học, mức độ đa dạng VSV, độ ẩm, nhiệt độ, pH, nồng độ
oxy và các điều kiện địa hóa thổ nhưỡng khác (Picton, 2004).
Chuyển hóa 2,4-D bởi dioxygenase phụ thuộc

-ketoglutarate do gene tfdA mã hóa
đã được nghiên cứu ở chủng Cupriavidus necator JMP134 (Fukumori, 1993). Các
VSV phân hủy 2,4-D đã được tìm thấy trong một số loại đất, bùn, vùng nước hiếu khí
gần bề mặt, phân ủ, bùn hoạt tính, hồ và sông. 2,4-D được chuyển hóa thành 2,4-DCP
và sau đó được oxy hóa đến 3,5-dichlorocatechol. Quá trình phân hủy 2,4-D được thực
hiện bởi các VK Arthrobacter, Pseudomonas, Cupriavidus (tên cũ Alcaligenes hoặc
Ralstonia), Flavobacterium, Burkholderia (tên cũ Pseudomonas), Halomonas và
Variovorax thuộc lớp

ß và γ-Proteobacteria (Itoh, 2004).
Một số nghiên cứu về phân hủy 2,4-D và 2,4-DCP bởi nấm sợi đã được ghi
nhận. Ryan và Rumbus (1989) nghiên cứu về quá trình khoáng hóa 2,4,5-T bởi nấm
đảm P. chrysosporium BKM-F-1767 trong điều kiện nuôi cấy lỏng và trong đất.
Vroumsia và đtg (2005) đã nghiên cứu chi tiết về khả năng phân hủy 2,4-D và 2,4-

DCP bởi các loài nấm Aspergillus penicilloides, Mortierella isabellina,
Chrysosporium pannorum và Mucor geneevensis.
2,4,5-T khó bị phân hủy hơn và các nghiên cứu về phân hủy sinh học hợp chất này ít
hơn so với 2,4-D. Chủng VK sử dụng 2,4,5-T được nghiên cứu đầy đủ nhất là
Burkholderia phenoliruptrix AC1100 (tên cũ Pseudomonas cepacia AC1100) (Kitagawa,
18
2002). Một số chủng VK khác sử dụng 2,4,5-T như Nocardioides simplex 3E,
Stenotrophomonas maltophilia (Mai, 2001), Burkholderia sp. JR7B3 (Rice, 2005),
Raoultella planticola (Zharikova, 2006).
Tại Việt Nam, một số nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu các chủng hay
quần xã VSV có khả năng sinh trưởng và sử dụng 2,4-D, 2,4,5-T là nguồn carbon
theo cơ chế đồng trao đổi chất (Kiều Hữu Ảnh, 2003; Hoàng Thị Mỹ Hạnh, 2004;
Đặng Thị Cẩm Hà, 2005; La Thanh Phương, 2005; Lê Văn Nhương, 2005). Các kết
quả nghiên cứu sẽ được trình bày chi tiết ở phần cuối của chương này nhằm làm
sáng tỏ mục tiêu và các đóng góp của luận án.
1.3.2.2. Phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin
Theo Field (2008), trong số các nghiên cứu về VK phân hủy các hợp chất
PCDD và PCDF có tới 84% kết quả nghiên cứu công bố về phân hủy hiếu khí các
hợp chất dioxin chứa 1 hoặc 2 clo. Hiện nay, phân hủy sinh học các dioxin chứa ba
hay bốn clo đang được quan tâm nghiên cứu. Nhìn chung, quá trình phân hủy sinh
học của các hợp chất dioxin chứa clo tăng lên khi số nguyên tử clo trong phân tử
giảm. Các hợp chất PCDD/F chứa 5 nguyên tử clo hoặc nhiều hơn khó bị phân hủy
sinh học hiếu khí do độ độc của các hợp chất tăng cùng với số nguyên tử clo trong
phân tử. Nghiên cứu của Cermiglia (1979), Klecka (1980) cho thấy, dibenzo-dioxin
(DD), dibenzo-furan (DBF) và các chất tương tự chứa clo được chuyển hóa đầu tiên
đến các hợp chất dạng cis-dihydroxylate bởi các VK Pseudomonas và Beijerinckia
spp. Phân hủy naphthalene và biphenyl bởi VK không triệt để và tạo ra các sản
phẩm “ngõ cụt”. Phản ứng oxy hóa kép vị trí bên tạo ra DBF đã được hydroxylate
hóa và sản phẩm này được chuyển hóa tiếp thông qua quá trình cắt vòng ở vị trí
meta để tạo ra chất chuyển hóa phân cực màu vàng và hấp thụ cực đại ở bước sóng

khoảng 460 nm. Một số VK oxy hóa kép vị trí bên của dioxin và các hợp chất tương
tự bao gồm Novosphingobium aromaticivorans IFO15084, N. stygium IFO 16085,
N. sunterraneum IFO 16086, Porphyribacter sanguineus IAM 12620T,
Sphingobacterium yanoikuyae B1, B. cepacia F297, B. cepacia ET4, Ralstonia sp.
SBUG290, Pseudomonas sp. HL7b v.v. Kubota và đtg (2005) đã phân lập 7 chủng
19
VK Nocardioides aromaticivorans sử dụng DBF. Các chủng VK này tạo ra các chất
chuyển hóa màu vàng không hòa tan, hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 400 đến 507
nm và phụ thuộc pH.
Chủng Sphingomonas wittichii RW1 có khả năng chuyển hóa một số đồng phân
của dibenzo-p-dioxin và dibenzo-p-furans thành các hợp chất không độc. Chủng
này cũng có thể bẻ gãy khung carbon của dioxin và sử dụng chúng như nguồn
carbon và năng lượng duy nhất. Chủng này cũng đã được chứng minh là mang
enzyme dioxin dioxygenase (Hartmann, 2013, Sowers, 2013).
Chủng nấm Cerrena sp. F0607 có khả năng phân hủy 2,4,8-trichlorodibenzo-p-
furan ở nồng độ 10 mg/l trong đó phát hiện được cả 3 loại enzyme ngoại bào phân
hủy lignin (Hidayat, 2013). Nấm Pleurotus ostreatus có khả năng phân hủy penta-,
hexa-chlorobiphenyl. Trong môi trường nuôi cấy phát hiện được phức hệ enzyme
tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm như enzyme ngoại bào
(ligninolytic enzyme) và enzyme nội bào (cytochrome P450 monooxygenase,
arylalcohol dehydrogenase, arylaldehyde dehydrogenase) (Cvančarová, 2013).
Một số VK khác có cả hai quá trình oxy hóa kép ở vị trí bên và vị trí góc của
các dioxin như VK biển Cycloclasticus pugetti, Comamonas sp. KD7, Rhodococcus
sp. NCIMB 12038, Rhodococcus opacus SAO 101 (Chang, 2008) và Rhodococcus
sp. HA01 (Aly, 2008).
Theo Habe, chủng Rhodococcus opacus SAO101 có khả năng sử dụng 1-
MCDD, 2,3-DCDD, 2,7-DCDD; chủng Terrabacter sp. DBF63 có khả năng sử dụng
2-MCDD, 2,3-DCDD (Habe, 2001). Theo Aly, chủng Rhodococcus sp. HA01 có thể
sử dụng DD là nguồn carbon duy nhất nhưng các tế bào sinh trưởng trên DBF có thể
chuyển hóa DD, 2-CDBF và 3-CDBF (Aly, 2008). Chủng P. veronii PH03 phân hủy

được 90,7% DD, 79,7% DBF, 88,3% 1-MCDD và 78,6% 2-MCDD sau 60 giờ nuôi
cấy với nồng độ ban đầu của các chất là 1 mM (Hong, 2004).
Ở Việt Nam, một số chủng VSV phân lập từ đất hoặc bùn ô nhiễm chất diệt cỏ
chứa dioxin có khả năng sử dụng DBF và sinh trưởng trên môi trường chứa DD, 2-
20
MCDD như nguồn carbon đồng trao đổi chất. Tuy nhiên, các kết quả chi tiết sẽ
được trình bày ở phần cuối của chương này.
1.3.3. Phân hủy kỵ khí chất diệt cỏ/dioxin
Trong nhiều thập niên qua, quá trình phân hủy kỵ khí các hợp chất hữu cơ
chứa clo đã và đang được quan tâm nghiên cứu. Nhiều VK KK sử dụng các chất ô
nhiễm chứa clo là các chất nhận điện tử trong quá trình hô hấp và được gọi là VK
KK hô hấp loại clo hoặc hô hấp clo (Hiraishi, 2008). Tuy nhiên, số lượng các
nghiên cứu loại khử clo vẫn ít hơn nhiều so với nghiên cứu phân hủy sinh học
dioxin, các chất tương tự dioxin và các sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy
theo cơ chế oxy hóa.
1.3.3.1. Phân hủy sinh học kỵ khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy
Các VSV tham gia vào quá trình loại khử clo rất đa dạng, chủ yếu thuộc ba
ngành chính là Chloroflexi, Firmicute và Proteobacteria (Hiraishi, 2008; Maphosa,
2010). Nghiên cứu đầu tiên về loại khử clo là quá trình chuyển hóa 2,4,5-T thành
2,5-D bởi quần xã VSV chuyển hóa 3-chlorobenzoate (Suflita, 1984). Theo Bryant
(Bryant, 1992), phân hủy 2,4,5-T được bắt đầu bởi sự loại một nguyên tử clo thành
2,5-D trong mẫu bùn và trầm tích. Tuy nhiên, trong các quần xã VSV, quá trình
loại khử clo thường xảy ra ở các vị trí bên và 2,4,5-TCP được phát hiện là sản phẩm
đầu tiên của quá trình chuyển hóa kỵ khí 2,4,5-T (Mitsevich, 2000, Nguyen, 2007).
Phân hủy 2,4-D chủ yếu bắt đầu bởi sự loại bỏ nguyên tử clo ở vị trí bên (Boyle,
1999a). Quá trình chuyển hóa 2,4-D đến 4-chlorophenoxyacetate cũng đã được
phát hiện (Warner, 2002). Quá trình phân hủy 2,4-DCP ở điều kiện kỵ khí trong các
mẫu trầm tích nước ngọt cũng đã được công bố (Zhang,1990). Trong các quần xã
VK, loại khử clo của các chlorophenol tạo thành từ các chlorophenoxyacetate
thường được bắt đầu bởi phản ứng loại một clo ở vị trí ortho, kết quả là làm tăng

lượng 3,4-dichlorophenol từ 2,4,5-T (Mikesell, 1985; Gibson, 1990), 3-
chlorophenol từ 2,5-D (Bryant, 1992; Nguyen, 2007) hoặc 4-chlorophenol từ 2,4-D
(Warner, 2002).
21
1.3.3.2. Phân hủy kỵ khí các hợp chất dioxin
Townsend (Townsend, 1983) đã có nghiên cứu đầu tiên về sự thay đổi các
dạng dioxin và sự tích lũy các dạng ít clo trong các mẫu trầm tích. Loại khử clo của
các hợp chất dioxin bởi VSV đã được phát hiện trong trầm tích, bùn và đất nhiễm
những hợp chất này (Vargas, 2001; Yoshida, 2005; Hiraishi, 2008). Kết quả nghiên
cứu của Bunge và đtg cho thấy chủng Dehalococcoides mccartyi CBDB1 có khả
năng loại khử clo của 1,2,3,4-TCDD và 1,2,3,7,8-PeCDD (Bunge, 2003). Chủng
thuần D. mccartyi 195 hay quần xã VK có mặt chủng này có khả năng loại khử clo của
1,2,3,4-TCDD tạo ra 1,2,4-TrCDD, 1,3-DiCDD, loại clo của HCB tạo ra 1,2,3,5-TCB,
loại clo của 2,3,4,5,6-pentachlorobiphenyl thành 2,3,4,6-TCB, 1,3,5-TrCB, loại clo của
1,2,3,4-tetrachloronaphthalene tạo ra các đồng phân dichloronaphthalene chưa xác
định (Fennell, 2004). Việc bổ sung 1,2,3,4-TCB và 2,3,4,5-tetrachloroanisole đã tăng
cường quá trình loại clo của 1,2,3,4-TCDD và TCDF của VSV trong các trầm tích
(Hiraishi, 2008). Theo Bunge, các mẫu làm giàu VK KK từ bùn có khả năng loại clo
1,2,4-TrCDD và 1,2,3-TrCB tới 1,3-DCB. Ngoài ra, trong quá trình loại khử clo, số
VK loại khử clo đã tăng 4 lần so với ban đầu và đạt 11% số lượng VK tổng số có mặt
trong mẫu làm giàu ở cuối chu kỳ nuôi cấy (Bunge, 2008). Các VK Dehalococcoides
có khả năng loại khử clo của các hợp chất hữu cơ chứa nhiều clo thành các hợp chất
chứa ít clo như các đồng phân chứa 1-2 nguyên tử clo. Các hợp chất này sẽ bị các
VSV hiếu khí phân hủy tiếp bằng cách cắt khung carbon (Bunge, 2009).
1.4. Đa dạng các vi khuẩn tham gia hô hấp loại khử clo
Các VK KK hô hấp loại khử clo rất đa dạng và được chia thành 3 nhóm.
Trong phần này sẽ trình bày chi tiết về đặc điểm của các VK hô hấp loại khử clo nói
chung và đặc điểm, đại diện của từng nhóm nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của các vi khuẩn hô hấp loại khử clo
Đã có nhiều bằng chứng về VK KK tham gia hô hấp loại clo đóng vai trò quan

trọng trong quá trình chuyển hóa và loại độc tố của các hợp chất hữu cơ chứa clo như
chloroethene, chlorobenzene, chlorophenol, PCB, PCDD/Fs. Theo công bố của một số
tác giả thì các VK tham gia loại khử clo thuộc 3 ngành chính là Firmicutes (VK Gram
22
dương có tỷ lệ G + C thấp), Proteobacteria (bao gồm

- và δ

- Proteobacteria) và
Chloroflexi (Hình 1.7) (Smidt, 2000, 2004; Hiraishi, 2008; Richardson, 2013).
(i) Các đại diện của ngành Firmicutes bao gồm các chi Desulfitobacterium,
Dehalobacter, Clostridium, Acetobacterium có khả năng loại khử clo của các hợp
chất hữu cơ mạch thẳng, vòng thơm hay cả hai.
(ii) Các đại diện của ngành Proteobacteria bao gồm các chi Desulfuromonas,
Desulfomonile, Desulfovibrio, Dehalospirillum và một số chi khác như
Sulfurospirillum, Anaeromyxobacter, Geobacter, Pseudomonas, Shewanella v.v.
(Suyama, 2001; Rowe, 2008; Richardson, 2013; Kranzioch, 2013).
(iii) Các đại diện của ngành Chloroflexi bao gồm các chi Dehalococcoides,
Dehalobium và Dehalogenimonas. Đây là các chi VK có khả năng loại clo của rất
nhiều hợp chất chứa clo vòng thơm, đa vòng thơm và mạch thẳng (Hiraishi, 2008;
Richardson, 2013; Kranzioch, 2013). Ngoài ra, rất nhiều VK thuộc ngành Chloroflexi
không nuôi cấy được cũng có mặt trong các khu vực ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa
clo (Nguyễn Bá Hữu, 2009; Đào Thị Ngọc Ánh, 2013).
Dựa vào đặc tính sinh lý về khả năng loại khử clo, các VK có khả năng hô hấp
loại khử clo được chia thành ba nhóm là nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc, nhóm hô
hấp loại khử clo không bắt buộc và nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất (Hiraishi,
2008).
(a) VK hô hấp loại khử clo không bắt buộc là nhóm có khả năng loại khử
clo của các hợp chất chứa clo để sinh năng lượng trong quá trình hô hấp (Hiraishi,
2008). Tuy nhiên, các VK nhóm này vẫn có thể tổng hợp năng lượng khi được nuôi

cấy trên các cơ chất hữu cơ không chứa clo khác như hydrocarbon, 2,4,6-
trinitrotoluene, 2,4-dinitro-toluene, hexahydro-1,2,3-trinitro-1,3,5-triazine và có thể
là một số hợp chất vô cơ như muối sulfate, thiosulfate, nitrate, nitrite, Mn
2+
, Fe
2+

(Barton, 2007). Nhóm này thường có kiểu trao đổi chất đa dạng, dễ nuôi cấy và
phân lập. Hầu hết các VK KSF thuộc nhóm này. Theo một số tác giả (Hiraishi,
2008; Maphosa, 2010; Richardson, 2013), nhóm hô hấp loại khử clo không bắt buộc
bao gồm các loài thuộc chi Anaeromyxobacter, Desulfomonile, Desulfovibrio,
Desulfomonas, Geobacter, Sulfurospirillium, Desulfitobacterium.
23
(b) VK hô hấp loại clo bắt buộc là nhóm VK có kiểu sống bị giới hạn,
tổng hợp năng lượng cho sinh trưởng từ quá trình loại khử clo của các hợp chất
vòng thơm hay mạch thẳng chứa clo với H
2
là chất cho điện tử. Tất cả các chủng đã
phân lập được đều là VK sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ và pH trung tính, sống
trong môi trường đất, nước ngọt và nước biển (Hiraishi, 2008). VK hô hấp loại clo
bắt buộc gồm các loài thuộc chi Dehalobacter, Dehalococcoides, Dehalobium,
Dehalogenimonas và một số đại diện thuộc ngành Chloroflexi không nuôi cấy.
Nhóm VK này thường là kỵ khí bắt buộc và chỉ sử dụng năng lượng sinh ra từ quá
trình loại khử clo cho hô hấp và sinh trưởng. Nhóm này rất khó phân lập và nuôi
cấy ở dạng chủng thuần. Tuy nhiên, nhóm VK này có tiềm năng để xử lý các chất ô
nhiễm hữu cơ chứa clo do chúng chứa rất nhiều bản sao gene chức năng tham gia
vào quá trình loại khử clo (Krajmalnik-Brown, 2005; Lee, 2006; Richardson, 2013).
(c) Nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất là nhóm VK KK bắt buộc hay
không bắt buộc, chúng loại khử clo cùng với quá trình trao đổi chất và sinh năng
lượng. Đại diện của nhóm này bao gồm Propionigenium, Pseudomonas,

Shewanella, Desulfobacterium, Acetobacterium, Clostridium (Hiraishi, 2008). Đây
là các VK kỵ khí bắt buộc hay không bắt buộc nhưng chúng có thể sống trong điều
kiện hoàn toàn không có oxy. Đặc biệt là VK Pseudomonas là VK hiếu khí nhưng
cũng sống được trong điều kiện có rất ít hay hoàn toàn không có oxy.
24

Hình 1.7.Cây phát sinh chủng loại của các VK loại khử clo dựa trên trình tự đoạn
gene 16S rRNA. Con số trong ngoặc đơn là mã số trên GenBank (Hiraishi, 2008)
O: Các VK loại khử clo bắt buộc F: các VK loại khử clo không bắt buộc
+: Các VK có khả năng loại khử clo đồng trao đổi chất
Khi nghiên cứu quần xã VK KK loại clo từ vị trí ô nhiễm các dung môi hữu
cơ ở West Louisiana Hoa Kỳ cho thấy có 42 dòng VK trong đó Dehalobacter chiếm
25 dòng, Clostridium chiếm 5 dòng, Dehalococcoides chiếm 4 dòng, các chi khác
chiếm ít hơn 3 dòng (Grostern, 2006). Ngoài ra, một số VK sinh metan như
Methanosarcina và acetogene như Acetobacterium, Spomusaovate có thể loại clo
theo cơ chế đồng trao đổi chất (EPA, 2006; Hiraishi, 2008). Trong các mẫu làm
giàu từ sông Dương Tử (Trung Quốc) trên PCE, các VK Dehalobacter,
Dehalococcoides, Desulfomonile và Desulfitobacterium có mặt và quá trình loại clo
25
của PCE xảy ra hoàn toàn tới ethene. Tuy nhiên, nếu không có mặt Dehalococcoides
thì quá trình loại khử clo chỉ dừng lại ở 1,2-cis-DCE (Kranzioch, 2013).
Ngoài ra, có nhiều VSV hiếu khí khác cũng tham gia loại khử clo của DDT
thành DDD như Proteus vulgaris, E.coli, Enterobacter, Bacillus, Flavobacterium,
Cyanobacteria. Một số VK hiếu khí khác lại phân hủy DDT theo con đường kỵ khí
như Hydrogenomonas, Enterobacter aerogenes, Bacillus, E.coli (Gohil, 2011).
Trong số các VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo, VK KSF,
Dehalococcoides và Pseudomonas được nghiên cứu nhiều do đặc tính riêng của
chúng. Cho đến nay, Dehalococcoides được xem là các “thợ khử” clo, thuộc nhóm
hô hấp loại khử clo bắt buộc còn VK KSF thuộc nhóm loại khử clo không bắt buộc,
dễ nuôi cấy. VK Pseudomonas có thể sống trong cả điều kiện hiếu khí hay kỵ khí

không bắt buộc và có khả năng loại khử clo (trong điều kiện kỵ khí) hay chuyển hóa
các hợp chất hữu cơ chứa clo (trong điều kiện hiếu khí). Do đó, sự đa dạng các
nhóm này sẽ được trình bày ở các tiểu mục sau.
1.4.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate
VK KSF có mặt ở hầu hết các môi trường sinh thái như trong nước biển, nước
ngọt và cả trầm tích, đất, đặc biệt là những nơi có nồng độ sulfate cao. Các VK KSF là
nhóm VK KK sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử trong quá trình trao đổi năng
lượng (Barton, 2007). Về đặc điểm sinh lý và trao đổi chất, các VK KSF thuộc nhóm
loại clo không bắt buộc, có thể sử dụng các hợp chất hữu cơ chứa clo làm chất nhận
điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp. Tuy nhiên, tại các nơi không có các hợp chất
chứa clo, các VK này vẫn tồn tại và có thể sử dụng các hợp chất vô cơ như các muối
sulfate, muối thiosulfate hay các hợp chất hữu cơ không chứa clo như 2,4-
dinitrotoluene, 2,4,5-trinitrotoluene, hydrocarbon v.v. làm chất nhận điện tử cuối cùng
trong chuỗi hô hấp của chúng. Do đó, vai trò của nhóm VK này rất quan trọng trong
quá trình phân hủy sinh học các chất ô nhiễm hữu cơ chứa clo hay không chứa clo
(Barton, 2007). Trong một quần xã VK KSF thường tồn tại nhiều nhóm VK KSF khác
nhau, chúng hỗ trợ nhau trong quá trình sinh trưởng. Một số chủng sẽ phân hủy các