Nghiên cứu một số chỉ tiêu trong quy trình sản xuất, kiểm nghiệm vacxin giải độc tố escherichia coli phòng bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu ở lợn
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.29 MB, 105 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
------------------
NGUYỄN HỮU MẪN
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU TRONG QUY TRÌNH
SẢN XUẤT, KIỂM NGHIỆM VACXIN GIẢI ðỘC TỐ
ESCHERICHIA COLI PHÒNG BỆNH TIÊU CHẢY
VÀ SƯNG PHÙ ðẦU Ở LỢN
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành
: THÚ Y
Mã số
: 60.62.50
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRƯƠNG QUANG
HÀ NỘI - 2010
LỜI CAM ðOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai cơng bố trong bất kì
cơng trình nào khác.
Tơi xin cam đoan rằng các thơng tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược
chỉ rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn.
Tác giả luận văn
Nguyễn Hữu Mẫn
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... i
LỜI CÁM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện ñề tài ngồi sự nỗ lực của bản thân tơi
đã nhận được rất nhiều sự giúp ñỡ, tạo ñiều kiện của Viện sau ñại học, Ban
chủ nhiệm Khoa Thú y, trường ðHNN Hà Nội; Ban giám đốc, Trung tâm
Nghiên cứu thuộc Cơng ty HANVET; các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh
vật - Truyền nhiễm, ñặc biệt là sự hướng dẫn nhiệt tình và chu đáo của
PGS.TS Trương Quang.
Tơi xin bày tỏ lời cám ơn chân thành nhất tới các quí phịng ban, các
thầy cơ trong bộ mơn, PGS.TS Trương Quang và các đồng nghiệp đã giúp
đỡ, hướng dẫn tơi hồn thành tốt luận văn này.
Xin trân trọng cám ơn !
Tác giả luận văn
Nguyễn Hữu Mẫn
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... ii
MỤC LỤC
Lời cam ñoan
i
Lời cám ơn
ii
Mục lục
iii
Danh mục các chữ viết tắt
v
Danh mục các bảng
vi
Danh mục các hình
viii
1.
MỞ ðẦU
i
2.
TỔNG QUAN
3
2.1
Tình hình nghiên cứu trong nước
3
2.2
Tình hình nghiên cứu ở nước ngồi
5
2.3
Vi khuẩn Escherichia coli
6
2.4
Bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn do E. coli gây ra
19
2.5
Tìm hiểu về vacxin
27
3.
ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
37
3.1
ðối tượng, ñịa ñiểm nghiên cứu
37
3.2
Nội dung nghiên cứu
37
3.3
Nguyên liệu
37
3.4
Phương pháp nghiên cứu
38
4.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
51
4.1
Kiểm tra vô trùng vacxin giải ñộc tố E. coli
51
4.2
Xác ñịnh liều sử dụng vacxin giải ñộc tố E. coli.
52
4.2.1
ðối với lợn con sau cai sữa
52
4.2.2
ðối với lợn nái chửa
54
4.3
Xác định chỉ tiêu an tồn của vacxin giải ñộc tố E. coli
56
4.3.1
Xác ñịnh chỉ tiêu an tồn và liều an tồn của vacxin giải độc tố
E. coli đối với chuột bạch
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... iii
56
4.3.2
Xác định chỉ tiêu an tồn của vacxin giải độc tố E. coli ñối với bản
ñộng vật
58
4.4
Nghiên cứu xác ñịnh hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli
60
4.4.1
Xác ñịnh hàm lượng giải độc tố có trong vacxin giải độc tố E. coli
60
4.4.2
Xác ñịnh hiệu lực của vacxin ñối với chuột bạch
61
4.4.3
Xác ñịnh hiệu lực của vacxin ñối với lợn
68
4.5
Nghiên cứu ñiều kiện bảo quản và thời gian bảo quản vacxin giải độc
tố E. coli
4.5.1
Kết quả kiểm tra tình trạng vật lý và hiệu giá giải ñộc tố trong vacxin
trong thời gian bảo quản
4.5.2
75
75
Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli tại các thời ñiểm
khác nhau trong thời gian bảo quản ñối với chuột bạch
77
4.6
Thử nghiệm thực ñịa và kiểm tra hiệu lực của vacxin ngồi thực địa
79
4.6.1
Kết quả kiểm tra an tồn của vacxin ngồi thực địa
79
4.6.2
Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin ngồi thực địa
80
4.6.3
Khảo sát độ dài miễn dich của vacxin giải độc tố E. coli đối với lợn ngồi
thực địa
84
5.
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ
86
5.1
Kết luận
86
5.2
ðề nghị
86
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... iv
88
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADP
Agar –gel Diffuse Precipitation
BA
Blood agar
CFU
Colony – Forming Unit
DD
Dưới da
ðC
ðối chứng
E.coli
Escherichia coli
FT
Fluid Thioglycolate
FX
Phúc xoang
HGKT
Hiệu giá kháng thể
HGKðTTB
Hiệu giá kháng độc tố trung bình
MD
Miễn dịch
MLD
Minimum Lethal Dose
NA
Nutrient Agar
NB
Nutrient Brorth
SA
Sabouraud Agar
TCCS
Tiêu chuẩn cơ sở
TM
Tĩnh mạch
TN
Thí nghiệm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... v
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
4.1
Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin giải ñộc tố E. coli
4.2
Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng ñộc tố của lợn con sau cai sữa trước
và sau khi tiêm vacxin giải ñộc tố E. coli
4.3
51
53
Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng ñộc tố trong huyết thanh của lợn nái
chửa trước và sau khi tiêm vacxin giải ñộc tố E. coli
55
4.4
Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an tồn của vacxin đối với chuột bạch
57
4.5
Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an tồn của vacxin đối với lợn con sau cai sữa
59
4.6
Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an tồn của vacxin đối với lợn nái chửa
60
4.7
Kết quả xác ñịnh hiệu giá giải ñộc tố trong vacxin
61
4.8
Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng ñộc tố E. coli trong huyết thanh chuột
miễn dịch bằng phản ứng kết tủa nhanh trên phiến kính
4.9
Kết quả xác định liều tối thiểu gây chết 100% chuột bạch của dịch lọc
canh trùng E. coli
4.10
62
64
Kết quả xác ñịnh liều tối thiểu gây chết 100% chuột bạch của hỗn hợp
canh trùng E. coli cường ñộc
66
4.11
Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với chuột bạch
67
4.12
Kết quả xác ñịnh liều tối thiểu gây bệnh cho 100% lợn con sau cai sữa
bằng dịch lọc canh trùng E. coli
4.13
Kết quả xác ñịnh liều tối thiểu gây bệnh cho 100% lợn con sau cai sữa
của hỗn hợp canh trùng E. coli cường ñộc
4.14
69
70
Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch và hiệu lực của vacxin giải ñộc tố
E. coli ñối với lợn con sau cai sữa
73
4.15
Tổng hợp kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin giải độc tố E. coli
74
4.16
Kết quả kiểm tra tình trạng vật lý và hiệu giá giải ñộc tố của vacxin
trong q trình bảo quản
4.17
76
Kết quả kiểm tra định kỳ hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt độ
phịng đối với chuột bạch
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... vi
77
4.18
Kết quả kiểm tra ñịnh kỳ hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt ñộ từ 2
- 8°C ñối với chuột bạch
4.19
Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin giải ñộc tố E. coli tiêm cho lợn
ngoài thực ñịa
4.20
81
Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli đối với lợn nái
mang thai ngồi thực địa
4.22
80
Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli đối với lợn
con sau cai sữa ngồi thực địa
4.21
78
82
Tổng hợp so sánh kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E.
coli tiêm cho lợn con sau cai sữa và lợn nái mang thai ở các ñịa
phương
4.23
Kết quả khảo sát ñộ dài miễn dịch của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối
với lợn sau cai sữa
4.24
83
84
Kết quả khảo sát ñộ dài miễn dịch của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối
với lợn nái mang thai
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... vii
85
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
4.1
Tên hình
Trang
HGKðTTB của lợn con sau cai sữa trước và sau khi tiêm vacxin giải
ñộc tố E. coli với các liều khác nhau
4.2
HGKðTTB của lợn nái chửa trước và sau khi tiêm vacxin giải ñộc tố
E. coli
4.3
61
Hiệu giá kháng độc tố E. coli trung bình trong huyết thanh của chuột
TN/ðC với hiệu giá giải ñộc tố vacxin
4.5
55
Phản ứng ADP giữa giải ñộc tố E. coli với kháng ñộc tố trong huyết
thanh chuột ñã ñược miễn dịch
4.4
53
62
Phản ứng kết tủa sau 36 - 48 giờ phản ứng trong ống nghiệm giữa giải
ñộc tố E. coli với kháng ñộc tố trong huyết thanh của chuột ñã ñược
miễn dịch
4.6
Chuột bạch chết khi tiêm canh trùng E. coli ñộc ñể xác ñịnh liều tối
thiểu gây chết 100%
4.7
75
Hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn con sau sai sữa và
lợn nái mang thai ni ở các địa phương
4.10
71
Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với chuột
bạch và lợn
4.9
66
Lợn phát bệnh khi tiêm canh trùng E. coli cường ñộc ñể xác ñịnh liều
tối thiểu gây bệnh 100% lợn
4.8
63
83
Kết quả xác ñịnh ñộ dài miễn dịch của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối
với lợn sau cai sữa và nái mang thai
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... viii
85
1. MỞ ðẦU
Trong q trình chăn ni lợn ở Việt Nam, có rất nhiều bệnh gây thiệt hại lớn
về kinh tế, trong đó có hội chứng tiêu chảy. Ngun nhân gây tiêu chảy có rất nhiều:
Virus gây viêm dạ dày ruột (TGE), Rotavirus, Coccidia... Vi khuẩn E. coli là nguyên
nhân quan trọng nhất trong gây bệnh tiêu chảy ở lợn mới sinh và sau cai sữa [46].
Tập đồn vi khuẩn E. coli, hiện có trên 2000 chủng và trong đó có khoảng
10% gây bệnh. Ở lợn, từ sơ sinh cho ñến trưởng thành luôn bị E. coli tấn công [31]:
Lứa tuổi lợn sơ sinh gây bệnh: Lợn con phân trắng
Lứa tuổi lợn con theo mẹ gây bệnh: Tiêu chảy (rối loạn tiêu hoá)
Lứa tuổi lợn trước và sau cai sữa gây bệnh: Sưng phù ñầu lợn con
Yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli rất đa dạng có thể bằng cơ học gây tổn
thương tổ chức, bội nhiễm gây rối loạn chức năng, có thể gây bệnh do nội, ngoại
ñộc tố tiết ra. Do vậy, bệnh do E. coli gây thiệt hại khá lớn cho chăn nuôi lợn ở cả
các nước tiên tiến cũng như ở Việt Nam.
ðể chống lại bệnh do E. coli, các nhà thú y hiện nay đã sử dụng nhiều
phương thuốc, từ cổ truyền đơng y ñến các kháng sinh hiện ñại, kể cả các liệu pháp
hoá sinh, dinh dưỡng kỹ thuật cao… nhưng cũng chỉ khống chế ñược một phần.
Ở Việt Nam cũng ñã áp dụng nhiều biện pháp có kết quả, trong đó tác dụng
tốt nhất là kháng sinh. Mấy thập kỷ qua, thuốc kháng sinh đã giúp các nhà chăn
ni giảm bớt một phần ñáng kể tổn thất do dịch bệnh. Tuy nhiên, mặt trái của
kháng sinh ngày càng lộ rõ: Các nhà khoa học trong nước khẳng ñịnh E. coli ñã
kháng thuốc với tỷ lệ cao [16], [36]. ðể khắc phục tình trạng này, trên thế giới và ở
Việt Nam đã có các chế phẩm sinh học ra đời, trong đó có chứa các vi khuẩn có lợi
và đối kháng với vi khuẩn E. coli như Subtilis, Lactobacillus acidophillus ñể giúp
con vật chống lại bệnh [7], [13], [43].
Và gần ñây lại nghiên cứu thành công thêm sản phẩm kháng thể E. coli, là
một thuốc sinh học ñặc hiệu chống lại vi khuẩn E. coli mà không gây hậu quả xấu
như dùng kháng sinh.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 1
Các kết quả nghiên cứu về bệnh E. coli ở Việt Nam đã cho thấy độc lực, tính
gây bệnh ở các lứa tuổi, phân bố và cả tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli
đang lưu hành. Từ đó địi hỏi cấp bách phải có thuốc phịng bệnh chủ ñộng và Viện
thú y ñã nghiên cứu vacxin E. coli, tuy nhiên chưa nghiên cứu về phịng chống độc tố
của nó. Trong khi độc tố là phần khá quan trọng trong bệnh sinh của bệnh do
E. coli và cũng là yếu tố chính gây bệnh, làm bệnh trở nên trầm trọng hơn. Vấn ñề này
mở ra một hướng nghiên cứu mới về độc tố làm thuốc phịng bệnh E. coli cho lợn.
Từ kết quả thu ñược của ñề tài nghiên cứu ứng dụng cấp nhà nước năm 2007
về nghiên cứu ñộc tố E. coli của công ty thuốc thú y HANVET, chúng tơi tiến hành
đề tài: ‘‘Nghiên cứu một số chỉ tiêu trong quy trình sản xuất, kiểm nghiệm vacxin
giải ñộc tố E. coli phòng bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu ở lợn”
Mục đích nghiên cứu : Xây dựng quy trình kiểm nghiệm, đánh giá chất
lượng vacxin giải độc tố E. coli.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 2
2. TỔNG QUAN
2.1
Tình hình nghiên cứu trong nước
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) gây bệnh tiêu chảy và phù ñầu ở lợn con
ñã ñược biết ñến từ rất lâu và ngày càng phổ biến ở các trại chăn nuôi tập trung và
trong nông hộ. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, bệnh tiêu chảy và
phù ñầu ở lợn con ñã ñược khống chế phần nào, nhưng việc loại trừ nó trong chăn
ni thì hầu hết các nhà nghiên cứu đều cho rằng cịn rất nhiều khó khăn không
những ở nước ta mà ở cả các nước có trình độ khoa học tiên tiến trên thế giới [3],
[8], [17]. Chính vì vậy mà nhiều nhà khoa học vẫn quan tâm nghiên cứu.
Theo Lê Văn Tạo [31] bệnh do E. coli gây ra ở lợn con gồm 3 loại bệnh:
(1) Bệnh phân trắng lợn con phân lập ñược serotype O9, O111, O149, kháng
nguyên bám dính F4;
(2) Bệnh tiêu chảy do E. coli serotype O8, O141, O147, O149, O157, trong
đó O149 (F4) chiếm tỷ lệ cao;
(3) E. coli gây bệnh phù ñầu: Serotype kháng nguyên O138, O139K12H1,
O141K85q, O141K85ac, yếu tố bám dính F18 và độc tố thần kinh ST2e.
Cù Hữu Phú và cộng sự [23] ñã phân lập ñược 60 chủng vi khuẩn E. coli ở lợn từ
35 ngày ñến 4 tháng tuổi mắc bệnh tiêu chảy, trong ñó có 42 chủng gây dung huyết.
Lý Thị Liên Khai [17] khi phân lập E. coli từ phân lợn con bị tiêu chảy và
phân lợn con khỏe mạnh ñã cho biết: Các chủng E. coli mang K88, K99 và 987P là
nguyên nhân chính gây tiêu chảy cho lợn con từ 1 - 2 tuần tuổi. Vi khuẩn E. coli
thường xuyên cư trú trong ruột lợn và chúng chỉ gây bệnh khi gặp ñiều kiện thuận
lợi như: Tác ñộng stress làm giảm sức ñề kháng của lợn, làm tăng số lượng vi khuẩn
và sinh ñộc tố.
Trương Quang [25], 100% mẫu tiêu chảy phân lập được E. coli có độc lực
mạnh và yếu tố gây bệnh cao: Yếu tố bám dính 93,33%; dung huyết 53,33%; độc tố
chịu nhiệt (ST) 90%; độc tố khơng chịu nhiệt LT 90%; có cả hai loại ST và LT
73,33%; ñộc lực mạnh giết chết chuột 100%.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 3
Nguyễn Khả Ngự và cộng sự [19], [20], xác ñịnh khả năng dung huyết và
kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con trước và sau cai sữa bị phù
đầu ở đồng bằng sơng Cửu Long. Với 21 chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn chết,
tác giả cho biết 100% số chủng kết tủa với kháng huyết thanh K88, 40% gây dung
huyết mạnh, các chủng này đều có khả năng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh
thông thường.
Cũng nghiên cứu về khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây
tiêu chảy lợn, Bùi Thị Tho và cộng sự [36] sau khi kiểm tra khả năng kháng thuốc
kháng sinh của 183 chủng E. coli phân lập từ phân của lợn con bị phân trắng, đã nhận
định: Tính kháng thuốc của E. coli ở mỗi cơ sở có sự khác biệt rõ rệt tùy theo q
trình sử dụng và có sự khác biệt về chủng E. coli gây bệnh ở các lứa tuổi lợn khác
nhau. Các chủng E. coli tạo khuẩn lạc dạng nhám có tính kháng thuốc cao hơn các
chủng tạo khuẩn lạc trơn. Qua 20 năm kiểm tra tính kháng thuốc kháng sinh của
E. coli phân lập từ lợn con bị bệnh phân trắng, các tác giả nhận thấy tính kháng thuốc
của chúng ñối với một số thuốc kháng sinh thường dùng tăng lên rất nhanh. Tỷ lệ các
chủng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh cũng phát triển nhanh, một số chủng ñã
kháng với hầu hết các loại thuốc thường dùng [36].
Phạm Thế Sơn và cộng sự [26], các chủng E. coli gây bệnh lợn con tiêu chảy
chủ yếu mang kháng nguyên bám dính F4 (K88), độc tố đường ruột STa, STb và LT,
cả 3 loại STa+STb+LT.
Theo Trương Quang và cộng sự [25], kháng nguyên bám dính K88 (F4) là một
trong những yếu tố gây bệnh ñầu tiên, quan trọng của các chủng E. coli ñộc ở lợn 1 60 ngày tuổi. ðộc tố ñường ruột ST, LT và ST +LT.
ðỗ Ngọc Thúy và cộng sự [37] cho biết tỷ lệ kháng kháng sinh của 106
chủng E. coli ñược phân lập từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy có xu hướng kháng
mạnh với các loại thuốc kháng sinh thường dùng ñể ñiều trị bệnh như Amoxicillin,
Cloramphenicol, Streptomycin.
Nguyễn Viết Không và cộng sự [18], bằng phản ứng ELISA phát hiện kháng
thể trong huyết thanh của lợn sử dụng kháng nguyên F18-pili xác ñịnh tỷ lệ mang
kháng thể ñặc hiệu kháng E. coli gây bệnh phù đầu: Tỉ lệ 100% dương tính ở lợn
nái, 60% ở lợn con sơ sinh tuần ñầu, 12,5% ở nhóm lợn theo mẹ 15 - 21 ngày tuổi,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 4
thấp nhất ở lợn trước cai sữa 22 - 28 ngày tuổi; sau đó tăng dần theo lứa tuổi 30% ở
lợn con cai sữa, 57,5% ở lợn hậu bị.
ðỗ Trung Cứ và cộng sự [7], sử dụng chế phẩm Biosubtyl ñể phòng bệnh
tiêu chảy cho lợn con ñã làm giảm ñược 42% số lợn tiêu chảy ở giai ñoạn từ 1 - 60
ngày tuổi.
ðặng Xuân Bình, Trần Thị Hạnh, Lê Văn Tạo [4], chọn chủng chế chế phẩm
sinh học: 1 chủng F5 có sinh độc tố ST, LT; 2 chủng F6 có sinh ST và LT. Tất cả
đều kháng kháng sinh và có độc lực cao.
ðặng Xn Bình, ðỗ Văn Trung [5] chọn chủng E. coli F5, F6, F4 chế
vacxin ñều có ñộc tố ñường ruột LT. Vacxin ñã làm giảm ñược tỷ lệ lợn con mắc
bệnh phân trắng 9,5 - 11,2% so với lợn đối chứng khơng dùng vacxin.
2.2
Tình hình nghiên cứu ở nước ngồi
Cox và cộng sự [49] cho rằng, E. coli cộng sinh có mặt thường trực trong
đường ruột của người và động vật, trong q trình sống vi khuẩn có khả năng tiếp nhận
các yếu tố gây bệnh như yếu tố bám dính (K88, K99), yếu tố dung huyết (Hly), yếu
tố cạnh tranh (Colv), yếu tố kháng thuốc kháng sinh và ñộc tố ñường ruột. Các yếu tố
gây bệnh này khơng được di truyền qua ADN của nhiễm sắc thể mà ñược di truyền qua
ADN nằm trên plasmid. Những yếu tố gây bệnh này giúp cho E. coli bám dính vào tế
bào nhung mao ruột non, xâm nhập vào thành ruột, phát triển với số lượng lớn. Sau đó
vi khuẩn thực hiện q trình gây bệnh bằng cách sản sinh ñộc tố, gây triệu chứng tiêu
chảy, phá hủy tế bào niêm mạc ruột và tế bào nhung mao ruột non.
E. coli gây bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn con có mặt ở hầu hết các nước
trên thế giới nên đã có nhiều tác giả nghiên cứu về chúng. Simon và cộng sự [65] ñã
làm rõ vai trị của ba loại kháng ngun bám dính K88 trong E. coli là K88ab,
K88ac và K88ad và cho biết: Các chủng E. coli sản sinh ñộc tố ñường ruột (ETEC)
mang những kháng ngun bám dính này đều gây tiêu chảy nặng dẫn ñến tử vong ở
một số lợn con. Sự cảm nhiễm bệnh tiêu chảy và phù ñầu ở lợn con có liên quan
mật thiết đến khả năng bám dính của E. coli.
Smith thơng báo có hai loại độc tố là thành phần chính của Enterotoxin được
tìm thấy ở các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy. Sự khác biệt của hai loại ñộc tố này
nằm ở khả năng chịu nhiệt. ðộc tố chịu nhiệt (Heat stable toxin - ST) chịu ñược nhiệt
ñộ 1000C trong 15 phút, ñộc tố không chịu nhiệt (Heat labile toxin - LT) bị bất hoạt ở
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 5
600C trong vòng 15 phút [66].
Fairbrother và cộng sự [50] khi nghiên cứu các yếu tố gây bệnh ở từng chủng
E. coli phân lập ñược từ các thể bệnh khác nhau, ñã ñặt tên vi khuẩn theo những yếu
tố gây bệnh mà chúng có khả năng sinh ra như: Enterotoxigenic Escherichia coli
(ETEC), Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Verotoxigenic Escherichia coli
(VTEC) và Adherencia Enteropathogenic Escherichia coli (AEEC).
Cùng với việc phân lập và nghiên cứu các yếu tố gây bệnh của E. coli, việc
nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm phòng bệnh tiêu chảy ở lợn cũng ñã ñược các
nhà khoa học trên thế giới ñặc biệt quan tâm.
Akita và cộng sự (1993) ñã nghiên cứu sản xuất kháng ñộc tố ñặc hiệu qua
lịng đỏ trứng gà dùng trong phịng và chữa bệnh tiêu chảy cho lợn con [44].
2.3
Vi khuẩn Escherichia coli
Trực khuẩn ruột già Escherichia coli (E. coli) thuộc họ Enterobacteriaceae. Trong
các vi khuẩn đường ruột, E. coli là lồi phổ biến nhất. E. coli cịn có tên là
Bacterium coli commune, Bacillus coli communis do Escherich phân lập năm 1885
từ phân trẻ em.
E. coli thường xuất hiện rất sớm ở ñường ruột người và ñộng vật, ngay sau
khi ñẻ hai giờ và tồn tại cho ñến khi vật chủ chết. Chúng thường định cư ở phần sau
của ruột, ít khi gặp ở dạ dày hay ruột non. Trong nhiều trường hợp cịn tìm thấy
chúng ở niêm mạc của nhiều bộ phận khác trong cơ thể.
Từ đường tiêu hóa, E. coli được thải theo phân ra mơi trường ngồi. Việc
xác định chỉ số E. coli ở mơi trường giúp đánh giá mơi trường đó tốt hay xấu về
mặt vệ sinh [9], [32]. Ở điều kiện bình thường, các chủng E. coli khơng gây bệnh,
khi các điều kiện chăm sóc, ni dưỡng, vệ sinh thú y kém, ñiều kiện ngoại cảnh
bất lợi dẫn ñến sức chống ñỡ của con vật suy giảm thì E. coli trở nên độc và có
khả năng gây bệnh [32].
2.3.1 ðặc tính sinh vật hóa học của E. coli
2.3.1.1 ðặc tính hình thái
E. coli là trực khuẩn ngắn, hai ủu trũn, kớch thc 2 - 3ì0,6 àm. Trờn tiờu
bn nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu ñều hoặc sẫm ở hai ñầu,
ñứng tụ lại thành từng đám, đơi khi xếp 2 - 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài. Trong môi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 6
trường ni cấy lâu ngày có khi thấy những trực khuẩn dài 4 - 8 µm. E. coli di động
nhờ có lơng ở xung quanh thân, nhưng khi ni cấy trong điều kiện bất lợi sẽ mất lơng,
khơng di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày để
nhuộm có thể thấy màng giáp mơ, cịn khi soi tươi sẽ khơng thấy được. Dưới kính hiển
vi điện tử, cịn phát hiện được các pili, yếu tố bám dính của E. coli [33].
2.3.1.2 ðặc tính ni cấy
E. coli là trực khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt
độ từ 5 - 400C, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH thích hợp là 7,2 - 7,4 nhưng có thể phát
triển ñược ở pH từ 5,5 - 8,0 [38].
E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số
chủng có thể phát triển được ở mơi trường tổng hợp đơn giản [23].
Trong mơi trường nước thịt: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, E. coli phát triển
rất nhanh, mơi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đơi khi hình
thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt mơi trường, mơi trường có mùi phân thối.
Trên môi trường thạch thường: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, E. coli hình
thành khuẩn lạc trịn ướt, bóng láng, màu tro nhạt, hơi lồi, đường kính 2 - 3 mm. Có
thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng nhày (mucous) và dạng nhám (rough).
Trên môi trường thạch máu: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, hình thành
khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền khơng gọn, màu sáng, kích thước từ 1 - 2 mm. Có khi
gây dung huyết.
Trên môi trường thạch Mac Conkey: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, E. coli
hình thành khuẩn lạc màu đỏ cánh sen, trịn nhỏ, hơi lồi, khơng nhày, rìa gọn, không
làm chuyển màu môi trường.
Môi trường Endo: Sau khi ni cấy ở 370C/24 giờ, E. coli hình thành khuẩn
lạc màu ánh kim.
Môi trường thạch Brilliant Green: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, E. coli
hình thành khuẩn lạc màu vàng chanh
Môi trường E.M.B (Eosin Methyl Blue): Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ,
E. coli hình thành khuẩn lạc màu tím đen.
Mơi trường thạch Istrati: Sau khi ni cấy ở 370C/24 giờ, E. coli hình thành
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 7
khuẩn lạc màu vàng.
E. coli không mọc trên các môi trường lục Malachite và Muller Kauffmann,
bị ức chế khi nuôi trong các mơi trường Wilson Blair.
2.3.1.3 ðặc tính sinh hóa
- Lên men sinh hơi các loại đường:
E. coli có khả năng lên men sinh hơi các loại ñường glucose, fructose,
galactose, lactose, maniton, mannit, levulose, xylose; không lên men andonit và
innozit; lên men khơng ổn định các loại đường dulciton, saccarose, salixin [32].
E. coli lên men sinh hơi nhanh ñường lactose, cịn Salmonella spp thì khơng
có đặc tính này, đây là ñặc ñiểm quan trọng ñể phân biệt E. coli với Salmonella spp.
- Các phản ứng khác:
Sữa
Genlatin
ðơng sau 24 giờ đến 72 giờ ở 370C
Khơng tan chảy
Indol
+
Catalase
+
Oxidase
-
Urease
-
Di động
+
MR
+
VP
-
H2S
-
2.3.1.4 Sức đề kháng
E. coli có sức đề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt ñộ 550C trong 1 giờ hoặc 600C
trong 30 phút, ñun sơi 1000C thì chết ngay. Những chủng E. coli trong phân có xu
hướng đề kháng với nhiệt cao hơn những chủng phân lập ở mơi trường bên ngồi. Ở
mơi trường bên ngồi các chủng E. coli gây bệnh có thể tồn tại ñến 4 tháng. Các
chất sát trùng như axit phenic 3%, clorua thủy ngân (HgCl2) 0,1%, formol 0,2% có
thể diệt E. coli sau 5 phút. E. coli ñề kháng với điều kiện khơ và hun khói [32].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 8
2.3.2 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli
E. coli được chia thành các nhóm huyết thanh (serogroup) và kiểu huyết
thanh (serotype) khác nhau dựa theo cấu trúc kháng nguyên O, K, H và F. Theo phản
ứng kết tủa có 250 kiểu kháng nguyên O, 89 kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H và
một số kháng nguyên F [32], [33].
2.3.2.1 Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân - Ohne Hauch)
Kháng nguyên O của E. coli có bản chất lipopolysaccharide, rất ñộc. Chỉ cần
1/20 mg kháng nguyên O ñủ giết chết chuột bạch sau 24 giờ. Kháng nguyên O ñược
coi như một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào vi khuẩn.
Cấu trúc phân tử polysaccharide của kháng nguyên O gồm hai phần: Phần
polysaccharide nằm ngoài chứa nhóm hydro có chức năng tạo ra tính đặc trưng về
serogroup; phần polysaccharide ở bên trong khơng chứa nhóm hydro có chức năng
phân biệt giữa các dạng khuẩn lạc: dạng S (Smooth), dạng R (Rough), dạng M
(Mucous). Khi làm mất dần từng ñơn vị ñường của các chuỗi polisaccharide hoặc
làm thay đổi vị trí ở các đơn vị này sẽ dẫn ñến thay ñổi ñộc lực của các vi khuẩn.
Kháng ngun O chịu được nhiệt, khơng bị phá hủy khi ñun nóng ở 1000C
trong 2 giờ. Dưới tác ñộng của cồn, axít HCl nồng độ 1N vi khuẩn chịu được trong
20 giờ, nhưng lại bị phá hủy bởi formol 0,5%.
Kháng nguyên O ñược cấu trúc bởi các phân tử lớn, thành phần các phân tử gồm:
+ Polyosit: tạo ra tính ñặc hiệu của kháng nguyên.
+ Protein: làm cho phức hợp có tính kháng ngun.
+ Lipit: kết hợp với polyosit và là cơ sở của độc tính.
Tất cả kháng ngun O ñều cư trú ở bề mặt, do ñó nó liên hệ trực tiếp với hệ
thống miễn dịch. Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra
phản ứng kết tủa. Phản ứng kết tủa kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ, khi lắc
rất khó tan.
2.3.2.2 Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch)
Kháng nguyên H là thành phần lơng của vi khuẩn, có bản chất protein, rất
kém bền vững so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H không chịu nhiệt, bị phá
hủy ở 600C trong 1 giờ. Bị cồn 50% và các enzym phân giải protein phá hủy. Kháng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 9
nguyên H tồn tại ñược khi xử lý bằng formol 0,5%.
Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tương ứng sẽ tạo ra hiện tượng kết tủa
H, trong đó các vi khuẩn ñược kết tủa lại với nhau nhờ các lơng vì các kháng thể H
khi cố định trên lơng sẽ là cầu nối với các lông bên cạnh. Phản ứng xảy ra nhanh
hơn so với kháng nguyên O và các hạt kết tủa cũng lớn hơn, giống như những cụm
bơng rất dễ tan khi lắc vì lơng của vi khuẩn rất nhỏ và dễ ñứt. Vi khuẩn di ñộng khi
tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành khơng di động.
Kháng ngun H của E. coli khơng có tính độc và cũng khơng có ý nghĩa
trong đáp ứng miễn dịch phịng vệ nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý
nghĩa rất lớn trong việc xác ñịnh tên vi khuẩn [22]. Các nhà khoa học đã dùng
những chủng E. coli có lơng và khơng có lơng của cùng một serogroup O để gây
cảm nhiễm cho chuột bằng ñường miệng với lượng vi khuẩn bằng nhau. Kết quả
cho thấy khả năng gây bệnh cho chuột thí nghiệm hoàn toàn giống nhau.
Kháng nguyên H bảo vệ cho vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào ñại thực
bào, từ đó giúp vi khuẩn sống lâu và tồn tại lâu hơn trong ñại thực bào.
2.3.2.3 Kháng nguyên K (Kháng ngun vỏ - Capsular)
Kháng ngun K cịn được gọi là kháng nguyên vỏ (Capsular), chúng bao
quanh tế bào vi khuẩn và có bản chất hóa học là polysaccharide. Kháng nguyên này
ngăn cản sự ngưng kết của vi khuẩn trong huyết thanh "O" tương ứng. Khi đun
nóng 100 - 1210C kháng nguyên sẽ mất tác dụng ngăn cản. Vai trò của kháng
ngun K chưa được thống nhất lắm. Có nhiều ý kiến cho rằng, nó khơng có ý
nghĩa về độc lực của vi khuẩn, vì thấy độc lực của chủng E. coli có kháng ngun K
cũng giống độc lực của chủng khơng có kháng ngun K [42]. Có ý kiến khác cho
rằng, nó có ý nghĩa về độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố
phòng vệ của vật chủ [27]. Tuy vậy, phần lớn các ý kiến đều thống nhất kháng
ngun K có hai nhiệm vụ sau:
+ Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O nên thường ghi liền
công thức serotype của vi khuẩn là Ox:Ky như E. coli O139:K88, O149:K88...
+ Tạo ra hàng rào bảo vệ cho cho vi khuẩn chống lại tác ñộng của ngoại cảnh
và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 10
2.3.2.4 Kháng nguyên F ( Kháng nguyên bám dính - Fimbriae)
Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh ñều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng
nguyên bám dính. Các chủng khơng gây bệnh khơng có kháng ngun bám dính.
Kháng ngun bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể ñặc hiệu trên bề mặt tế
bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày, giúp vi khuẩn chống lại khả năng đào thải
của nhu động ruột. Kháng ngun bám dính của E. coli nằm trên cấu trúc pili
(fimbriae), một cấu trúc ngắn thẳng, xuất phát từ một ñĩa gốc trong màng nguyên
sinh chất của tế bào vi khuẩn. Fimbriae có bản chất là protein mọc trên bề mặt tế
bào vi khuẩn với số lượng từ 10 - 40 fimbriae trên một tế bào vi khuẩn. Quan sát
dưới kính hiển vi ñiện tử, chúng giống như một chiếc áo lông bao bọc xung quanh
vi khuẩn. Fimbriae của vi khuẩn E. coli khác lơng ở chỗ cứng hơn, khơng lượn sóng
và khơng liên quan đến chuyển động. Kháng ngun bám dính được phân loại bởi
phản ứng huyết thanh, thụ thể ñặc hiệu hoặc bằng khả năng kết tủa với hồng cầu của
các lồi động vật khác nhau và bằng phản ứng PCR [11], [27], [46].
Kháng ngun có chức năng bám dính đặc trưng của ETEC (Enterotoxigenic
E. coli) gây bệnh cho lợn chủ yếu là F4 (K88), F6 (987P), F17 và đơi khi có cả F5
(K99). Kháng ngun có chức năng bám dính của ETEC gây tiêu chảy nguyên phát ở
trâu bò là F5 (K99) đơi khi thấy cả F4 (K88) với tỷ lệ ít hơn. E. coli gây bệnh cho trẻ
em thường có kháng ngun bám dính F41 [11], [30].
2.3.3 Các yếu tố gây bệnh của E. coli
2.3.3.1 Yếu tố bám dính của E. coli
ðể gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính được lên tế bào biểu mơ của
ruột non. Q trình bám dính được thực hiện qua ba giai đoạn: Hấp thụ, gắn kết và
bám dính. Hai q trình trước ñược thực hiện nhờ các tác ñộng vật lý, hóa học,
bước bám dính được thực hiện bởi các sợi bám dính chun biệt (pili) trên bề mặt
vi khuẩn đảm nhiệm, đó là q trình liên kết giữa kháng ngun tại yếu tố bám
dính với các receptor tương ứng trên bề mặt của các tế bào biểu mô. Hầu hết các
chủng ETEC đều có các yếu tố bám dính, bao gồm: K88 (F4), K99 (F5), 987P
(F6), F17, F18, F41, F42 và F165.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 11
