Phân lập agrobacterium rhizogenes và nghiên cứu ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp vinca alkaloid của rễ tơ cây dừa cạn (catharanthus roseus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN NHƯ NHỨT

PHÂN LẬP Agrobacterium rhizogenes
VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG
LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
Vinca ALKALOID CỦA RỄ TƠ
CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus)

Ngành: Sinh học
Mã số ngành: 62 42 30 15

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2018


Công trình đƣợc hoàn thành tại:
- PTN Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tƣờng tỉnh Bình Dƣơng.
- PTN LabB, Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật và Chuyển hóa thứ
cấp, trƣờng ĐH KHTN – ĐHQG.HCM.
- TT Sâm và dƣợc liệu, trƣờng ĐH Y dƣợc Tp.HCM.

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. BÙI VĂN LỆ
Phản biện 1: PGS. TS. DƢƠNG TẤN NHỰT
Phản biện 2: PGS. TS. LÊ THỊ THỦY TIÊN
Phản biện 3: TS. PHAN TƢỜNG LỘC
Phản biện độc lập 1: PGS. TS. DƢƠNG TẤN NHỰT
Phản biện độc lập 2: TS. PHAN TƢỜNG LỘC

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Cơ sở đào tạo
họp tại Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG.HCM,
vào hồi …. giờ …. ngày ….. tháng ….. năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện:
1.

Thƣ viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM

2.

Thƣ viện trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQG.HCM


CHƢƠNG MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Nuôi cấy rễ tơ được chuyển gen bằng Agrobacterium rhizogenes là kỹ
thuật đang được sử dụng phổ biến nhằm thay thế cho kỹ thuật nuôi cấy sẹo
và nuôi cấy huyền phù cho nhiều loài thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp
(Doran, 2013). Kỹ thuật này cũng đã được áp dụng trên cây Dừa cạn cho
các mục đích chất thứ cấp từ những năm 1980. Tuy nhiên không may mắn
khi hầu hết các dòng rễ tơ cây Dừa cạn có tốc độ tăng trưởng thấp (Peebles,
2008). Mặc dù vậy, cho đến nay các nghiên cứu không ngừng được thực
hiện nhằm tìm ra dòng rễ tơ có khả năng tổng hợp hợp chất đích mong
muốn. Gần đây, Hanafy và cộng sự (2016) cũng đã tiến hành nghiên cứu
cảm ứng tạo rễ tơ cây Dừa cạn bằng chủng A. rhizogenes K599. Cơ sở để
các các nhà khoa học tin tưởng tiếp tục nghiên cứu là do đặc điểm chuyển
gen của A. rhizogenes là quá trình chèn các gen trên plasmid Ri của nó vào
vị trí ngẫu nhiên trên bộ gen của tế bào thực vật dẫn đến các dòng rễ tơ thu

được sẽ có đặc điểm tăng trưởng khác nhau (Chandra và cộng sự, 2013).
Cũng chính vì lý do đó mà việc nghiên cứu sản xuất được nhiều dòng rễ tơ
khác nhau và sau đó là sàng lọc được dòng rễ tơ mong muốn gặp nhiều khó
khăn và tốn nhiều thời gian. Mặt khác, cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu
trên rễ tơ cây Dừa cạn vẫn còn hạn chế khi chỉ vận dụng vài chủng A.
rhizogenes nhất định. Trong khi đó, loài vi khuẩn này phổ biến rộng rãi
trong đất (Wang, 2006; Murugesan và cộng sự, 2010). Do đó, việc khai
thác các chủng A. rhizogenes hoang dại được phân lập từ đất sẽ mang đến
cơ hội thu được nhiều dòng rễ tơ mới từ cây Dừa cạn cũng như tiềm năng
chọn lọc được dòng rễ tơ thích hợp cho các nghiên cứu có liên quan.

-1-


Mục tiêu
Phân lập các chủng A. rhizogenes có trong tự nhiên và đánh giá ảnh
hưởng của các chủng A. rhizogenes thu được lên khả năng sinh tổng hợp
Vinca alkaloid của cây Dừa cạn thông qua gây nhiễm trực tiếp lên cây in
vivo như yếu tố ngoại sinh và thông qua rễ tơ được cảm ứng bằng A.
rhizogenes như yếu tố nội sinh.
Ý nghĩa khoa học
Luận án nhằm ghi nhận sự hiện diện của A. rhizogenes trong đất vùng rễ
của một số cây trồng ở Việt Nam và khả năng chuyển gen cảm ứng tạo rễ
tơ của chúng trên cây Dừa cạn cũng như ảnh hưởng của chúng lên khả năng
sinh tổng alkaloid của cây Dừa cạn và rễ tơ.
Ý nghĩa thực tiễn
Luận án góp phần thu thập được A. rhizogenes bản địa làm công cụ cho
các nghiên cứu chuyển gen vào tế bào thực vật. Ngoài ra, kết quả của luận
án giúp sản xuất được nhiều dòng rễ tơ khác nhau từ cây Dừa cạn phục vụ
cho các nghiên cứu sau này hướng đến sản xuất Vinca alkaloid.

Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập A. rhizogenes từ mẫu đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt
Nam có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn.
2. Sàng lọc chủng A. rhizogenes có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ cao ở
cây Dừa cạn và nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp để cảm ứng
cho chủng vi khuẩn đã chọn lọc.

-2-


3. Nghiên cứu chọn lọc một số điều kiện để bảo quản rễ tơ Dừa cạn.
4. Sàng lọc dòng rễ tơ có khả năng tăng trưởng và sinh tổng hợp
alkaloid cao và nghiên cứu chọn lọc điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ
trong môi trường lỏng.
5. Khảo sát hàm lượng alkaloid tổng số và một số alkaloid có giá trị
trong rễ tơ và rễ cây in vivo được gây nhiễm trực tiếp với A. rhizogenes
chọn lọc

-3-


CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu sơ lƣợc về Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes là loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, gram âm,
hiện diện phổ biến trong đất. Chúng cùng họ với Rhizobium và có khả năng
xâm nhiễm vào vết thương của thực vật gây ra triệu chứng bệnh rễ tơ
(Tzfira và Citovsky, 2008). Tình trạng phân loại đến loài và dưới loài của
chúng còn rất phức tạp nên vẫn được gọi là R. rhizogenes. Chúng có khả
năng chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo thành rễ tơ nhờ có
mang plasmid Ri. Quá trình chuyển gen của chúng vào tế bào thực vật vẫn

chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn và có nhiều điểm giống với A.
tumefaciens.
1.2. Giới thiệu sơ lƣợc về cây Dừa cạn
Cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) có nguồn gốc ở Madagascar và
được trồng như cây cảnh ở nhiều nơi trên thế giới. Chúng được sử dụng
như dược liệu nhờ khả năng sinh tổng hợp những hợp chất có giá trị. Trong
đó gồm các Vinca alkaloid có hoạt tính chống ung thư trên người. Tuy
nhiên, hàm lượng của chúng trong cây Dừa cạn rất thấp nên các nhà khoa
học không ngừng nghiên cứu các kỹ thuật sản xuất nhằm nâng cao sản
lượng của chúng (Peebles, 2008).
1.3. Sơ lƣợc về rễ tơ
Rễ tơ thu được từ sự chuyển gen của A. rhizogenes vào tế bào thực vật
có đặc điểm phát triển nhanh không cần hormone, ổn định về mặt di truyền,
có khả năng tổng hợp hợp chất thứ cấp cao hơn cây chủ. Do đó, rễ tơ được
ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như sản xuất hợp chất đích, xử lý môi
trường, nghiên cứu các con đường chuyển hóa và sinh lý rễ, tạo giống cây
trồng…

-4-


1.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng A. rhizogenes trong khai thác rễ
tơ Dừa cạn
Quá trình chuyển gen của A. rhizogenes vào tế bào thực vật xảy ra ngẫu
nhiên nên vị trí chèn các gen từ vi khuẩn vào bộ gen tế bào chủ cũng như số
lượng bản sao được chèn cũng không giống nhau. Do đó, các dòng rễ tơ thu
được có đặc điểm tăng trưởng vào biến dưỡng cũng không giống nhau.
Không may mắn là rễ tơ cây Dừa cạn có khả năng tăng trưởng thấp hơn rễ
tơ từ nhiều loài thực vật khác. Trong khi đó, hầu hết các nghiên cứu chỉ sử
dụng vài chủng A. rhizogenes nhất định và chủ yếu chúng mang plasmid tái

tổ hợp để làm sáng tỏ con đường biến dưỡng. Mặt khác, dù có tính di
truyền ổn định hơn so với nuôi cấy tế bào, vài dòng rễ tơ có thể mất đặc
điểm mong muốn sau một thời gian cấy chuyền. Vì thế, cho đến nay, các
nhà khoa học không ngừng nổ lực sản xuất các dòng rễ tơ mới cũng như
tìm kiếm các biện pháp khác nhau để can thiệp nhằm khai thác tối đa kỹ
thuật nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất các dược chất có giá trị.

-5-


CHƢƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Luận án nhằm nghiên cứu khả năng chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ của
A. rhizogenes hiện diện trong đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt Nam trên
cây Dừa cạn in vivo và in vitro. Qua đó, đánh giá ảnh hưởng của chúng lên
khả năng sinh tổng hợp alkaloid tổng số và một số alkaloid thành phần của
cây in vivo và rễ tơ thu được trong in vitro.
2.2. Vật liệu
Các mẫu đất được lấy từ vùng rễ của một số loại cây trồng ở Việt Nam
được dùng để phân lập A. rhizogenes.
Chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và các chủng vi khuẩn làm đối
chứng cho các kiểm tra sinh hóa nhận diện A. rhizogenes.
Các cây họ đâu và cây Dừa cạn in vivo và cây Dừa cạn in vitro.
Các hóa chất, môi trường, dụng cụ và thiết bị để phân lập A. rhizogenes,
nuôi cấy vi khuẩn, nuôi cấy mô thực vật và tách chiết cũng như xác định
hàm lượng alkaloid.
2.3. Phƣơng pháp
Các phương pháp được sử dụng chủ yếu:
- Các phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc trên môi
trường MG-Te; các phương pháp kiểm tra các đặc điểm hình thái

và sinh hóa của vi khuẩn Emanuel và Lorrence (2009), Murugesan
và cộng sự (2010) và José (2012); phương pháp kiểm tra bệnh học
in vivo theo Georgina và cộng sự (2007) và Kereszt và cộng sự
(2007); PCR nhận diện các gen rolABC và gởi mẫu giải trình tự
16s rDNA.
-6-


- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường lỏng.
- Phương pháp gây nhiễm cảm ứng tạo rễ tơ in vitro; phương pháp
nhận diện rễ tơ chuyển gen bằng phân tích PCR sự hiện diện của
gen rolB trong rễ và các phương pháp nuôi cấy rễ tơ trên môi
trường thạch và môi trường lỏng.
- Các phương pháp sinh hóa như phương pháp xác định trọng lượng
tươi và trọng lượng khô, phương pháp OTT để tách chiết alkaloid
tổng số và phương pháp sắc ký lỏng cao áp phân tích các alkaloid.
- Phương pháp xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS (Statistical
Package for the Social Sciences) 20.0, phép thử Duncan.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Mẫu đất
1. Phân lập, nhận diện A. rhizogenes
- Phân lập trên môi trường chọn lọc; nhận diện bằng kiểm tra hình thái và sinh hóa, sinh học phân
tử và kiểm tra bệnh học in vivo
2. Nghiên cứu thiết lập quy trình cảm ứng tạo rễ tơ
- Sàng lọc chủng vi khuẩn, lựa chọn loại mô và xác định các điều kiện gây nhiễm (thời gian ngâm
mẫu, mật độ tế bào, thời gian ủ cảm ứng, chất cảm ứng, chế độ chiếu sáng, môi trường khoáng cơ
bản, nguồn carbon)

3. Nghiên cứu nuôi cấy bảo quản rễ tơ cây dừa cạn
- Xác định điều kiện nuôi cấy bảo quản rễ tơ (môi trường khoáng cơ bản, nhiệt độ và ánh sáng) và

xác định tỷ lệ dòng rễ tơ bảo rồn được gene rol.
4. Nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ cây dừa cạn
- Sàng lọc dòng rễ tơ có khả năng sinh tổng hợp alkaloid cao; xác định các điều kiện nuôi cấy tăng
sinh khối (môi trường khoáng cơ bàn, pH ban đầu, nguồn và nồng độ đường) và xác định đường
con tăng trưởng.

5. Xác định hàm lƣợng các alkaloid thành phần có trong cây dừa cạn in vivo và rễ tơ

Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt quá trình nghiên cứu.
-7-


CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập Agrobacterium rhizogenes
Từ 235 mẫu đất vùng rễ của mười loài cây trồng khác nhau (gồm dưa
hấu, dưa leo, đậu bắp, đậu đen, đậu đũa, đậu nành, đậu phộng, đậu que, đậu
xanh và lúa nước) đã phân lập được 274 dòng khuẩn lạc có đặc điểm tương
tự với Agrobacterium trên môi trường MG-Te với 3 dạng khuẩn lạc khác
nhau (Hình 3.1). Có ba mươi bốn dòng khuẩn lạc có những đặc điểm sinh
hóa giống với loài A. rhizogenes.

Dạng 1

Dạng 2

Dạng 3

Hình 3.1. Ba dạng khuẩn lạc khác nhau trên môi trường MG-Te đặc trưng
của Agrobacterium.

Hình 3.5. Sự xuất hiện triệu chứng rễ tơ trên bốn giống Dừa cạn in vivo khi
được xâm nhiễm bằng dòng C18 đã phân lập được sau 3 tuần gây nhiễm.

-8-


Kiểm tra bệnh học cho thấy có mười ba dòng khuẩn lạc có khả năng
xâm nhiễm tạo rễ tơ trên bốn giống cây Dừa cạn in vivo VIN002, VIN005,
VIN072 và VIN077 (Hình 3.5). Cả mười ba dòng này đều được nhân diện
thuộc loài A. rhizogenes dựa trên trình tự 16S ribosome DNA và đều có
chứa plasmid Ri mang các gen rolABC (Bảng 3.4 và Hình 3.6). Hầu hết
các dòng trong số mười ba dòng đã phân lập được sử dụng cao nấm men
1% làm nguồn nitrogen để phát triển với nguồn carbon thay đổi (glucose,
lactose, mannitol hoặc sucrose) 1-1,5% ở pH 6,5-7,5 (Bảng 3.5). Dựa vào
nguồn gốc phân lập được và điều kiện tăng trưởng đã cho thấy mười ba
dòng này là mười ba chủng A. rhizogenes khác nhau.
C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang

rolA rolB rolC nước thang

Đối chứng

rolA

C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang

rolB

C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang

rolC

-9-

Hình 3.6. Kết quả
phân tích PCR xác
nhận sự hiện diện các
gene rolABC trong
plasmid của mười ba
dòng vi khuẩn đã
sàng lọc được.


Bảng 3.4. Kết quả so sánh bắt cặp đoạn gen 16s ribosome trên ngân hàng
dữ liệu NCBI và nhận diện gen rolABC ở 13 dòng vi khuẩn có khả năng
tạo rễ tơ trên cây Dừa cạn
Trình tự 16S ribosom DNA
Sự hiện diện gen rol
Dòng
Loài tƣơng đồng
Độ tƣơng đồng
A
B
C
C02
A. rhizogenes
99%
Có
Có
Có

C04
A. rhizogenes
99-100%
Có
Có
Có
C09
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có
C10
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có
C12
A. rhizogenes
99%
Có
Có
Có
C15
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có

C18
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có
C20
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có
C24
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có
C26
A. rhizogenes
99%
Có
Có
Có
C29
A. rhizogenes
99-100%
Có
Có
Có

C32
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có
C34
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có
Bảng 3.5. Bảng tổng hợp nguồn gốc và một số điều kiện tăng trưởng của
13 chủng A. rhizogenes đã thu nhận được có khả năng chuyển gen cảm ứng
rễ tơ trên cây Dừa cạn
Ký hiệu Ký hiệu
chủng khuẩn lạc
C02

VBa2

C04

VBa9

C09

VĐu23

C10

VĐu24

Đất vùng
rễ
Đậu bắp
Đậu đũa

Dạng
Môi
khuẩn trƣờng
lạc
2
MT2

pH

Nguồn carbon

Nguồn nitrogen

7,0

Mannitol 1,5%

Cao nấm men 1%

3

MT2

7,5

Mannitol 1,5%

Cao nấm men 1%

3

MT4

6,5

Glucose 1,0%

Cao nấm men 1%

2

MT5

6,5

Sucrose 1,5%

Peptone 1%

C12

VHa7

Dưa hấu

3

MT5

7,0

Glucose 1,0%

Cao nấm men 1%

C15

VLe12

Dưa leo

1

MT5

6,5

Sucrose 1,5%

Peptone 1%

C18

VLu14

Lúa nước

3

MT4

6,5

Lactose 1,5%

Cao nấm men 1%

C20

VNa11

Đậu nành

3

MT4

6,5

Lactose 1,5%

Cao nấm men 1%

C24

VPh11

2

MT2

6,0

Mannitol 1,0%

Cao nấm men 1%

C26

VPh22

3

MT5

6,5

Glucose 1,0%

Cao nấm men 1%

C29

VPh56

3

MT2

6,5

Mannitol 1,0%

Cao nấm men 1%

C32

VXa5

2

MT5

6,5

Glucose 1,0%

Cao nấm men 1%

C34

VXa21

3

MT5

7,0

Glucose 1,0%

Cao nấm men 1%

Đậu phộng

Đậu xanh

- 10 -


3.2. Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ trên cây Dừa cạn in vitro
Ở điều kiện in vitro, cả 13 chủng đã phân lập được đều có thể cảm ứng
tạo rễ tơ trên cây Dừa cạn. Rễ tơ do 13 chủng vi khuẩn cảm ứng đều có
mang các gen rol thông qua kết quả phân tích PCR (Hình 3.8). So với
chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và 12 chủng còn lại, chủng A.
rhizogenes C18 có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ cao nhất trên cả ba giống
Dừa cạn VIN002, VIN005 và VIN072 (Bảng 3.6). Trong khi đó, chủng A.
rhizogenes C26 có khẳng năng chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ cao nhất trên
giống Dừa cạn VIN077. Điều kiện thích hợp để thu nhận rễ chuyển Dừa
cạn bằng hai chủng A. rhizogenes C18 và C26 thay đổi tùy theo giống Dừa
cạn (Bảng 3.7). Rễ tơ thu được phát triển nhanh hơn rễ thường và có nhiều
lông rễ bao quanh (Hình 3.9).

Bảng 3.6. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ trên bốn giống Dừa cạn được cảm ứng
bằng các chủng A. rhizogenes
Chủng
A. rhizogenes
C02

I (%)
VIN002
de

39,6

g

VIN005
11,0

g

39,3

d

VIN072

VIN077

d

4,6f

g

17,5c

18,0

C04

26,7

C09

16,3h

40,0d

15,7e

21,1b

C10

e

38,1

28,9

e

e

13,6

17,5c

C12

47,7c

23,2f

10,2fg

14,2d

C15

17,8

h

f

h

3,3f

C18

59,4a

50,3a

40,0a

20,2b

C20

0

i

e

c

0g

C24

40,7d

47,5b

14,4e

7,2e

C26

e

38,1

43,2

c

f

10,6

26,7a

C29

24,8g

46,4b

0,8h

3,8f

C32

55,0

b

c

h

0g

C34

45,8c

29,3e

31,5b

21,4b

f

e

b

21,7b

ATCC15834

29,3

22,2
31,4

45,6b
30,3

- 11 -

8,1

0

23,5

0

32,5


C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 nước rễ thang
thường

C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C24 C26 C29 C32 C34 rễ thang
thường

Rễ tơ do các chủng khuẩn
cảm ứng từ giống dừa cạn VIN002

Rễ tơ do các chủng khuẩn

cảm ứng từ giống dừa cạn VIN005

C02 C04 C09 C10 C12 C18 C20 C24 C26 C29 C34 rolB rễ thang
thường

C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C24 C26 C29 C34 rolB rễ thang
thường

Rễ tơ do các chủng khuẩn
cảm ứng từ giống dừa cạn VIN077

Rễ tơ do các chủng khuẩn
cảm ứng từ giống dừa cạn VIN072

Hình 3.8. Sự hiện diện của gen rolB được chuyển từ A. rhizogenes vào rễ
tơ.
Bảng 3.19. Tóm tắt các yếu tố thích hợp được đề xuất khi cảm ứng tạo rễ
tơ trên bốn giống Dừa cạn VIN002, VIN005, VIN072 và VIN077
Yếu tố

A. rhizogenes
Vi
khuẩn

OD600 nm
Phenol

Thực vật

Loại mô

Thời gian gây nhiễm
Ủ cảm ứng
trong tối
Điều
Ủ loại nhiễm
kiện
nuôi cấy
Môi trường
mẫu
nuôi cấy
Nguồn carbon
Tỷ lệ mẫu hình thành rễ
(%)

Giống Dừa cạn
VIN002

VIN005

VIN072

VIN077

C18

C18

C18

C26

0,4
Res
100 µM
Lá

0,4
Res
100 µM
Lá

0,2
Res
50 µM
Lá

0,2
Ace
50 µM
Lá

5 phút

10 phút

5 phút

10 phút

5 ngày

6 ngày

6 ngày

6 ngày

1000 lux,
16h/ngày

1000 lux,
16h/ngày

1000 lux,
16h/ngày

1000 lux,
16h/ngày

1/2W

1/2W

1/2W

1/2W

Mal 3%

Mal 3%

Suc 2%

Suc 2%

79,9

73,0

69,6

58,3

Res: Resorcylic acid; Ace: Acetosyringone; Mal: Maltose; Suc: Sucrose.

- 12 -


3.3. Điều kiện nuôi cấy và bảo quản rễ tơ cây Dừa cạn trên môi trƣờng
thạch
Các dòng rễ tơ thu được sau khi chuyển gen từ A. rhizogenes vào các
giống Dừa cạn có điều kiện để nuôi cấy bảo quản thích hợp được trình bày
trong Bảng 3.22. Các dòng rễ tơ có khả năng giữ được gen rolB sau 12
tháng. Khi được nuôi cấy bảo quản trên môi trường thạch và nhiệt độ
không phù hợp hoặc được chiếu sáng, rễ tơ có xu hướng chuyển thành sẹo
tự phát, ít phân nhánh hơn hoặc thoái hóa chóp rễ.
Bảng 3.22. Tỷ lệ dòng rễ tơ giữ được gen rol (%) sau 12 tháng cấy chuyền
bảo quản liên tục trên môi trường thạch
Nhóm dòng

rễ tơ

Điều kiện bảo quản thích hợp

Gene rol
rolA
rolB rolC
o
VIN002
Môi trường B5, tối, 25 – 27 C
93,3
90,0
96,7
VIN005
Môi trường B5, tối, 25 – 27oC
90,0
93,3
93,3
VIN072
Môi trường W, tối, 25 – 27oC
90,0
80,0
86,7
o
VIN077
Môi trường W, tối, 25 – 27 C
93,3
93,3
90,0
Kết quả khảo sát trên 30 dòng rễ phát triển bình thường (không tạo sẹo, không tạo

chồi) cho mỗi nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn.

3.4. Nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ Dừa cạn
Kết quả thu được cho thấy chỉ số tăng trưởng FGI không giống nhau
giữa các dòng rễ từ cùng một giống Dừa cạn. Ngoài ra, FGI cũng thay đổi
lớn giữa các nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn (Bảng 3.23). Hàm
lượng alkaloid tổng số (mg/g trọng lượng rễ khô) không giống nhau giữa
các dòng rễ tơ được cảm ứng từ cùng một giống Dừa cạn và giữa các giống
Dừa cạn (Hình 3.12 - 3.15). Dòng rễ có hàm lượng alkaloid tổng số cao
hơn không hoàn toàn tương đồng với dòng có chỉ số tăng trưởng cao hơn.
Hầu hết những dòng rễ có chỉ số tăng trưởng cao sẽ có năng suất alkaloid
tổng số cao. Kết quả trên đã giúp chọn lọc được bốn dòng rễ tơ có khả năng
tổng hợp alkaloid cao tương ứng cho bốn giống Dừa cạn gồm các dòng
VIN002-12, VIN005-07, VIN072-15 và VIN077-09.
- 13 -


70
60
50
40
30
20
10
0

FGI (g/g FWi)

Alkaloid tổng số (mg/g DW)

Y alkaloid (mg/g FWi)

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Dòng rễ tơ đƣợc cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN002

Hình 3.12. Biểu đồ chỉ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số và khả
năng sinh tổng hợp alkaloid của các nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn
VIN002.
70
60
50
40
30
20
10
0

FGI (g/g FWi)

Alkaloid tổng số (mg/g DW)

Y alkaloid (mg/g FWi)

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Dòng rễ tơ đƣợc cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN005

Hình 3.13. Biểu đồ chỉ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số và khả
năng sinh tổng hợp alkaloid của các nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn
VIN005.
70

60
50
40
30
20
10
0

FGI (g/g FWi)

Alkaloid tổng số (mg/g DW)

Y alkaloid (mg/g FWi)

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Dòng rễ tơ đƣợc cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN072

Hình 3.14. Biểu đồ chỉ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số và khả
năng sinh tổng hợp alkaloid của các nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn
VIN072.

- 14 -


70
60
50
40
30
20

10
0

FGI (g/g FWi)

Alkaloid tổng số (mg/g DW)

Y alkaloid (mg/g FWi)

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Dòng rễ tơ đƣợc cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN077

Hình 3.15. Biểu đồ chỉ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số và khả
năng sinh tổng hợp alkaloid của các nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn
VIN077.
Bảng 3.23. Chỉ số tăng trưởng và khả năng sinh tổng hợp alkaloid của bốn
nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn
Nhóm
dòng rễ
Min
tơ
VIN002 8,4
VIN005 7,8
VIN072 7,3
VIN077 6,9

FGI
Max
36,6
31,8

30,2
27,5

Trung
bình
21,4
20,0
16,2
15,0

malkaloid (mg/g DW)
Trung
Min Max
bình
4,23 10,20 7,96
4,07 11,13 6,45
6,93 14,9 10,3
6,37 12,77 8,07

Yalkaloid (mg/g FWi)
Trung
Min
Max
bình
6,0
57,9
27,6
5,0
58,4
19,7

11,8
57,7
23,3
4,4
54,2
17,4

Kết quả thu được từ khảo sát trên 20 dòng khác nhau của mỗi nhóm dòng
rễ tơ.
Tương tự như khi được nuôi cấy trên môi trường thạch, khi được nuôi
cấy trên môi trường lỏng trong môi trường không phù hợp, các dòng rễ có
thể bị gãy vụn, hóa nâu và không phát triển, vài trường hợp sẽ tạo sẹo tự
phát và chồi tự phát. Hai dòng rễ tơ VIN002-12 và VIN005-07 tăng trưởng
tốt trên môi trường lỏng 1/2B5 trong khi hai dòng rễ VIN072-15 và
VIN077-09 tăng trưởng tốt trên môi trường lỏng 1/2W.

- 15 -


FGI

25

VIN002-12
VIN005-07
VIN072-15
VIN077-09

20
15

10
5
0
0

7

14

21

28

35

42

Ydb (g/g FWi)

Thời gian (ngày)
4
3
3
2
2
1
1
0

VIN002-12

VIN005-07
VIN072-15
VIN077-09

0

7

14

21 28 35 42
Thời gian (ngày)
Hình 3.17. Đồ thị đường cong tăng trưởng của các dòng rễ tơ chọn lọc theo
trọng lượng tươi (trên) và trọng lượng khô (dưới).

Nguồn carbon thích hợp cho cả bốn dòng rễ tơ chọn lọc phát triển là
sucrose 2%. pH ban đầu của môi trường nuôi cấy bốn dòng rễ tơ cần được
kiểm soát trong dãy 6,0-6,5. Ở các điều kiện nuôi cấy chọn lọc, cả bốn
dòng rễ có pha thích nghi kéo dài đến ngày thứ 14 sau khi cấy (Hình 3.17).
Dòng rễ VIN002-12 và VIN077-09 có pha tăng trưởng kết thúc ở ngày thứ
35 trong khi hai dòng rễ VIN005-07 và VIN072-15 kết thúc ở ngày thứ 28
sau khi cấy. Khi kết thúc pha tăng trưởng, các dòng rễ tơ chọn lọc VIN00212, VIN005-07, VIN072-15 và VIN077-09 đạt chỉ số tăng trưởng FGI
tương ứng là 20,41, 20,13, 20,11 và 17,12; năng suất sinh khối khô Ydb
tương ứng là 3,11, 3,13, 3,05 và 2,61 (g/g FWi).
- 16 -


3.6. Ảnh hƣởng của A. rhizogenes trên khả năng sinh tổng hợp alkaloid
của cây Dừa cạn in vivo và rễ tơ
Khi áp dụng A. rhizogenes như yếu tố ngoại sinh bằng cách gây nhiễm

lên thân cây in vivo, hai chủng A. rhizogenes C18 và C26 không ảnh hưởng
lên sự tăng trưởng của cây Dừa cạn. Tuy nhiên, khả năng sinh tổng hợp
alkaloid trong các bộ phận lá, thân và rễ tăng lên đáng kể so với đối chứng.
Phân tích các alkaloid thành phần có trong lá và rễ cho thấy chúng thay đổi
không giống nhau (Bảng 3.40) và sự thay đổi này không phụ thuộc vào
chủng vi khuẩn. Kết quả cũng cho thấy có thể ứng dụng chủng C18 để tăng
cường sinh tổng hợp các alkaloid có giá trị trong lá cây Dừa cạn VIN005.
Bảng 3.40. So sánh khả năng sinh tổng hợp các alkaloid trong lá và rễ cây
Dừa cạn bị A. rhizogenes xâm nhiễm so với đối chứng sau 90 ngày gieo hạt
Giống Dừa
cạn

Chủng A.
rhizogenes

Bộ phận
Cat

So sánh với đối chứng
Ajm
VCR
Vin

VBL

Lá thử thật
=





VIN002
C18
Rễ thử thật
=




Lá thử thật
=




VIN005
C18
Rễ thử thật
=




Lá thử thật
=




VIN072

C18
Rễ thử thật
=




Lá thử thật
=




VIN077
C26
Rễ thử thật
=
=
=


: giảm, : tăng, =: không thay đổi ở mức ý nghĩa 0,05; Cat: catharanthine, Ajm:
ajmalicine, VCR: vincristine, Vin: vindoline, VBL: vinblastine.

Khi áp dụng A. rhizogenes như yếu tố nội sinh thông qua các dòng rễ tơ,
các rễ tơ Dừa cạn chọn lọc được cảm ứng bằng hai chủng C18 và C26
(được thu nhận khi kết thúc pha tăng trưởng) có khả năng sinh tổng hợp
alkaloid cao hơn đáng kể so với rễ cây được gây nhiễm trực tiếp với A.
rhizogenes. Phân tích HPLC cho thấy hàm lượng các alkaloid thành phần
trong các dòng rễ này không giống nhau. Trong đó, dòng rễ VIN002-12

không chứa Vindoline và hai dòng VIN005-07 và VIN072-15 chỉ chứa
- 17 -


Ajmalicine. Dòng VIN077-09 có đầy đủ các alkaloid khảo sát, tuy nhiên có
chỉ số tăng trưởng FGI và năng suất sinh khối khô Ydb thấp nhất. Ba dòng
rễ VIN002-12, VIN005-07 và VIN072-15 có FGI và Ydb tương đương.
So sánh giữa áp dụng A. rhizogenes như yếu tố nội sinh (gây nhiễm trực
tiếp lên thân cây in vivo) và như yếu tố nội sinh (thông qua rễ tơ được
chuyển gen rol) cho thấy rễ tơ có biểu hiện tăng khả năng sinh tổng hợp
alkaloid cao hơn rễ cây được gây nhiễm trực tiếp (Bảng 3.44). Đáp ứng
tăng biểu hiện sinh tổng hợp alkaloid phụ thuộc vào từng giống Dừa cạn.
Ngoài ra, kết quả so sánh cũng cho thấy rễ tơ có khả năng tổng hợp
Ajmalicine cao hơn nhưng Catharanthine, Vindoline, Vinblastine và
Vincristine thấp hơn rễ cây được gây nhiễm trực tiếp với A. rhizogenes.
Bảng 3.44. So sánh hàm lượng alkaloid tổng số trong rễ tơ và trong rễ cây
in vivo được gây nhiễm trực tiếp với A. rhizogenes với rễ cây đối chứng
Giống Dừa
Rễ thử thật so với đối
Rễ tơ so với đối
cạn
chứng
chứng
VIN002
+ 1,51b
+ 2,26b
VIN005
+ 2,69a
+ 5,15a
VIN072

+ 1,76b
+ 5,89a
c
VIN077
+ 0,40
+ 3,18b
Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng 1 cột có các chữ cái theo sau giống nhau
thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở p=0,05.

So sánh tiềm năng giữa bốn dòng rễ tơ chọn lọc (Bảng 3.45) cho thấy
hai dòng VIN002-12 và VIN077-09 có tiềm năng ứng dụng cao hơn nhờ
vào khả năng sinh tổng hợp nhiều thành phần alkaloid với hàm lượng cao
hơn. Ngoài ra, kết quả đã cho thấy giống Dừa cạn VIN005 có hàm lượng
alkaloid tổng số trong rễ thấp nhất nhưng khi được gây nhiễm với chủng
C18 có biểu hiện đáp ứng tăng sinh tổng hợp alkaloid nhiều nhất giữa bốn
giống. Qua đó cho thấy dòng rễ tơ VIN005-07 cũng có thể mang đặc điểm
đáp ứng tăng biểu hiện sự sinh tổng hợp alkaloid (trong đó có Ajm) nếu sử
dụng yếu tố ngoại sinh để kích thích khi nuôi cấy dòng rễ tơ này.
- 18 -


Bảng 3.45. So sánh đặc điểm, điều kiện nuôi cấy và khả năng sinh tổng
hợp Vinca alkaloid của các dòng rễ tơ chọn lọc
Đặc điểm

Nguồn
gốc

Giống Dừa cạn
Chủng A. rhizogenes

cảm ứng
Hình thái

Đặc
điểm
tăng
trƣởng
trên môi
trƣờng
thạch

Đặc
điểm
tăng
trƣởng
trong
môi
trƣờng
lỏng

Môi trường
Điều kiện nuôi cấy
FGI (g/g FWi)
Alkaloid tổng số
(mg/g DW)

Dòng rễ tơ chọn lọc
VIN002-12 VIN005-07 VIN072-15 VIN077-09
VIN002

VIN005

VIN072

VIN077

C18

C18

C18

C26

Nhánh rễ dày đều, không phình to chóp rễ,
phân nhánh đều, thẳng không cuộn
B5
B5
W
W
25-27 oC, tối
34,8a
31,1ab
30,2b
27,5b
9,37bc

10,60ab

11,13a

8,93c

Yalkaloid (mg/g FWi)

57,9ns

58,4ns

57,7ns

54,2ns

Môi trường
pH
Nguồn carbon
Thời gian kết thúc
pha tăng trưởng
FGI cuối pha tăng
trưởng (g/g FWi)

1/2B5

1/2B5
1/2W
6,0 – 6,5
Sucrose 2%

1/2W

35 ngày

28 ngày

28 ngày

35 ngày

20,41a

20,13a

20,11a

17,12b

Ydb (g/g FWi)

3,11a

3,13a

3,05a

2,61b

Alkaloid tổng số
(mg/g DW)
Yalkaloid (mg/g FWi)

8,11c

9,09b

10,47a

8,24c

25,29b

28,46b
Ajm
1,287b
-

31,94a

21,51c

Cat 0,756a
Năng suất các
Ajm 1,648a
alkaloid thành phần VCR 0,020b
(mg/g FWi)
VBL 0,801a

Cat 0,258b
c
Ajm 1,069 Ajm 1,296b
VCR 0,040a

Vin 0,068a
VBL 0,030b

FGI: chỉ số tăng trưởng trọng lượng tươi, Yalkaloid: năng suất alkaloid tổng số, Ydb: năng
suất sinh khối khô, FWi: trọng lượng tươi rễ nguồn.
Các trị trung bình của các chỉ số trong cùng 1 dòng có các chữ cái theo sau giống nhau thì
khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở p=0,05.

- 19 -


CHƢƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
Dựa trên những kết quả và thảo luận ở trên, chúng tôi có các kết luận
như sau:
- Phân lập được 13 chủng A. rhizogenes có khả năng cảm ứng rễ tơ Dừa
cạn.
- Xác định được một số điều kiện thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ trên
bốn giống Dừa cạn VIN002, VIN005, VIN072 và VIN077 đạt 79,9%, 73%
và 69,6% 58,3% tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ tương ứng.
- Điều kiện để nuôi cấy bảo quản trên thạch các dòng dòng rễ tơ từ
giống Dừa cạn VIN002 và VIN005 là môi trường Gamborg’s B5 (B5)
trong tối ở 25-27 oC. Điều kiện để nuôi cấy bảo quản trên thạch các dòng
dòng rễ tơ từ giống Dừa cạn VIN072 và VIN077 tương tự trên môi trường
thạch White. Ở các điều kiện này, tỷ lệ số dòng rễ tơ giữ được gen rolB đạt
90,0%, 93,3%, 80,0% và 93,3% tương ứng sau 12 tháng bảo quản.
- Sàng lọc được bốn dòng rễ tơ VIN002-12, VIN005-07, VIN072-15 và
VIN077-09 có khả năng tăng trưởng và sinh tổng hợp alkaloid cao. Hai
dòng VIN002-12 và VIN005-07 tăng trưởng tốt trong môi trường 1/5B5 và
hai dòng VIN072-15 và VIN077-09 tăng trưởng tốt trong môi trường 1/2W

với pH ban đầu của môi trường 6,0 – 6,5 và nguồn carbon thích hợp là
sucrose 2%.
- Rễ tơ Dừa cạn mang gen rol được chuyển từ A. rhizogenes C18 và
C26 có khả năng sinh tổng hợp alkaloid cao hơn rễ cây in vivo được gây
nhiễm trực tiếp với A. rhizogenes. Trong đó, khả năng sinh tổng hợp
Ajmalicine ở rễ tơ cao hơn rễ cây in vivo được gây nhiễm trực tiếp với A.
rhizogenes nhưng khả năng sinh tổng hợp Catharanthine, Vindoline,
Vinblastine và Vincristine thì ngược lại.
- 20 -


- Chủng A. rhizogenes C18 có tiềm năng ứng dụng để làm tăng khả
năng sinh tổng hợp Ajmalicine, Vindoline, Vincristine và Vinblastine trên
lá của giống Dừa cạn VIN005 bằng cách gây nhiễm trực tiếp lên thân.
- Hai dòng rễ tơ VIN002-12 và VIN077-09 có hiện diện nhiều alkaloid
có giá trị và có khả năng tăng trưởng cao mà không cần bổ sung hormone
có tiềm năng ứng dụng trong nghiên cứu thu nhận sinh khối rễ tơ giàu
Ajmalicine, Catharanthine, Vindoline, Vincristine và Vinblastine.
4.2. Đề nghị
Từ những kết quả đã thu được bước đầu trong luận án này cũng như
dựa trên những phân tích tổng quan ban đầu, chúng tôi nhận thấy sự cấp
thiết giải quyết các vấn đề như sau:
- Nghiên cứu bảo tồn các chủng A. rhizogenes đã phân lập được
nhằm bào tồn công cụ chuyển gen phục vụ cho nghiên cứu rễ tơ.
- Nghiên cứu thêm các điều kiện khác và phương pháp khác để bảo
quản bốn dòng rễ chọn lọc nói riêng cũng như rễ tơ từ cây Dừa cạn để phục
vụ việc bảo tồn những dòng rễ mục tiêu sau này.
- Nghiên cứu nuôi cấy bốn dòng rễ chọn lọc hướng đến các mục tiêu
thu nhận alkaloid, đặc biệt là hai dòng VIN002-12 và VIN077-09.
Ngoài ra, dựa trên những kết quả bước đầu này, chúng tôi cho rằng

có thể triển khai các nghiên cứu ứng dụng sau:
- Dựa trên khả năng cảm ứng tạo rễ tơ, việc triển khai các nghiên cứu
liên quan đến đặc điểm này hứa hẹn sẽ có nhiều ứng dụng.
- Ngoài ra, có thể nghiên cứu sản xuất polysaccharide ngoại bào
(curdlan) từ những chủng dương tính với thuốc thử vanillin.

- 21 -


CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN
1. Nguyễn Nhƣ Nhứt và Bùi Văn Lệ (2017), “Nghiên cứu bước đầu
nuôi cấy bảo quản các dòng rễ tơ từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus
(L.) G. Don) được cảm ứng bằng Agrobacterium rhizogenes được
phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, Đã
đƣợc chấp nhận đăng.
2. Nguyễn Nhƣ Nhứt và Bùi Văn Lệ (2017), “Nghiên cứu sự tăng
trưởng trong môi trường lỏng của rễ tơ cây Dừa cạn (Catharanthus
roseus (L.) G. Don) được cảm ứng bằng Agrobacterium rhizogenes”,
Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, Đã đƣợc chấp nhận
đăng.
3. Nguyễn Nhƣ Nhứt và Bùi Văn Lệ (2017), “Phân lập và nhận diện
Agrobacterium rhizogenes có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ trên cây Dừa
cạn (Catharanthus roseus) in vivo”, Tạp chí phát triển Khoa học và
Công nghệ, Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, tập 20(T1),
48-59.
4. Nguyễn Nhƣ Nhứt và Bùi Văn Lệ (2016), “Khả năng cảm ứng hình
thành rễ chuyển gen từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) bằng các
chủng Agrobacterium rhizogenes được phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí
phát triển Khoa học và Công nghệ, tập 19(T3), 44-52.
5. Nguyễn Nhƣ Nhứt và Bùi Văn Lệ (2016), “Ảnh hưởng của các yếu tố

nuôi cấy lên sự cảm ứng rễ chuyển gen từ các giống cây Dừa cạn
(Catharanthus roseus) của chủng Agrobacterium rhizogenes C18”,
Tạp chí KHKTNLN, Trường ĐH Nông Lâm Tp.HCM, tập 2, 26-33.
6. Nguyễn Nhƣ Nhứt và Bùi Văn Lệ (2016), “Ảnh hưởng của các yếu tố
nuôi cấy lên sự cảm ứng rễ chuyển gen từ cây Dừa cạn (Catharanthus
roseus) của chủng Agrobacterium rhizogenes C26”, Tạp chí Khoa học,
Trường ĐH Cần Thơ, tập 44b. 96-103.
- 22 -


7. Nguyễn Nhƣ Nhứt và Bùi Văn Lệ (2015), “Ảnh hưởng của các hợp
chất phenol trong huyền phù Agrobacterium rhizogenes lên khả năng
cảm ứng hình thành rễ chuyển gen từ cây Dừa cạn (Catharanthus
roseus)”, Tạp chí Khoa học, Trường ĐHSP TPHCM, tập 12(78), 152160.

- 23 -