Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS để sản xuất chế phẩm PROBITICS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------------o0o-----------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Đề Tài:

TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI
KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ĐỂ
SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTICS
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ NGÀNH:

111
GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
SVTH: NGUYỄN HOÀNG ÂN
MSSV: 105111004
LỚP:

05DSH

TP. Hồ Chí Minh, Thng 6 năm 2009


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp ngoài nổ lực bản thân còn có sự giúp
đỡ của quý thầy cô và các bạn trong lớp.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
TS. Nguyễn Hoài Hương là người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt
những kiến thức, kinh nghiệm quý bo trong suốt thời gian làm đồ án tốt

nghiệp.
Thầy cô khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học đã trang bị cho tôi
những kiến thức quý báo trong suốt thời gian học tập 4 năm tại nhà trường
Thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi
hòan thành tốt đồ án tốt nghiệp.
Tất cả các bạn sinh viên lớp 05DSH đã giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình làm đồ án.
Lời cảm tạ cuối cùng xin được giành gia đình. Con xin cảm ơn ba mẹ. Ba mẹ
luôn là điểm tựa vững chắc, là niềm động viên và tạo điều kiện cho con có
ngày hôm nay.


Đồ án tốt nghiệp
Hoài Hương

GVHD: TS. Nguyễn

CHƯƠNG 1 - MỞ ĐẦU
Probitics là những vi sinh vật sống có ảnh hưởng tốt đến vật chủ bằng
cách giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Vi khuẩn probiotics giúp hồn
thiện hệ tiêu hóa, kháng các vi khuẩn gây bệnh thơng qua các chất kháng
khuẩn ( acid, bacteriocins, H2O2), tăng cường hệ thống miễn dịch, giảm
cholesterol trong máu, khắc phục hiện tượng khơng tiêu hóa đường lactose
có trong sữa, giảm tiêu chảy.... Đặc biệt vi khuẩn probiotics khơng gây hại
cho vật chủ.
Hiện nay probiotics được ứng dụng rộng rãi trong các thực phẩm,
dược phẩm, trong chăn ni. Sử dụng probiotics trong dược phẩm và chăn
ni có thể hạn chế được việc sử dụng kháng sinh, giảm tác động đến sức
khỏe con người.
Phần lớn các chế phẩm probiotics là vi khuẩn lactic được phân lập từ hệ

đường ruột của người và động vật và được xem là an tồn: L. acidophilus, L.
casei...
Mơi trường MRS là mơi trường chuẩn để phân lập và ni cấy vi
khuẩn lacitc để thu sinh khối, nhưng nếu sử dụng mơi trường này thì giá
thành sản phẩm cao, kết quả chế phẩm tạo thành giá rất cao.
Đề tài :” Tối ưu hóa mơi trường ni cấy vi khuẩn Lactobacillus
acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotics ”. Với mục đích tận dụng các
nguồn ngun liệu rẻ tiền để thay thế cho mơi trường MRS trong sản xuất
sinh khối vi khuẩn lactic nói chung và L. acidophilus nói riêng.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
 Khảo sát chọn nguồn cacbon thay thế glucose trong mơi trường lên
men.
 Tối ưu hóa mơi trường cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
L. acidophillus

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
Trang 1


Đồ án tốt nghiệp
Hoài Hương

GVHD: TS. Nguyễn

 So sánh động học ni cấy L. acidophilus trên mơi trường MRS và mơi
trường tối ưu
 So sánh khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị (E. coli) của dịch ni cấy
L. acidophilus trong mơi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu.

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 2


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

CHƯƠNG 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.. Probiotics
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu Probiotics
Vào những năm đầu của thế kỷ 19, những nghiên cứu đầu tiên về sự tương tác
của vi sinh vật với cơ thể vật chủ đã bị phủ nhận. Đến đầu 1885, Escherich đã miêu
tả về sự hình thành hệ vi sinh vật trong ruột của trẻ em và nêu ra những lợi ích của
chúng trong tiêu hố. Doderlein khẳng định rằng sự có lợi của vi khuẩn trong âm đạo
bằng cách sản xuất ra acid lactic, nó có thể ngăn chặn hoặc ức chế sự phát triển của
vi khuẩn gây bệnh. Các vi khuẩn sản xuất acid lactic trong q trình trao đổi chất
mà tiêu biểu là nhóm vi khuẩn lên men lactic đã được sử dụng kết hợp với các sản
phẩm lên men sữa. Cuốn sách Prolongation of Life của Metschnikoff đã đưa ra
những lợi ích của vi khuẩn lactic đến sức khoẻ của con người khi con người sử dụng
những sản phẩm sữa kết hợp với các vi khuẩn lactic. Ơng cho rằng người Cap-ca có
thể sống lâu là do họ đã sử dụng một lượng lớn các sản phẩm sữa lên men [19].
Henry Tissier là một bác sĩ khoa nhi ở Pháp kiểm tra phân của những trẻ em bị
tiêu chảy và thấy rằng chỉ chứa một lượng ít các vi khuẩn “bifi”. Trong khi đó vi
khuẩn này lại tồn tại một lượng lớn trong phân của các trẻ em có sức khoẻ tốt. Ơng
cho rằng vi khuẩn này có thể giúp bệnh nhân hồi phục lại bệnh.[45]
Năm 1900, Tissier cho rằng Bifidobacteria và một số nhóm vi khuẩn khác sản
sinh acid lactic nhưng chủ yếu là vi khuẩn lactic có tác dụng tốt đối với sức khoẻ
[19].
Năm 1917, trước khi Alexander Fleming khám phá ra ampicilin, giáo sư

Alfred Nissle người Đức đã phân lập ra một chủng thuộc lồi E. coli khơng gây
bệnh từ phân của các chiến binh trong chiến tranh thế giới thứ nhất và ơng đặt tên
chủng này là Nissle 1917. Các chiến binh này bị bệnh viêm ruột kết và chủng vi
khuẩn Nissle 1917 được sử dụng như là probiotics để trị bệnh cho các chiến sĩ [46].
2.1.2. Định nghĩa Probiotics
Probiotics là thuật ngữ có nguồn gốc từ Hy Lạp bao gồm có hai từ: “pro” có ý
nghĩa là vì, “biosis” có nghĩa là sự sống. Probiotics được định nghĩa đầu tiên là do
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
3

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

Parker(1974): “ những sinh vật và các chất mà giúp cân bằng hệ sinh vật đường
ruột”. Nhưng 1989, Fuller đã định nghĩa lại Probiotics:” những vi sinh vật sống bổ
sung vào thức ăn mà chúng có tác động tốt đến sức khoẻ của động vật chủ bằng cách
tạo cân bằng hệ sinh vật đường ruột” [17]. Bifidobacteria và lactobacilli là chi được
sử dụng rộng rãi nhất. Nấm men (Saccharomyces cerevisiae), một vài chủng E. coli
và Bacilllus spp cũng được sử dụng như một probiotics [46].
Havenaar và Huis Int Veld, 1992 định nghĩa:” probiotics là một hoặc sự kết
hợp của các vi sinh vật sống, ảnh hưởng có lợi đến vật chủ, hồn thiện hệ vi sinh vật
đường ruột [26].
Theo viện khoa học quốc tế ( International Life Sciences Institute), nhóm làm
việc tại châu Âu (1998) định nghĩa probiotics: “ là vi sinh vật sống bổ sung vào thức
ăn tác động có lợi đến vật chủ” [26].

Theo tổ chức thực phẩm, nơng nghiệp và sức khỏe thế giới “ probiotics là
những vi sinh vật sống, khi mà sử dụng một lượng đầy đủ như là thức ăn, sẽ mang lại
sức khỏe tốt cho vật chủ ” [25].
Theo FAO:” Những vi sinh vật khi sử dụng với một lượng đủ sẽ tác động có
lợi đến vật chủ”. Hầu hết probiotics là vi khuẩn, sinh vật đơn bào [49].
2.1.3. Cơ chế tác động của probiotics
Sự tương tác lẫn nhau bình thường của hệ vi sinh đường ruột là một trong các
yếu tố quan trọng đảm bảo sức khỏe của vật chủ, sự tương tác này bị gián đoạn có
thể dẫn đến một số bệnh lý do mất cân bằng hệ vi sinh đường ruột làm tăng nhanh số
lượng vi khuẩn gây bệnh. Probiotics được chứng minh là có khả năng chống lại một
số tác nhân gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella,

Listeria monocytogenes,

Helicobacter pylori, và rotavirus. Cơ chế tác động của probiotics như sau:
2.1.3.1. Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn: bao gồm bacteriocins, acid
hữu cơ, và hydrogen peroxide .
Bacteriocins là một chất kháng khuẩn, được chia làm 4 lớp:


Lớp thứ nhất là những phân tử peptid nhỏ (< 5 kDa)

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
4

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương



GVHD: TS. Nguyễn Hoài

Lớp thứ hai là những phân tử peptid nhỏ (< 10 kDa), thường là những

phân tử peptid hoạt động ở màng tế bào.


Lớp thứ 3 là những phân tử protein lớn (>30 kDa), bền về nhiệt, gồm các

enzyme ngoại bào


Lớp thứ tư là những bacteriocins phức tạp, ngồi protein còn có các thành

phần khác như lipid và cacbohyrate [35].
Bacteriocins được sản xuất bởi vi khuẩn lactic, khi tiến hành phân tích gen cuả
các vi khuẩn lactobacilus gồm L. plantarum, L. acidophilus NCFM, L. johnsonii
NCC 533, và L. sakei đều thấy chúng là các lồi có khả năng sinh bacteriocins và
chúng thường độc đối vi khuẩn gram dương như

Lactococcus, Streptococcus,

Staphylococcus, Listeria, và Mycobacteria. Cơ chế hoạt động cơ bản của
bacteriocins chủ yếu tạo nên những lỗ trên màng tế bào chất và sau đó enzyme được
tiết ra gây trở ngại cho q trình trao đồi chất của vi khuẩn gây bệnh. Một vài vi
khuẩn thuộc chi Bifidobacteria cũng có khả năng sản xuất ra bacteriocins gây độc
cho cả vi khuẩn gram âm và gram dương. Đặc biệt probiotics còn kích thích các tế
bào biểu mơ ruột sản xuất ra các chất kháng khuẩn [25].

Acid hữu cơ cũng có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, được
sản xuất bởi vi khuẩn lactic như acetic, lactic, acid propionic làm pH mơi trường hạ
thấp xuống ảnh hưởng đến pH nội bào của vi khuẩn gây bệnh. Một vài vi khuẩn chi
Lactobacillus ngăn chặn sự phát triển của Salmonella enterica bằng cách sản xuất ra
acid lactic [25].
Hydrogen Peroxide cũng là chất kháng khuẩn, một vài vi khuẩn
Lactobacillus trong cơ quan âm đạo phụ nữ được tìm thấy chúng có khả năng sản
sinh ra hydrogen peroxide ngăn cản sự phát triển vi khuẩn gây bệnh gonococci trong
cơ quan sinh dục nữ. Ngồi ra vi khuẩn Lactobacillus còn ngăn chặn sự phát triển
của Gardnerella vaginalis khi có sự kết hợp của hydrogen peroxide, lactic acid, và
bacteriocins [25].
2.1.3.2. Cạnh tranh vị trí gắn kết

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
5

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

Khả năng gắn kết trn biểu mơ ruột l một yếu tố quan trọng cho vi sinh vật cư
trú trên ruột, và cũng chính là giai đoạn đầu của qu trình xm nhiễm. Probiotics trong
hệ tiêu hóa có chức năng ngăn chặn khả năng bám dính của tác nhân gây bệnh và
giảm lượng chất độc của chúng trên biểu mơ ruột. Một vài vi khuẩn Lactobacilli và
Bifidobacteria có khả năng cạnh tranh vị trí với vi khuẩn gây bệnh bao gồm S.
enterica, Yersinia enterocolitica và bám dính trên tế bào biểu mơ ruột. Một vài

trường hợp, vi khuẩn probiotics có thể chiếm cả vị trí gắn kết của vi khuẩn gây bệnh
ngay cả khi những vi khuẩn gây bệnh này đã bám chặt trên tế bào biểu mơ nếu được
xử lý với probiotics [25]. Lactobacillus GG và Lactobacillus plantarum 299V cạnh
tranh vị trí bám với Escherichia coli 0157H7 và HT-29, Lactobacilli fermentum RC14 cạnh tranh vị trí bám dính với Staphylococcus aureus do đó làm giảm sự bám
dính của các tác nhân gây bệnh [25].
Ngồi ra probiotics còn có các cơ chế khác tác động lên các vi khuẩn gây
bệnh. Vi khuẩn probiotics như Treptococcus thermophilus và Lactobacillus
acidophilus enha hoạt hóa tạo ra protein bịt kín vùng bị tổn thương của ruột. Thứ hai,
các vi khuẩn probiotics khác như Lactobacillus rhamnosus GG có khả năng ngăn
ngừa bệnh viêm ruột và các tế bào chết bám trên biểu mơ ruột. Cuối cùng là chức
năng ngăn chặn, lactobacillus được chứng minh rằng là chủng có khả năng làm giảm
độ thẩm thấu vào màng nhầy, hạn chế được sự xâm nhập của vi sinh vật có kích
thước nhỏ ở chuột [26].
Sinh tổng hợp chất nhày là một trong những cơ chế chống lại các tác nhân
gây bệnh, chất nhầy sẽ cơ lập, bất hoạt vi sinh vật gây bệnh. MUC2 và MUC3 là hai
mRNA làm tăng kích thích sản sinh ra chất nhầy, bảo vệ tế bào biểu mơ chống lại sự
bám dính của vi khuẩn gây bệnh. Lactobacillus plantarum 299v được chứng minh
rằng có khả năng làm giảm tác động của E. coli trên tế bào biểu mơ ruột.
2.1.3.3. Cạnh tranh nguồn dinh dưỡng
Probiotics còn có khả năng cạnh tranh các chất dinh dưỡng với các vi sinh vật
gây bệnh. Bất kỳ vi sinh vật nào cũng cần có nguồn dinh dữơng để phát triển, chẳng

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
6

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

hạn sự phát triển vi khuẩn probiotics sử dụng đường đơn (glucose, fructose) làm
giảm sự phát triển của Clostridium difficile (sử dụng đường đơn ) [26].
Sắt là yếu tố quan trọng đối với tất cả các tế bào sống ngoại trừ Lactobacillus
plantarum và Borrelia burgdorferi, nó cần thiết trong các q trình sinh hóa trong tế
bào và có thể gây độc ở ngưỡng cao. Sự hấp thu và lưu trữ sắt được điều chỉnh bởi tế
bào [19]. Siderophore lá chất có khối lượng phân tử thấp, có khả năng gắn kết các
ion sắt. Siderophore có thề hòa tan sắt tủa thành dạng dễ sử dụng cho vi sinh vật. Do
đó tận ứng yếu tố này, có thể chọn các vi sinh vật vơ hại có khả năng sản xuất
siderophore làm vi khuẩn probiotic, nó sẽ cạnh tranh ion sắt với vi khuẩn gây bệnh
[9]. Bifidobacteria có khả năng sản sinh siderophore và cạnh tranh ion sắt trong ruột
già như E. coli [19].
Ngồi ra probiotics còn tác động đến hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây
độc, quorum sensing có liên quan đến q trình điều hòa các nhân tố gây độc của vi
khuẩn đặc biệt là Virio. Vi khuẩn probiotics sẽ phá vỡ hệ thống này, đây cũng là một
biện pháp mới để chống lại các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản.
2.1.3.4. Kích thích miễn dịch
Mặc dù cơ chế vẫn chưa được sáng tỏ, việc sử dụng probiotics có tác dụng
làm tăng dáp ứng miễn dịch, nhất là miễn dịch tự nhiên. Spanhaak et al thí nghiệm sử
dụng Lactobacillus casei Shirota ở 20 người đàn ơng. Những ngừơi đàn ơng này
được ăn theo chế độ trong 8 tuần, 10 người đàn ơng được uống sữa lên men bổ sung
1x1012 cfu/ml Lactobacillus casei Shirota, 10 người còn lại uống sữa lên men. Kết
quả làm tăng đáp ứng miễn dịch ở 10 người sử dụng sữa chua có bổ sung
Lactobacillus casei Shirota [27]. Nhiều chủng Lactobacillus có khả năng hoạt hóa
đại thực bào, kích thích hình thành bạch cầu trung tính, kích thích tế bèo tua (dendrit)
làm tăng khả năng tổng hợp IgA và interferon gamma.
2.1.4. Vi sinh vật probiotics:
2.1.4.1.Vi khuẩn lactic:

Lactobacillus : Hầu hết các vi sinh vật probiotics đều là các vi khuẩn sản sinh
ra acid lactic. Từ xưa con người đã biết cách sử dụng các vi khuẩn có lợi bổ sung vào
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
7

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

các sản phẩm lên men, chủ yếu thuộc lồi L. casein và một vài chủng L. acidophilus.
Cách đây khoảng 40 năm và 30 năm ở Đức vi khuẩn lactic đã được ứng dụng bổ
sung vào trong các sản phẩm sữa lên men. Hai lồi “Lactobacillus acidophilus” và
“Bifidobacterium bifidum” được giới thiệu rất phổ biến ở Đức vào cuối 1960 trong
các sản phẩm bơ sữa bởi vì nó có thể giúp ổn định vi khuẩn đường ruột và tạo một
cảm giác chua nhẹ gây cảm hứng cho người tiêu dùng trong các sản phẩm sữa chua.
Ở Đức sản phẩm có tên thương mại là “mild yogurts” hoặc “bio-yogurts“. Ở Mỹ sữa
acidophilus lại được phát triển và điều quan trọng đối với các lồi này là phải được
chứng minh là an tồn với người sử dụng. L. casei/paracasei, L. rhamnosus, L.
acidophilus, và L. johnsonii đây là những lồi được sử dụng nhiều nhất và đã được
chứng minh là an tồn cho người sử dụng [19].
Lactobacillus có khoảng 60 lồi bao gồm L. acidophilus, L. plantarum, L.
casei, và L. rhamnosus…. Cách đây hơn 100 năm con người đã sử dụng các vi khuẩn
Lactobacillus bổ sung vào thực phẩm nhằm tăng thời gian bảo quản, tăng vị ngon,
tạo ra các cấu trúc khác nhau trong thực phẩm. Hương vị của sản phẩm là do các sản
phẩm trao đổi chất của Lactobacillus. Chẳng hạn acetaldehyde có trong yogurt,
diacety có trong có trong các sản phẩm sữa lên men [19].

Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh của lactobacillus đã được nghiên cứu
trong điều kiện in vitro, đặc biệt khả năng bám dính và cạnh tranh vị trí bám dính của
lactobacillus với các vi khuẩn gây bệnh. Coconnier et al, chứng minh được L.
acidophilus ngăn cản sự bám dính của E. coli O157:H7, Salmonella enterica,
Yersinia pseudotuberculosis và Listeria monocytogenes trên tế bào Caco-2 cells.
Tương tự như vậy, Forestier et al. cũng chứng minh được khả năng ngăn cản bám
dính của L. casei và L. rhamnosus Lcr35 đối với E. coli và Klebsiella pneumoniae
trên tế bào Caco-2 cells. Ngồi cớ chế cản trở sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh thì
Lactobacillus còn ức chê vi khuẩn gây bệnh bằng sinh acid làm pH mơi trường
giảm xuống và bacteriocins. Theo nghiên cứu của Vescovo et al, ơng tiến hành thử
nghiệm khả năng kháng khuẩn của năm chủng L. casei trên Aeromonas hydrophila,
L. monoytogenes, S. typhimurium,và S. aureus trong điều kiện invitro. Tuy nhiên ở
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
8

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

nghiên cứu này, L. casei IMPCLC34 là chủng có tác động mạnh nhất đối với
Aeromonas hydrophila, S. typhimurium, và S. aureus, tuy nhiên nó khơng có tác
động kháng đối với L. monocytogenes. Nhưng ngược lại Lactobacillus spp phân lập
từ gà lại có khả năng kháng lại Campylobacter spp trong điều kiện invitro [19].
Dựa vào khả năng sinh bacteriocins của Lactobacillus, mà Lactobacillus được
sử dụng rất nhiều trong các sản phẩm rau quả, thịt, và cá lên men. Khả năng sinh
bacteriocins của lactobacillus được khám phá vào 1975, và nhiều loại bacteriocins

khác đã được biết đến. Hiện nay lactobacillus được ứng dụng rộng rãi trong các sản
phẩm cá, bơ sữa, và thịt trong vấn đề bảo quản và nâng cao chất lượng sản phẩm.
Hầu hết các chủng sinh bacteriocins đều đã được biết, như Lactocin 705 bởi L. casei
CRL705 kháng S. aureus, L. monocytogenes, S. pyogenes, Acidocin CH5 bởi L.
acidophilus CH5 kháng vi khuẩn gram âm, acidophilin 801 bởi L. acidophilus IBB
801 kháng một số vi khuẩn gram âm và gram dương… [19].
Bifidobacteria: Vi khuẩn Bifidobacteria được phát hiện đầu tiên bởi Henry
Tissier (1899, 1900) khi ơng nghiên cứu vi sinh vật trong phân của những đứa trẻ.
Lúc ban đầu Tissier xếp nó vào chi Bacillus, nhưng đến năm 1924 xếp nó vào chi
Bifidobacteria sau khi quan sát thấy những đặc điểm khác nhau về mặt hình thái học
và cấu tạo vách tế bào so với chi bacillus. Chúng hình roi, khơng di chuyển, khơng
sinh bào tử, kị khí bắt buột. Trong cơ thể người có khoảng 500 vi khuẩn, trong đó
Bifidobacteria là một trong những vi khuẩn chiếm số lượng đáng kể trong ruột. Mười
lồi khác nhau của Bifidobacteria đã được phân lặp từ cơ thể người. Trong số các
lồi đó là B. longum, B. bifidum, và B. infantis đã được biết đến.
Bifidobacteria cũng như lactobacillus có khả năng kháng lại các vi khuẩn gây
bệnh bằng acid lactic và acetic và các chất kháng khuẩn như bacteriocins. Một số vi
khuẩn Bifidobacteria được sử dụng như thuốc kháng khuẩn trong điều kiện in vitro
và in vivo với Salmonella, Shigella, Clostridium, Bacillus cereus, Staphylococcus
aureus, Candida albicans, và Campylobacter jejuni. Một nghiên cứu thực tiễn cho
thấy B. bifidum có khả năng kháng Shigella dysenteriae trong điều kiện in vitro [19].

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
9

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh
và vi khuẩn gây hỏng thức ăn. Trong đó, Gagnon et al thử khả năng kháng của năm
lồi thuộc chi bifidobacterial đối với E. coli O157:H7 trong invitro, và kết quả hai
trong năm lòai thể hiện khả năng kháng E. coli O157:H7. O’Riordan và Fitzgerald
sàng lọc được 22 vi khuẩn Bifidobacterium và trong đó có 12 lồi có khả năng kháng
vi khuẩn gram âm và gram dương, bao gồm Pseuedomonas spp., Salmonella spp, E.
coli,…. Trong nghiên cứu của Gibson and Wang về khả năng kháng của 8 vi khuẩn
bifidobacteria trong điều kiện invitro với Listeria monocytogene, Clostridium
perfringens, Salmonella spp, vibrio cholerae, và E. coli, hầu hết E. coli và C.
perfringens bị tiêu diệt bởi B. infantis va B. Longum. bifidobacterial còn được ứng
dụng bổ sung vào thức ăn cho những đứa bé gớp phần làm giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu
chảy và tiêu chảy cấp do rotavirus do với những đứa trẻ bình thường [19].
Khơng giống với Lactobacillus, bifidobacteria rất hạn chế về các tài liệu về
bacteriocins. Bifidin là một bacteriocins được sinh ra từ B. bifidum NCDC 1452 có
khả năng kháng rất nhiều vi khuẩn : E. coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,
Micrococcus flavus, và Pseudomonas fluorescens [19].
2.1.4.2.Nấm men:
Lactobacillus, Bifidobacterium được sử dụng rộng rãi nhất trong các sản phẩm
probiotics, tuy nhiên nấm men cũng được sử dụng như một probiotics. Theo nghiên
cứu của H. Kumura, Y. Tanoue, M. Tsukahara, T. Tanaka, và K. Shimazaki kiểm tra
hoạt tính probiotic của tám lồi nấm :Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces
lactis,

Kluyveromyces

lodderae,

Kluyveromyces

marxianus,

Saccharomyces

cerevisiae, và Yarrowia lipolytic được phân lập từ kefir [21].
Saccharomyces boulardii tác dụng trị tiêu chảy ở trẻ nhỏ. Theo bác sĩ Karpa
S. boulardii có khả năng sinh enzyme khử độc tố của C. difficile. Saccharomyces
boulardii, khác với lactobacilli hoặc bifidobacteria nó khơng tạo hệ vi sinh trong
ruột người mà nó chỉ tồn tại một hoặc hai tuần trong ruột. Chúng ngăn chặn các tác
nhân gây bệnh và sau đó ra khỏi ruột, đồng thời giúp lactobacilli và bifibacteria phát
triển nhanh [55]. Theo kết quả nghiên cứu của McFarland và Bernasconi
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
10

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

Saccharomyces boulardii phát triển tốt nhất ở 370C và có thể sống sót khi trãi qua hệ
tiêu hóa của người và động vật. S. boulardii có khả năng ức chế sự phát triển của
nấm Candida albicans [19].
Hiện nay các sản phẩm probiotics trên thị trường chủ yếu sử dụng
Lactobacillus và bifidobacteria. Probiotics có thể chỉ là chế phẩm chi tồn tại một lòai
hoặc có sự kêt hợp với các lồi khác như Bacillus cereus, B. clausii, B. pumilis,

Escherichia coli (Nissle), Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P.
acidopropionici, P. thoenii, và Saccharomyces boulardii. Ngồi ra nấm men cũng
được sử dụng như một probiotics bổ sung vào thức ăn cho vật ni. Có khoảng 65%
các sản phẩm sữa probiotics được bán trên thị trường châu Âu, trong khi đó ở Nhật
thì có khoảng 70% trong các loại thực phẩm bán trên thị trường. Ở Mỹ, Canada,
Châu Âu người ta sử dụng kết hợp nhiều chi khác nhau để trị các bệnh trên lợn và
gia cầm: Bifidobacterium. Lactobacillus, Streptococcus, Bacillus,
Pediococcus, Leuconostoc và Propionibacterium (Lloyd-Evans,

Bacteroides,
1989; Tobey,

1992). Nhưng ở Nhật và một số nước phía Đơng sử dụng thêm chủng Clostridium
với tên thương mại là Broilact và Aviguard sử dụng để phòng bệnh nhiễm
Salmonella ở gia cầm.
2.1.5. Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotics:
Các vi sinh vật dùng làm probiotics phải đảm bảo các đặc điểm sau:
- Khơng gây bệnh, khi sử dụng nó sẽ có tác động tốt đối với vật chủ
- Có khả năng tồn tại khi đi xun qua dạ dày ( dịch tiêu hố, dịch acid, dịch
mật)
- Có khả năng bám đính tốt trên niêm mạc ruột của đường tiêu hố vật chủ
- Sản xuất các kháng sinh chống lại các mầm bệnh: acid, bacteriocin, H2O2….
- Duy trì tốt khả năng sống trong q trình sản xuất, bảo quản và sử dụng
- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hố vật chủ
- Dễ ni cấy
- Kích thích hoạt động của gen kháng và sinh ra chất chống ung thư.
- Tăng cường khả năng hấp thụ lactose
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
11

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

- Giảm huyết áp của những người bị chứng cao huyết áp.
- Ngăn ngừa và giảm mức độ gây bệnh tiêu chảy
- On định cấu trúc gen trong q trình tạo chế phẩm
2.1.6. Ứng dụng của probiotics
2.1.6.1. Trong thực phẩm và dược phẩm
Trong cơ thể người tồn tại khoảng 1014 tế bào vi sinh vật với sự đa dạng của
các lồi, có khoảng 400 lồi. Các vi sinh vật tồn tại trong đường ruột tác động qua lại
giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột. Sự tồn tại của các vi sinh vật trong hệ tiêu hố
còn phụ thuộc vào chế độ dinh dưỡng trong cơ thể. Trong cơ thể ln tồn tại các vi
khuẩn cơ hội, khi gặp điểu kiện thuận lợi nó sẽ phát triển đủ số lượng và gây độc cho
cơ thể.
Vi khuẩn probiotics được rộng rãi trong các sản phẩm khác nhau trên khắp thế
giới, chúng được bổ sung vào thực phẩm, tạo ra các chế phẩm thuốc và bổ sung vào
thức ăn cho vật ni.
Thực phẩm probiotics là thực phẩm chứa các vi khuẩn sống có lợi và khơng
ảnh hưởng đến sức khỏe của con người. Chẳng hạn, trong các sản phẩm sữa lên men
bổ sung Lactobacillus acidophilus có thể giúp cho những người khơng có khả năng
hấp thu sữa có thể hấp thụ tốt hơn. Một số thực phẩm probiotics như là phomat, sữa
chua, kifer, dưa cải, giấm… [50]
Thực phẩm probiotics hiện nay được bán rất phổ biển ở Mỹ phần lớn là
yogurt. Yogurt được làm từ sữa kết hợp với các lồi Streptococcus thermophilus và
Lactobacillus acidophilus hoặc Lactobacillus bulgaricus. Sữa có nguồn gốc từ bò,

dê, cừu….
Kefir cũng là một sản phẩm lên men, có thể được làm từ nhiều nguồn gốc
khác nhau: sữa bò, sữa cừu, sữa dê. Ngồi ra có thể làm từ sữa đậu nành, sữa gạo và
nước dừa. Khi chọn được vi khuẩn probiotics thích hợp sẽ cấy vào sữa, những lồi
có thể dùng là Lactobacillus kefiri, một số chi Leuconostoc, Lactococcus
Thức uống probiotics được giới thiệu đầu tiên vào 2007 bởi New Food, được
khám phá bởi Steve Demos, đây là loại đồ uống chứa Lactobacillus plantarum 299v.
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
12

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

Ngồi ra còn nhiều sản phẩm lên men khác mang tính chất truyền thống: món
dưa cải bắp ở Đức, kim chi ở Hàn quốc, choucroute ở pháp[51]
Probiotics được sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh, hiện nay trên thị
trường ngồi các sản phẩm đa dạng về probiotics ở dạng thực phẩm, còn có các dạng
viên nén, dạng dịch, dạng bột dùng điều trị một số bệnh đường tiêu hóa:
- Tiêu chảy do kháng sinh: khoảng 20% người dùng thuốc kháng sinh, đặc
biệt là Clindamycine, Cephalosporine, Penicilline bị mắc bệnh tiêu chảy. Ngun
nhân là do kháng sinh sẽ giết các vi sinh vật đường ruột làm mất cân bằng hệ vi sinh
đường ruột. Clotridium difficle và Kelbsiela oxytoca là hai tác nhân gây bệnh chính,
khi hệ vi sinh đường ruột ổn định chúng vẫn tồn tại với số lượng ít trong ruột, khi
mất cân bằng thì chúng tăng lên nhanh và giải phóng độc tố là A và B gây bệnh tiêu
chảy và viêm ruột. Có nhiều nghiên cứu sử dụng probiotics để chữa bệnh tiêu chảy

do kháng sinh và kết quả cho thấy S. boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG,
Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt. Chúng làm giảm đáng kể thời gian phục
hồi khi mắc bệnh [39]. Một nghiên cứu sử dụng L. acidophilus để trị bệnh tiêu chảy
do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin, nghiên cứu này tiến hành trên 16 người,
một nữa cho sử dụng 125ml sữa chua chứa L. acidophilus mỗi ngày, nữa nhóm còn
lại cho sử dụng sữa chua khơng có L. acidophilus. Kết quả nghiên cứu, nhóm sử
dụng sữa chua có chứa L. acidophilus bệnh hồi phục trong 2 ngày, nhóm còn lại 8
ngày [27].
- Tiêu chảy cấp : Ngun nhân do rotavirus, chủ yếu ở trẻ em ở các nước
đang phát triển. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Lactobacillus. rhamnosus
GG, Bifidobacterium bifidum và Streptococcus thermophilus làm giảm lượng
rotavirus trong hệ tiêu hóa [39]. Một nghiên cứu điều trị tiêu chảy cấp tính trẻ em ở
châu Á, cho thấy rằng khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus GG có thể rút ngắn một
nữa thời gian chữa trị. Ở châu Âu, kết quả nghiên cứu sử dụng L. rhamnosus đã bị
bất hoạt bởi nhiệt cũng mang lại kết quả tương tự như L. rhamnosus sống [9] . Bin
và Boulloche đã thực hiện nghiên cứu sử dụng Lactocbacillus acidophilus để điều
trị tiêu chảy cấp ở trẻ em. Bin tiến hành nghiên cứu 50 trẻ en bị tiêu chảy cấp ở
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
13

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

Trung Quốc. Ơng lấy ngẫu nhiên 30 người điều trị bằng cách sử dụng L. acidophilus,
còn 20 bé còn lại thì điều trị bằng phương pháp bình thường. Kết quả cho thấy khơng

có sự khác biệt giữa hai cách chữa trị, thời gian khỏi bệnh của hai phương pháp chữa
bệnh là như nhau. Nghiên cứu của Boulloche et al ở 103 bé còn bú sữa mẹ và trẻ em
bị tiêu chảy cấp sử dụng L. acidophilus đã bất hoạt bằng cách sử dụng nhiệt. Kết quả
cũng cho thấy khơng có sự khác biệt giữa hai nhóm điều trị. Thời gian phục hồi bệnh
như nhau [27].
- Viêm đường tiêu hóa: do nhiều tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, vi rút, kí
sinh trùng nhưng ngun nhân chủ yếu là do nhiễm rotavirus và Helicobacter
pylori gây viêm lt và ung thư dạ dày. Chúng xâm nhập vào các tế bào ở đỉnh
nhung mao ruột, phá hủy nhung mao, làm mất khả năng hấp thụ các chất dinh
dưỡng. Do khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng kém, các chất cacbohydroxit tồn
động trong ruột, dẫn đến tiêu chảy và mất nứơc nghiêm trọng gây nguy hiểm cho
trẻ sơ sinh và trẻ dưới ba tuổi và trẻ suy dinh dưỡng [9].
- Ngừa ung thư: Một số thành viên của vi khuẩn đường ruột có khả năng tiết ra
các enzyme như glycosidase, azoreductase, nitroreductase và - glucoronidase,
chúng sẽ hoạt hóa các chất tiền ung thư thành các chất ung thư hoạt hóa. Những
nghiên cứu trên người sử dụng L. acidophilus hoặc Lactobacillus casei làm giảm
đáng kể hoạt động của các enzyme trên [36].
- Giảm cholesterol: Cholesterol là một chất béo steroid, có ở màng tế bào của
tất cả các mơ trong cơ thể, và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật.
Khi lượng cholesterol trong máu cao sẽ gây ra một số bệnh tim mạch như xơ vữa
động mạch, huyết áp tăng, bệnh lý ở hệ thống mạch vành như nhồi máu cơ tim, đột
quỵ. Trong cơ thể, cholesterol có 2 dạng mà y học gọi là LDL-C có trọng lượng phân
tử thấp (hay còn gọi là cholesterol có hại) và HDL-C có trọng lượng phân tử cao(hay
còn gọi là cholesterol có lợi). HDL vận chuyển cholesterol đến các cơ quan, vì vậy
nếu hàm lượng của HDL trong máu càng cao thì càng giảm nguy cơ mắc bệnh mạch
vành. Ngược lại LDL-C vận chuyển cholesterol từ cơ quan đến mạch máu cho nên
nếu nồng độ LDL-C trong máu cao là có nguy cơ mắc bệnh cao. LDL-C ln tạo ra
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
14

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

các mảng xơ vữa trên thành các động mạch nói chung và động mạch vành tim nói
riêng. Các mảng xơ vữa này làm cho lòng các động mạch vành bị chít hẹp hoặc có
thể bít tắc, từ đó gây nên tình trạng thiếu máu đến ni dưỡng tế bào cơ tim, gây ra
các cơn đau thắt ngực và nhồi máu cơ tim. Nghiên cứu của Gilliland SE, Nelson CR,
Maxwell C trong điều kiện in vitro vi khuẩn có thể làm giảm lượng colesterol trong
mơi trường ni cấy. Một nghiên cứu của Lin et al. về khả năng làm giảm cholesterol
trong máu của Lactobacillus bulgaricus và Lactobacillus acidophilus. Ơng tiến hành
trên 23 người cho sử dụng thuốc dạng viên nén chứa 3x107 CFU Lactobacillus
bulgaricus và Lactobacillus acidophilus trong 16 tuần, và 15 người khơng sử dụng
thuốc. Kết quả ở nhóm cho sử dụng thuốc thì hàm lượng cholesterol trong máu giảm
xuống từ 5.7 xuống 5.4 sau 16 tuần [27]. Nghiên cứu ở Ấn Độ, sử dụng sữa trâu lên
men bằng lồi L. acidophilus làm giảm lượng cholesterol trong máu 12 - 20% sau
một tháng sử dụng [27]. Hai nghiên cứu khác sử dụng E. faecium và S. thermophilus,
các nhà nghiên cứu tiến hành thử nghiệm trên 29 người đàn ơng, cho sử dụng sữa lên
men chứa 108 - 1011 cfu/ml E. faecium và S. thermophilus và 28 người đàn ơng sử
dụng sữa bình thường. Kết quả cho thấy hàm lượng cholesterol trong máu giảm 0.37
- 0.41 mmol/L sau 6 tuần sử dụng, nhóm sử dụng sữa bình thường thì hàm lượng
cholesterol khơng đổi. Sau đó tác giả tiến hành nghiên cứu lần hai ở phậm vi rộng
hơn, ơng tiến hành tương tự ở 87 người đàn ơng và phụ nữ kết quả cho thấy hàm
lượng cholesterol giảm nhiều sau 4 -12 tuần và thí nghiệm cuối cùng 24 tuần và 30
tuần thì thấy khơng có sự thay đổi nhiều. Ơng đưa ra kết luận E. faecium có khả năng
làm giảm Cholesterol trong máu nhanh [27].

- Tăng cường khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzyme khác:
Hiện tượng khơng có khả năng tiêu hóa lactose tìm thấy khắp trên thế giới do cơ thể
khơng có enzyme lactase thủy phân lactose. Enzyme này được giải phóng khi vi
khuẩn bị dung giải do tác dụng của acid mật [9]. Triệu chứng của bệnh thường gây
phìn bụng, đầy hơi, tiêu chảy. Theo kết quả nghiên cứu của Rasstal et al 2000 vi
khuẩn latobacii và bifidobacteria làm tăng enzyme lactase trong ruột non [17]. Ở

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
15

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

trẻ sơ sinh thường mắc chứng kém tiêu hóa đường saccarose, khắc phục bằng cách
cho uống saccharomycess cerevisiae, trong nấm men có chứa enzyme saccarase.
2.1.6.2. Nơng nghiệp
2.1.6.2.1. Ni trồng thủy hải sản.
UN FAO ước tính tới năm 2020 một nữa lượng thủy sản cung cấp cho tòan
thế giới sẽ được cung cấp nhờ ni trồng thủy sản do các nguồn cá khai thác tự nhiện
bị khai thác q mức. Ở Việt Nam ni trồng thủy sản cũng đang trên đà phát triển,
năm 2002 chính phủ đã quyết định thủy sản là ngành kinh tế ưu tiên, trong đó ni
tơm là ngành mũi nhọn nhằm tăng kinh ngạch xuất khẩu, chuyển đổi cơ cấu kinh tế
kém hiệu quả, giảm áp lực khai thác ven bờ, nâng cao việc sử dụng đất và tạo việc
làm cho người dân. Năm 2002 Việt Nam đã xuất khẩu trên 2 tỉ USD thủy sản, trong
đó tơm chiếm 50% đứng hàng thứ 5 trên thế giới. Hiện nay phổ biến nhất là ni tơm

sú và cá ba sa, tuy nhiên hiện nay ngành ni trồng thủy sản đang mắc phải khó khăn
chủ yếu là dịch bệnh do vi khuẩn, virút, nấm, ký sinh trùng gây ra. Khi phát hiện
bệnh nơng dân thường sử dụng kháng sinh đổ xuống hồ hoặc bổ sung thêm vào thức
ăn. Kháng sinh có thể điều trị tức thời đối với các vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên khi
sử dụng nhiều lần vi khuẩn sẽ trở nên kháng thuốc ( khó trị hơn), mặc khác khi sử
dụng thường xun sẽ để lại dư lượng kháng sinh trong tơm, cá ni gây ảnh hưởng
đến con người dẫn đến nguy cơ khó dùng kháng sinh trị bệnh cho con ngươi và
khơng thể nhập khẩu sang các nước khác gây thiệt hại lớn. Nhiều nơng dân sử dụng
kháng sinh như một tác nhân phòng bệnh ngay khi vật ni chưa phát bệnh.
Virút là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm, là mối đe dọa hàng
đầu đối với ngành ni trồng thủy sản. Hiện nay người ta phát hiện khoảng 20 virut
gây bệnh trên tơm, hầu hết là thành viên họ Pavoviridae, Baculoviridae,
Piconaviridae, Togaviridae cùng một số họ khác. Bệnh đầu vàng ở tơm được phát
hiện đầu tiên ở Thái vào 1990 tại một hồ ni tơm sú do Yellow Head Virus gây ra.
Bệnh đốm trắng do virut thuộc chủng Baculoviru được phát hiện đầu tiên tại Đài
Loan tỷ lệ chết rất cao có thể 100% sau 3 - 5 ngày nhiễm bệnh [8].

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
16

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

Vi khuẩn cũng là tác nhân gây bệnh nguy hiểm đặc biệt là Virio làm tơm chết
rất nhanh. Ngồi ra nấm và kí sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên tơm. Tơm

thường nhiễm nấm là lagenidium calinectes và Sirolpidium spp ở giai đọan ấu trùng
nên tỷ lệ chết rất cao. Kí sinh trùng là động vật ngun sinh có thể lây nhiễm tất cả
các giai đoạn phát triển của tơm như Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, anophrys,
Acineta ssp, Lagenophrys, Ephelota là các tác nhân kí sinh bên ngồi [8].
Ngồi u tố dịch bệnh Ngồi yếu tố dịch bệnh ơ nhiễm mơi trường ni
trồng cũng là vấn đề khó khăn. Với mục đích tăng sản lượng, người dân ni với mật
độ cao và khơng có biện pháp xử lý thích hợp gây hiện tượng thiếu oxy trong ao dẫn
đến tơm bị ngạt. Thức ăn dư thừa dẫn đến hiện tượng phú dưỡng hóa làm tảo phát
triển, các chất hữu cơ trong ao trích lũy ngày một tăng sẽ làm giảm lượng oxy hòa
tan. Lớp bùn lắng động lâu ngày tạo điều kiện cho các vi khuẩn kị khí phát triển sinh
khí H2S và CH4. Amoni tồn tại dưới dạng NH3 hoặc NH4+ tùy thuộc vào pH của mơi
trường. NH3 độc tính cao hơn NH4+ do NH3 khơng mang điện tích dễ thấm qua màng
tế bào mang cá và hòa tan tốt trong chất béo, NH4+ có kích thước lớn hơn, mang điện
và kết hợp với nước nên khó thấm qua tế bào mang cá. Khi nồng độ NH3 cao tơm sẽ
bị ngộ độc cấp tính và chết nhanh. Các hợp chất chứa nitơ dạng oxy hóa gồm nitrite
và nitrate khi vượt qua nồng độ 0.3mg/l sẽ gây ngộ độc cho tơm [9].
Cơ chế tác động của probiotics trong thủy sản: cạnh tranh vị trí gắn kết với vi
khuẩn, sản xuất ra các chất ức chế, cạnh tranh nguồn năng lượng, tăng cường khả
năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, nâng cao đáp ứng miễn dịch, can thiệp vào hệ
thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh, nâng cao chất lượng nước ao
Hiện nay có một số biện pháp khắc phục như dùng kháng sinh đổ trực tiếp hoặc
bổ sung vào thức ăn cho tơm, phương pháp này hiện nay khơng được chấp nhân. Ở
tơm hệ miễn dịch khơng đặc hiệu, nó khơng có khả năng ghi nhớ được các bệnh nên
sử dụng vacine một mặt khơng đạt được kết quả cao, mặc khác chi phí cao, tốn nhiều
thời gian. Do đó biện pháp tốt nhất là sử dụng probiotics trong phòng và chữa bệnh ở
tơm. Probiotics được dùng với nhiều hình thức như tiêm trực tiếp, bom vào đường
ruột, nhúng vào dung dịch probiotics, bổ sung vào thức ăn. Phương pháp hữu hiệu
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
17

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

nhất là nhúng tơm vào dung dich probiotics ( tơm ở giai đoạn ấu trung hoặc bổ sung
vào thức ăn hàng ngày cho tơm).
-

Vi khuẩn và nấm được sử dụng nhiều nhất có vai trò như probiotics.

Bacillus spp là vi khuẩn gram dương được sự dụng phổ biến trong cải tạo mơi trường
nước trong các ao ni, chúng chuyển hóa các chất hữu cơ thành CO2 và sinh khối,
giảm vi khuẩn gây bệnh trong ao [40]. Một nghin cứu của Watchariya Purivirojkul,
Nontawith Areechon, Prapansak Srisapoome v Monchan Maketon phân lập Bacillus
spp từ ruột của tơm gồm 3 chủng B. pumilus NW01, B. sphaericus NW02 và B.
subtilis NW03, sau đo sử dụng ba chủng trên kiểm tra khả năng kháng với V.
harveyi trong điều kiện in vitro với mật độ 102 CFU/ml, kết quả lượng vi khuẩn V.
harveyi từ mức 4.23x10 2 ở 0 giờ sau đó tăng 1.40±0.21 × 10 7 cfu/ml ở 24 giờ rồi
tiếp tục giảm 7.80±1.90 × 10 5 cfu/ml ở 120 giờ [31].
- Các vi khuẩn sinh acid lactic cũng được sử dụng rộng rãi, Gatesoupe(1991)
chứng minh được Lactobacillus giúp lồi cá bơn phát triển nhanh [48]. Một thí
nghiệm khả năng kháng của vi khuẩn dị dưỡng đường tiêu hóa của cá hồi và cá bơn
với tác nhân gây bệnh là A. samodicida, kết quả cho thấy vi khuẩn tạo vòng kháng
và bao phủ lên A. samodicida [48]. J Brunt and B Austin tiến hành thí nghiệm trên
cá hồi, ơng tiến hành phân lập vi khuẩn trong ruột cá hồi và test với hai chủng
Lactococcus garvieae 29-99 và Streptococcus iniae 00-318. Vi khuẩn được phân lập

trên mơi trường MRS và định danh bằng sinh hoc phân tử, tên là Aeromonas sobria
GC2. Khi tiến hành test hai Aeromonas sobria GC2 với Lactococcus garvieae 29-99
và Streptococcus iniae 00-318 kết quả cho thấy Aeromonas sobria GC2 có khả năng
kháng Lactococcus garvieae 29-99 và Streptococcus iniae 00-318 ( là hai chủng gây
bệnh chết ở cá hồi và được phân lập Viện Nghiên Cứu Thủy Sản ). Sau đó tiến hành
thực nghiệm, bổ sung thức ăn cá hồi bị bệnh với liều lượng 5x10-7 tế bào/ gam thức
ăn, kết quả thiệt hại 75% đến 100% khi khơng bổ sung probiotics vào thức ăn, nhóm
điều trị thì thiệt hại từ 0- 6% [13]. Một nghiên cứu về khả năng sống sót của tơm
Litopenaeus vannamei sau khi bị nhiễm Virio harveyi, tác giả phân lập vi khuẩn
lactic từ ruột tơm trưởng thành tại trường đại học Santa Catarina, Brazil, chọn các
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
18

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

khuẩn lạc hình cầu và xác định hình thái bằng phương pháp nhuộm gram. Các vi
khuẩn phân lập được trãi trên mơi trường MRS ủ 24h và 350C, sau đó đục lỗ thạch
đường kính 1cm, V. harveyi được trãi trên mơi trường Marine Agar, đặt thạch lên ủ
cùng mơi trường Marine Agar ủ 24h ở 300C. Kết quả cho thấy vòng kháng của hai
chủng C2 và B6 có vòng phân giải lớn nhất là 8.0 ± 0.5mm và 6.0 ± 0.6 [13].Theo
nghiên cứu của Lara-Flores et al. (2003), ơng sử dụng hai chủng probiotics là nấm (
Saccharomyces cerevisiae) bổ sung vào thức ăn cho cá bột Nile tilapia (Oreochromis
niloticus), kết quả nghiên cứu giảm tỷ lệ chết ở cá bột, cá tăng trưởng nhanh hơn
[15].

2.1.6.2.2. Chăn ni.
Sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã cải biến di truyền tăng năng
suất gia cầm. Khi điều này là tốt cho ngành chăn ni gia cầm, con người bắt đầu
tăng mật độ ni, làm tăng nguy cơ nhiễm các bệnh nguy hiễm cho vật ni, đặc biệt
là vi khuẩn như E. coli, Salmone spp, Clostridium perfringens và Campylobacter
spp. Một thời gian rất dài con người đã sử kháng sinh trong điều trị các loại bệnh
này. Nhiều quốc gia đã nghiêm cấm sử dụng kháng sinh bởi vì chúng sẽ tạo ra các vi
khuẩn kháng thuốc sẽ khó chữa trị cho con người hơn khi bị nhiễm. Do đó một biện
pháp thay thế tốt nhất và kinh tế nhất là sử dụng các chế phẩm probiotics bổ sung
vào thức ăn trong chăn ni.
Probiotics được sử dụng trị các bệnh rối loạn hệ vi sinh đường ruột và tăng
khả năng thẩm thấu của ruột. Trong hệ tiêu hóa vi khuẩn di chuyển qua dạ dày đến
ruột non và bám chặt vào biểu mơ, chúng giúp tăng tốc độ phát triển và khả năng
chuyển hóa thức ăn ở heo, gà và thú con. Probiotics giúp trung hòa lượng độc tố
trong ruột do E. coli gây ra ( đây là vi khuẩn gây bệnh chủ yếu ở heo).
Vi khuẩn probiotics cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh như
Clostridium perfringens, giảm khả năng hoạt động của vi khuẩn phân hủy urê, tổng
hợp vitamin, kích thích hệ thống miễn dịch, duy trì hệ vi sinh đường ruột, hòan thiện
hệ tiêu hóa [43].

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
19

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

Những sản phẩm probiotics đã được biệt đến rất nhiều qua các sản phẩm sữa
lên men và sản phẩm bơ sữa. Các sản phẩm probiotics được ứng dụng trong chăn
ni ở các nộng trại chỉ được giới thiệu cách nay khoảng hai thập niên với mong đợi
là giúp nâng cao hệ thống miễn dịch chống lại các tác nhân gây bệnh. Việc sử dụng
probiotics đã được quan tâm rất nhiều đặc biệt ở các quốc gia phát triển như châu Âu
đã ngăn cấm sử dụng kháng sinh ngăn ngừa và trị bệnh cho động vật ni [43].
Gia cầm: Sản xuất gia cầm thu lãi rất cao, do lợi nhuận mà các chủ trang trại
khơng quan tâm đến sức khỏe con người mà sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi,
do đó việc cấm sử dụng thưốc kháng sinh ở châu Âu vào ngày 1 tháng 1 năm 2006 ở
các trang trại chăng ni gia cầm đã được ban hành. Một trong những thành cơng
của chế phẩm probiotics sử dụng trong chăn ni gia cầm là Bacillus subtilis với tên
thương mại là CloSTATM. Chế phẩm này giúp hồn thiện khả năng phát triển của vật
ni. B. subtilis còn được biết đến có khả năng ngăn cản sự phát triển của các vi
khuẩn gây bệnh trong hệ tiêu hóa của gà. B. subtilis PB6, Streptococcus pneumonia
đã được chứng minh rằng có khả năng giết Clostridium perfringens, Campylobacter
jejuni,. Các chế phẫm của B. subtilis thường được bảo quản ở các dạng viên nén.
Các chế phẩm probiotics có thể chỉ chứa một lồi như Enterococcus faecium với tên
thương mại là Protexin® , nhưng đồng thời cũng có thể là sự kết hợp của nhiều lồi
thuộc các chi như Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus. Cơ chế bảo vệ của
probiotics ở gia cầm chủ yếu cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh. Sự
bám dính của vi khuẩn probiotics trên ruột của gia cầm là một trong những đặc điểm
quan trọng cho việc tuyển chọn các vi khuẩn probiotics. Các nghiên cứu được biết
đến rộng rãi như vi khuẩn latic, B. subtilis, Enterocuccus faecium là những lồi có
sức sống tốt nhất trong hệ tiêu hóa của động vật. Nhiều tác động có lợi của probiotics
như hồn thiện hệ thống miễn dịch, hòan thiện hệ vi sinh đường ruột, giảm các tác
nhân gây viêm, giảm lượng amoniac và urê thải ra, giảm lượng cholesterol, tăng khả
năng bám dính. Hiện nay có nhiều nghiên cứu xa hơn sử dụng probiotics nâng cao
khả năng phát triển và tăng chất lượng trứng gà [43]. Salmonella là tác nhân chính
gây bệnh thương hàn, phó thương hàn, bạch lỵ ở gia cầm, chúng thừơng tồn tại trong

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
20

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

đường tiêu hóa của gà và có thể gây bệnh cho con người qua thức ăn. Nghiên cứu
của J. Vicente, S. Higgins, L. Bielke, G. Tellez,D. Donoghue, A. Donoghue, and B.
Hargis ở gà tây bị nhiễm salmonela, tiến hành hai thí nghiệm với bảy lồi, chia làm
hai nhóm: nhóm thứ nhất năm lồi: :Escherichia coli, Kluyvera ascorbata, Klebsiella
travesanii, Lactobacillus casei, và Lactobacillu cellobiosus, nhóm thứ hai hai lồi: L.
casei và L. cellobiosus. Ơ thí nghiệm thứ nhất sử dụng probiotics ở mật độ 108 và
106 đồng thời kết hợp với phun acid hữu cơ. Kết quả cho thấy sử dụng probiotics ở
nồng mật độ cao(108) thì salmonella giảm tới 90%. Trong khi đó khi xử lý với mật
độ probiotics thấp( 106) có sự kết hợp với xử lý với acid hữu cơ thì hiệu quả xử lý
đến 100%, khơng còn sự xuất hiện của Salmonella. Ơ thí nghiệm thứ hai chỉ sử dụng
probiotics riêng lẻ với mật độ tương tự thí nghiệm thứ nhất hoặc sử dụng acid hữu
cơ. Kết quả thí nghiệm đạt kết quả khơng cao, chỉ đạt từ 75 - 85% [41]. Do đó việc
vệ sinh chuồng trại cũng khơng kém phần quan trọng trong chăn ni.
Heo: Heo ở giai đoạn cho bú, rất dễ bị xâm nhiễm bởi các vi khuẩn gây bệnh
do hệ vi sinh vật đường tiêu hóa của heo chua hồn chỉnh, do đó việc sử dụng kháng
sinh trong trị bệnh và phòng bệnh heo con rất phổ biến, tuy nhiên việc sử dụng kháng
sinh lại ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Cấm sử dụng thuốc kháng sinh trong
chữa bệnh hoặc đưa ra những quy định nghiêm ngặc trong sử sụng kháng sinh để trị
bệnh cho động vật ni ở châu Âu đã được ban hành. Sử dụng probiotics giúp hồn

thiện sự phát triển và tăng khả năng kháng các vi sinh vật gây bệnh ở heo đã được
nghiên cứu rộng rãi và khuyến khích sử dụng. Kế hoạch HEALTHYPIGUT của EU
đề ra vào giữa 2001 và 2004, trong nghiên cứu này có sự kết hợp giữa nấm và
Pediococccus acidilactici bổ sung vào trong chế độ ăn của heo con, kết quả giúp
hòan thiện chức năng mơ cơ trong hệ tiêu hóa heo con [43]. Baird (1977) đã nghiên
cứu thành cơng bổ sung lactobacillus vào thức ăn giúp tăng trọng lượng trung bình
của heo, tương tự Pollman (1986) cũng đã thành cơng trong nghiên cứu của mình
giúp tăng trọng lượng heo bằng bổ sung lactobacillus [16].
Động vật nhai lại: Trong dạ cỏ của động vật nhai lại xảy ra q trình phân
hủy cabohydrat và protein. Trong dạ cỏ pH từ 5.8 - 6.5, thiếu oxy, đây là điều kiện
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
21

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

thuận lợi cho động vật ngun sinh, vi khuẩn kị khí và nấm. Một trong những ứng
dụng sớm nhất của probiotics trong xử lý tăng acid trong dạ cỏ động vật nhai lại
bằng nấm. Tăng acid trong dạ cỏ là do sản xuất thừa lượng acid hữu cơ dễ bay hơi
như acid probionic, acetates trong thức ăn của chúng. Nếu khơng chữa trị dẫn đến
giảm sự ngon miệng, tiêu chảy, giảm thành phần chất béo trong sữa. Do đó việc bổ
sung nấm vào trong thức ăn sẽ làm giảm vấn đề tăng acid trong dạ dày, tạo điều kiện
cho các vi khuẩn phân hủy cellulose phát triển, hòan thiện hệ tiêu hóa [43].
Một phần sử sụng nấm để giảm bớt hàm lượng acid trong dạ cỏ, ngồi ra còn
sử sụng vi khuẩn cũng được sử dụng với nhiều thành cơng từ những năm 1970 làm

tăng khả năng sản xuất sữa và trọng lượng, hồn thiện sức khỏe và tăng khả năng
kháng bệnh
Trong dạ cỏ của động vật nhai lại khi trưởng thành sẽ chứa một lượng lớn các
vi khuẫn, nấm, chúng có khả năng ngăn cản sự xâm nhập các vi sinh vật bênh ngồi.
Hệ vi sinh vật trong ruột non và ruột già của những động vật nhai lại còn non thì
vắng mặt các động vật ngun sinh, và sự rối loạn hệ tiêu hóa ở thú con có thể sử
dụng probiotics để chữa trị. Hệ vi sinh dạ cỏ của thú con ban đầu chủ yếu là vi khuẩn
cellulose và vi khuẩn lên men metan và vi khuẩn lên men lactate và mật độ vi khuẩn
lên men lactate sẽ giảm dần đến tuần thứ 13, sau đó hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của bê
sẽ giống với hệ vi sinh của các động vật nhai lại trưởng thành. Động vật ngun sinh
cũng được tìm thấy trong dạ cỏ sau tuần thứ 13.
Mục đích chủ yếu của việc sử dụng thức ăn bổ sung probiotics là giảm bớt tỷ
lệ chết và những ngun nhân gây chết với bệnh đường tiêu hóa và hơ hấp. Sử dụng
S. cerevisiae và A. oryzae được sử dụng trộn lẫn vơi nhau trong thức ăn làm tăng
lượng sữa tiết ra ở bò cái. Một số nghiên cứu sử dụng probiotics bổ sung vào thức ăn
làm tăng lượng chất khơ, năng suất sữa và một số thành phần quan trọng trong sữa.
Tuy nhiên một khuynh hướng tốt để hòan thiện khả năng phát triển và tiết nhiều sữa
bằng cách kết hợp giữa probiotics và prebiotic, chẳng hạn kết hợp giữa các vi khuẩn
lactic và mannanoligosaccharide ở bò [43].
2.2. Cơng nghệ sản xuất chế phẩm probiotics:
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
22

Trang


Đồ án tốt nghiệp
Hương

GVHD: TS. Nguyễn Hoài

Hiện nay probiotics được ứng dụng và nghiên cứu rộng khắp thế giới. Chế
phẩm probiotics rất đa dạng và dần dần thay thế phương pháp trị liệu các bệnh đừơng
tiêu hóa bằng kháng sinh, nâng cao hệ thống miễn dịch, của người và động vật ni,
giúp vật ni tăng trưởng nhanh và tăng cao chất lượng sản phẩm.
Một chế phẩm probiotics với tên “YEASTURE-W” chứa chủng nấm Saccharomyces
cerevisae do cơng ty “Cenzone” của Mỹ sản xuất , được sử dụng cho gia cầm, giúp
gia cầm tăng trọng nhanh và tăng chất lượng thịt [23].
All - Lac Denka là chế phẩm probiotics do cơng ty denka Pharmaceutial Nhật
bản sản xuất, chứa hai chủng Lactobacillus acidophilus và Enterococcus faecium
chứa 5x109 cfu/g [33].
Health Plus First Probiotics 90 Vcapsules đây là probiotics cung cấp cho trẻ
em, chứa 40 tỷ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, sử dụng bổ sung vào thức ăn cho
trẻ. Giúp trẻ duy trì cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tăng khả năng hấp thụ thức ăn…
[54].
Hiện nay trên thị trường Việt Nam cũng xuất hiên nhiều sản phẩm dạng
probiotics như sản phẩm Probio thuốc dạng đơng khơ chứa khoảng 1 tỷ tế bào
Lactobacillus acidophilus trị một số bệnh đường ruột. Sản phẩm do cơng ty dược
phẩm IMEXPHARM sản xuất.
Một nghiên cứu rất thành cơng của TS. Võ Thị Hạnh sản xuất hai chế phẩm
Probiotics Bio I và Probiotics Bio II. Bio I sử dụng cho gia súc, gia cầm, kích thích
tiêu hóa cho, tăng trọng, giảm tiêu tốn thức ăn, ức chế các vi khuẩn gây bệnh trong
đường ruột, phòng trị các chứng rối loạn tiêu hóa, các chứng tiêu chảy do sử dụng
kháng sinh lâu dài, nâng cao sự hấp thu các chất dinh dưỡng. Chế phẩm Bio II sử
dụng trong ni trồng thủy sản, góp phân hủy những thức ăn thừa và các khí thải ở
đáy ao, ổn định pH và màu nước ao, kìm hãm sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây
bệnh cho tơm, cá như các vi khuẩn Vibrio spp, tăng năng suất ni trồng.
Quy trình sản xuất chế phẩm Probiotics rất phức tạp và trãi qua nhiều giai đọan, sơ
đồ tổng qt như sau:

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân
23

Trang