Quy trình chẩn đoán viêm gan bằng kỹ thuật PCR elisa và real time PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VIÊM GAN C BẰNG KỸ
THUẬT PCR ELISA VÀ REAL-TIME PCR

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện
MSSV: 0811110030

:Đoàn Nguyễn Thái Hòa
Lớp: 08CSH1

TP. Hồ Chí Minh, 2011


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, không sao
chép từ luận án khác. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực. Nếu sai tôi
xin chịu hoàn toàn trách nhiệm và chịu mọi kỷ luật của khoa và nhà trường đề ra.
Hồ Chí Minh, ngày 4 tháng 7 năm 2011
Sinh viên

Đoàn Nguyễn Thái Hòa

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: GV hướng dẫn, đã nhiệt tình,
giúp đỡ tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất em hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
Em xin chân thành cám ơn ban giám hiệu trường Đại học Kỹ Thuật
Công Nghệ Tp.HCM, đặc biệt là quý thầy cô khoa Môi Trường & Công Nghệ
Sinh Học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, dìu dắt em trong suốt thời
gian ngồi ghế nhà trường.
Em xin nói lên lòng biết ơn sâu sắc đối với Ông Bà, Cha Mẹ đã nuôi dạy
em thành người.
Xin chân thành cám ơn anh chị và bạn bè đã ủng hộ, giúp đỡ và động
viên chúng em trong thời gian học tập và nghiên cứu.
Mặc dù em đã cố gắng hoàn thành luận văn trong phạm vi và khả năng
cho phép nhưng chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót. Em kính mong
nhận được sự cảm thông và tận tình chỉ bảo của quý thầy cô.


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ vi
LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C ........................... 3
1.1. Lịch sử phát hiện bệnh ................................................................................ 3
1.2. Đặc điểm của virus gây bệnh viêm gan siêu vi C ....................................... 3
1.2.1. Cấu tạo của virus HCV ................................................................... 3
1.2.2. Cấu trúc genome virus HCV ........................................................... 4
1.2.3. Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh ......................................... 7

1.3. Triệu chứng lâm sàng .................................................................................. 8
1.3.1. Giai đoạn cấp tính ........................................................................... 8
1.3.2. Giai đoạn mãn tính ......................................................................... 8
1.4. Chẩn đoán.................................................................................................... 9
1.5. Dịch tễ học .................................................................................................. 10
1.5.1. Tình trạng nhiễm bệnh viêm gan siêu vi C ..................................... 10
1.5.2. Con đường lây bệnh và các biện pháp đề phòng và điều trị bệnh
viêm gan siêu vi C ..................................................................................... 11
1.6. Định lượng RNA-HCV trong huyết thanh .................................................. 15
1.6.1. Phương pháp PCR ELISA .............................................................. 15
1.6.2. Phương pháp khuếch đại tín hiệu .................................................... 17
1.6.3. Phương pháp PCR ........................................................................... 19
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP .......................................................... 29
2.1. Vật liệu ....................................................................................................... 29
2.1.1. Vật liệu sinh học.............................................................................. 29
2.1.2. Hóa chất .......................................................................................... 29
2.1.3. Thiết bị - dụng cụ ............................................................................ 30


2.2. Phương pháp .............................................................................................. 33
2.2.1. Ly trích RNA................................................................................... 34
2.2.2. Thực hiện phản ứng phiên mã ngược.............................................. 36
2.2.3. Phương pháp PCR ELISA ............................................................. 37
2.2.4. Phương pháp Real-time PCR .......................................................... 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ................................................................ 41
3.1. Kết quả ........................................................................................................ 41
3.1.1. Biểu đồ khuếch đại của real-time PCR ........................................... 41
3.1.2. Biểu đồ đường chuẩn của real-time PCR ....................................... 43
3.2. Thảo luận..................................................................................................... 44
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 46

4.1. Kết luận ...................................................................................................... 46
4.2. Kiến nghị ..................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO

ii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
HCV

Hepatitis C Virus

DNA

Dexoxyribonuclic acid

RNA

Ribonuclic acid

cDNA

complementary DNA

PCR

Polymerase chain reaction

dNTPs

Deoxyribonucleotide triphosphates

bDNA

branched DNA

ELISA

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Ct

Threshold cycle (chu kỳ ngưỡng)

RT

Revserse Transcription

iii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc HCV ............................................................................................ 5
Hình 1.2. Cấu trúc genome virus .............................................................................. 5
Hình 1.3. Chu kỳ sống của HCV............................................................................... 7
Hình 1.4. Các giai đoạn phát triển bệnh .................................................................... 8
Hình 1.5. Tình hình nhiễm bệnh viêm gan siêu vi C trên thế giới 2002 (đơn vị
tính: triệu người) ....................................................................................................... 11
Hình 1.6. Bản đồ phân bố tỷ lệ nhiễm HCV ............................................................. 11
Hình 1.7. Các vi giếng của microtiter plate chứa kháng nguyên .............................. 16

Hình 1.8. Kỹ thuật bDNA nhánh .............................................................................. 18
Hình 1.9. Nguyên tắc hoạt động của PCR ................................................................ 20
Hình 1.10. Máy Stratagene Mx3000P ....................................................................... 24
Hình 1.11. Real-time, sử dụng Taqman probe để định lượng................................... 26
Hình 2.1. Máy ủ lắc ................................................................................................... 30
Hình 2.2. Máy khay rửa vi giếng .............................................................................. 30
Hình 2.3. Máy đọc vi thẻ ........................................................................................... 30
Hình 2.4. Máy luân nhiệt Real-time iCyCler ............................................................ 31
Hình 2.5. Máy ly tâm eppendorf 0.2ml ................................................................... 31
Hình 2.6. Máy ủ nhiệt khô ........................................................................................ 32
Hình 2.7. Máy vortex ................................................................................................ 32
Hình 2.8. Máy ly tâm thu huyết thanh ...................................................................... 33
Hình 2.9. Máy ly tâm ................................................................................................ 33
Hình 2.10. Quy trình phát hiện HCV ........................................................................ 33
Hình 2.11. Biểu đồ chu trình nhiệt của Real-time PCR ........................................... 40
Hình 3.1. Biểu đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh
quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sáng kích thích vào mỗi chu
kỳ nhiệt ...................................................................................................................... 41
Hình 3.2. Biểu đồ đường chuẩn của phản ứng Real Time PCR ............................... 43

iv


Hình 3.3. Biễu đồ khuếch đại vẽ lên các đường biểu diễn khuếch đại của các
mẫu thử và các mẫu chuẩn ........................................................................................ 44
Hình 3.4. Biểu đồ khuếch đại biểu diễn sự khuếch đại của các mẫu dương và
mẫu âm .....................................................................................................................................45

v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bàng 1.1. Các thuốc trên thị trường dùng điều trị viêm gan C và các thuốc có
triển vọng ....................................................................................................................... 14

vi


LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay, người ta ước tính có khoảng hơn phân nửa dân số trên thế giới
đã từng bị nhiễm một hoặc nhiều siêu vi gây viêm gan từ siêu vi A đến siêu vi G.
Nhiễm siêu vi A và E chỉ gây ra bệnh lý cấp tính và diễn tiến bệnh thường tự
giới hạn, ít để lại hậu quả nghiêm trọng. Ngược lại, viêm gan siêu vi B, C và D
có thể dẫn đến những nhiễm trùng dai dẳng mãn tính với nguy cơ tiến triển sang
xơ gan, ung thư gan và đưa đến tử vong. Hơn nữa, tỉ lệ mắc bệnh viêm gan siêu
vi B và C nhanh chóng gia tăng ở nhiều quốc gia đã làm cho bệnh này trở thành
một vấn đề đáng được quan tâm cho sức khoẻ cộng đồng.
Siêu vi viêm gan C là một trong những bệnh nguy hiểm rất đáng lo ngại
hiện nay, bởi số lượng người nhiễm bệnh, cũng như các kiểu biến chứng gây
nguy hiểm đến sức khỏe con người như xơ gan, ung thư thư gan… Ở Việt Nam,
bệnh này mới xuất hiện gần đây nên chúng ta chưa hiểu rõ được nguyên nhân
gây ra bệnh và cũng chưa biết cách phòng ngừa nhiều nên chúng ta sẽ dễ dàng
mắc phải. Viêm gan siêu vi C xâm nhập vào cơ thể nhờ virus HCV (Hepatitis C
Virus), được Houghton phát hiện vào năm 1989. Từ đó, nhờ vào những thử
nghiệm tìm anti-HCV, tỉ lệ người bị nhiễm viên gan sau truyền máu đã giảm đi
đáng kể. Trong suốt thập niên 90 của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã đạt được
nhiều thành tựu mới trong lãnh vực nghiên cứu cấu trúc phân tử của siêu vi và
đặc biệt là trong điều trị. Hiện này những phương thức trị liệu siêu vi C mặc dù
chưa phải là hoàn hảo nhưng càng ngày càng có những thuốc mới hơn và hiệu
quả cao hơn được đưa vào thử nghiệm lâm sàng. Khả năng thường xuyên biến

đổi cấu trúc di truyền của siêu vi C đã trở thành một thách thức lớn cho việc chế
tạo thuốc chủng ngừa trong tương lai. Cho nên, nếu ta phát hiện bệnh viêm gan
siêu vi C này càng sớm càng tốt thì ta sẽ biết được nhiễm genotype C nào, để tìm
ra loại thuốc điều trị tốt.
Để phát hiện ra dòng virus này thì nhiều nhà khoa hoc đã nghiên cứu ra
nhiều phương pháp phát hiện virus HCV dựa vào các ứng dụng của sinh học

1


phân tử như : phương pháp ELISA kết hợp với phương pháp PCR, phương pháp
lai phân tử (Hybrid Capture, bDNA )...và gần đây nhất là phương phát RealTime PCR là phương pháp được sử dụng nhiều nhất hiện nay vì phương pháp
này, thao tác dễ thực hiện, ít gây sai sót, cho kết quả trong thời gian ngắn, và
định tính một cách chính xác, độ nhạy cao hơn kỹ thuật bDNA và phương pháp
xác định bệnh nhân có bị nhiễm viêm gan lại hay không, vì các phương pháp
khác chỉ xác định được bệnh nhân có bị nhiễm cấp tính hay mãn tính do không
phân biệt chắc chắn được tình trạng đang nhiễm hay đã lành (hết mầm bệnh
trong cơ thể, không còn nguy cơ lây lan), ví dụ : phương pháp PCR ELISA, sau
khi điều trị bệnh đã hết, có nghĩa là kháng nguyên lạ đã không còn, nhưng kháng
thể vẫn còn tồn tại trong cơ thể một thời gian dài, có khi đến nhiều năm…
Do đó, việc chẩn đoán viêm gan C là một trong những nhu cầu cần thiết
đối với con người. Cho nên, em chọn đề tài này để tìm hiểu quy trình chẩn đoán
bệnh viên gan siêu vi C bằng phương pháp Real-Time PCR và phương pháp
PCR ELISA là hai phương pháp thông dụng nhất hiện nay.

2


CHƯƠNG1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C
1.1 Lịch sử phát hiện bệnh [7]

Bệnh viêm gan siêu vi C do Hepatitis C Virus (HCV) gây ra. Đây là một
bệnh nguy hiểm, thường dẫn đến các biến chứng như xơ gan và ung thư gan
nguyên phát với tỉ lệ cao. Hiện nay, số người nhiễm HCV trên thế giới ước tính
khoảng 170 triệu người (số liệu năm 2000).

) Quá trình phát hiện bệnh viêm gan siêu vi C:
Năm 1975, Prince và cộng sự nhận định rằng có một chứng bệnh viêm
gan siêu vi sau truyền máu không do HBV và có thời kỳ ủ bệnh dài hơn thời ủ
bệnh do HAV. Sau đó, các tác giả khác chứng minh về mặt huyết thanh học rằng
bệnh viêm gan siêu vi loại này không có liên quan gì đến bệnh viêm gan siêu vi
A và từ lúc này danh từ “bệnh viêm gan siêu vi không A không B” ra đời.
Vào tháng 5 năm 1989, có một phát hiện mới về viêm gan siêu vi không A
không B được công bố. Bằng phương pháp ly tâm siêu tốc huyết tương thu từ
những con tinh tinh bị bệnh viêm gan siêu vi, Choo và cộng sự đã tách chiết
nucleic acid của virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào genome (bộ
gene) của λgt11 và xâm nhiễm E. coli. Trong số hàng triệu dòng thu được có một
dòng có phản ứng đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh người bị bệnh
viêm gan siêu vi không A không B sau truyền máu. Cuối cùng, họ xác định rằng
bệnh viêm gan siêu vi không A không B do một loại siêu vi mới gây ra, đó là
siêu vi C (HCV).
1.2. Đặc điểm của virus gây bệnh viêm gan siêu vi C: [1, tr. 8-12], [20]
1.2.1 Đặc điểm sinh học của virus HCV
HCV là virus thuộc họ Flaviviridae. Đây là một loại virus RNA, có vỏ
lipid, đường kính khoảng 55-65 nm. Trọng lượng phân tử khoảng 4.106 daltons.
Bộ gen (genome) của siêu vi là một chuỗi đơn RNA có cực tính (+), nằm bên

3


trong phần nucleocapsid hình đa diện. Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các

protein E1 và E2 tạo thành các phức hợp dimer ( Hính1.1).
Điểm đặc biệt ở virus này là chưa có một nghiên cứu nào có thể xác định
cấu trúc chính xác của virus. Cho đến nay, các nhà khoa học chỉ thiết lập nên
một mô hình mang tính chất mô phỏng cấu trúc của virus này. Nguyên nhân của
việc này là do HCV không thể gây nhiễm nhân tạo trên các dòng tế bào hiện có
trên các phòng thí nghiệm trên thế giới (không phân lập được virus mà chỉ tách
được gen di truyền ( acid nhân ) trong huyết tương người bị nhiễm HCV RNA).
Đây chính là một trong những trở ngại lớn trong việc tìm hiểu cặn kẽ về virus
này.
Mật độ các hạt tử của virus HCV trong huyết thanh rất thay đổi, từ 1,03
đến 1,72g/ml. Sở dĩ có sự thay đổi này là do các virion lưu hành trong máu dưới
nhiều dạng khác nhau : hoặc là ở dạng tự do có tính lây nhiễm rất cao nhưng chỉ
hiện diên ở mật độ tương đối thấp ( khoảng 1,03 ) hoặc là ở dạng kết hợp với các
đại phân tử đặc biệt là các lipoprotein hoặc hiện diện trong các phức hợp miễn
dịch nhưng mật độ lại cao (khoảng 1,10). Thực nghiệm trên khỉ chimpanzee cho
thấy tính lây nhiễm của HCV tự do cao hơn rõ rệt so với dạng kết hợp với các
đại phân tử. Một điểm quan trọng nữa là virus này có khả năng biến thể nhanh và
tạo thành rất nhiều type và sub-type kháng thuốc.
Chính vì khả năng biến thể quá nhanh này mà cho đến nay vẫn chưa có
một loại vaccine nào có hiệu quả đối với HCV.

4


Hình 1.1: Cấu trúc HCV

1.2.2 Cấu trúc genome virus HCV
Genome của virus HVC là một cuỗi RNA có cực tính dương, được chia
làm 3 phần. Bộ gene của virus có kích thước khoảng 9400 nucleotide (Hình 1.2).

Hinh 1.2. Cấu trúc genome virus

n Đầu 5’ không mã hoá (5’UTR-untranslated region hay 5’NCR = noncoding region ) gồm 341 - 344 nucleotid. Đây là vùng tương đối ít bị biến đổi
nhất giữa các phân týp (subtype) khác nhau. Do đó, người ta sử dụng vùng này
như là một chất mồi (primer) để phát hiện RNA của virus HCV bằng phương
pháp PCR. Chức năng của vùng này là tham gia vào việc điều hoà quá trình nhân

5


đôi của siêu vi. Tại đây, có một số cấu trúc uốn lượn (stem-loop structure ) gồm
27 nucleotid, giữ vai trò ức chế quá trình giải mã (translation ) theo cơ chế điều
hoà âm tính (negative regulation ). Vùng này còn là vị trí gắn kết với ribosome,
được gọi là IRES (internal ribosome entry site ), để khởi phát quá trình giải mã
cho việc tổng hợp chuỗi polyprotein tiền chất của siêu vi.
o Vùng được mã hoá giữa 2 đầu 5’ và 3’. Vùng này chỉ có một khung
đọc mở duy nhất (open reading frame) gồm 9.379 - 9481 nucleotid, được giải mã
để tổng hợp một polyprotein tiền chất (precursor) của siêu vi gồm khoảng 3000
acid amin. Sau đó, polyprotein này sẽ được các enzyme protease của siêu vi và
các enzyme peptidase tín hiệu của tế bào (host signal peptidases), phân cắt thành
các protein cấu trúc và protein không cấu trúc.
- Protein cấu trúc : được tạo ra từ các gen C, E1 và E2
*Protein capsid = protein C : mã hoá protein lõi, tạo nên phần nucleotid-capsid
bao bọc bên ngoài chuỗi genom RNA của siêu vi .
* Protein E1 và E2 (envelope): mã hoá protein vỏ, là hai glycoprotein của lớp vỏ,
liên kết với nhau thành phức hợp dimer.
- Protein không cấu trúc
* Protein NS2 là một enzyme Matallopproteinase, phân cắt polyprotein tiền chất
tại chỗ nối NS2/NS3.
* Protein NS3 (proteas/helicase ) các enzyme thuỷ giải và cắt đứt liên kết hydro.

* Protein NS4 : (Gồm NS4 A VÀ NS 4B ) : NS4 A cần thiết cho hoạt tính của
men protease NS3, NS4 B một protein liên kết với màng tế bào.
* Protein NS5 (polymerase ) gồm NS5A và NS5B và NS5B là dùng để tổng hợp
chuổi RNA từ khuôn mẫu là RNA.
p Đầu 3’ không mã hoá (3’UTR hay 3’ NCR ) bao gồm 3 vùng : vùng
đầu tiên có chiều dài thay đổi từ 28Æ 42 nucleotid, tiếp theo là vùng poly (U)
hoặc poly (A) để báo hiệu kết thúc quá trình giải mã. Tận cùng là một đoạn X
gồm 98 nucleotid.

6


1.2.3 Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh
Đầu tiên, HCV gắn vào một receptor (thụ thể) chưa được xác định trên bề
mặt tế bào gan nhờ hai glycoprotein bề mặt của nó là E1 và E2. HCV xâm nhập
vào bên trong tế bào gan sau một quá trình hòa màng (membrane fusion). RNA
mạch (+) của HCV được dịch mã thành protein nhờ hệ thống dịch mã của tế bào
chủ. Protein tiền thể tạo ra sẽ được phân cắt bởi enzyme tín hiệu (signalase) để
tạo ra các protein cấu trúc (C, E1, E2) và các protein không cấu trúc (NS1-NS5).
Sau khi HCV đã tạo ra reverse transcriptase của nó thì enzyme này bắt đầu phiên
mã ngược để tạo ra mạch RNA mạch (-) bổ sung với mạch (+) đã có. Chính
mạch RNA (-) này là khuôn để tạo ra RNA genome của HCV((+) ssRNA). (Hình
1.3 )

Hình 1.3 Chu kỳ sống của HCV

7


Sau đó, capsomer được tạo ra từ các protein thành phần như C, E1, E2 sẽ

kết hợp với RNA genome của HCV ((+)ssRNA) để tạo thành dạng nucleocapsid.
Nucleocapsid này tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát ra ngoài, trở thành
dạng virus hoàn chỉnh và đi xâm nhiễm một tế bào khác.
1.3.Triệu chứng lâm sàng: [7], [21]
1.3.1- Giai đoạn cấp tính:
Bệnh nhân nhiễm HCV ở giai đoạn cấp tính thường không có biểu hiện
bệnh lý hoặc chỉ có những biểu hiện bệnh nhẹ (rất khó quan sát bằng mắt
thường). Khoảng 60-70% các bệnh nhân nhiễm không thể hiện triệu chứng, 2030% có thể có biểu hiện vàng da, 10% các bệnh nhân thể hiện một số triệu chứng
không đặc hiệu như: mệt mỏi, đau bụng…
Triệu chứng biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân ở giai đoạn cấp tính HCV
tương tự như các bệnh nhân nhiễm các virus gan gây bệnh ở gan khác. Do vậy,
việc xét nghiệm các bệnh nhân này bằng các thử nghiệm miễn dịch là điều cần
thiết để xác định bệnh nhân nhiễm loại virus Hepatitis nào. Tuy nhiên, các thử
nghiệm miễn dịch này chỉ có kết quả tốt (80%) sau 15 tuần kể từ khi có những
biểu hiện bệnh lý. Tỉ lệ trên tăng dần theo thời gian và tối đa là sau 9 tháng hầu
như 100% các bệnh nhân nhiễm HCV đều có thể phát hiện virus bằng kỹ thuật
miễn dịch.
Do nhược điểm về thời gian mà các kỹ thuật miễn dịch tỏ ra không có
hiệu quả trong việc phát hiện sớm virus. Tuy nhiên, do các kỹ thuật phát hiện
HCV bằng sinh học phân tử còn quá mắc tiền do vậy kỹ thuật miễn dịch vẫn
được sử dụng phổ biến hiện nay tại các quốc gia đang phát triển.
1.3.2-Giai đoạn mãn tính:
Sau giai đoạn nhiễm cấp tính khoảng 15-25% bệnh nhân sẽ tự loại bỏ tất
cả các virus HCV và cơ thể trở lại bình thường như khi chưa nhiễm virus. Tuy
nhiên, khoảng hơn 75% các bệnh nhân nhiễm HCV sẽ chuyển sang giai đoan
mãn tính.

8

Hình 1.4. Các giai đoạn phát triển bệnh

Trong giai đoạn nhiễm mãn tính bệnh nhân thường không có bất kỳ một
biểu hiện bệnh lý nào. Giai đoạn này có thể kéo dài từ 20-30 năm hoặc có thể
kéo dài hơn trước khi bệnh nhân chuyển thành ung thư gan. Vì thế người bệnh
thường không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Nhiều trường hợp bệnh chỉ
được phát hiện khi đã có biến chứng nghiêm trọng như : xơ gan với biểu hiện
báng bụng (ổ bụng có nước), giãn mạch máu đường tiêu hóa, có thể vỡ gây chảy
máu ồ ạt và tử vong. Một biến chứng nữa là ung thư tế bào gan. Khi đã xơ, gan
khó hồi phục lại, cho dù tình trạng viêm có thuyên giảm. Vì vậy, các thầy thuốc
khuyên nên điều trị sớm nhằm ngăn ngừa hoặc làm chậm tiến triển sang giai
đoạn xơ gan.
1.4. Chẩn đoán
Chẩn đoán viêm gan do siêu vi C, ngoài các xét nghiệm đánh giá chức
năng gan, siêu âm gan ( nhằm nghiên cứu cấu trúc của gan và các bộ phận xung
quanh, tìm dấu hiệu xơ gan hoặc biểu hiện bất thường), sinh thiết gan ( Xét
nghiệm này cho phép các chuyên gia quan sát tế bào gan dưới kính hiển vi, xác
định mức độ viêm nhiễm, chẩn đoán giai đoạn bệnh, đánh giá hiệu quả điều
trị.)....thì các xét nghiệm tìm HCV giữ một vai trò rất quan trọng .
Anti-HCV: có thể tìm thấy ở 70% trường hợp khi bắt đầu có triệu chứng
và khoảng 90% trong vòng 3 tháng sau. Tuy nhiên, nhiều người bị viêm gan C

9


nhưng không có triệu chứng. Anti-HCV không xác định được là đang nhiễm cấp
tính, đã lành bệnh (đào thải hết virus) hay chuyển sang giai đoạn mãn tính.
HCV RNA : phát hiện trực tiếp siêu vi trong máu, một bằng chứng của
nhiễm HCV và virus đang tăng sinh, đồng thời định danh dưới nhóm để lựa chọn
phác đồ hợp lý. Có thể phát hiện HCV-RNA trong vòng 1 đến 2 tuần sau khi

nhiễm virus. Xét nghiệm này còn được sử dụng để tiên lượng đáp ứng tốt với
điều trị.
1.5. Dịch tễ học:
Từ khi Choo Q.L phát hiện siêu vi gan viêm gan C năm 1989 đến nay,
nhiều nghiên cứu dịch tễ học nhiễm siêu vi C đã được tiến hành để đánh giá tình
trạng nhiễm siêu vi C trong cộng đồng, các đường lây nhiễm và diễn tiến các
trường hợp bị lây nhiễm.
1.5.1 . Tình trạng nhiễm bệnh viêm gan siêu vi C: [1], [22]
Tình hình trên thế giới:
Số người bị nhiễm viêm gan siêu vi C trên thế giới là khoảng 170 triệu
người, trong đó khu vực Đông Nam Á chiếm tỷ lệ cao với khoảng 32,3 triệu
(xem hình 1.5). Con số này cũng đã gia tăng trong những năm gần đây. Virus
viêm gan siêu vi C được xem như là kẻ giết người thầm lặng vì bệnh nhân khi
mắc phải virus này có thể không có các triệu chứng gì trong khoảng hơn 10 năm
trước khi phát triển thành viêm gan mãn tính và ung thư gan. Khoảng 40-50%
các trường hợp ghép gan ở Hoa kỳ là do nhiễm virus viêm gan C. Có 6 chủng
virus viêm gan C được xác định (HCV1-6) và tùy thuộc vào chủng virus nhiễm
mà các đáp ứng trị liệu cũng khác nhau.

10


Hình 1.5. Tình hình nhiễm bệnh viêm gan siêu vi C trên thế giới năm 2002 (đơn vị
tính: triệu người)

Hình 1.6. Bản đồ phân bố tỷ lệ nhiễm HCV

Tình hình trong nước:
Hiện nay, ở Việt Nam tỷ lệ nhiễm HCV chiếm từ 1-5% dân số.
1.5.2. Con đường lây bệnh và các biện pháp đề phòng và điều trị bệnh

viên gan siêu vi C [1], [21]
1.5.2.1 Con đường lây bệnh
HCV lây lan bằng sự tiếp xúc trực tiếp qua máu. Đường truyền bệnh bao
gồm việc dùng chung các vật dụng ma túy như kim chích, kim dùng để xâm
mình, xỏ da và châm cứu cũng có thể truyền HCV. Dùng chung các vật dụng cá

11


nhân như dao cạo, bàn cải đánh răng, đồ cắt móng tay, tuy ít nguy cơ nhưng vẫn
có thể làm lây nhiễm bệnh.
Một số ít có thể bị lây nhiễm HCV do sự quan hệ tình dục không an toàn.
Các nhân viên y tế cũng có nguy cơ nhiễm bệnh vì những tai nạn việc làm
như bị kim đâm hoặc trong những trường hợp không thể tránh được có thể tiếp
xúc trực tiếp với máu của người mang bệnh.
Những người mẹ bị HCV có thể truyền bệnh cho con vào lúc trước hoặc
sau khi sinh. Sự lây truyền này tùy thuộc vào mức độ HCV có trong máu của
người mẹ.
1.5.2.2. Các biện pháp phòng ngừa :
Cho đến nay vẫn chưa có thuốc chủng ngừa siêu vi viêm gan C. Ngay cả
những hy vọng về một loại thuốc chủng ngừa cho căn bệnh này trong tương lai
cũng chưa thấy hé mở. Vì 3 lý do sau:
+ Thứ nhất: siêu vi C có khả năng biến hóa,nhưng đã nói ở phần
1.2.1 cấu tạo HCV, chúng có khả năng thay đổi các đặc tính di truyền bằng cách
thay thế những cấu trúc trên nhiễm sắc thể của mình. Điều này chẳng những gây
khó khăn cho hệ thống miễn nhiễm trong việc phát hiện và đối phó với chúng,
mà còn là nguyên nhân khiến cho việc tìm ra thuốc chủng ngừa bệnh này trở nên
cực kỳ khó khăn.
+ Thứ hai : do siêu vi C không “hoạt động” với bất cứ loài động vật
nào khác ngoài con người và một loài tinh tinh (chimpanzee). Vì thế, việc nghiên

cứu thử nghiệm rất khó khăn.
+ Cuối cùng: Khả năng sao chép của siêu vi C trong điều kiện
phòng thí nghiệm rất yếu ớt.
Vì thế, việc phòng ngừa bệnh viêm gan siêu vi C hiện nay chủ yếu là tập
trung vào các biện pháp ngăn chặn từ đầu.
Như đã biết, siêu vi viêm gan C lây lan chủ yếu qua sự tiếp xúc trực tiếp
với máu của người có bệnh, nên các biện pháp tiệt trùng và chăm sóc thích hợp

12


đối với các vết thương ngoài da như băng bó mọi vết cắt, vết thương sẽ giảm
thiểu đáng kể nguy cơ nhiễm bệnh.
Tuyệt đối không dùng chung kim chích, các dụng cụ chích ma túy, vật
dụng cá nhân hoặc bất cứ thứ gì có thể dính máu. Phải sát trùng đúng cách
những dụng cụ dùng để xâm mình, xỏ da và châm cứu.
1.5.1.3 Điều trị:
Loại dược phẩm thường dùng để chống lại viêm gan C là interferon, một
thuốc ức chế sự nhân lên của virus. Các thuốc interferon dùng để điều trị viêm
gan gồm: interferon alfa-2b (Intron A), interferon alfa-2a (Roferon-A) và
interferon alfacon-1 (Infegen). Nhưng interferon chỉ có tác dụng ở khoảng 20%
số trường hợp.
Hiện nay, tiêm interferon thường được phối hợp với uống ribavirin-một
thuốc kháng sinh virus phổ rộng. Điều trị thường mất sáu tháng đến một năm và
thành công ở khoảng 40% số người bị HCV.
Gần đây, một thuốc khác, interferon pegyl hóa (PEG) có hiệu quả gấp hai
lần interferon thông thường. Vào tháng 1-2001 Cơ quan quản lý thuốc và dược
phẩm Mỹ (FDA) đã cho phép dùng PEG interferon-peginterferon alfa-2b (PEGIntron) để điều trị viêm gan.
Tùy theo loại genotype mà điều trị, tức là kiểu loại di truyền của siêu vi.
Xét nghiệm này giúp cho bác sĩ điều trị xác định được là mình đang “đối mặt với

ai” để có thể quyết định các phương thức điều trị. Thời gian điều trị bệnh viêm
gan C sẽ tùy thuộc vào kết quả của cuộc thử máu này. Nếu genotype được xác
định là loại số 1, bệnh nhân cần điều trị khoảng một năm. Nếu là loại số 2 hoặc
3, thời gian sẽ là khoảng 6 tháng. Những loại khác có thể phải điều trị từ 6 đến
12 tháng, tùy theo từng trường hợp.

13


Bàng 1.1: Các thuốc trên thị trường dùng điều trị viêm gan C và các
thuốc có triển vọng [22]
Tên Thuốc

Công ty

Cơ chế tác động

Có trên thị trường
PEG-Interferon-alpha

Roche

Interferron tác động kéo dài

Schering-Plough

Interferon tác động kéo dài

®

(Pegasys )
PEG-Interferron-alpha 2b
®

(Peg-Intron )
Ribavirin

Copegas®(Roche),Rebetol®

Nucleosid ức chế polymerase
®

( Schering Plough), Ribaphere ,
Interferon alpha-2a

Vilona®,Virazole®

(Roferon-A )

Roche

Hiệp lực với interferon

Interferon alpha-2b
(Intron® A )

Schering-Plough

Interferon

Các hãng thuốc và dạng thuốc generic Interferron điều trị viêm gan siêu vi B
khác

và một số dạng C

Đang nghiên cứu
Pha III
Viramidine(Taribavirin)

Valeant Pharma

Interferon –Beta

Serono

Tiến dược của ribavirin

Zadaxin

SciClone

Interveron-Beta 1a,tác nhân miễn

Nucleosid ức chế polymerase

dịch
Pha II
VX-950

Certex

Ức chế NS3 serine protease

Valoppicitabine (NM283)

Indenix/Novartis

Nucleosid ức chế polymerase

SCH503034

Schering-Plough

Ức chế NS3 serine protease

Albuferon

Human Genome Sciences/Novartis

Interferon-alpha gắn kết với albumin)
Xanh methylen

Suvus (Methylene blue)

Bioenvision

Tác nhân miễn dịch

Omega interferon

Intarcia Therapeutics

Interferon tác động kéo dài,đã sử

Multiferon

Viragen/Valentis

dụng ở một số quốc gia,ngoại trừ Hoà
Kỳ và chau âu

Actilon (CPG 10101)

Chủ vận TLR9 ( Tác nhận miễn dịch)

Coley

14


1.6. Định lượng RNA-HCV trong huyết thanh
1.6.1.Phương pháp PCR ELISA [8], [15], 17]
1.6.1.1 Định nghĩa:
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - Xét nghiệm hấp thu
miễn dịch liên kết với enzyme) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện sự hiện
diện của kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu xét nghiệm.
Phương pháp này dựa vào nguyên lý tính bắt cặp đặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể. Do trong thành phần phản ứng có enzyme, khi thêm cơ
chất tương ứng, enzyme sẽ biến đổi cơ chất và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Khi virus viêm gan C vào trong cơ thể thì hệ thống miễn dịch của cơ thể

sẽ tạo ra những chất để chống lại việc xâm nhập này, những chất này gọi là
kháng thể. Nếu cơ thể có kháng thể (Anti-HCV) có nghĩa là đã có sự hiện diện
của virus viêm gan C.
Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên kháng thể sẽ quyết định cường
độ màu ánh sáng phát ra.
1.6.1.2 Phương pháp xét nghiệm virus HCV bằng ELISA
Có 2 cách :
+ Phương pháp gián tiếp là phương pháp miễn dịch, nghĩa là qua
phản ứng kháng nguyên kháng thể ta sẽ xác định được kiểu của kháng thể, từ đó
biết được type huyết thanh của siêu vi C (HCV serotype)
+ Phương pháp trực tiếp dựa trên sự phân tích trực tiếp trên gen của
siêu vi C để xác định kiểu gen của siêu vi C (HCV genotype).
Ưu điểm của kỹ thuật này là đơn giản, không sợ nguy cơ ngoại nhiễm và
có thể thực hiện hoàn toàn trên máy tự động. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn
còn ít nhiều nhược điểm như không định được chi kiểu (subtype), không biết
được tình trạng bệnh nhân có hay không có HCV-RNA (tình trạng siêu vi đang
tăng sinh để điều trị đặc hiệu), ở bệnh nhân bị ức chế hay suy giảm miễn dịch sẽ
không có anti HCV từ đó không xác định được loại HCV, không phân biệt được

15


giữa anti HCV nhiễm trước đây còn tồn tại và loại HCV đang nhiễm. Và một
điều cực kỳ quan trọng là sự phù hợp giữa type huyết thanh và kiểu gen vẫn còn
nhiều khác nhau. Dễ bị dương tính giả, chi phí cao.
Hiện nay, người ta kết hợp phương PCR với phương pháp ELISA để phát
hiện virus HCV, người ta hay gọi là phương pháp PCR-ELISA. Để nhân bản
cDNA được tách chiết từ RNA HCV trong huyết thanh người bệnh, sau đó ta
cho vào trong vi giếng tiến hành xét nghiệm.

Hình 1.7. Các vi giếng của microtiter plate chứa kháng nguyên

*Phương pháp PCR-ELISA:
Dưới sự xúc tác của enzyme kết hợp với kháng thể kháng digoxigenin.
Đầu tiên, người ta tách chiết HCV RNA từ huyết thanh và chuyển thành cDNA
nhờ enzyme phiên mã ngược, cDNA này được dùng làm bản mẫu (template) cho
phản ứng PCR. Trong thành phần của phản ứng PCR, một trong hai primer sẽ
được đánh dấu ở đầu 5’ với biotin, như vậy, sản phẩm PCR tạo ra sẽ có một
mạch được đánh dấu biotin ở đầu 5’. Sau bước nhân bản, sản phẩm PCR được
biến tính thành dạng mạch đơn và được cho vào các vi giếng. Mặt trong mỗi vi
giếng được phủ streptavidin là một protein có ái lực đặc biệt cao đối với biotin sẽ
giữ các mạch mang bitotin ở đầu 5’. Tiếp theo, người ta cho probe đặc hiệu cho
HCV vào vi giếng và tiến hành phản ứng lai. Probe này được đánh dấu ở đầu 3’
với digoxigenin sẽ bắt cặp bổ sung với mạch mang biotin ở đầu 5’. Phức hợp
kháng thể kháng digoxigenin-alkaline phosphatase được cho vào và ủ trong một
thời gian thích hợp, phần dư thừa sẽ được loại bỏ. Phản ứng màu sẽ xuất hiện khi

16