Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của ba kết hợp với NAA và 2,4 d lên mẫu cây lá kim ngân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------------o0o-----------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BA KẾT
HỢP VỚI NAA VÀ 2,4-D LÊN MẪU CẤY LÁ KIM NGÂN
(Lonicera japonica Thunb)
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã ngành

: 111

GVHD: CN. BÙI VĂN THẾ VINH
SVTH : NGUYỄN THÁI QUỲNH QUYÊN
MSSV : 105111053

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC KTCN TPHCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC
------------------------

KHOA: MT và CNSH

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN THÁI QUỲNH QUYÊN

MSSV:105111053

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỚP: 05DSH

1. Đầu đề đồ án tốt nghiệp

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BA KẾT HỢP VỚI NAA VÀ
2,4-D LÊN MẪU CẤY LÁ KIM NGÂN (Lonicera japonica Thunb)
2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu)
 Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro.
 Xác định thời gian khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy lá để tìm ra thời gian khử trùng
cho tỉ lệ nhiễm thấp nhất và mẫu cấy vẫn còn có khả năng tăng trưởng.
 Khảo sát cách đặt mẫu lá của Kim Ngân Hoa để tìm ra cách đặt mẫu cho khả năng phát
sinh hình thái nhanh và tốt nhất.
 Đánh giá tác động của chất kích thích tăng trưởng (BA, 2,4-D, NAA) ở các nồng độ khác
nhau lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy.
3. Ngày bàn giao Đồ án tốt nghiệp: 1/04/2009
4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/6/2009
5. Họ tên người hướng dẫn

Phần hướng dẫn

CN. Bùi Văn Thế Vinh

Toàn bộ Đồ án

Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn.
Ngày …… tháng……..năm 2009
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH

( Ký và ghi rõ họ tên)

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN
Người duyệt (chấm sơ bộ): ....................................................
Đơn vị:...................................................................................
Ngày bảo vệ: .........................................................................
Điểm tổng kết: .......................................................................
Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp: ................................................

(Ký và ghi rõ họ tên)


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

Lời cảm ơn
Em xin chân thành cảm ơn:
 Ban Giám hiệu Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh,
Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền
đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.
 Thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và giúp

đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
 Thầy Phạm Minh Nhựt và các thầy cô, anh chị nhân viên tại Phòng Thí Nghiệm
khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học thuộc Trường Đại học Kỹ Thuật Công
Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành
khoá luận này.
 Cha mẹ đã suốt đời tận tụy để con có được ngày hôm nay.
 Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp 05DSH đã gắn bó, giúp đỡ tôi trong suốt 4
năm qua.

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

Mục lục
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt ..............................................................................................i
Danh mục bảng ...................................................................................................... ii
Danh mục hình ...................................................................................................... iii

1.

MỞ ĐẦU .........................................................................................1

1.1.

Đặt vấn đề ................................................................................................2

1.2.

Mục đích và nội dung nghiên cứu............................................................4

1.2.1.

Mục đích ..................................................................................................4

1.2.2.

Nội dung nghiên cứu................................................................................4

2.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................5

2.1.

Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật................................................6

2.1.1.

Khái niệm.................................................................................................6

2.1.2.

Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật..............6

2.1.2.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản................................................................6
2.1.2.2. Về mặt thực tiễn sản xuất.........................................................................7
2.1.3.

Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp nhân giống in vitro ......7

2.1.4.

Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô ........................................................9

2.1.5.

Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô .............................10

2.1.6.

Các bước nhân giống in vitro.................................................................10

2.1.6.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy .............................................................10
2.1.6.2. Tạo thể nhân giống in vitro....................................................................12
2.1.6.3. Nhân giống in vitro ................................................................................13
2.1.6.4. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro.............................................................13
2.1.6.5. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm ..................................................13
2.1.7.

Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro ............................14

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

2.1.7.1. Sự hình thành chồi bất định .................................................................15
2.1.7.2. Sự hình thành rễ bất định ......................................................................17
2.1.8.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái trong nuôi
cấy in vitro.............................................................................................18

2.1.8.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy........................................................................18
2.1.8.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ....................................................21
2.1.9.

Các chất khử trùng hóa học được sử dụng trong nuôi cấy mô .............26

2.2.

Giới thiệu chung về Kim Ngân Hoa .....................................................27

2.2.1.

Vị trí phân loại ......................................................................................27

2.2.2.

Đặc điểm quan trọng của Kim Ngân Hoa .............................................28

2.2.3.

Tác dụng dược lý...................................................................................31

2.2.4.

Điều kiện trồng trọt ...............................................................................33

2.2.5.

Những nghiên cứu chính về Kim Ngân Hoa.........................................36

3.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................37

3.1.

Thời gian và địa điểm thí nghiệm .........................................................38

3.2.

Vật liệu ..................................................................................................38

3.2.1.

Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................38

3.2.2.

Trang thiết bị và dụng cụ ......................................................................38

3.2.3.

Các loại môi trường...............................................................................39

3.2.4.

Điều kiện nuôi cấy trong phòng nuôi cấy in vitro ................................40

3.3.

Phương pháp bố trí thí nghiệm..............................................................40

3.3.1.

Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung
dịch Javel 7% ........................................................................................40

3.3.2.

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của cách đặt mẫu lá lên môi trường
nuôi cấy đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu ............................ 41

3.3.3.

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA
kết hợp với 2,4 D và NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim

Ngân Hoa ..............................................................................................42

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

3.4.

Phân tích thống kê.................................................................................42

4.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................... 43

4.1.

Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch
Javel 7% ................................................................................................44

4.2.

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của cách đặt mẫu lên khả năng phát
sinh hình thái của mẫu cấy....................................................................47

4.3.

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA

kết hợp với 2,4 D và NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim
Ngân Hoa ..............................................................................................50

4.3.1.

Thí nghiệm 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng
BA kết hợp với 2,4 D lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân
Hoa ........................................................................................................50

4.3.2.

Thí nghiệm 3.2 : Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng
BA kết hợp với NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân
Hoa ........................................................................................................58

5.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................... 68

5.1.

Kết luận .................................................................................................69

5.2.

Đề nghị ..................................................................................................70

6.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

6.1.

Tài liệu tham khảo trong nước

6.2.

Tài liệu tham khảo nước ngoài

PHỤ LỤC

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
 2,4-D

: 2,4-dichlorophenolxyacetic acid

 BA

: 6-benzyladenine

 MS

: Môi trường MS (Murashige và Skoog,1962)

 NAA

: – Naphthalene acetic acid

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.

Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô

Bảng 3.1.

Môi trường MS bổ sung 2,4-D và BA ảnh hưởng lên sự phát sinh hình
thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa

Bảng 3.2.

Môi trường MS bổ sung NAA và BA ảnh hưởng lên sự phát sinh hình
thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa

Bảng 4.1.

Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy lá Kim Ngân Hoa

Bảng 4.2.

Ảnh hưởng của cách đặt mẫu cấy lên sự phát sinh hình thái sau 1 tháng
nuôi cấy

Bảng 4.3.

Anh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp 2,4-D lên sự
phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1
tháng nuôi cấy

Bảng 4.4.

Anh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp NAA lên sự
phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1
tháng nuôi cấy

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1.

Cây Kim Ngân Hoa (Lonicera japonica Thunb)

Hình 2.2.

Một số hình ảnh về Kim Ngân Hoa

Hình 2.2.

Hoa Kim Ngân phơi khô

Hình 4.1.

Cách đặt mẫu lá

Hình 4.2.

Mô sẹo phát sinh từ mẫu lá được đặt theo 2 cách khác nhau

Hình 4.3.

Ảnh hưởng của BA kết hợp với 2,4-D lên sự phát sinh mô sẹo của mẫu
lá Kim Ngân Hoa

Hình 4.4.

Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên sự phát sinh mô sẹo của mẫu
lá Kim Ngân Hoa

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh


Đồ án tốt nghiệp

1.1.

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

Đặt vấn đề

Kim Ngân hoa (Lonicera japonica Thunb) thuộc Họ Kim Ngân (Caprifolianceae) là
cây dược liệu chứa tanin và một saponin. Hoa chứa một flavonoid là scolymosid
lonicerin và một số carotenoid (. caroten, cryptoxanthin, auroxanthin). Quả mọng giàu
carotenoid mà phần lớn là cryptoxanthin. Lá chứa một glucosid gọi là loganin và
khoảng 8% tanin.
Theo Y học cổ truyền: Kim Ngân Hoa có tác dụng thanh nhiệt giải độc.
Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại chứng minh cây thuốc Kim Ngân Hoa có
tác dụng: kháng khuẩn, chống viêm, làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt và làm tăng tác
dụng thực bào của bạch cầu, tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh cường độ bằng 1/6
của cà phê, làm hạ cholesterol trong máu, tăng bài tiết dịch vị và mật.
Khi nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng các phương pháp khuyếch tán và
hệ nồng độ, người ta thấy nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim Ngân có tác dụng kháng
khuẩn mạnh đối với các trực khuẩn lỵ, dịch hạch, thương hàn, cận thương hàn, liên cầu
khuẩn tan máu, phẩy khuẩn tả. Tác dụng yếu hơn đối với các trực khuẩn bạch hầu,
E.Coli, phế cầu, tụ cầu khuẩn vàng. Nước sắc lá Kim Ngân với nồng độ 201,2% ức chế
trực khuẩn Shiga, với nồng độ 2050% ức chế trực khuẩn cận thương hàn, nồng độ 100%

có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam).
Mặc khác, Kim Ngân cũng là dược liệu quý được dùng điều trị ung thư trong Đông
và Tây y như ung thư tuyến vú, gan, vòm họng, cổ tử cung, u bướu giáp trạng, trực
tràng,..
Ngoài tác dụng hoa lá làm thuốc, ứng dụng trong mỹ phẩm, cho cảnh đẹp, hoa thơm,
mành che nắng và mái che nắng, Kim Ngân còn có tác dụng hấp thu nhiệt của ánh nắng
mặt trời (cho cây quang hợp và phát triển) nên mát hơn mành tre, mành nhựa và mái tôn
chống nóng. Ngoài ra, nó còn hút thán khí (CO2), nhả dưỡng khí (O2) làm sạch môi
trường, tạo bầu không khí trong lành.

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

Việt Nam được xem là một nước có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng với số
lượng trên 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật và là thị
trường đầy hứa hẹn khi nhu cầu sử dụng rất lớn không chỉ là thuốc mà xu thế mỹ phẩm
dùng nguyên liệu từ thiên nhiên thay thế nguyên liệu tổng hợp đã chiếm 90% tổng số
mỹ phẩm được sản xuất.
Tuy nhiên, trong vấn đề sản xuất, kinh doanh và lưu thông, phân phối dược liệu,
nguồn dược liệu chưa tương xứng với tiềm năng hiện có và còn rất nhiều bất cập.
Hơn 90% nguyên liệu sản xuất thuốc trong nước vẫn phải nhập khẩu, chủ yếu sản
xuất những loại thuốc thông thường, ngay cả những mặt hàng thuộc về thế mạnh của
Việt Nam là các loại thuốc y học cổ truyền (YHCT), dược liệu lưu hành trên thị trường
cũng chủ yếu nhập từ Đài Loan, Trung Quốc, Singapore.
Tại TP.HCM, nơi chiếm đến 70% tỷ trọng số lượng thành phẩm và nguyên liệu dược
liệu của cả nước, 90% mặt hàng đông dược lưu hành trên thị trường là hàng nhập lậu.

Một điều đáng lưu tâm nữa là chất lượng dược liệu hiện nay vẫn chưa được kiểm
soát (trên 50% mẫu kiểm tra không đạt tiêu chuẩn chất lượng) và tỷ lệ này với các loại
thuốc từ dược liệu là 10%.
Ngoài ra, việc trồng dược liệu hiện nay vẫn thiếu sự quy hoạch tập trung, thiếu sự hỗ
trợ căn cơ từ nhà nước khiến thị trường dược liệu không ổn định, cây dược liệu vì thế
cũng không phát triển.
Vẫn chưa có một cơ quan chuyên môn nào đảm trách khâu kỹ thuật sản xuất dẫn
đến tình trạng các cây dược liệu không đảm bảo được năng suất – chất lượng – giá cả ổn
định

để

cạnh

tranh

được

với

dược

liệu

nhập

khẩu.

Như vậy với giá trị to lớn của cây Kim Ngân, là cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam
trong tình hình dược liệu của nước ta hiện nay nói chung và Kim Ngân nói riêng thì việc

đẩy mạnh nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô theo quy mô công nghiệp để có thể
nâng cao năng suất và số lượng cây trồng trong thời gian ngắn nhất đáp ứng được nhu
cầu tiêu thụ cho thị trường Việt Nam và trên thế giới là điều hết sức cần thiết.
1.2.

Mục đích và nội dung nghiên cứu

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

1.2.1.

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

Mục đích

Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro. Đồng
thời tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết các hợp chất có giá trị dược lý trong
cây Kim Ngân làm nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệp dược.
1.2.2.

Nội dung nghiên cứu

Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng đến mẫu cấy lá của
cây Kim Ngân.

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

Đồ án tốt nghiệp

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

2.1. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1.

Khái niệm

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi
cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô
trùng. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin,
các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002).
2.1.2.

Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với
nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực
tiễn sản xuất và đời sống.
2.1.2.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản
Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự

sống.
Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh đặc tính của cơ
thể với hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra qui luật về mối tương
quan giữa các bộ phận trong cây.
Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó
cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo, và từ mô sẹo có thể kích thích để
tái sinh cây hoàn chỉnh và có thể gây ra những thay đổi định hướng ở mức độ tế bào
(trước khi cho ra cây hoàn chỉnh).
Trong một cơ thể, rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính
xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chúng ta có thể
khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân
biệt một cách rõ rệt. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đầy sự phát triển của cây
trồng theo chiều hướng mong muốn.
Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tìm hiểu và tiến hành
nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ. Từ đó, người ta tìm ra được
những cơ chế miễn dịch thực vật. Khi con người hoàn toàn làm chủ được cơ chế này thì
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

các biện pháp phòng bệnh được hoàn thiện và như vậy việc chống bệnh sẽ trở nên đỡ
tốn kém hơn rất nhiều.
2.1.2.2. Về mặt thực tiễn sản xuất
Ngoài tác dụng nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, phương pháp nuôi cấy mô còn
có những đóng góp hết sức cụ thể đối với sản xuất và đời sống.
Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào là áp dụng kỹ thuật sản
xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng. Những lợi ích trong

việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp được tóm tắt như
sau:
 Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cấy mô hay nuôi
cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh hay mang
mầm bệnh.
 Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem
vào sản xuất.
 Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch.
 Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối. Sự
đồng loạt này sẽ giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch. Do đó,
năng suất lao động sẽ tăng lên. Chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện cho
khâu tiêu thụ và chế biến.
Tóm lại, nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn trong
sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp. Đây thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh
trong ngành trồng trọt.
2.1.3.

Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp nhân giống in vitro

Một số thuận lợi của phương pháp nhân giống in vitro (Pierik, 1975, Anonymous,
1980; van Assche, 1983; Gebhard và cộng sự, 1983; Kunneman-Kooij, 1984):
 Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo.
 Có thể tái sinh được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo và sự
tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh hơn do nhân
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô và tạo được cây sạch bệnh
vì có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa mẫu vào nuôi cấy, đồng thời
cũng có thể xử lý mẫu cấy của các cây có mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi
trường nuôi cấy. Các cây sạch bệnh này có thể được trao đổi dễ dàng giữa các
nơi với nhau do cây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất.
 Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên có
thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng.
 Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn dinh
dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanh năm.
 Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân giống
kế tiếp.
 Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy.
 Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng gen.
 Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai soma.
 Một số loại cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây bất
thụ đực, cây bất thụ do đột biến… có thể được duy trì và nhân giống bằng
phương pháp nhân giống in vitro.
Tuy nhiên bên cạnh những thuận lợi trên, phương pháp nhân giống in vitro có những
bất lợi sau:
 Kiểu gen thực vật không được ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy.
 Đặc biệt đối với một số loài cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện.
 Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm rất khó đối với một số cây.
 Cây khi được chuyển từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm rất dễ bị tấn công bởi
một số loại bệnh hại do nó đã quen sống trong điều kiện vô trùng. Vì vậy, cần
phải xử lý môi trường và giá thể sống của cây thật cẩn thận.
 Khả năng tái sinh cây có thể bị mất đi do việc cấy chuyển mô sẹo và huyền phù
tế bào được lặp lại nhiều lần.
 Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện.
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

 Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm cho giá thành của
cây tăng lên.
2.1.4.

Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh vực
như:
 Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp (nuôi
cấy tế bào trần).
 Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cầy huyền phù tế bào) trên
quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, các steroid
(dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm
hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp.
 Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây con thay
vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn).
 Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn).
 Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại.
 Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp.
 Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử.
 Nuôi cấy quang tự dưỡng.
2.1.5.

Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô

Bảng 2.1. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô
Nguồn gốc mẫu cấy
Đỉnh sinh trưởng
Chồi đỉnh
Chồi bên

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

Kích thước

Mẫu được tách

0,5 – 1 mm

Tế bào đỉnh sinh trưởng

0,5 – 1 cm

Chốp đỉnh có chứa một
phần thân

0,5 – 1 cm

Chồi bên có chứa một
phần thân, lá và chồi nách


Đồ án tốt nghiệp

Mẫu lá

0,2 – 0,3 cm

Phiến lá

0,2 – 1 cm

Rễ

0,5 – 1 cm

Dạng củ hành

1 – 2 cm

Hạt nảy mầm

2 – 3 mm

Hạt phấn

2.1.6.

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

0,1 – 0,5 mm

Mẫu lá được cắt nhỏ, phân
nửa được cấy chìm vào
môi trường

Phiến lá non được đặt trên
môi trường, mặt dưới đặt
trên mặt thạch
Mẫu rễ được đặt trên mặt
thạch
Mẫu được đặt trên mặt
hay được cấy chìm phân
nữa vào môi trường
Chồi non
Hạt phấn trong túi phấn

Các bước nhân giống in vitro

Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau:
2.1.6.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải sạch
bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng.
Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm
tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ.
Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vô
trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng. Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa mẫu và
khử trùng mẫu cấy.
+ Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửa mẫu
bằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy.
+ Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khử các
nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường được sử dụng để khử trùng
mẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite calcium, oxy già, nitrate
bạc, dung dịch bromine, chlorur thủy ngân. Khi thêm Tween 20 (polyoxyethylene
sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật như vậy bề mặt mẫu tiếp xúc với
chất khử trùng tốt hơn.
+ Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vô trùng trong
tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu, những phần bị tổn
thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích hợp.
+ Mẫu thực vật thường bị nhiễm bên trong và có thể được khử trùng bằng cách bổ
sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫu bằng các
chất này trước khi khử trùng.
+ Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ khi bắt
đầu nuôi cấy. Khi bị hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và lâu ngày mẫu sẽ
chết. Hiện tượng hóa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy có chứa một lượng lớn tannin
hoặc các hợp chất hydroxyphenol. Các mô non thường ít bị hóa nâu hơn mô trưởng
thành hay mô già. Hiện tượng hoại tử hoặc hóa nâu là do hoạt động của enzyme oxidase
có nhân Cu (ví dụ như polyphenoloxidase và tryosinase), nó được tổng hợp và phóng
thích tùy thuộc vào vết thương trong suốt quá trình cắt và khử trùng mẫu.
Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn cản hiện tượng hóa nâu là
dùng than hoạt tính để hấp thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra. Lượng thường dùng
0,5 – 5 g/l. Ngoài ra còn có một số chất khác như: polyvinyl pyrolidone (PVP), acid
ascorbic, acid citric, L–cystein, hydrochlorite, 1,4 – ditheithreitol, glutathione và
mercaptoethanol.
Khi nghiên cứu enzyme phenolase người ta thấy rằng enzyme này hoạt động mạnh ở
pH 6,5 và hoạt động yếu ở pH thấp. Vì vậy, nếu giảm pH thì sẽ giảm được hiện tượng
hóa nâu.
Tóm lại, từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để làm giảm hiện tượng hóa

nâu của mẫu cấy nên:
 Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mô non. Gây vết thương trên mẫu với kích thước nhỏ
nhất.

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

 Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vào môi
trường.
 Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng có lượng O2 thấp, không có ánh sáng
trong 1 – 2 tuần đầu.
 Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp sang
môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao.
 Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắt đầu nuôi
cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ không tích tụ.
2.1.6.2. Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể
nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt.
Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây
trồng. Tuy nhiên, có những loài cây trồng không có khả năng nhân giống, người ta
thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo.
Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin, GA3 và các
chất hữu cơ khác.
2.1.6.3. Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy

là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi trường tạo thể chồi,
đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo
dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh. Cây nhân
giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn.
2.1.6.4. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bị chuyển ra
vườn ươm cây. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trường
bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích
thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào
nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hòa của mẫu, kiểu di
truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro.
2.1.6.5. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm
Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được
nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm… Nên khi
chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng
có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và
mau héo.
Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp,
nhiệt độ không khí mát, ẩm độ cao,… cây con thường được cấy trong luống ươm cây có
cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần phải được phủ
nylon để giảm quá trình thoát nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo
ra trong quá trình cấy mô sẽ dần dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được

xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên để rút ngắn thời gian ra rễ.
2.1.7.

Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro

Sự tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà
phải trải qua một quá trình rất phức tạp vì:
 Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và những mối tương
quan mới được hình thành.
 Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau:
 Loại bỏ sự phản biệt hóa của các tế bào phản biệt hóa (dẫn đến sự trẻ hóa tế bào).
 Sự phân chia tế bào (đôi khi dẫn đến sự hình thành mô sẹo): sự hình thành cơ
quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra.
 Sự hình thành cơ quan
 Sự phát triển cơ quan
 Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố:
 Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

 Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hoặc ngoài thiên nhiên
 Vị trí của mẫu cấy trên cây
 Thời gian thu mẫu trong năm
 Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh
 Kích thước của mẫu cấy, phương pháp cấy, nuôi, thành phần dưỡng chất trong
môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng, các yếu tố vật lý trong quá

trình nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng,… sự bổ sung một số cơ chất khác vào
trong môi trường,…
Những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô rất
phức tạp, chúng ta không thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ý đến
một số vấn đề sau:
 Quá trình tái sinh phức tạp do chịu sự tương tác của nhiều nhân tố khác nhau (môi
trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hòa sinh trưởng,…).
 Không thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các loài vì mỗi loài khác
nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau.
 Khó có thể điều hòa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi loài khác nhau:
trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đóng vai trò quyết định do đó các
yếu tố ngoại sinh như chất điều hòa ảnh hưởng không nhiều.
 Sự hình thành rễ bất định thường đối lập với sự hình thành chồi bất định. Nếu cả hai
quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiều thiếu sót. Để
thu nhận một cây hoàn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo chồi bất định trước sau đó
cảm ứng tạo rễ.
2.1.7.1. Sự hình thành chồi bất định
Người ta sử dụng phương pháp tạo chồi bất định như một phương pháp nhân giống
vô tính nhằm làm tăng số lượng cây mong muốn.
Các loại cây thường được áp dụng phương pháp này để nhân giống ví dụ như:
Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lily, lan dạ hương, Nerin…
Có nhiều điểm giống nhau giữa tạo chồi bất định và tạo rễ bất định:
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

 Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành công khi sử dụng các bộ

phận của cây con (Anonymous, 1984).
 Đường luôn luôn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo cơ quan (chồi và rễ).
 Sự hình thành chồi và rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic.
 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định
 Ánh sáng
Ánh sáng kích thích sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ là có một
số cây trồng lại có thể tạo chồi dễ dàng hơn khi ở trong tối: chồi hoa của Freesia (Pierik
và Steegmans, 1975), cuống hoa Eucharis grandiflora và Nerine bowdenii (Pierik,
1985; Pierik và Steegmans, 1986). Economou và Read (1986) cho biết rằng các mẫu cấy
lá của Petunia hyrbida tăng trưởng trên môi trường không có cytokinin và được xử lý
với ánh sáng đỏ thì tạo ra nhiều chồi có trọng lượng tươi lớn hơn là được nuôi cấy dưới
ánh sáng đỏ xa. Tuy nhiên, trên môi trường có BA thì khi xử lý với ánh sáng đỏ và ánh
sáng đỏ xa thì sẽ tạo ra số lượng chồi và trọng lượng tươi của chúng tương tự nhau và
nhiều hơn trên môi trường không có cytokinin.
 Nhiệt độ
Nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ
như Begonia (Heide, 1965) và Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972).
 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất định có phần phức tạp:
 Có những loài thực vật về mặt cơ bản không cần cả auxin lẫn cytokinin để tạo
chồi bất định như: rau diếp xoăn (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren và
Heide, 1972; Rossini và Nitsch, 1966).
 Hầu hết các loài thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi, trong khi
auxin lại có vai trò ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Nitsch,
1968).
 Có một số thực vật cần đến auxin ngoại sinh để tạo chồi, đó là trường hợp Lili
(van Aartrijk, 1984), lan dạ hương (Pierik và Steegmans, 1975).
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

 Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp rất quan trọng trong
việc tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau như Begonia (Ringe và Nitsch,
1968; Heide, 1965) và cây bông cải (Margara, 1969).
Chúng ta có thể kết luận rằng ở những loài cần cytokinin và auxin cho sự tái sinh
chồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin. Tỉ lệ của hai chất điều hòa
sinh trưởng này sẽ quyết định sự hình thành cơ quan (Skoog và Tsui, 1948; Miller và
Skoog, 1953). Cytokinin BA rất hiệu quả trong việc thúc đẩy tạo chồi ở nhiều loài thực
vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao sẽ xuất hiện nhiều biến dị (chồi biến dạng).
Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽ tăng
hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1957; Nitsh và cộng sự, 1969). Một số trường hợp,
việc sử dụng một mình adenine cũng có thể cảm ứng tạo chồi: Begonia (Ringle và
Nitsch, 1968), cây thuốc lá (Skoog và Tsui, 1948).
Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở loài Begonia rex
(Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid abscisic ức chế
sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn có trường hợp cảm ứng sự hình thành chồi như
ở cây Ipomoea batatas.
2.1.7.2. Sự hình thành rễ bất định
Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mô của chúng
còn giữ khả năng phân sinh.
Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót của
mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyền của
loài, tuổi của mẫu, vị trí của mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương, số lần
cấy chuyển, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng, than hoạt tính,
đường, agar, pH,…
2.1.8.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in

vitro
2.1.8.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên