tìm hiểu quy trình định lượng lượng hcv bằng kỹ thuật real-time pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ
TP. HCM








KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP





TÌM HIỂU QUY TRÌNH ĐỊNH HCV BẰNG KỸ THUẬT
REAL-TIME PCR




Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : BÙI QUANG THIỆU
MSSV: 0811110081 Lớp: 08CSH2




TP. Hồ Chí Minh, 2011


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT……………………………………….… i
DANH MỤC HÌNH ẢNH………………………………….…………………ii
DANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………………iii
CHƯƠNG MỞ ĐẦU………………………………………………….………iv
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C
1.1. Giới thiệu về bệnh viêm gan……………………………………… 2
1.1.1. Giới thiệu chung ……………………………….……………. 2
1.1.2. Lịch sử phát hiện viêm gan C………………………………… 2
1.2. Dịch tể học…………………………………………………………… 3
1.2.1.Tình hình nhiễm siêu vi C tại thế giới………………………… 3
1.2.2. Tình hình nhiễm siêu vi C trên Việt Nam …………………… 5
1.3. Con đường lây nhiễm……………………………………………… 5
1.4. Triệu chứng lâm sàng………………… …… …… …………… 6
1.5. Biện pháp phòng ngừa và điều trị 7
1.5.1. Biện pháp phòng ngừa………… …………………………… 8
1.5.2. Điều trị…………………………… …… 8
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ VIÊM GAN SIÊU VI C
2.1. Giới thiệu…………………………………………… …… …… 11
2.2. Cấu trúc - đặc điểm…………………………………………… …12

2.2.1. Protein cấu trúc……………………………………… …… 12
2.2.2. Protein không cấu trúc ………………….…………… …… 13
2.3. Cơ chế gây bệnh…………………………………………………… 13
2.3.1. Sự sao chép và xâm nhập tế bào chủ……………… ……… 14
2.3.2. Nhiễm HCV cấp……………………………………… …… 14
CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN C
3.1. Chẩn đoán lâm sàng……………………………………………… 17
3.1.1. Xét nghiệm chẩn đoán tình trạng viêm gan………… ……….17
3.1.2. Xét nghiệm đánh giá chức năng gan………………… ………17
3.1.3. Siêu âm bụng tổng quát………………………………… … 17
3.1.4. Sinh thiết tế bào gan……………………………………… 17
3.1.5. Xét nghiệm miễm dịch học…………………… …………….17
3.2. Chẩn đoán cận lâm sàng……………………………………………18
3.2.1. Phương pháp bDNA…………………… ………………… 18
3.2.2. Phương pháp ELISA…………………………… ………… 18
3.2.3. PCR định lượng cạnh tranh……………… ………………….19
3.2.4. Kỹ thuật Hybrid……………………… …………………… 20
3.2.5. Kỹ thuật Real-Time PCR………………… … 20
CHƯƠNG 4: QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT ĐỊNH LƯỢNG HCV
4.1. Kỹ thuật Real-Time PCR………………………………………….23
4.1.1. Nguyên tắc……………………………………………… ….23
4.1.2. Các thành phần của phản ứng Real-Time PCR………… 24
4.1.3. Các kiểu phản ứng Real-Time PCR…………………… …25
4.1.4. Khái niệm chu kỳ ngưỡng………………………… ….……28
4.1.5. Thiết kế đường cong chuẩn………… ………………… ….29
4.1.6. Tính lặp lại của phản ứng Real-Time PCR………… … ….30
4.2. Quy trình thực hiện…………………………………… …… ….33
4.3. Thuyết minh quy trình……………………………………… … 34
4.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu…………… …………… … 34
4.3.2. Thu nhận RNA………… ………………………… …… 35

4.3.3. Quy trình thực hiện…………………… …………… ….35
4.3.4. Thực hiện phản ứng RT……………… ……………………35
4.3.5. Thực hiện phản ứng Real-Time PCR……… ………… ….36
4.4. Đọc và giải thích kết quả ……………………………… ………44
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN……………………………………………….45
TÀI LIỆU THAM KHẢO




DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ALT : Aspartate Amino Transferase
AST : Alanin Amino Transferase
bDNA : branched DNA
bp : base pair
cDNA :complementary DNA
Ct : threshold Cycle
DNA : Desoxyribonucle acid
dNTPs : deoxynucleotide Triphosphates
ELISA : Enzyme Linked Immuno Assay
FRET : Fluorescent Resonance
HAV : Hepatitis A Virus
HBV : Hepatitis B Virus
HCV : Hepatitis C Virus
mRNA : messenger Ribonucleic Acid
RNA : Ribonucle acid
PCR : Polymerase Chain Reaction
RT-PCR : Reverse Transcription-Polymerase Chai Reaction
Tm : melting Temperature

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1: Biểu đồ phân bố tình hình nhiễm HCV trên thế giới………… 3
Hình 2.1: Cấu trúc HCV…………………………………………………11
Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc gen HCV………………………………………12
Hình 4.1: Các bước của một chu trình Real-Time PCR…………………23
Hình 4.2 : Máy ly tâm thu huyết thanh………………………………… 30
Hình 4.3 : Máy Stratagene Mx3000P………………………………… 30
Hình 4.4 : Máy ly tâm……………………………………………………31
Hình 4.5 : Máy vortex……………………………………………………31
Hình 4.6 : Máy ủ nhiệt khô………………………………………………32
Hình 4.7 : Máy ly tâm eppendorf 0.2ml…………………………………32
Hình 4.8: Quá trình luân nhiệt………………………………………… 37
Hình 4.9: Kết quả chạy Real-Time PCR cho mẫu bệnh phẩm
nhiễm HCV…………………………………………………………… 40

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điều trị viêm gan C………………7
Bảng 4.1. Kết quả quá trình thử nghiệm quy trình Real-Time PCR…………… 38

CHƯƠNG MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh gan do siêu vi C (hepatilis C virus – HCV) gây ra là một trong những
bệnh lý nguy hiểm về gan. Bệnh không có các triệu chứng lâm sàng rõ ràng, diễn
tiến âm thầm, 85% người bệnh chuyển sang xơ gan và ung thư gan. Hơn nữa, bệnh
chưa có vacxin phòng ngừa, chi phí cho quá trình điều trị là khá cao.
Những yếu tố góp phần tăng tỷ lệ điều trị thành công là phát hiện sớm bện, xác
định được nồng độ và loại type virus nhiễm trong máu.
Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, hiện nay, đã có thể phát hiện một số type
phổ biến của virus tại Việt Nam. Đối với yêu cầu xác định nồng độ virus trong máu,
kỹ thuật realtime PCR có thể đáp ứng được các yêu cầu đặt ra. Vì vậy, tôi tiến hành
tìm hiểu đề tài “Tìm hiểu quy trình định lượng HCV bằng kỹ thuật Realtime PCR”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tìm hiểu về quy trình định lượng virus viêm gan C bằng phương pháp sinh
học phân tử, giúp phát hiện bệnh nhanh chóng và chính xác để điều trị kịp
thời.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu

Tìm hiểu về quy trình định lượng virus viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học
phân tử.
Đánh giá được độ nhạy và chính xác của quy trình.
4. Phương pháp nghiên cứu
Thu thập tài liệu.
Tìm hiểu các quy trình phát hiện virus viêm gan siêu vi C.
Xác định quy trình về mặt lý thuyết.
Dự đoán đánh giá quy trình đề xuất.
5. Các kết quả đạt được của đề tài
Tìm hiểu thành công về quy trình định lượng virus viêm gan C bằng kỹ
thuật sinh học phân tử, điều quan trọng ở đây là việc tách chiết và tinh sạch
RNA của vi virus viêm gan C để tránh trường hợp dương tính giả có thể xảy
ra.
Đánh giá được độ nhạy và chính xác của quy trình.




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN










KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 2
1.1. Giới thiệu về bệnh viêm gan C [1,9]
1.1.1. Giới thiệu chung
Gan là cơ quan nội tạng lớn nhất và đảm nhận nhiều vai trò chức năng quan
trọng của cơ thể như hỗ trợ tiêu hóa, điều hòa chuyển hóa năng lượng, dự trữ máu,
khử độc,…
Viêm gan là tính trạng gan bị sưng hoại tử tế bào gan, giảm hoặc mất dần
chức năng hoạt động. Có nhiều nguyên nhân gây viêm gan như thuốc, rượu, chất
độc,… quan trọng và phổ biến nhất là do nhiễm siêu vi. Có nhiều loại siêu vi viêm
gan: A, B, C, D, E, G, TT virus, Sen virus,… trong đó, chỉ có virus gây viêm gan B,
C, D là có thể gây viêm gan mãn tính, xơ gan và dẫn đến ung thư gan. Bệnh viêm
gan siêu vi C lần đầu được phát hiện vào năm 1989, do Hepatitis C virus gây ra.
Bệnh thường ít gây triệu chứng rõ ràng và điển hình. Chủ yếu là các dấu hiệu mệt
mỏi, chán ăn rối loạn tiêu hóa, ít khi bị vàng da. Việc phát hiện bệnh hầu hết là do
tình cờ khi xét nghiệm máu hoặc kiểm tra sức khỏe.
Diễn tiến bệnh âm thầm, chưa có vacxin phòng ngừa, tỷ lệ chuyển thành xơ

gan và ung thư gan cao hơn so với bệnh viêm gan so siêu vi B. Mặt khác, chi phí
điều trị bệnh là khá cao và cần tuân theo phát đồ điều trị chặt chẽ . Do đó, việc xét
nghiệm máu định kỳ là rất cần thiết để phát hiện bệnh gan sớm.
1.1.2. Lịch sử phát hiện viêm gan siêu vi C
Năm 1975, Prince và cộng sự nhận định rằng có một chứng bệnh viêm gan
siêu vi sau truyền máu không do viêm gan siêu vi B và có thời kỳ ủ bệnh dài hơn
thời ủ bệnh do viêm gan siêu vi A. Sau đó, các tác giả: Bassler và cộng sự (1995),
Lee và cộng sự (1993), Livak và cộng sự (1995) chứng minh về mặt huyết thanh
học rằng bệnh viêm gan siêu vi loại này không có liên quan gì đến bệnh viêm gan
siêu vi A và từ lúc này danh từ “bệnh viêm gan siêu vi không A không B” ra đời.
Vào tháng 5 năm 1989 bằng phương pháp ly tâm siêu tốc huyết tương thu từ
những con tinh tinh bị bệnh viêm gan siêu vi, Choo và cộng sự (1989) đã tách chiết
nucleic acid của virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào bộ gen của
λgt11 và xâm nhiễm E. coli, thu được có một dòng có phản ứng đặc hiệu với kháng
thể có trong huyết thanh người bị bệnh viêm gan siêu vi không A không B sau
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 3
truyền máu. Cuối cùng, Choo và cộng sự (1989) xác định rằng bệnh viêm gan siêu
vi không A không B do một loại siêu vi mới gây ra, đó là siêu vi C (HCV).
1.2. Dịch tể học [3,11]
1.2.1 Tình hình nhiễm siêu vi C trên thế giới

Hình 1.1: Bản đồ phân bố tỷ lệ nhiễm HCV trên thế giới
(Nguồn: www: WHO, 2008)
Theo ước tính của tổ chức y tế thế giới WHO, trung bình 3% dân số thế giới
nhiễm viêm gan siêu vi C , 170 triệu người mang virus này dạng mạn tính.

Trong
đó, Đông Nam Á có khoảng 32,3 triệu người bị nhiễm, chiếm 2.15% dân số khu
vực này.
Tần suất toàn bộ của HCV ở cộng đồng chung được báo cáo theo từng lục địa
với tần suất trung bình 5.17% ở Châu Phi , 3.5% ở Châu Á, 1,93% ở Châu Mỹ,
1,75% ở Châu Âu, và 1.88% ở Châu Đại Dương. Tính trên toàn cầu là 2.856% có
nghĩa là khoảng 210 triệu người nhiễm HCV trên toàn thế giới.
Ở các nước phát triển, HCV là nguyên nhân của 20% các ca viêm gan cấp, 70%
viêm gan mạn, 40% xơ gan giai đoạn cuối, 60% ung thư gan, 30% ca ghép gan. Ở
các nước đang phát triển, HCV là nguyên nhân của 18% các ca viêm gan cấp, 69%
viêm gan mạn, 33% xơ gan giai đoạn cuối, 52% ung thư gan, 32% ca ghép gan. Ở
các nước kém phát triển, HCV là nguyên nhân của 36% các ca viêm gan cấp, 75%
viêm gan mạn, 50% xơ gan giai đoạn cuối, 66% ung thư gan, 38% ca ghép gan.
Trong các genotype của HCV, gen type 1 chiếm tỷ lệ cao nhất trên thế giới nói
chung và ở nước Mỹ nói riêng với 35% loại 1a và 35% loại 1b. Genotype 3 thường
thấy ở Pakistan, Úc, Scotland. Genotype 4 ở Trung Đông và Châu Phi cũng như
Không có
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 4
South Africa. Genotype 6 tại Hồng Kông và Macau.
1.2.2. Tình hình nhiễm siêu vi C ở Việt Nam [7,13]
Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HCV 1,8% dân số cả nước. , trung bình từ 1-3 trường
hợp/100000 người mỗi năm.
Theo Trương Xuân Liên (2010), tỷ lệ nhiễm HCV ở một số đối tượng tại

TP.HCM là : trên người tiêm chích ma túy là 96,2%, nhiễm HIV là 73,6%, bệnh
nhân xơ gan : 47,8%, bệnh nhân viêm gan : 26,6%, bệnh nhân ung thư gan :
23,2%, bệnh nhân nghi viên gan :19,3%, người cho máu : 14%, gái mại dâm : 9,9%,
bệnh nhân da liễu : 6,9%, nhân viên y tế : 3,28% và người cho máu bình thường :
2,53%.
Nakata và cộng sự (2007) khảo sát trên người không có bệnh gan ở 2 thành
phố lớn là Hồ Chí Minh và Hà Nội thì thấy tỉ lệ có kháng thể kháng HCV (anti-
HCV) lần lượt là 9% (43/491) và 4% (18/511). Phân bố kháng thể không phụ thuộc
theo tuổi. Cũng trong nghiên cứu này, ở TP.HCM, tần suất nhiễm anti-HCV khá cao
ở người tiêm chính ma túy 87%, bệnh nhân đang thẩm tách máu : 54%, hoặc có
bệnh ưa chảy máu : 29%. Nghiên cứu cũng cảnh báo cần sàng lọc anti-HCV ở
người cho máu vì mục đích thương mại là quan trọng.
Theo Trần Thanh Dương và cộng sự (2009) nghiên cứu kiểu gen của 14
bệnh nhân viêm gan tại Hà Nội thì thấy các kiểu gen 1a, 1b và 6a lần lượt là 4, 4 và
6 trường hợp. Cũng chính tác giả này, phân tích HCV ở phụ nữ mại dâm tại Hà Nội
thì thấy có nhiều kiểu gen : 1a, 1b, 6, 6a, 9a. Cao nhất là 1a, 6a và 1b.
1.3. Con đường lây nhiễm HCV [5,7]
HCV lây truyền theo đường máu và các đường lây chủ yếu sau :
 Người nhận máu, chế phẩm máu hoặc các bộ phận cơ thể từ một người cho
nhiễm HCV.
 Nhân viên y tế: tiếp xúc với bệnh phẩm chứa siêu vi trong quá trình làm việc.
 Ðường tình dục.
 Mẹ truyền sang con.
Dùng chung dao cạo, bàn chải răng, kềm cắt móng tay với người bị nhiễm siêu vi
C, kim chích xăm mình hay xỏ lỗ tai không đảm bảo vô trùng.
Tuy nhiên, 30-40% các trường hợp là không rõ nguyên nhân.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 5
1.4 Diễn tiến bệnh [13,15]

Sau khi bị nhiễm siêu vi, bệnh nhân có thời gian ủ bệnh từ 2 tuần – 6 tháng.
Đây là giai đoạn nhiễm trùng cấp tính. Phần lớn bệnh nhân không có triệu chứng
lâm sàng. Một số có biểu hiện mệt mỏi, chán ăn, … Việc chẩn đoán bệnh trong giai
đoạn này dựa vào xét nghiệm máu.
Sau 6 tháng, khoảng 85% bệnh nhân chuyển thành dạng mãn tính. Khi đó,
bệnh diễn tiến thầm lặng có thể từ 10-30 năm. Khi bệnh nhân phát hiện thường vào
giai đoạn cuối, khi các tế bào gan đã xơ, viêm và hoại tử
Có hai dạng viêm gan mạn tính
-Viêm gan C mãn tính có men ALT(Aspartate Amino Transferase) bình
thường, (ALT do gan tạo ra thường có một hàm lượng cố định trong máu, trị số
bình thường ALT < 40 U/L ,AST < 40 U/l)
Trường hợp viêm gan C mãn tính có men ALT bình thường là khi bệnh nhân
có sự hiện diện của anti-HCV, RNA HCV (+) bằng phương pháp PCR, và men
ALT bình thường kéo dài.
-Viêm gan C mãn tính có men ALT tăng :
Bệnh nhân viêm gan C mãn tính thuộc vào loại này. Tùy theo tổn thương mô
học mà chia làm hai loại: viêm gan mãn nhẹ và viêm gan mãn mức độ từ vừa đến
nặng. Sự phân biệt này rất quan trọng về tiên lượng và chỉ định điều trị
+ Viêm gan mãn nhẹ:
Viêm gan mãn nhẹ là khi sinh thiết gan cho thấy tổn thương mô học nhẹ.
Theo cách tính của Knodell(1980) viêm gan mãn nhẹ là khi số điểm sơ hóa là 0
hoặc 1 và số điểm hoại tính viêm- hoại tử nhỏ hơn 6.
+ Viêm gan từ mức độ vừa đến nặng:
Viêm gan từ mức độ vừa đến nặng là khi sinh thiết gan thấy có tổn thương
viêm- họai tử đáng kể hoặc xơ hóa lan rộng. Theo cách tính của Knodell (1980)
viêm gan mãn vừa và nặng được xác định là khi số điểm sơ hóa là 3 hoặc 4 và số
điểm hoạt tính lớn hơn 6.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 6
Nhiễm cấp tính


Không triệu chứng Mệt mỏi Viêm gan nặng





Hồi phục Viêm gan mãn





Hình 1.2: Sơ đồ diễn tiến bệnh siêu vi
( Nguồn: bệnh viện Hòa Hảo)
1.5. Biện pháp phòng ngừa và điều trị [20.23]
1.5.1. Biện pháp phòng ngừa
Các vết máu khô từ những người nhiễm HCV có thể lây cho người khác trong
khoàng thời gian từ 16 giờ đến 4 ngày, ở nhiệt độ phòng. Do đó, các vết máu cần
phải được tẩy sạch và người thực hiện phải mang bao tay cao su.
Không dùng chung ống chích, kim tiêm, bông băng.
Không dùng chung dao cạo râu, bàn chải đánh răng, dụng cụ cắt móng tay.
Quan hệ tình dục không an toàn.
Băng vết thương để tránh tiếp xúc máu cho người khác.
1.5.2. Điều trị

Điều trị viêm gan siêu vi đòi hỏi phải có kiến thức sâu về viêm gan và thuốc
chống siêu vi . Do đó, bệnh nhân nên được điều trị và theo dõi bởi bác sĩ chuyên về
viêm gan.
60%
2 tuần- 6 tháng
39%
15%
1%
Nhiễm cấp tính
10-30
năm
Không triệu chứng
Mệt mỏi
Viêm gan nặng
Hồi phục
85%
Viêm gan
không biến
chứng
20% Biến
chứng xơ và
ung thư
Viêm gan mạn
Viêm gan
không biến
chứng
20% Biến
chứng xơ
và ung thư
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 7
Hiện nay, để chống lại viêm gan C là interferon, một thuốc ức chế sự nhân lên
của virus. Các thuốc interferon dùng để điều trị viêm gan gồm: interferon α2b
(Intron A), interferon α2a (Roferon-A) và interferon alfacon-1 (Infegen). Nhưng
interferon chỉ có tác dụng ở khoảng 20% số trường hợp.
Hiện nay, tiêm interferon thường được phối hợp với uống ribavirin-một thuốc
kháng sinh virus phổ rộng. Điều trị thường mất sáu tháng đến một năm và thành
công ở khoảng 40% số người bị HCV.
Gần đây, một thuốc khác, interferon pegyl hóa có hiệu quả gấp hai lần
interferon thông thường. Vào tháng 1-2001 Cơ quan quản lý thuốc và dược phẩm
Mỹ đã cho phép dùng interferon pegyl hóa, interferon-peginterferon alfa-2b để
điều trị viêm gan.
Theo nghiên cứu của bác sĩ Nguyễn Thu Thủy-bệnh viện Hòa Hảo TP.HCM
Hiệu quả điều trị phụ thuộc nhiều yếu tố như: giới tính, thời gian ủ bệnh, độ
tuổi……
Yếu tố Thuận lợi Không thuận lợi
Giới tính
Độ tuổi
Thời gian bệnh
Xơ gan
Cân nặng
Nồng độ virus
Genotype

Nữ
<40
Ngắn
Không
>75 kg

Thấp
Không phải type 1
Nam
>40
Dài
Có
<75 kg
Cao
Type 1
Bảng 1.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh viêm gan C
Do đó, các lời khuyên được đưa ra để giữ gìn sức khỏe và bảo vệ gan:
 Theo dõi và tuân theo sự chỉ dẫn của bác sĩ chuyên khoa.
 Hạn chế tối đa các chất kích thích như rượu bia các loại nước có gas, các loại hóa
chất, các loại phụ gia
Hạn chế chất béo động vật.
Không sử dụng bất ký loại thuốc gì nếu không có chỉ định của bác sĩ đặc biệt các
loại thuốc giảm đau, thuốc an thần, thuốc ngủ…
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 8
Sống khoẻ mạnh, tập luyện vừa phải, ăn uống điều độ, không uống rượu, nghỉ
ngơi đầy đủ là những phương thức tốt cho bịnh nhân viêm gan C để giữ gìn sức
khoẻ, năng lượng.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 9

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN VỀ VIÊM GAN
SIÊU VI C

















KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 10
2.1. Hepatitis C virus -HCV [10,11]
HCV được xếp vào họ Flaviviridae vì có một số đặc tính về cấu trúc gen
tương tự như Flavivirus và Peptivirus. Do số lượng, việc xử lý protein virus và các
đặc điểm sao chép có một số khác biệt, nên gần đây HCV được xếp vào giống mới

của họ Flaviviridae với tên Hepacivirus. HCV lại có chung các đặc điểm với
Picornavirus và các virus thực vật như Potyvirus, làm cho ta lầm tưởng HCV là một
mắt xích tiến hóa giữa các virus thực vật và động vật.
HCV thuộc nhóm Flavirus HCV là một siêu vi nhỏ, hình cầu, đường kính
khoảng 55-65nm. Trọng lượng phân tử vào khoảng 4106 daltons. Bộ gen của siêu vi
C là một chuỗi đơn RNA độ 95000 nucleotide chứa một khung đọc mở dịch mã dài
mã hóa một polypeptide lớn 3010-3033 amino acid bắt đầu tại codon methionin
trong khung đọc đầu tiên và nằm bên trong phần nucleocapside 30-35nm có cấu
trúc đối xứng 20 mặt. Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các protein E1 và E2 tạo
thành các phức hợp primer.
Kiểu đọc mở HCV mã hóa một tiền chất polyprotein mà tiền chất này được
xử lý đồng dịch mã hoặc sau dịch mã để tổng hợp các protein cấu trúc ( C, E1, E2,
p7) và các protein không cấu trúc (NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a và NS5b).
HCV có 6 gentype được ký hiệu theo thứ tự từ 1 đến 6. Mỗi gentype có nhiều type
phụ. Trong đó, thường gặp nhất là các type 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5, 6. type 1a và 1b là
khó chửa trị nhất vì độc lực mạnh của virus. Bên cạnh đó, HCV thường bị đột biến
nên có khả năng tránh được các đáp ứng miễn dịch của cơ thể và dễ chuyển sang
nhiễm mạn tính.


2.2. Cấu trúc HCV [4]







Hình 2.1. Cấu trúc HCV
Protein vỏ

E1
Protein vỏ
E2
Protein liên
kết màng
Protein lõi
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 11
(Nguồn: James A. Perkin, 2001)
Vật liệu di truyền của HCV là một chuỗi RNA mạch( +), chứa khoảng 9400
nucleotide mã hóa cho một polyprotein tiền thể gồm 3011 amino acid. Gen chứa
một khuôn đọc mở với các trình tự được trình bày trong hình 2.2

Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc gen HCV
(Nguồn: James A. Perkin, 2001)
 Đầu 5’ không dịch mã: có chức năng điều hòa dịch mã.
C (nucleocapsid): protein lõi.
E1 (envelope): protein vỏ.
E2 (envelope): protein vỏ.
NS2 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng.
NS3 (protease/helicase): các enzyme thủy giải và cắt đứt liên kết hydro.
NS4 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng.
NS5 (polymerase): enzyme nhân bản vật liệu di truyền.
Gen của siêu vi C là một chuỗi đơn RNA có cực tính dương, gồm khoảng
9500 nucleotide được chia làm ba vùng:
(i)Đầu 5’ không mã hóa gồm 341-344 nucleotide. Đây là vùng tương đối bị ít
biến đổi nhất giữa các phân type khác nhau. Do đó vùng này như là một chất mồi
để phát hiện RNA của siêu vi C bằng phương pháp PCR. Chức năng của vùng này
là tham gia vào quá trình điều hòa nhân đôi của siêu vi.

(ii)Vùng được mã hóa nằm giữa hai đầu 5’ và 3’. Vùng này chỉ có một khung
đọc mở duy nhất gồm 9379-9481 nucleotide, được giải mã để tổng hợp một
polyprotein tiền chất của siêu vi gồm khoảng 3000 acid amin. Sau đó, protein này
sẽ được các enzyme protease của siêu vi và các enzyme peptidase tín hiệu của tế
bào phân cắt thành protein cấu trúc và protein không cấu trúc.
(iii)Đầu 3’ không mã hóa:
RNA virus chỉ có một khung đọc mẫu duy nhất mã hóa khoảng 3010-3033
aa, hai đầu được gắn kết bởi các vùng không dịch mã 3’ và 5’. Polyprotein được
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 12
phân cắt sau dịch mã với các peptidase tín hiệu và các protease mã hóa virus NS2-3
và NS 3-4 để sinh ra các protein cấu trúc và không cấu trúc trưởng thành.
2.2.1. Các protein cấu trúc
Các protein cấu trúc bao gồm C, E1 và E2 :
Protein capsid = protein C (21 kDa) tạo nên phần nucleocapsid bao bọc bên ngoài
chuỗi gen của siêu vi.
Protein E1 (37 kDa) và E2 (61 kDa) là hai glycoprotein của lớp vỏ, liên kết với
nhau thành các phức hợp dimer. Ở protein E2 có hai vùng siêu biến là HVR1 (ở vị
trí acid amin 390-410) và HVR2 (ở vị trí acid amin 474-480). Vùng siêu biến này
thường xuyên bị biến đổi qua mỗi lần siêu vi nhân đôi, tạo ra sự khác biệt giữa các
gen của siêu vi C trong cùng một bệnh nhân. HVR1 còn là nơi kích thích hệ thống
miễn dịch tạo ra kháng thể trung hòa. Vì vậy kháng thể mà cơ thể tạo ra không theo
kịp sự biến đổi liên tục tại vùng HVR1. Đây là cơ chế giúp siêu vi trốn tránh được
đáp ứng miễn dịch của ký chủ và làm cho tình trạng nhiễm siêu vi C thường chuyển
sang mãn tính.
Protein p7 (7 kDa) mà chức năng vẫn chưa được biết rõ.
2.2.2. Các protein không cấu trúc:
Protein NS2 (23 kDa).
Protein NS3 (68 kDa).

Protein NS4 ( gồm NS4A và NS4B).
Protein NS5 ( gồm NS5A và NS5B) : NS5A (56-58 kDa) có liên quan đến
chuyển hóa lipid vì nó tương tác với thành phần apolipoprotein Á. Vùng NS5A còn
được xem là vùng quyết định nhạy cảm của siêu vi C đối với interferon-alpha.Vùng
này làm mất tác dụng của interferon qua trung gian việc ức chế men protein kinase
PKR. Một khi PKR bị ức chế, nó sẽ không ức chế quá trình nhân đôi của siêu vi.
Nếu có đột biến xảy ra ở vùng NS5A có thể tạo được sự đáp ứng tốt với interferon.
NS5B (65kDa) chính là men RNA polymerase phụ thuộc RNA. Men này dùng để
tổng hợp chuỗi RNA từ khuôn mẫu là RNA.
2.3. Cơ chế gây bệnh
Đầu tiên, HCV gắn vào một thụ thể trên bề mặt tế bào gan nhờ hai
glycoprotein bề mặt của nó là E1 và E2, thực hiện quá trình hòa màng. RNA mạch
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 13
(+) của HCV được dịch mã nhờ hệ thống dịch mã của tế bào chủ. Protein tiền thể
tạo ra sẽ được phân cắt bởi enzyme tín hiệu để tạo ra các protein cấu trúc C, E1, E2
và các protein không cấu trúc là NS1-NS5. Sau đó bắt đầu phiên mã ngược để tạo ra
mạch RNA mạch (-) bổ sung với mạch (+) đã có nhờ vào enzyme Reverse
Tranriptase. Sau đó, capsomer được tạo ra từ các protein thành phần như C, E1, E2
sẽ kết hợp với RNA kép của HCV để tạo thành dạng nucleocapsid. Nucleocapsid
này tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát ra ngoài, trở thành dạng virus hoàn
chỉnh và đi xâm nhiễm một tế bào khác.
2.3.1. Sự sao chép và xâm nhập vào tế bào vật chủ
Các bước sao chép được mô tả như sau :
Protein màng của E2 giúp gắn kết virus vào tế bào.
 Sự cởi bỏ vỏ ngoài của HCV.
 Quá trình dịch mã và xử lý protein.
 Sự tổng hợp RNA HCV mạch âm nhờ RNA polymerase được mã hóa trong vùng
NS5B.

 Tổng hợp RNA HCV mạch dương : Sau khi hình thành, chuỗi RNA mạch âm
thành khuôn mẫu để tổng hợp bộ gen RNA mạch dương của virus mới. Quá trình
này được thực hiện bởi HCV RNA polymerase.
 Sự tạo vỏ ngoài HCV : Sự nảy chồi của HCV, các hạt RNA được tạo vỏ nảy chồi
qua màng bào tương.
 Sự bài tiết HCV kết hợp chủ yếu với lưới nội bào tương với khoảng 10
12
virion
HCV mỗi ngày.
2.3.1.1. Nhiễm HCV cấp
HCV được truyền từ người sang người theo đường máu hoặc tiếp xúc với
dịch cơ thể người mang HCV. HCV có thể lưu hành tự do trong huyết tương và gây
nhiễm các tế bào di động như lympho bào, bạch cầu đơn nhân. Ngoài ra, bằng
phương pháp lai in situ, PCR và các nghiên cứu miễn dịch huỳnh quang đã tìm thấy
các thành phần virus trong tế bào gan, các tế bào lympho B và T, và các đại thực
bào, và hóa học mô miễn dịch đã chứng minh các kháng nguyên virus trong các tế
bào thượng bì đường mật và trong các tế bào thượng bì tuyến nước bọt. Việc phát
hiên này có nhiều ý nghĩa rất quan trọng :
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 14
-Việc nuôi cấy siêu vi C có thể thực hiện được ở các dòng lympho bào.
- Các tế bào đơn nhân có thể là nguồn chứa siêu vi và đặc biệt có thể là
nguyên nhân gây tái nhiễm siêu vi C sau khi ghép gan.
- Sự lây nhiễm ở các tế bào đơn nhân có thể chọn lọc nên một vài biến chủ
đặc biệt và tạo điều kiện cho bệnh tồn tại kéo dái.
-RNA virus thường được phát hiện 2 ngày sau truyền nhiễm, tuy nhiên
không liên tục, cho thấy có các đơn bùng cháy sau chép virus. Khi được xác định
bằng định lượng PCR và bằng xét nghiệm DNA nhánh, tình trạng huyết tương tăng
lên mức độ cao (180 bộ gene/ml hay nhiều hơn) trước khi xuất hiện các triệu chứng

lâm sàng.
Mật độ của các hạt tử HCV trong huyết thanh rất thay đổi, từ 1,03 đến
1,72g/ml. Sở dĩ mật độ của HCV thay đổi như vậy là do các virion lưu hành trong
máu dưới nhiều dạng khác nhau : hoặc là ở dạng tự do có tính lây nhiễm rất cao
nhưng chỉ hiện diện với mật độ tương đối thấp (khoảng 1,03) ; hoặc là ở dạng kết
hợp với các đại phân tử, đặc biệt là các lipoprotein hoặc hiện diện trong các phức
hợp miễn dịch nhưng mật độ lại cao.
2.3.1.2. Nhiễm HCV mạn
Nhiễm HCV thường có 80% tình trạng virus có trong huyết thanh tồn tại,
cho dù không có các triệu chứng lâm sàng và sinh hóa. Lượng virus trong huyết
thanh được phát hiện trong quá trình tồn tại biến đổi thay đổi theo từng cá nhân, từ
102 – 1010 gene/ml, và có thể dao động mạnh theo thời gian. Tình trạng virus huyết
thanh có lúc không phát hiện được cho là do dao động về số lượng tế bào nhiễm
virus, các yếu tố vật chủ tác động lên sự thanh thải virus cũng như hiệu quả sao
chép của các loài.







KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 15

CHƯƠNG 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN
ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN C















3.1. Chẩn đoán lâm sàng
3.1.1. Xét nghiệm chẩn đoán tình trạng viêm gan
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 16
Định lượng các men AST (Alanin Amino Transferase ) và ALT (Aspartate
Amino Transferase). Đặc điểm quan trọng về phương diện sinh hóa trong viêm gan
siêu vi C là sự dao động của men ALT lúc tăng, lúc giảm thậm chí trong giới hạn

bình thường. Sự tăng men gan trong viêm gan C cấp thường thấp hơn so với mức
tăng trong viêm gan A và B.
3.1.2. Xét nghiệm đánh giá chức năng gan
Chức năng bài tiết mật bị ảnh hưởng dẫn đến tình trạng tăng bilirubin trong
máu ( cả bilirubin trực tiếp và bilirubin giáp tiếp) gây vàng da. Bilirubin là sản
phẩm chuyển hoá của hemoglobin. Bilirubin gián tiếp và bilirubin trực tiếp thường
được đo để tầm soát và theo dõi bệnh gan hay đường mật.
Đánh giá chức năng tổng hợp yếu tố đông máu của gan bằng cách khảo sát
- Prothrombine bình thường 8,2-10,3
- Taux de prothrombin bình thường lớn hơn 80%.
- INR bình thường 0,9-1,3.
Đánh giá chức năng tổng hợp Albumin màu của gan. Trị số trung bình
Albumin trong máu từ 35-55 g/l và tỷ số Albumin/Globulin bình thường từ 1-1,5.
Albumin là protein quan trọng nhất của huyết thanh tham gia vào hai chức năng
chính : duy trì áp lực thẩm thấu keo trong huyết tương và liên két vận chuyển phân
tử nhỏ như : acid béo, bilirubin… Globulin chủ yếu là immunoglobulins (Ig's)- có
nhiều lọai, IgM, IgE ) được tạo ra từ bạch cầu, thuộc về kháng thể và có chức năng
nhận ra và "tấn công" các vật lạ xâm nhập cơ thể.
Chức năng thải NH
3
bình thường là 9-33µmol/L. Khi gan suy NH
3
sinh độc
cho cơ thể, đặc biệt là hệ thần kinh dẫn đến rối loạn tri giác, hôn mê.
3.1.3. Siêu âm bụng tổng quát
Giúp chẩn đoán loại trừ các nghuyên nhân gây tắc mật khác như sỏi mật, u
đường mật, u đầu tụy, hoặc các tổn thương như ung thư gan, sán lá gan…
Trong viêm gan cấp, cấu trúc gan đồng nhất, gan có thể hơi to.
Sinh thiết tế bào gan : quan sát tế bào gan dưới kính hiển vi, xác định mức độ
viêm nhiễm chẩn đoán giai đoạn bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị.

3.1.4. Xét nghiệm miễn dịch học
Tìm anti-HCV trong máu.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 17
Tuy nhiên xét nghiệm này dương tính chỉ có tính chất gợi ý về tình trạng
nhiễm HCV, không cho kết luận mới nhiễm hay đã nhiễm từ lâu và không thể kết
luận chắc chắn là không còn mang HCV.
3.2. Chẩn đoán cận lâm sàng
3.2.1. Phương pháp bDNA
Là một kỹ thuật lai phân tử giữa RNA HCV với những probe bắt cặp bổ sung
với một trình tự có tính bảo tồn cao ở vùng 5’ không mã hóa. Đây là một phương
pháp phát hiện và định lượng trực tiếp. Người ta xử lý huyết tương hoặc huyết
thanh người bệnh với protease K nhằm giải phóng RNA HCV từ các hạt virus.
RNA được lai với các probe đặc hiệu. Sau đó phức hợp RNA HCV-probe được cố
định trên một vi giếng và tiếp tục được lai với các probe khuếch đại tín hiệu, mỗi
probe này liên kết với nhiều phân tử alkaline phosphatase. Cuối cùng, cơ chất của
enzyme được cho vào vi giếng và tín hiệu hóa quang sẽ được thu nhận bởi máy đọc
tín hiệu ánh sáng.
Trong phương pháp định lượng bằng bDNA thì việc thiết kế các probe mục
tiêu là vô cùng quan trọng. Cả hai loại probe ( probe cố định RNA HCV vào vi
giếng và probe khuếch đại tín hiệu RNA HCV ) phải được thiết kế sao cho có thể
định lượng mọi genotype HCV với hiệu quả như nhau. Các loại probe này thường
có kích thước từ 16-24 nucleotide và nhiệt độ nóng chảy (Tm) vào khoảng 70
0
C
nhằm đảm bảo tính đồng nhất của phản ứng lai và tín hiệu tối đa.
Phương pháp cho kết quả tuyến tính với các mẫu huyết thanh có nồng độ
RNA HCV từ 200000 đến 120000000 phân tử RNA/1ml máu. Các genotype của
HCV cũng có ảnh hưởng trên việc định lượng RNA HCV giữa genotype 1 và 2 có

độ nhạy chênh lệch nhau vào khoảng 3 lần và giữa genotype 3a và 6a là 1,5 lần.
3.2.2. Phương pháp ELISA
Phương pháp này sử dụng nguyến tắc phát hiện phân tử lai dựa vào sự
chuyển màu cơ chất hoặc tín hiệu quang, hóa quang dưới sự xúc tác của enzyme kết
hợp với kháng thể kháng digoxigenin. Đầu tiên người ta tách chiết RNA HCV từ
huyết thanh và chuyển thành cDNA nhờ phản ứng phiên mã ngược. cDNA này
được dùng làm bản mẫu cho phản ứng PCR. Trong thành phần của phản ứng PCR,
một trong hai primer sẽ được đánh dấu ở đầu 5’ với biotin, như vậy sản phẩm PCR