Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của cây thạch tùng thân gập (Huperzia squarrosa)

Mục lục

1


Lời cảm ơn
Lời đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Trường Đại học Bách
khoa Hà Nội đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em trong quá trình học tập,
nghiên cứu để có thể hoàn thành đồ án của mình.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Lê
Thị Thùy, cảm ơn cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt cho chúng em nhiều kiến thức và
kinh nghiệm khoa học vô cùng quý báu. Cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trên từng
bước đường trong suốt thời gian học tập và hoàn thành đồ án chuyên ngành tại bộ môn
Công nghệ Hoá dược & Bảo vệ thực vật - Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội.
Chúng em cũng xin chân thành cảm ơn các bạn trong lớp Hoá dược – K59, trường
Đại học Bách khoa Hà Nội đã luôn quan tâm, giúp đỡ trong quá trình học tập và thực
hiện đồ án.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Nhóm sinh viên

2


Lời mở đầu
Ngành công nghiệp hoá dược và Hóa học các hợp chất thiên nhiên và các hợp chất
có hoạt tính sinh học là một trong những lĩnh vực nghiên cứu đã và đang được nhiều
nhà khoa học quan tâm. Trong đó, các loài cây thuốc là một nguồn tại nguyên hết sức
quý báu mà thiên nhiên đã mang tặng cho con người, chúng ta cần biết trân trọng và sử
dụng hợp lý nguồn tài nguyên vô giá này. Do vậy, sự hiểu biết cũng như việc nghiên
cứu thành phần hoá học của những cây cỏ làm thuốc là hết sức cần thiết. Việc xác định
thành phần hoá học, tác dụng dược lý của cây thuốc có một ý nghĩa hết sức quan trọng,

góp phần phát triển và cung cấp những hợp chất có giá trị cho công nghiệp hoá dược,
thực phẩm, hương liệu, mỹ phẩm…, có tác dụng thiết thực trong đời sống hàng ngày,
và là vấn đề quan tâm của toàn xã hội.
Cây Thạch tùng thân gập (tên khoa học là Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis, hay
còn có tên gọi khác là cây Thông đất) chứa hoạt chất Huperzine A và Huperzine B có
tác dụng điều trị bệnh Alzheimer rất hiệu quả. Chúng là các alcaloids ức chế
Acetylcholinesterase (AChE) mạnh, thuận nghịch, có chọn lọc và được hứa hẹn sẽ là
một loại thuốc đầy tiềm năng cho việc điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer.
Hiện nay, cây Thạch tùng thân gập đang rất được quan tâm, nghiên cứu, khai thác
và ứng dụng trong điều trị các bệnh về rối loạn trí nhớ, tổn thương não nhất là bệnh
Alzheimer. Vì thế, đề tài “Tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
cây Thạch tùng thân gập (Huperzia squarrosa)” sẽ góp phần đánh giá, bổ sung về
thành phần hoá học và tác dụng dược lý của Huperzia squarrosa.
Đồ án cung cấp những thông tin khoa học về quy trình chiết tách, xác định thành
phần hoá học được phân lập từ Huperzia squarrosa qua một số công bố khoa học trên
thế giới và ở Việt Nam. Bên cạnh đó, tìm hiểu về hoạt tính sinh học của một số chất có
hoạt tính được phân lập từ cây, đặc biệt là khả năng ức chế AChE của chúng, nhằm
điều trị bệnh Alzheimer một cách hiệu quả.
Nội dung của đồ án gồm 3 chương:
Chương 1: Tổng quan
3


Chương 2: Thành phần hoá học
Chương 3: Hoạt tính sinh học

PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1.

Mô tả về loài thực vật [1], [2], [7], [9]

Tên khoa học: Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis.
Tên đồng nghĩa: Lycopodium squarrosum (Forst.) Trevis.
Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis thuộc Họ Thông đất (Lycopodiaceae), lớp
Lycopodiopsida (bộ Lycopodiales); là loài thực vật chi Huperzia Bernh.
Tên Việt Nam: Râu rồng, Thạch tùng vảy, Thông đất nhám.
Mô tả về loài thực vật: Cây thảo phụ sinh, thân thòng thường mập, hình trụ, mọc
đứng ở phần gốc, sau gập thõng xuống dài 30-70 cm, dài 50-60 cm, 1-2 lần lưỡng
phân, to 4-5 mm. Lá hẹp, nhọn, xếp xoắn ốc hình dải - ngọn giáo, tỏa rộng ra, không
cuống, mép nguyên, lá ở đỉnh thì ngắn hơn lá ở gốc. Chùy dài ở dưới chót nhánh. Bào
tử diệp không khác lá thường, chỉ hơi nhỏ hơn; bào tử nang hình thận, nở thành 2
mảnh không bằng nhau. Bộ phận sinh sản ở ngọn thân thành bông không phân nhánh,
dài khoảng 10 cm, lá bào tử giống lá thật, nhưng ngắn hơn 2 lần, thẳng, nhọn, hơi
phình ở gốc. Túi bào tử hình thận, có 2 mảnh vỏ bằng nhau.
Công dụng: Râu rồng có vị hơi đắng, tính bình; có tác dụng khư phong, trừ thấp,
chỉ huyết. Dân gian dùng toàn cây trị ngoại thương xuất huyết. Có thể dùng trị đòn ngã
tổn thương. Ở Vân Nam (Trung Quốc) nhân dân địa phương dùng toàn cây trị đau dây
thần kinh hông và đau lưng do phong thấp. Ở Nepal, toàn cây râu rồng được dùng giã
đắp trị đau lưng.
1.2.

Sự phân bố và thu hái [1], [9]

Sinh thái: Thường mọc ở thân cây, đá ẩm, vùng núi. Râu rồng là cây ưa ẩm, ưa
bóng, thích nghi với điều kiện khí hậu mát và ẩm vùng núi. Cây thường bám trên vách
4


đá, hoặc trên thân, cành những cây gỗ lớn trong rừng kín thường xanh ẩm còn nguyên
sinh hay tương đối nguyên sinh.

Cây sinh sản bằng bào tử diễn ra trong môi trường nước (chủ yếu là nước mưa).
Cây cũng có khả năng mọc chồi nhanh sau khi bị cắt hoặc bị gãy. Hiện nay, tình trạng
trồng làm cảnh khác môi trường sống tự nhiên của nó và kích thước quẩn thể cây nhỏ
nên râu rồng có thể xếp vào nhóm cây đang bị đe dọa.
Phân bố khá hẹp, ở một số vùng núi thấp, có khi cả núi trung bình của Cao Bằng
(Trà Lĩnh), Thanh Hóa, Lâm Đồng (núi Lang Bian) và Khánh Hòa (hòn Vọng Phu).
Còn gặp ở Lào, Campuchia cũng như nhiều nước thuộc xứ 6 hệ thực vật cổ nhiệt đới.
Trên thế giới còn có ở Trung Quốc, Lào, từ Mađagátxca đến châu Đại Dương, Đài
Loan và Himalaya.
1.3.

Sơ lược về thành phần hóa học [3], [10], [14]

Các

alkaloid

phân

lập

được

từ

Huperzia

squarrosa

(Forst.)

Trevis:

Lycosquarosine A (1), Acetylaposerratinine (2), Huperzine A (3), Huperzine B (4), 8αhydrophlemariurine B (5), Huperzinine (6), Lycoflexine N-oxide (7), Phlegmariurine B
(8), Lycoposerramine U N-oxide (9), 12-epilycodine N-oxide (10) và Pyrrolhuperzine
A (11).
Bảng 1. Cấu trúc của các alkaloid trong Huperzia squarrosa

5


1.4.
Tác dụng dược lý
1.4.1. Bệnh Alzheimer [3], [11], [12], [17]

Bệnh Alzheimer (AD) là một loại chứng mất trí gây ra vấn đề về trí nhớ, suy nghĩ
và hành vi. Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa thần kinh và là nguyên nhân phổ
biến và chủ yếu gây ra chứng sa sút trí tuệ ở người cao tuổi, kích thích suy giảm nhận
thức tiến triển, rối loạn tâm thần, mất trí nhớ, sự hiện diện của tuổi già, rối loạn dây
thần kinh và giảm sự truyền cholinergic.

6


Triệu chứng thường phát triển chậm và trở nên trầm trọng hơn theo thời gian, trở
nên nghiêm trọng đủ để can thiệp vào công việc hàng ngày.
Thần kinh học đã chứng minh rằng chức năng cholinergic làm suy giảm não trước
và vỏ não ở bệnh mất trí nhớ do tuổi già của chứng Alzheimer.
Các vấn đề cơ bản của bệnh Alzheimer:
Bệnh Alzheimer là dạng bệnh mất trí nhớ phổ biến nhất, một thuật ngữ chung về

mất trí nhớ và các khả năng nhận thức khác nghiêm trọng ảnh hưởng đến cuộc sống
hàng ngày. Bệnh Alzheimer chiếm từ 60 đến 80% trường hợp sa sút trí tuệ. Bệnh
Alzheimer không phải là một phần bình thường của sự lão hóa.Yếu tố rủi ro được biết
đến nhiều nhất là tuổi càng ngày càng tăng, phần lớn những người mắc bệnh
Alzheimer đều từ 65 tuổi trở lên. Nhưng bệnh Alzheimer không chỉ là bệnh ở tuổi già.
Khoảng 200.000 người Mỹ dưới 65 tuổi mắc chứng bệnh Alzheimer sớm (còn gọi là
bệnh Alzheimer sớm khởi phát).
Bệnh Alzheimer hiện tại không có phương pháp điều trị, nhưng vẫn có các phương
pháp trị liệu cho các triệu chứng và vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu. Mặc dù các
phương pháp điều trị hiện tại của Alzheimer không thể ngăn chặn bệnh Alzheimer tiến
triển, nhưng họ có thể tạm thời làm chậm lại các triệu chứng của chứng mất trí và cải
thiện chất lượng cuộc sống cho những người có bệnh Alzheimer và những người chăm
sóc bệnh Alzheimer. Ngày nay, trên toàn thế giới, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực
nhằm tìm ra những phương pháp tốt hơn để điều trị bệnh Alzheimer, trì hoãn thời gian
khởi phát và ngăn không cho nó phát triển.
Các yếu tố nguy cơ của bệnh Alzheimer sớm:
Bệnh Alzheimer tiến triển theo thời gian, nơi các triệu chứng mất trí trở nên trầm
trọng hơn qua các năm. Trong giai đoạn đầu, mất trí nhớ là nhẹ, nhưng với bệnh
Alzheimer giai đoạn muộn có thể mất khả năng giao tiếp. Bệnh Alzheimer là nguyên
nhân thứ sáu gây tử vong ở Hoa Kỳ. Những người bị bệnh Alzheimer sống trung bình
tám năm sau khi các triệu chứng của họ trở nên đáng chú ý với người khác, nhưng
sống sót có thể từ 4 đến 20 năm, tùy theo tuổi tác và các điều kiện sức khoẻ khác.
1.4.2. Dấu hiệu cảnh báo của bệnh Alzheimer [18]
• Mất trí nhớ làm ảnh hường tới cuộc sống hằng ngày:
7


Một trong những dấu hiệu phổ biến nhất của bệnh Alzheimer là mất trí nhớ, đặc biệt là
quên những thông tin đã đọc gần đây. Có thể bao gồm quên ngày hoặc sự kiện quan
trọng; hỏi lại nhiều lần một vấn đề; ngày càng cần phải dựa vào các bộ phận trợ giúp

bộ nhớ (ví dụ như ghi chú nhắc nhở hoặc thiết bị điện tử) hoặc các thành viên trong gia
đình về những thứ họ tự xử lý.
•

Gặp khó khăn trong việc lên kế hoạch và giải quyết vấn đề:

Một số người có thể gặp những thay đổi trong khả năng của họ để lập kế hoạch và làm
theo kế hoạch hay làm việc với những con số. Họ có thể quên một công thức quen
thuộc hoặc theo dõi các hóa đơn hàng tháng. Họ có thể gặp khó khăn trong việc tập
trung và mất nhiều thời gian hơn để làm việc giống trước đây đã làm.
•

Khó hoàn thành công việc hàng ngày:

Những người bị Alzheimer thường cảm thấy khó hoàn thành công việc hàng ngày. Đôi
khi, mọi người có thể gặp sự cố khi lái xe tới một vị trí quen thuộc, quản lý tiền bạc
hoặc ghi nhớ các quy tắc của trò chơi yêu thích.
•

Quên thời gian và địa điểm:

Những người bị bệnh Alzheimer có thể quên ngày, mùa và thời gian. Họ có thể gặp
khó khăn để hiểu một điều gì đó nếu nó không xảy ra ngay lập tức. Đôi khi họ có thể
quên vị trí của họ và cách họ đến đó.
•

Gặp khó khăn để hiểu hình ảnh trực quan và không gian:

Đối với một số người, có vấn đề về thị lực là dấu hiệu của bệnh Alzheimer. Họ có thể
gặp khó khăn khi đọc, đánh giá khoảng cách và xác định màu sắc hoặc độ tương phản,

điều này có thể gây ra vấn đề khi lái xe.
•

Gặp khó khăn trong nói và viết:

Những người có bệnh Alzheimer có thể gặp rắc rối khi theo dõi và tham gia cuộc trò
chuyện. Họ có thể dừng lại ở giữa một cuộc trò chuyện và không biết làm thế nào để
tiếp tục hay gặp khó khăn với từ vựng trong giao tiếp.
•

Để sai vị trí và quên đường đi:
8


Một người có bệnh Alzheimer có thể để đồ đạc trong phòng nhầm chỗ. Họ có thể bị
mất đồ và quên đường.
1.4.3. Điều trị Alzheimer từ thực vật [3], [4], [8]

Theo đó, sự tăng cường truyền dẫn thần kinh cholinergic đã được coi là một trong
những cách tiếp cận điều trị tiềm năng chống AD. Mặc dù sinh bệnh học của AD phức
tạp và liên quan đến nhiều con đường, hai giả thuyết lớn hiện đang được xem xét về cơ
chế phân tử là: giả thuyết cholinergic và giả thuyết cascade amyloid. Do đó, trọng tâm
ở đây là các chất ức chế cholinesterase chọn lọc (ChE) để giảm bớt sự thiếu hụt
cholinergic và cải thiện sự truyền dẫn thần kinh. Theo đó, cả hai đều có thể được thiết
lập thành các mục tiêu điều trị hữu hiệu đối với AD.
Một chiến lược điều trị để tăng cường chức năng cholinergic là sử dụng chất ức chế
acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) để tăng lượng acetylcholine, có trong các
khớp thần kinh giữa nơ-ron thần kinh cholinergic. Các chất ức chế AChE như
donepezil, rivastigmine và galantamine, được nghiên cứu rộng rãi nhất. Các chất ức
chế AChE, đã được chứng minh là cải thiện đáng kể chức năng nhận thức trong AD.

Các loài rêu (Lycopodiaceae) được biết đến là một nguồnalkaloid Lycopodium
phong phú có hệ dị vòng phức tạp và các đặc tính sinh học khác nhau. Huperzine A,
một loại alkaloid với bộ khung C16N2 được phân lập từ loài Huperzia serrata của
Trung Quốc đã được chứng minh là chúng có hiệu quả cao, đặc hiệu, và là chất ức chế
thuận nghịch của AChE. Cho đến nay, hơn 300 alkaloids Lycopodium đã được công
bố. Hầu hết các alkaloids Lycopodium có hoạt tính ức chế AChE như huperzine A,
huperzine B, và N-methylhuperzine B thuộc nhóm Lycodine. Người ta đang nỗ lực
không ngừng để tìm kiếm các alkaloid Lycopodium cấu trúc và hoạt tính sinh học thú
vị, đặc biệt là trong Lycopodium spp. từ Việt nam, một alkaloid kiểu C 16N1 mới,
lycosquarosine A đã được phân lập cùng với năm alkaloid Lycopodium đã biết đến từ
loài Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis. Trước đây, Lycopodium squarrosum (H.
squarrosa) có nguồn gốc từ Thái Lan, được nghiên cứu về mặt hóa thực vật và có một
số alkaloid fawcettimine đã được mô tả.

9


PHẦN 2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC
2.1.
Phương pháp 1 [14]
2.1.1. Sơ đồ khối

10


Sephadex LH-20 (103,17g);
MeOH:CH2Cl2 (1:1) (400ml).

Phân
Phânđoạn

đoạnF3.1
F3.2 Phân đoạn F3.3 Phân đoạn F3.

11


HPLC (MeOH: H2O; 1:1)

……

……

Lycoflexine N-oxide
Phlegmariurine
(7) (6,5mg)
B (8) (4,0mg)

12-epilycodine N-oxide (10)
Lycoflexine N-oxide (7) HuperzineA (3)
Phân đoạn F3.4I

……

……

Lycoposerramine U N-oxide (9)

2.1.2. Thuyết minh

Toàn bộ cây tươi (rhizome-stem-sporangia) của H.squarrosa (1,25kg) được ngâm

trong MeOH (12Lx3) ở nhiệt độ phòng trong 6 ngày, thu được dịch chiết MeOHvà cho
bay hơi đến khô. Cặn chiết thô (107.67g) được hoà tan với axit tar-taric 3% (800mL).

12

……


Dịch nước được chiết với EtOAc (400mLx3), kiềm hóa với NaHCO 3 (pH=10), và sau
đó được chiết với CH2Cl2 (500mLx5).
Pha hữu cơ được làm khan bằng Na 2SO4 khan và cho bay hơi thu được phân đoạn
alkaloid(1,86g). Phân đoạn này được tiến hành sắc ký cột trên Sephadex LH-20 (980g)
sử dụng hệ dung môi MeOH:CH2Cl2 (1:1, v/v) (500ml) thu được các phân đoạn F1 đến
F4. Phân đoạn F3 (1,33g) được tiến hành sắc ký cột lần 2 trên Sephadex LH-20
(103,17g) sử dụng hệ dung môi MeOH:CH2Cl2 (1:1, v/v) (400ml) thu được 4 phân
đoạn F3.1 đến F3.4.
Phân đoạn 3.3 được tiếp tục tinh chế bằng HPLC (cột Cosmosil 5C18-Ms-II) với
hệ dung môi MeOH : H2O (1:1, v/v) thu được 16 phân đoạn (F3.3A-P).
•
•

Lycoflexine N-oxide (7) (6.5mg) thu được từ phân đoạn F3.3G.
Phlegmariurine B (8) (4.0mg) thu được từ phân đoạn F3.3K.

Phân đoạn 3.4 được tinh chế bằng HPLC (cột Cosmosil 5C18-Ms-II) sử dụng hệ
dung môi MeOH : H2O (3:2, v/v) thu được 20 phân đoạn (F3.4.A-Z).
•
•
•
•

Lycoposerramine U N-oxide (9) (4,3 mg) thu được từ phân đoạn F3.4E.
12-epilycodine N-oxide (10) (8,4mg) thu được từ phân đoạn F3.4F.
Lycoflexine N-oxide (7) (4.4mg) thu được từ phân đoạn F3.4I.
Và HuperzineA (3) (1,2 mg) thu được từ phân đoạn F3.4 P.

2.1.3. Thành phần

Các chất phân lập được:
Bảng 2. Cấu trúc của các alkaloids phân lập được

13


2.2.
Phương pháp 2 [10]
2.2.1. Sơ đồ khối

14


Sắc ký cột Silicagel (2x20 cm, Hex

15


2.2.2. Thuyết minh
Mẫu cây H.squarrrosa khô (750g) được nghiền nhỏ và ngâm trong MeOH (3Lx4)

ở nhiệt độ phòng. Cặn chiết thô được hoà với dung dịch gồm axit tartaric 5% (200ml)

và CH2Cl2. Pha nước được kiềm hóa bằng dung dịch Na 2CO3 tới pH=10 và sau đó
được chiết với CH2Cl2. Phần chiết giàu alkaloid (1,39 g) được tiến hành sắc ký cột
Sephadex LH-20 (3×91 cm, CH2Cl2:MeOH, 1:1, 700 mL) và thu được 6 phân đoạn
(P1-P6).
Phân đoạn P5 (686,4mg) được tiến hành sắc ký cột lần 2 trên Sephadex LH-20
(3×70 cm, CH2Cl2:MeOH, 1: 1, 2000 mL) thu được 7 phân đoạn (P5.1-P5.7).
Phân đoạn P5.5 (543,3mg) được tiến hành sắc kí cột silicagel (3×30 cm,
CH2Cl2:MeOH: NH3-MeOH, 1:0:0–0:9:1) thu được 7 phân đoạn (P5.5.1-P5.5.7).
• Phân đoạn P5.5.1 (44,3 mg) được tiến hành sắc kí cột silicagel (2x20 cm, Hexane:
EtOAc:MeOH, 3:7:0-0:7:3) thu được hợp chất Pyrrolhuperzine A (11) (6,7 mg) là chất
rắn màu trắng.
• Từ phân đoạn P5.5.2 thu được Huperzine A (3) tinh khiết (214,5 mg, 0.0014%).
2.2.3. Thành phần

Bảng 3. Cấu trúc của các alkaloid phân lập được

16


2.3.
Phương pháp 3 [3]
2.3.1. Sơ đồ khối

17


Hợp chất 2

Hợp chất 1

18


2.3.2. Thuyết minh

Cây thạch tùng thân gập (H.Squarrosa) được thu hái tại tỉnh Lâm Đồng, miền
Trung Việt Nam tháng 5 năm 2012, được xác định bởi giáo sư Trần Công Luận, khoa
Y học cổ truyền, trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu nghiên cứu
(TCL 00116) được đặt ở Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh.
Mẫu nguyên liệu thô (2.5 kg) được chiết với 5L Metanol trong 3 lần. Dịch chiết
được cô dưới áp suất giảm thu được dich chiết thô (502g), sau đó huyền phù hóa trong
HCl 5% và hòa với CH2Cl2. Lớp nước được kiềm hóa tới pH~10 với dung dịch NH 3,
chuẩn bị cho sắc ký cột hạt nhựa macrophy Dianion HP 20, kích thước cột (750×1000
mm).
Quá trình sắc ký cột được thực hiện như sau: Dịch chiết(pH=10) được bơm vào
cột. Sau khi hấp phụ, cột được rửa với nước khử ion để loại bỏ các chất phân cực, sau
đó rửa giải với Metanol 100% thu được dịch chiết alkaloid thô. Dịch chiết được cô
quay ở 40 ̊C, thu được cặn chiết. Cặn chiết này tiếp tục tiến hành sắc ký cột với chất
hấp phụ silicagel, hệ dung môi sử dụng CH 2Cl2/MeOH với gradient nồng độ thay đổi
từ 100-0 đến 0-100, 80%CH2Cl2/MeOH, sau đó bão hòa với , thu được 8 phân đoạn.
•

Sau khi loại dung môi của phân đoạn 2 (242 mg) thu được một chất rắn vô định
hình, không màu (16.3mg, hợp chất 1) từ kết tinh trong hệ dung môi MeOH-

acetone.
• Sau khi loại bỏ dung môi của phân đoạn 3 (870 mg), hợp chất 2 thu được từ kết
tinh trong hệ dung môi MeOH-acetone (26mg).
• Phân đoạn 7 (218 mg) tiến hành chạy cột MPLC với hệ dung môiMeOH/H 2O
(5:1) thêm 0.1% axit triflo axetic (TFA) thu được hợp chất 3 (8.5mg).

• Từ phân đoạn 4 (115 mg), hai hợp chất 4 (3.6 mg, tR = 18.6 min) và hợp chất 5
(3.6 mg, tR = 21.1 min) được tinh chế bằng semi-preparative HPLC (sử dụng
hệ dung môi MeOH 0.1% TFA (25:75 → 85:15; tốc độ dòng 5 mL/ phút) trong
90 phút; phát hiện UV ở bước sóng 210 nm; YMC Pak cột ODS-A (20×250
mm, kích thước hạt 5 μm].
• Hợp chất 6 (5.5 mg; tR = 28.6 min) thu được từ phân đoạn 5 (212 mg) bằng
semi-preparative HPLC (sử dụng hệ dung môi MeOH-0.1% TFA (20:80 →
80:20; tốc độ dòng 5 ml/phút) trong 90 phút; phát hiện UV ở bước sóng 210
nm; YMC Pak cột ODS-A (20×250 mm, kích thước hạt 5 μm).
19


2.3.3. Thành phần

Các chất phân lập được:
Bảng 4. Cấu trúc của các hợp chất phân lập được

20


PHẦN 3. HOẠT TÍNH SINH HỌC
3.1.
Hoạt tính ức chế ACh và AChE
3.1.1. Thí nghiệm ức chế sự hoạt động cholinesterase trong ống nghiệm [3]

Hoạt tính ức chế các enzym Acetylcholinesterase (AChE) và butyryl-cholinesterase
(BChE) được đo bằng phương pháp quang phổ được phát triển bởi Ellman và cộng sự
với sự điều chỉnh nhỏ. ACH và BCh được sử dụng làm chất nền để phát hiện sự ức chế
của AChE và BChE. Hỗn hợp phản ứng có dung dịch đệm natri phosphat (pH = 8.0,
140 μL); dung dịch mẫu thử nghiệm (20 μL); và dung dịch AChE hoặc BChE (20 μL)

được trộn lẫn và ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Tất cả các mẫu kiểm tra và đối
chứng dương tính (berberine) được hòa tan trong dimethyl sulfoxide phân tích 10%.
Các phản ứng được bắt đầu với việc bổ sung DTNB (10 ml) và ACh hoặc BCH (10
ml), tương ứng.
Quá trình thủy phân của ACh hoặc BCh được theo dõi bằng cách tạo thành anion
5-thio-2-nitrobenzoate màu vàng ở 412 nm trong 15 phút, là kết quả của phản ứng của
DTNB với thiocholine, được giải phóng bởi quá trình thủy phân enzyme của ACh hoặc
BCh. Tất cả các phản ứng được thực hiện trong ba lần và ghi lại trong 96-well
microplates, sử dụng dụng cụ VERSA max (Molecular Devices, Sunnyvale, CA,
USA). Tỷ lệ ức chế được tính từ biểu thức (1-S/E)x100, trong đó E và S là các enzyme
hoạt động tương ứng khi không có và có mẫu kiểm tra tương ứng. Hoạt tính ức chế
ChE của mỗi mẫu được biểu diễn theo chỉ số IC50 (μM cần thiết để ức chế sự thủy
phân của chất nền, ACh hoặc BCh, 50%), được tính từ đường cong ức chế log-dose.
3.1.2. Vai trò của ACh và AChE
3.1.2.1.
Vai trò của ACh trong bệnh Alzheimer [6]

Acetylcholine (ACh) thúc đẩy sự tỉnh táo trong phần nền não trước. Kích thích
phần não này tăng sự giải phóng acetylcholine, giúp tỉnh táo và có giấc ngủ REM
(Rapid Eye Movement), ngược lại sự ức chế phóng thích acetylcholine ở phần nền não
trước bằng adenosine gây giấc ngủ sóng chậm.
Sự góp mặt của phân tử acetylcholine (ACh) có vai trò quan trọng và đáng chú ý
trong việc truyền dẫn thần kinh. Tuy nhiên, thực tế là toàn bộ khu vực vỏ não nhận
cholinergic đi vào từ phần nền não trước cho thấy ACh có nhiều vai trò ngoài việc tăng
khả năng tập trung, và giả thuyết này phù hợp với những phát hiện cho thấy rằng
21


cholinergic có một tác động đáng kể tới nhận thức. Trên thực tế, giả thuyết cholinergic
của bệnh Alzheimer cho thấy sự thiếu hụt dẫn truyền thần kinh cholinergic trong vỏ

não góp phần vào sự suy giảm nhận thức đặc trưng ở bệnh nhân. Tuy nhiên, do tầm
quan trọng của cholinergic trong khả năng tập trung, mức độ rối loạn chức năng nhận
thức trong bệnh Alzheimer là kết quả trực tiếp từ sự bất thường của cholinergic (chứ
không phải là một di chứng của hiện tượng mất tập trung do lỗi dẫn truyền thần kinh
cholinergic).
Ví dụ, hoạt tính của acetyltransferase choline, enzyme xúc tác quá trình tổng hợp
của ACh từ choline và acetyl coenzyme A, giảm xuống còn 35% đến 50% mức bình
thường trong bệnh Alzheimer.
Hơn nữa, sự tái hấp thu synaptic của cholin, là điều cần thiết cho việc tổng hợp các
phân tử ACh sẽ được giải phóng vào khe synaptic (khớp thần kinh) trong các vòng
truyền dẫn thần kinh tiếp theo, giảm xuống -60% mức bình thường trong bệnh
Alzheimer, và qua phép đo trực tiếp cho thấy rằng mức độ tổng hợp ACh giảm xuống
một nửa ở các bệnh nhân bị ảnh hưởng. Trên thực tế, điều này đã được chứng minh
rằng mức độ suy giảm của tổng hợp ACh có tương quan đáng kể với hiện tượng ngày
càng tăng mức độ nghiêm trọng của chứng sa sút trí tuệ ở bệnh nhân mắc bệnh
Alzheimer (Bảng 5).
Bảng 5. Sự thay đổi của các Cholinergic marker trong bệnh Alzheimer

Độ ảnh hưởng so với mức bình thường (%)
Hoạt tính ChAT
35-50
Tổng hợp ACh
40-50
Hấp thu Choline
60
Hoạt tính AChE
40-60
Nicotinic
60-70
Muscarinic

80-100
ChAT=Choline Acetyltransfease; ACh=Acetylcholine;
AChE=Acetylcholinesterase.

Mặc dù sự đột biến cholinergic khác nhau đã được tìm thấy nhiều trong bệnh
Alzheimer, nhưng các chất tiếp nhận ACh gần như không thay đổi ở những bệnh nhân

22


này. Do đó, các can thiệp về dược lý nhằm khôi phục mức ACh bình thường trong não
có kì vọng làm tăng khả năng truyền dẫn thần kinh cholinergic.
3.1.2.2.

Vai trò của AChE trong bệnh Alzheimer [15]

Acetylcholinesterase (AChE) là một enzym đích quan trọng trong điều trị bệnh
Alzheimer. Vai trò chính của AChE là thủy phân acetylcholine và dẫn đến ức chế dẫn
truyền xung động thần kinh.
Bệnh Alzheimer là rối loạn thoái hóa thần kinh thường gặp nhất và là nguyên nhân
phổ biến nhất của chứng mất trí, với các triệu chứng lâm sàng như suy giảm nhận thức
tiến triển liên quan đến suy giảm trong các hoạt động của cuộc sống hàng ngày và rối
loạn hành vi tiến triển trong suốt quá trình bệnh.
Theo giả thuyết cholinergic, việc phát sinh bệnh Alzheimer có liên quan đến sự
thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine trong não tới gần 90% bệnh nhân
mắc bệnh Alzheimer là sự suy giảm nồng độ ACh trong vùng dưới đồi và vỏ não.
Acetylcholine là chất dẫn truyền thần kinh tại khe synapse, có vai trò quan trọng trong
hoạt động của hệ thần kinh và nồng độ acetylcholine được duy trì ổn định bởi enzyme
acetylcholinesterase (AChE). AChE là một enzyme có chức năng làm ngưng lại hoạt
động của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine tại các synapse thần kinh cholinergic

thông qua việc thủy phân acetylcholine tạo thành cholin và acid acetic.
Ở các bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer, do có sự tích tụ các mảng amyloid và các
đám rối thần kinh, khiến cho nồng độ acetylcholine bị suy giảm đáng kể. Do vậy, các
thuốc ức chế AChE nhằm duy trì nồng độ acetylcholine đóng một vai trò quan trọng
trong việc ngăn chặn sự tiến triển của bệnh Alzheimer.
3.2.
Một số chất có hoạt tính được phân lập từ Huperzia squarrosa
3.2.1. Huperzine A [13], [19]

Công thức phân tử: C15H18N2O
Trọng lượng phân tử: 242.322 g/mol
(-)-Huperzine A lần đầu tiên được phân lập từ Huperzia serrata năm 1986, và hàm
lượng trung bình của Huperzine A là 0,011%.

23


Danh pháp IUPAC: [5R-(5a, 9b, 11E)]-5-amino-11-ethlidene-5,6,9,10-tetrahydro7-methyl-5,9-methanocycloocta [b] pyridin-2(1H)-on.
Số CAS cho Huperzine A là 120786-18-7.
Huperzine A ổn định khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Huperzine A được chứng minh là có tính bảo vệ thần kinh bằng cách hoạt động như
một chất đối kháng không cạnh tranh của các thụ thể NMDA (N-methyl-D-aspartate)
tại một trong những vị trí gắn kết polyamine hoặc gần các vị trí phối hợp PCP
(Phencyclidine) và MK-801 (Dizocilpine) nhưng không có các hiệu ứng phụ thần kinh
của PCP hoặc MK-801. Việc tiền xử lý các tế bào thần kinh sơ cấp với Huperzine A
làm giảm độc tính gây ra glutamate.
Huperzine A là một chất ức chế mạnh, cụ thể và có thể ức chế acetylcholinesterase,
có hiệu lực tương đương với physostigmine, galantamine, donepezil, và tacrine. Nó tạo
ra norepinephrine và dopamine phụ thuộc liều trong vỏ não của chuột khi dùng nội
màng hoặc tại chỗ thông qua sự phân tách vi mô và nhiều hoạt động khác, bao gồm

khả năng bảo vệ tế bào chống lại hydrogen peroxide, protein beta amyloid (hoặc
peptide) và staurosporine -cô nhiễm cytotoxicity và apoptosis. Các tác dụng bảo vệ
này liên quan đến khả năng làm suy giảm oxy hoá, điều hoà sự biểu hiện của protein
apoptosis Bcl-2, Bax, P53, và caspase-3, bảo vệ ty thể, tăng cường các yếu tố tăng
trưởng thần kinh và các thụ thể của nó và can thiệp vào tiền chất amyloid chuyển hóa
protein.
Huperzine A được dùng cho những người tình nguyện khỏe mạnh và bệnh nhân
trong nhiều thử nghiệm ở Trung Quốcchứng minh sự an toàn, khả năng dung nạp cũng
như hiệu quả trong việc điều trị bệnh Alzheimer, suy nhược cơ thể lành tính, chứng
mất trí, và chứng nhồi máu cơ tim. Nó thường được sử dụng ở Trung Quốc để điều trị
sưng, sốt và viêm, rối loạn máu và tâm thần phân liệt, được chấp thuận để sử dụng ở
Trung Quốc để điều trị bệnh Alzheimer.
Huperzine A được lựa chọn để nghiên cứu trên các mô hình về chứng động kinh ở
động vật dựa trên các đặc tính bảo vệ thần kinh của nó. Dưới sự trợ giúp của ASP
(Anticonvulsant Screening Program), Huperzine A (ADD 357133) được chứng minh
có khả năng hoạt động mạnh chống lại các cơn co giật do PTZ (pentylenetetrazol) gây
24


ra và ít hơn đối với cơn động kinh gây ra do điện giật tối đa sau khi tiêm cho chuột
Swiss-Webster, với hoạt động chống co giật cao điểm trong một giờ . Với liều 1,2 và
4mg /kg, nhận thấy có tối đa là 62,5% được bảo vệ. Quan sát thấy sự suy giảm trong
thử nghiệm rotarot ở 75 và 100% chuột thử nghiệm ở các liều lần lượt là 2 và 4mg/kg.
TD50là 0,83mg/kg.
Huperzine A cũng được nghiên cứu vớinhững “cơn đau formalin” ở chuột 1 mg/kg
i.p (tiêm phúc mô) ức chế hoàn toàn cơn đau ở tất cả các thời điểm, và 0.5mg/kg i.p.
(60% của TD50) gây ra sự ức chế hoàn toàn. Cả hai kết quả đều cho thấy sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê từ việc kiểm soát (P<0,01) cho thấy hiệu quả tiềm năng trong việc
điều trị các hội chứng như chứng viêm, chấn thương cũng như chứng đau thần kinh.
3.2.2. Huperzine B [5], [16], [20]

Công thức phân tử: C16H20N2O
Khối lượng riêng: 256.349 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: 217-219 độ C
Huperzine B là một chất ức chế acetylcholinesterase.
Chỉ định: Để điều trị bệnh Alzheimer.
•

Dược động học:

Huperzine B là một Lycopodium alkaloid. Nghiên cứu chỉ ra nó là một chất ức chế
acetylcholinesterase. Thử nghiệm lâm sàng ở Trung Quốc đã chỉ ra rằng Huperzine có
hiệu quả tương đương với các loại thuốc hiện có trên thị trường, và thậm chí còn có lợi
thế hơn so với tacrine (THA) và an toàn hơn về mặt hạn chế các tác dụng phụ.
Trong các thí nghiệm thực hiện trên thỏ chỉ ra, Huperzine B có chỉ số điều trị cao
hơn so với (-)-Huperzine A, trong khi Huperzine A lại khả năng ức chế AChE cao hơn
Huperzine B. (-)-Huperzine A là một Lycopodium alkaloid đã được cho phép sử dụng
như một loại thuốc để điều trị bệnh Alzheimer.
Tuy nhiên, các nghiên cứu về mặt hóa học và các cấu trúc-hoạt tính của Huperzine
B còn rất hạn chế. Chỉ có một vài dẫn xuất N-methyl hoá và hydro hóa đơn giản của
Huperzine B được điều chế và thử nghiệm hoạt tính ức chế AChE.
25