báo cáo thực tập knvsv

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
֎֎֎
KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HỌ VÀ TÊN: MAI
LỚP: 15CSH
MSSV: 1518246

I.

ĐỊNH
ĐỂM
1. Quá

Cho dung
trước đến khi được
Bóp nhừ thịt trong
dịch đến bậc 3 và
trống, vô trùng,
đĩa tương tự như

BÁO
CÁO KẾT
QUẢ
THỰC
TẬP
KIỂM
NGHIỆM
VI SINH
VẬT

TRONG
THỰC
PHẨM

HUỲNH XUÂN TRÚC

LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS (PHƯƠNG PHÁP
KHUẨN
LẠC)
trình thực hiện
dịch pha loãng vào 10g mẫu thịt xay đã chuẩn bị
100g. Ta được dung dịch pha loãng bậc 1 của mẫu.
dung dịch để đồng nhất chúng. Pha loãng dung
bậc 4, ở mỗi bậc pha loãng, cấy vào 2 đĩa petri
mỗi đĩa 1ml dung dịch. Cấy 1ml canh khuẩn vào 1
mẫu để làm đối chứng. Sau đó, đổ dung dịch VRB


đã được đun tan và làm nguội tới 45 oC vào 2/3 đĩa petri và xoay tròn cho đều. Chờ VRB đông đặc, kế đến
đổ thêm một lớp mỏng VRB trên bề mặt đĩa. Chờ VRB đông đặc, lật ngược đĩa petri và gói đĩa petri mang
đi ủ ở nhiệt độ 37.0 ± 0.5oC trong 24 tiếng.
Sau khi ủ, quan sát đĩa petri và chọn đếm những khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, quầng tủa
muối mật và đường kính ≥0.5mm. Ghi nhận lại số lượng đã đếm được. chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng với
kích cỡ và hình dạng khác nhau cấy sang môi trường BGBL. Tiếp tục ủ ở nhiệt độ 37.0 ± 0.5oC trong 24
tiếng.
Quan sát ống nghiệm sau khi ủ để xác định tỉ lệ xác nhận R.
2. Kết quả nhận được
Ở môi trường VRB sau khi ủ xuất hiện những khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa
muối mật.
Ở môi trường BGBL sau khi ủ, miệng ống nghiệm xuất hiện những bọt khí.

3. Xử lý quan trắc
Môi trường VRB có thành phần Neutral Red do đó khi Coliforms lên men lactose tạo axit sẽ tạo
môi trường axit làm cho khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm. Đồng thời axit tạo ra tác dụng với muối có
trong môi trường tạo tủa muối mật.
BGBL là môi trường lỏng, tăng sinh chọn lọc Coliforms. Do Coliforms có khả năng sinh hơi và lên men
lactose nên trên bề mặt môi trường BGBL có xuất hiện những bọt khí.
4. Đánh giá nhận xét
•

Tỉ lệ xác nhận R:

R= =
•

Tổng số Coliforms (CFU/g) (C)

C == = 1.105 (CFU/g)
 Có 1.105 (CFU/g) Coliforms trong 1g mẫu
II.
QUY
TRÌNH
ĐỊNH
1. Quá trình thực hiện

TÍNH

E.

coli

GIẢ

ĐỊNH

Cho dung dịch pha loãng vào 10g mẫu thịt xay đã chuẩn bị trước đến khi được 100g. Ta được
dung dịch pha loãng bậc 1 của mẫu. Bóp nhừ thịt trong dung dịch để đồng nhất chúng. Hút 10ml dung
dịch mẫu pha loãng bậc 1 sang môi trường LSB đôi. Hút 1ml dung dịch mẫu E. coli giả định vào môi
trường LSB đơn để làm đối chứng. Ủ 2 ống nghiệm ở nhiệt độ 37.0 ± 0.5oC trong 24 tiếng.
Quan sát ống nghiệm sau khi ủ. Chọn ống có sinh hơi tiếp tục cấy sang 10ml môi trường EC
Broth. Tiếp tục ủ ở nhiệt độ 44.0 ± 0.5oC trong 24 tiếng. Nếu ống nghiệm mẫu không sinh hơi, mẫu được
coi là âm tính E. coli.
Quan sát ống nghiệm sau khi ủ. Chọn ống có sinh hơi tiếp tục cấy sang 5ml môi trường canh
trypton. Tiếp tục ủ ở nhiệt độ 44.0 ± 0.5oC trong 24 tiếng. Nếu ống nghiệm mẫu không sinh hơi, mẫu
được coi là âm tính E. coli.
Ống nghiệm sau khi ủ mang đi thử nghiệm phản ứng indol, ghi nhận kết quả.


2. Kết quả nhận được
Sau khi ủ trong môi trường LSB, cả hai ống đều có hiện tượng quẩn đục, bề mặt ống có bọt khí
và sinh hơi trong chuông durham.
Sau khi ủ trong môi trường EC Broth, cả hai ống đều có trở nên đục, bề mặt ống có bọt khí và
sinh hơi trong chuông durham.
Sau khi ủ trong môi trường Canh Trypton, cả hai ống đều đục hơn. Khi thử phản ứng indol với
thuốc thử kovac thì thấy bề mặt của chất lỏng trong ống chuyển sang đỏ.
3. Xử lý quan trắc
LSB là môi trường tăng sinh chọn lọc Coliforms, do đó quẩn đục trong ống nghiệm là Coliforms
đã được tăng sinh. Coliforms cũng có khả năng sinh hơi nên bọt khí trên bề mặt và trong chuông durham
là do Coliforms sinh ra.
EC Broth là môi trường tăng sinh chọn lọc khẳng định lại dòng vi sinh vật đã tăng sinh từ LSB.Ủ ở
44 C để chọn lọc lại E. coli giả định. E. coli giả định có khả năng sinh hơi nên bọt khí trên bề mặt và trong

chuông durham là do E. coli giả định sinh ra.
o

Môi trường canh trypton là môi trường nuôi E. coli giả định có chứa tryptophan. E. coli giả định
oxy hóa tryptophan tạo hợp chất indol. Thuốc thử Kovac’s có chứa p-dimethyaminobanzaldehyde phản
ứng với indol tạo thành phức hợp có màu đỏ.
4. Đánh giá nhận xét
Phát hiện E. coli giả định trong 1g mẫu
III.

QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S. aureus
1. Quá trình thực hiện

Cho dung dịch pha loãng vào 10g mẫu thịt xay đã chuẩn bị trước đến khi được 100g. Ta được
dung dịch pha loãng bậc 1 của mẫu. Bóp nhừ thịt trong dung dịch để đảm bảo dung dịch đồng nhất. Pha
loãng dung dịch đến bậc 3. Cấy 0.1ml dung dịch mẫu pha loãng bậc 3 lên bề mặt 2 đĩa môi trường BPA,
trải đều bằng que trải tam giác sau đó ủ ngược đĩa ở nhiệt độ 37.0 ± 0.5oC trong 48 tiếng. Dùng que cấy
lấy sinh khối từ mẫu S. aureus đối chứng ria vào đĩa petri có môi trường BPA để làm đối chứng. Ủ ở nhiệt
độ 37.0 ± 0.5oC trong 48 tiếng
Sau khi ủ, quan sát đĩa petri và chọn đếm những khuẩn lạc đặc trưng (tròn, lồi, đen bóng, có
quầng sáng hoặc quần trong hoặc cả 2). Sau đó cấy khuẩn lạc đặc trưng sang môi trường TSA. Ủ ống
nghiệm ở nhiệt độ 37.0 ± 0.5oC qua đêm.
Sau khi ủ, cấy chuyển vào ống chứa 0.3ml huyết tương. ủ ở nhiệt độ 37.0 ± 0.5oC và theo dõi sau
3h, 5h. Quan sát hiện tượng. Thu nhận kết quả.
2. Kết quả nhận được
Sau khi ủ trong môi trường BPA, thấy xuất hiện những khuẩn lạc có màu đen bóng, tròn, lồi có
quầng sáng hoặc quầng trong bao quanh hoặc chỉ có màu đen.
Sau khi ủ trong môi trường TSA, khuẩn lạc tăng sinh thành những vệt trắng.
Sau 3h, 5h khi ủ trong ống nghiệm có huyết tương, không có hiện tượng đông tụ hoặc đông rất
ít.

3. Xử lý quan trắc
Môi trường BPA tăng sinh chọn lọc S. aureus. Khuẩn lạc S. aureus có màu đen do khử telurite
thành telurium, dạng lồi và tạo vòng trong xung quanh khuẩn lạc, do sự thủy phân protein. Sau đó có thể
xuất hiện 1 vòng đục ở trong vòng trong có tác động của lecithinase.
S. aureus tạo ra coagulase kết hợp với các cấu tử trong huyết tương thành từng khối hay từng
cục. Sau khi ủ qua các mốc thời gian mà ống nghiệm chỉ đông tụ rất ít hoặc không thấy hiện tượng đông
tụ cho thấy trong mẫu không có hoặc có với số lượng không đáng kể S. aureus.
4. Đánh giá nhận xét
•

Tỉ lệ xác nhận R:

R= = =0
•

Tổng số Coliforms (cfu/g) (C)

S = R = 0 (CFU/g)
 Có 0 (CFU/g) S. aureus trong 1g mẫu
IV.
QUY
TRÌNH
1. Quá trình thực hiện

ĐỊNH

TÍNH

Salmonella.

Cho dung dịch BPW vào 25g mẫu thịt xay đã chuẩn bị trước đến khi được 250g. Ta được dung
dịch pha loãng bậc 1 của mẫu. Bóp nhừ thịt trong dung dịch để đảm bảo dung dịch đồng nhất. Dùng que
cấy lấy sinh khối từ mẫu Salmonella đối chứng cấy vào ống nghiệm chứa môi trường BPW để làm đối
chứng.Ủ ở nhiệt độ 37.0 ± 0.5oC trong 24 tiếng.
Hút 0.1ml canh khuẩn trong mẫu và trong ống đối chứng sang ống môi trường RV rồi ủ ở 42 ±
0.2 C trong 24 tiếng.
o

Sau khi ủ, cấy phân lập mẫu và đối chứng sang môi trường XLS và Ủ ở nhiệt độ 37.0 ± 0.5oC trong
24 tiếng.
Quan sát đĩa XLD, chọn khuẩn lạc đặc trưng ( trong suốt, có hay không có tâm đen) cấy sang môi
trường 5ml BHI. Ủ ở nhiệt độ 37.0 ± 0.5oC trong 4-6 tiếng. Cấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh
hóa KIA, Manitol Phenol Red Broth, Urea Broth, LSB, Canh Trypton. Ủ ở nhiệt độ 37.0 ± 0.5oC trong 24
tiếng.
Quan sát hiện tượng và thu nhận kết quả.
2. Kết quả nhận được
Sau khi ủ trong môi trường RV, cả hai ống nghiệm đều trở nên đục, ống đối chứng đục hơn .
Sau khi ủ trong môi trường XLD, đĩa petri đối chứng có màu hồng, đĩa petri mẫu màu vàng có vài
chỗ loang hồng. Cả 2 đĩa đều có những khuẩn lạc có tâm đen, những khuẩn lạc trong suốt, hoặc trắng
đục.
Sau khi ủ ở môi trường BHI, cả 2 ống nghiệm đều đục hơn ban đầu.
Sau khi ủ trong các môi trường sinh hóa, có các hiện tượng:
+

Môi trường LDC: cả hai ống đều có màu tím thẫm (khác màu tím ban đầu). (+)


+

+
+
+

Môi trường MPRB: cả hai ống đều chuyển sang màu vàng. (+)
Môi trường Urea Broth: cả 2 ống đục hơn ban đầu. (-)
Môi trường Canh Trypton: cả 2 ống đục hơn ban đầu, khi thử phản ứng indol bằng thuốc thử thì
không có hiện tượng. (-)
Môi trường KIA: ống đối chứng ở phần thạch đứng có màu đen, đáy ống hơi vàng, phần thạch
nghiêng có màu đỏ, có khuẩn lạc tròn trong trên bề mặt thạch nghiêng, phần thạch có những
chỗ sinh hơi. Ống mẫu phần thạc đứng có màu vàng, thạch nghiêng có màu đỏ, có khuẩn lạc
tròn, trong trên bề mặt thạch nghiêng, phần thạch có những chỗ sinh hơi
4. Xử lý quan trắc
Môi trườg BPW giúp sự tăng sinh phục hồi của các vi sinh vật thuộc họ Salmonella có trong mẫu.

Trong môi trường RV, ống nghiệm đục hơn do vi sinh vật tăng sinh làm đục môi trường. RV làm
ức chế sự tăng sinh của các vi sinh vật Salmonella không có khả năng tạo khuẩn lạc có tâm đen.
Trong môi trường BHI, ống nghiệm đục hơn do vi sinh vật tăng sinh làm đục môi trường.
Trong môi trường LDC, enzyme lisine decarboxylase trong Salmonella khử nhóm carboxyl, tạo
NH3 làm kiềm hóa môi trường kết hợp với thuốc thử Bromocecil purple giữ nguyên môi trường màu tím.
Môi trường Manitol ban đầu có màu đỏ, thành phần môi trường này có chứa phenol red,
Salmonella có khả năng lên men đường manitol có trong môi trường tạo acid làm giảm pH của môi
trường làm phenol red trong môi trường chuyển sang màu vàng.
Môi trường Urea Broth có chứa urea và phenol red, tuy nhiên Salmonella không có khả năng
thủy giải urea tạo được NH3 làm kiềm hóa môi trường, pH không đổi nên môi trường không đổi màu.
Môi trường Canh Trypton có chứa nhiều tryptonphan, tuy nhiên Salmonella không có khả năng
tách amin từ tryptophan do đó âm tính với thuốc thử indol, không sinh phức màu đỏ.
Môi trường KIA có chứa pepton, phenol red và rất ít lượng glucose và lactose. Salmonella sau khi
lên men hết lượng glucose trên bề mặt thì chuyển sang sử dụng pepton trong môi trường tạo NH 3 làm
môi trường kiềm hóa, pH tăng nên bề mặt thạch có màu đỏ. Ở phần thạch đứng, glucose được lên men

kị khí tạo acid hữu cơ làm acid hóa môi trường do đó cho phần thạch đứng có màu vàng đồng thời tạo
bọt khí trong ống thạch gây hiện tượng nứt thạch. Phần thạch đứng không có tủa đen chứng tỏ vi sinh
vật này không sinh H2S để tác dụng với ion Fe2+ có trong môi trường tạo FeS.
4. Đánh giá nhận xét
Không phát hiện Salmonella trong 25g mẫu.