TẠO cây cà CHUA MANG GEN HBsAg BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIẾN nạp GEN DÙNG VI KHUẨN agrobacterium tumefaciens (tt)

4 Ki m tra s di truy n c a gen ch n l c nptII và gen chuy n m c tiêu
HBsAg

th h T1 b ng ph

ng pháp sinh h c đ nh tính và PCR.

2.2 V t li u nghiên c u
2.2.1 V t li u th c v t: H t cà chua TN412 (cà chua bi) (Công ty Trang
Nông TP. HCM).


6
2.2.2 Vi khu n: Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (do phòng Công
ngh Gen, Phòng Thí nghi m Tr ng đi m phía Nam v Công ngh T bào
Th c v t - Vi n Sinh h c Nhi t đ i cung c p).
2.2.3 Plasmid: S d ng plasmid pITB-HBsAg ( 16,78 kb) [do TS. Nguy n
H u Tâm (Vi n Sinh h c Nhi t đ i) thi t k ] mang các gen: gusA (promoter
T7, terminator T7); nptII (promoter CaMV35S); HBsAg mã hoá protein
kháng nguyên b m t nh (S) đ

c đi u khi n b i h th ng [promoter PDS

(phytoene desaturase,  2 kb) + T7 RNA polymerase (2,7 kb)] t o s bi u
hi n chuyên bi t
2.3 Ph

mô qu .

ng pháp nghiên c u

2.3.1 Kh o sát nh h
m m vƠ nh h

ng c a BA, IAA lên s tái sinh ch i in vitro t lá

ng c a kháng sinh kanamycin lên lá m m, cơy con in

vitro
2.3.1.1 Kh o sát nh h

ng c a BA, IAA lên s tái sinh ch i in vitro t

lá m m: Xác đ nh môi tr
tr

ng tái sinh v i n ng đ các ch t đi u hòa sinh

ng ( HST) BA, IAA thích h p cho t l lá m m tái sinh ch i (%), s

ch i tái sinh/m u cao nh t đ i v i gi ng cà chua TN412.
Thành ph n môi tr
agar 8 g/L, đ
này không đ i

ng tái sinh là môi tr

ng MS v i vitamin B5,

ng saccharose 30 g/L, b sung IAA là 0,5 mg/L (n ng đ
các môi tr

ng kh o sát), n ng đ BA thay đ i l n l

1,25; 1,50; 1,75; 2,00; 2,25; 2,50 mg/L. M i môi tr
th c hi n v i 30 m u c y. Thí nghi m đ
toàn ng u nhiên v i các nghi m th c đ
2.3.1.2

nh h

t là

ng tái sinh kh o sát

c b trí theo ki u m t y u t hoàn
c l p l i 3 l n.

ng c a kháng sinh kanamycin lên lá m m, cơy con in

vitro: Xác đ nh n ng đ t i thi u c a kanamycin gây c ch kh n ng tái
sinh ch i và gây ch t lá m m, cây con cà chua in vitro đ áp d ng trong quá


7
trình ch n l c nh ng m u chuy n gen gi đ nh. Thí nghi m đ

c b trí

gi ng nh thí nghi m 2.3.1.1.
2.3.2 Xơy d ng quy trình bi n n p gen vƠo lá m m cơy cƠ chua TN412

b ng ph

ng pháp dùng vi khu n Agrobacterium tumefaciens: Các m u

lá m m s d ng có kích th
tr

c 5 mm x 7 mm và đ

c ti n nuôi c y trên môi

ng tái sinh thích h p (thí nghi m 2.3.1.1) trong th i gian 2 ngày. Sau

đó, cho d ch vi khu n (OD600 là 0,5) vào ng p lá m m trong th i gian 20
phút r i ti n hành nuôi chung m u lá m m v i Agrobacterium tumefaciens
trên môi tr

ng tái sinh có b sung acetosyringone n ng đ (100 µM). Sau

2 ngày nuôi chung, di t vi khu n Agrobacterium tumefaciens, nuôi c y ch n
l c lá m m trên môi tr

ng tái sinh có b sung kháng sinh kanamycin 50

mg/L đ n khi hình thành mô s o, phác th ch i, ch i chuy n gen hoàn
ch nh.
2.3.3 Ki m tra s hi n di n c a các gen bi n n p vƠ s bi u hi n c a
chúng b ng ph

ng pháp hóa mô t bƠo, sinh h c đ nh tính, hóa sinh

2.3.3.1 Ki m tra s bi u hi n đ nh tính c a gen kháng kanamycin nptII:
Ch i l n (ch a có r , cao 1,5 - 3 cm, tái sinh trên môi tr
50 mg/L) và m nh lá th t (7 x 7 mm, c a cây sinh tr
không ch t
tr

HST) đ

c nuôi c y trên các môi tr

ng MS không ch t HST và môi tr

ng kanamycin có
ng trên môi tr

ng t

ng

ng

ng: môi

ng tái sinh t t nh t (BA 2,0 mg/L;

IAA 0,5 mg/L) có b sung kanamycin 100 mg/L đ theo dõi kh n ng t ng
tr

ng (phát tri n r , thân, lá) và t o mô s o, tái sinh trong 30 ngày; so sánh

v i đ i ch ng.
2.3.3.2 Ki m tra s hi n di n c a các gen nptII, HBsAg b ng k thu t
PCR: Tách chi t DNA t ng s dùng ph

ng pháp CTAB (tham kh o tài

li u c a tác gi Fulton và cs. (1995)) và s d ng c p m i chuyên bi t đ i
v i gen HBsAg (Srinivas và cs., 2008) và gen nptII đ khu ch đ i đo n
DNA có kích th

ct

ng ng là 681 bp và 600 bp.