Sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (penaeus monodon)

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRẦN XUÂN THẠCH

SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ SNP LIÊN QUAN TỚI TÍNH TRẠNG TĂNG
TRƢỞNG Ở TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


Hà Nội - 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRẦN XUÂN THẠCH

SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ SNP LIÊN QUAN TỚI TÍNH TRẠNG TĂNG
TRƢỞNG Ở TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. ĐINH DUY KHÁNG

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Hà nội - 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Duy Kháng, Phòng Vi sinh vật học
phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xinchân thành cảm ơn PGS.TS Đồng Văn Quyền – Trƣởng phòng Vi sinh vật học
phân tử, Viện Công nghệ sinh học và các anh chị cán bộtrong Phòng đãtạo mọi điều
kiện thuận lợi để tôi đƣợc thực tập tại phòng, đƣợc học hỏi và nâng cao kiến thức chuyên
môn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Cƣờng – Trƣởng phòng Tin sinh học,
Viện Công nghệ sinh học và các anh chị em cán bộ trong phòng đã nhiệt tình giúp đỡđể
tôi có thể hoàn thành những kết quả nghiên cứu cuối cùng.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân và bạn bè đã luôn giúp đỡ,
động viên và tạo điều kiện tốt nhất để tôi đƣợc học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn
tốt nghiệp của mình.
Hà Nội, ngày 28tháng12 năm 2015
Họ c vi ên

Trần Xuân Thạch

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 3
1.1

Sơ lƣợc về tôm sú ..................................................................................... 3

1.2

Khái quát về tnh trạng tăng trƣởng.......................................................... 4

1.2.1

Di truyền tnh trạng ............................................................................ 4

1.2.2

Tính trạng tăng trƣởng........................................................................ 5

1.2.3

Một số gene liên quan tới tính trạng tăng trƣởng............................... 6

1.2.4

Một số nghiên cứu về tính tăng trƣởng ............................................ 10

1.3

Hệ phiên mã ............................................................................................ 11

1.4

Chỉ thị phân tử SNP ................................................................................ 12

1.4.1

Giới thiệu về SNP............................................................................. 12

1.4.2

Ứng dụng của chỉ thị SNP................................................................ 14

1.4.3

Triển vọng của SNP ......................................................................... 15

1.5

Tình hình nghiên cứu về chỉ thị SNP ở tôm ........................................... 18

1.6

Công nghệ giải trình tự thế hệ mới ......................................................... 19
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 22

2.1

Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu ........................................................... 22

2.1.1

Đối tƣợng nghiên cứu....................................................................... 22

2.1.2

Hóa chất và sinh phẩm ..................................................................... 22

2.1.3

Trang thiết bị .................................................................................... 22

2.2

Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 23

2.2.1

Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số .............................................. 23

2.2.2

Phƣơng pháp tinh chế mRNA. ......................................................... 23

2.2.3

Tạo thƣ viện cDNA .......................................................................... 25

2.2.4

Phƣơng pháp Phân tích dữ liệu ........................................................ 27
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 30

3.1

Tinh chế mRNA từ RNA tổng số. .......................................................... 30

3.2

Tạo thƣ viện cDNA ................................................................................ 30

3.3

Phân tích dữ liệu và tìm các SNP liên quan đến tính trạng tăng trƣởng. 34

3.3.1

Đánh giá chất lƣợng và tiền xử lý dữ liệu ........................................ 35

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


3.3.2

Lắp ráp de-novo hệ phiên mã ........................................................... 40

3.3.3

Phát hiện marker SNP trong ngân hàng unigene ............................. 41

3.3.4

Chú giải chức năng unigene trong hệ phiên mã ............................... 42

3.3.5

Phát hiện những unigene liên quan tới tính trạng tăng trƣởng......... 45

3.3.6

Sàng lọc SNP liên quan đến tính trạng tăng trƣởng tôm sú ............. 46

CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 47
4.1

Kết luận:.................................................................................................. 47

4.2

Kiến nghị: ............................................................................................... 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 48
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 52
Phụ lục 1: Thống kê Unigene và các gene liên quan tới tăng trƣởng .............. 52
Phụ lục 2. Tên unigene, vị trí và SNP liên quan tới tính trạng tăng trƣởng .... 60

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ vòng đời tôm sú Penaeus monodon ............................................. 4
Hình 1.2 Mô hình SNP ........................................................................................ 12
Hình 2.1 Tôm sú thu từ vùng biển Nghệ An....................................................... 22
Hình 3.1 Kiểm tra chất lƣợng thƣ viện cDNA của mô cơ .................................. 31
Hình 3.2 Kiểm tra chất lƣợng thƣ viện cDNA của mô tim................................. 32
Hình 3.3 Kiểm tra chất lƣợng thƣ viện cDNA của mô gan tụy .......................... 33
Hình 3.4 Kiểm tra chất lƣợng thƣ viện cDNA của mô gốc mắt ......................... 34
Hình 3.5 Kết quả đánh giá chất lƣợng dữ liệu thô và dữ liệu tinh sạch.............. 39
Hình 3.6 Thống kê phân bố độ dài unigene ........................................................ 41
Hình 3.7 Phân bố tần số allele trong toàn bộ SNP ............................................. 42
Hình 3.8 Tỷ lệ biến đổi transiton và transversion .............................................. 42
Hình 3.9 Kết quả 10 loài tƣơng đồng nhất trên cơ sỡ dữ liệu Nr ....................... 43
Hình 3.10 Sự phân bố chất lƣợng unigene tôm sú .............................................. 44
Hình 3.11 Biểu đồ phân bố tỷ lệ tƣơng đồng ...................................................... 44

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Nồng độ mRNA của 4 mô ................................................................... 30
Bảng 3.2 Mô tả bộ dữ liệu sau khi giải trình tự .................................................. 35
Bảng 3.3 Thống kê số lƣợng độ dài trình tự của 4 mô........................................ 36
Bảng 3.4 Thống kê chất lƣợng lắp ráp ................................................................ 40
Bảng 3.5Số lƣợng gene và hormone phát hiện ................................................... 45

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


KÍ TỰ VIẾT TẮT
SNP

Đột biến đa hình đơn nucleotide

E-value

độ tin cậy

QTL

Quantitative trait locus

NGS

Công nghệ giải trình tự thế hệ mới

Nr-NCBI

non-redundant

(ngân hàng dữ liệu

Nr_NCBI)

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


1

MỞ ĐẦU
Tôm sú là loài thủy sản mang lại giá trị kinh tế lớn, hiện nay đang đƣợc nhiều nƣớc
chú trọng phát triển nhƣ: Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn
Độ… Nghề nuôi tôm sú có ƣu thế lớn, vì đây là nguồn tài nguyên bản địa có thể nuôi
và khai thác lâu dài, mang lại lợi nhuận cao, xóa đói giảm nghèo và phát triển kinh tế xã

hội của mỗi nƣớc. Tuy nhiên, việc sử dụng nguồn giống còn thụ động, tự nhiên, khiến
chất lƣợng tôm sú sản xuất không đảm bảo, có dấu hiệu suy giảm sinh trƣởng, mang
mầm bệnh và tiềm ẩn nhiều rủi ro cho ngƣời nuôi tôm.
Thông tn về cấu trúc phân tử hệ gen của tôm sú đang là vấn đề quan trọng và đƣợc
quan tâm lớn đối với công tác chọn giống tôm. Nghiên cứu hệ gen sẽ cung cấp thông tin
chính xác cho việc xác định tính trạng quan trọng nhƣ: tính tăng trƣởng, tính kháng
bệnh, tính chống chịu… để từ đó có thể sàng lọc ra con giống sạch bệnh, năng suất cao,
thân thiện với môi trƣờng.
Hiện nay, những hiểu biết cơ bản về sinh học tôm, đặc biệt quan tâm đến sự điều
khiển sinh trƣởng, sinh sản và hệ thống miễn dịch còn rất hạn chế do thiếu thông tin về
hệ gen của chúng. Một trong các hƣớng đi quan trọng của nghiên cứu hệ gen tôm sú là
xác định các biến dị ảnh hƣởng tới chức năngsinh lý của tôm.
Với mục đích trên, chúng tôi tiến hànhnghiên cứu “Sàng lọc các chỉ thị phân tử
SNP liên quan tới tính trạng tăng trƣởng ở tôm sú (Penaeus monodon)”, mục tiêu
sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP và tìm vị trí SNP trên những gen liên quan tới tnh trạng
tăng trƣởng, nhằm cung cấp thông tin tìm
đƣợc phục vụ cho công tác nghiên cứu các gen chức năng, công tác chọn tạo giống và
bảo tồn giống tôm bản địa.


2

Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.


3

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Sơ lƣợc về tôm sú

Theo hệ thống phân loại của Holthui (1980) và Barnes (1989), tôm sú thuộc:
Ngành: Arthopoda (Chân khớp) Lớp:
Crustacea (Giáp xác)
Lớp phụ: Malacostraca
Bộ: Decapoda (Mƣời chân)
Bộ phụ: Macrura natantia (Bơi lội) Họ:
Penaeidae (Tôm he)
Giống: Penaeus
Loài: Penaeus monodon
Tên tiếng Anh: Black Tiger Shrimp
Tên địa phƣơng : Tôm Sú , tôm Rong. Tên
đồng nghĩa:
- Penaeus monodon Fabricius, 1798; Latreille, 1803 ;H.Milne Edwards,
1837; Bate, 1881; Miers, 1884;[24];Dall, 1957; Hall, 1962.
- Penaeus carinatus Dana, 1852; Kemp, 1918.
- Penaeus tahitensis Heller, 1862
- Penaeus semisulcatus exsulcatus Hilgeldorf, 1879.
- Penaeus coeruleus Stebbing, 1905.
- Penaeus bubulus[24].
- Penaeus monodon monodon Burkenroad, 1959
- Penaeus (Penaeus) monodon[3, 17].
Về đặc điểm sinh học, tôm sú là loài sống ở nơi chất đáy là bùn pha với
cát ở độ sâu ven bờ đến 40m nƣớc và độ mặn từ 5 – 34 ‰.Tôm sú có đặc
điểm thƣờng sinh trƣởng nhanh, trong 3 – 4 tháng có thể đạt cỡ trung bình 40


4

– 50 g. Tôm trƣởng thành tối đa với con cái có chiều dài từ 220 – 250 mm, trọng lƣợng
đạt từ 100 – 300 g, con đực dài từ 160 – 200 mm, trọng lƣợng đạt từ 80 – 200 g. Tôm có

tính ăn tạp, thức ăn ƣa thích là các loài nhuyễn thể, giun nhiều tơ và giáp xác. Về mặt
phân bố, ở nƣớc ta tôm phân bố từ Bắc vào Nam, từ ven bờ đến vùng có độ sâu 40 m,
vùng phân bố chính là vùng biển các tỉnh Trung bộ.
Hormone điều khiển sự tăng trƣởng của tôm là Gonal inhibiting hormone (GIH), đƣợc
sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan Xcủa cuống mắt, vận chuyển tới xinap của
tuyến giáp đƣa vào kho dự trữ và khi cần thì tiết ra, nên khi cắt mắt của tôm sẽ thúc đẩy
chu kỳ lột xác, đem lại sự thành thục mau chóng hơn [4].

Hình 1.1Sơ đồ vòng đời tôm sú Penaeus monodon
1.2 Khái quát về tính trạng tăng trƣởng
1.2.1 Di truyền tính trạng
Di truyền là hiện tƣợng chuyển những tính trạng của cha mẹ cho con
cái thông qua gen của bố mẹ. Trong sinh học, di truyền chuyển những đặc


5

trƣng sinh học từ một sinh vật cha mẹ đến con cái và nó đồng nghĩa với di chuyển
gen, gen thừa nhận mang thông tin sinh học (hay thông tin di truyền).
Tính di truyền biểu hiện ở sự giống nhau của các tính trạng giữa thế hệ này và thế
hệ khác. Đặc tính di truyền cho phép thế giới sinh vật bảo toàn nòi giống. Trải qua nhiều
thế hệ nối tiếp nhau nhƣng những đặc tính di truyền không bị mất đi, thế hệ con cháu
luôn có những đặc điểm giống bố mẹ, ông bà.
Các sinh giới sống trong điều kiện môi trƣờng luôn có những biến động nhƣ sự
thay đổi thời tết, nhiệt độ môi trƣờng, lƣợng nƣớc, lƣợng thức ăn và sự đấu tranh sinh
tồn giữa các loài. Để thích nghi với điều kiện sống, các cơ thể sống cũng có những thay
đổi, làm xuất hiện những tính trạng khác nhau giữa các thế hệ, đó là sự biến dị. Biến dị
biểu hiện sự sai khác của thế hệ con cháu so với thế hệ bố mẹ đồng thời sự sai khác của
một cá thể nào đó so với các cá thể khác cùng đàn ( ht tps :/ /vi .wi kip ed i a.o rg / wi ki
/Di _t ru yền ).

1.2.2 Tính trạng tăng trƣởng
Là sự tƣơng tác của nhiều gen hình thành nên một tính trạng trong cơ thể và
biểu hiện ra bên ngoài có thể là: tnh kháng bệnh, tính chống chịu, tính trạng tăng
trƣởng…, đôi khi là sự thay đổi của một vị trị trong gen (SNP) hay sự lặp lại của các base
(microsatellites) có thể tạo ra một tính trạng hoàn toàn mới. Tính trạng tăng trƣởng và
bệnh di truyền thông qua sự biểu hiện gen và mRNA ổn định.
Tính trạng tăng trƣởng có hệ số di truyền ở mức trung bình đến cao trên
hầu hết các loài cá, tôm. Điều này cho phép tính trạng tăng trƣởng có thể
đƣợc cải thiện từ 10 đến 20% [13],mỗi thế hệ chọn giống và về lý thuyết thì tốc độ tăng
trƣởng có thể đƣợc tăng gấp đôi sau 5 đến 6 thế hệ chọn lọc. Yếu tối môi trƣờng ảnh
hƣởng rất lớn tới tỷ lệ tăng trƣởng (chế độ ăn uống, khẩu


6

phần thức ăn, mật độ thả giống, nhiệt độ, độ mặn, oxy hòa tan, các mầm bệnh
và thành phần hóa học trong nƣớc).
Vì vậy, tnh trạng tăng trƣởng đƣợc xác định là tnh trạng đầu tiên và quan
trọng nhất trong hầu hết các chƣơng trình chọn giống. Về các thông số di truyền thì cho
đến nay thông tin về các chƣơng trình chọn giống giáp xác nói chung, tôm nói riêng còn
rất hạn chế.
1.2.3 Một số gene liên quan tới tính trạng tăng trƣởng ở động vật giáp xác
Hầu hết sinh vật nhân chuẩn có chứa mã (amino acid, exon vùng dịch
mã) và vùng không mang mã (intron và 5’-3’ vùng không dịch mã). Biến thể alen bất kì
trong chuỗi DNA khu vực này có khả năng làm thay đổi cấu trúc và hoạt động của các
protein mã hóa, hoặc gây ra những thay đổi các yếu tố quy định trong quá trình phiên mã
mRNA[20].
Những gene dƣới đây có khả năng ảnh hƣởng tới yếu tố tăng trƣởng của những loài
giáp xác dựa trên các nghiên cứu trƣớc đó trong các loài sinh vật hoặc một số mô hình
loài.

1. 5-Hydroxytryptamine receptor (5-HT): một amin neurotransmiter đƣợc tm thấy
trong hệ thần kinh của tất cả các loài sinh vật, ảnh hƣởng tới sự đa dạng các chức
năng sinh lý, hành vi và nhận thức. Trong loài giáp xác, hormone Serotinin não đƣợc
sinh ra có thể kích hoạt một số hormone khác gồm: hormone hyperglycaemic
(CHH), hormone đỏ pigmendispersing, hormone thay lông neurodepressing và
ức chế hormonr MIH(Moult-inhibitng hormone) [20].
2. Alpha-amylase: Trong động vật giáp xác, duy trì mức độ thích hợp glucose
trong huyết tƣơng là điều cần thiết để hỗ trợ một số chức năng sinh lý quan trọng và
để ứng phó với một loạt các yếu tố gấy stress môi trƣờng.


7

3. Cathepsin L: đƣợc quy ƣớc là thành phần chính của hệ thống lysosome
phân giải protein. Khả năng thu nhận và phân giải protein thừa.
4. Cyclophilin(Cyps): chứa một số isomerasa bảo tồn peptidylpoly cis- transđơn, biểu
hiện phong phú các protein cytosolic. Các nghiên cứu về cyclophilins ở động vật thủy
sinh chứng minh nó đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh.
5. Faty acid-binding protein (FANTs): là protein cytosolic nhỏ (~15 kDa) chủ yếu là acid
béo, là những gene quan trọng liên quan đến sự phát triển tính trạng lipit (chất béo).
6. Fibrillarin: là một protein dài 40 kDa nằm trong các thành phần sợi nhỏ dày đặc của
hạch nhân, có chức năng thiết yếu liên quan đến RNA nối và xử lý rRNA.
7. Glyceradehyde-3-phosphate

dehydrogenase

(GAPDH):

là

enzym glycolytc để

biến đổi glyceraldehyde-3-phosphate thành 1,3- bisphosphoglycerate, chúng tham
gia vào nhiều quá trình tế bào ngoài clycolysis, vài trò chức năng gồm: sửa chữa
DNA, tRNA. Trong khi GAPDH thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ là một gen kiểm soát biểu
hiện.
8. Growth hormone and insulin-like growth factor:axit somatotropic cơ bản bao gồm
các hoc môn: growth hormone-releasing hormone (GHRH), growth hormone (GH),
insulin-like growth factors (IGF-I and -II), một số protein mang và cơ quan cảm thụ.
Nói chung, các đƣờng truyền tín hiệu của hormone insulin có thể điều chỉnh sự
hấp thu glucose, axit béo, amino axit dẫn tới các mô mỡ động vật, mô cơ và gan,
thúc đẩy việc lƣu trữ các chất dinh dƣỡng dƣới dạng glycogen. Sự tích lũy axit IGF,
IGFs, IGFRs và sức mạnh của họ IGFNTs (IGF binding proteins), chúng cùng nhau
kiểm soát một số quá trình sinh học quan trọng bao gồm: tăng trƣởng của tế bào,
tăng sinh tế bào, biệt hóa tế bào và di cƣ tế bào.


8

9. Myostatin and growth differentiation factor 8/11: Myostatin (MSTN)còn
đƣợc gọi là growth differentation factor-8 (GDF-8), là một chất ức chế
autocrine/paracrine quan trọng của sự phát triển cơ xƣơng và là thành viên của
họ lớn transforming growth factor-β (TGF-β). GDF-11 cũng là một hormone có liên
quan chặt chẽ của siêu họ TGF- β đƣợc cho là có nguồn gốc từ một gen tổ tiên.
10. Signal transducer and activator of transcription (STAT): là một trong những con
đƣờng tín hiệu chính trong các tế bào nhân chuẩn. Con đƣờng này sử dụng trong
một loạt các quá trình tăng trƣởng và phát triển ở nhiều mô để kiểm soát tế
bào: tăng sinh, biệt hóa và xử lý tế bào chết. Nó còn có vai trò trong quá trình miễn
dịch virut ở động vật giáp xác và côn trùng.
11.Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC): còn đƣợc gọi là osteonectn

hoặc basement membrane protein 40 (BM40), là một bó collagen, protein chống
dính thuộc nhóm matricellular của protein. SPARC tham gia vào một loạt các quá
trình sinh học (phát triển, sửa chữa mô) và một số chức năng sinh lý (lắp ráp và
cấu tạo lƣới ngoại bào,
điều chỉnh nhiều đƣờng truyền tín hiệu nội bào, di cƣ tế bào, độ bám dính,
tăng sinh và biệt hóa).
12.Translin-associated factor X (TRAX): translin và protein liên kết của nó,là thành
phần của một RNA phức tạp liên quan đến nhiều hoạt động sinh học trong đó chúng
có thể quy định sự tăng trƣởng của tế bào, xử lý mRNA, sinh tinh, phát triển tế bào
thần kinh và chức năng, ổn định hệ gen quy định và khu vực gây ung thƣ.
13.Candidate growth genes effect on moulting: Neuropeptid là nhóm lớn nhất và đa
dạng nhất của nội tiết phân tử tn hiệu trong hệ thống thần kinh giáp xác. Ở loài
giáp xác, sự lột xác định kỳ là quá trình sinh lý quan trọng nhất cần thiết cho sự
tăng trƣởng và phát triển bao gồm quá trình lột


9

xác và sự tái sinh. Chúng đƣợc 2 neuropeptide điều khiển: moult- inhibitng hormone
(MIH) and crustacean hyperglycaemic hormone (CHH) đƣợc sản xuất trong các
tuyến xoang X-organ (X-organ sinus gland complex: XOSG) nằm trong hạch quang
của mắt.
14.Actin: protein cấu trúc có mặt mọi nơi trong tế bào nhân chuẩn. Sợi actn tạo nên sức
mạnh cho các cơ, kết nối với các tế bào khác.
15.Crustacean hyperglycaemic hormone (CHH): liên quan chủ yếu trong
điều chỉnh glucose trong huyết tƣơng, cũng nhƣ trong quá trình chuyển
hóa carbohydrate và chất béo.
16.Eyestalk factors:ở động vật xác có chứa các tế bào neurosecretory đƣợc cho là có
liên quan đến tính quy định sự lột xác. Từ khi lột xác có liên quan trực tiếp đến
sự phát triển cơ bắp và tăng trƣởng ở động vật giáp xác.Nghiên cứu thực nghiệm

cho thấy: việc cắt bỏ mắt dƣờng nhƣ là cách hiệu quả nhất để ảnh hƣởng đến lột
xác và tăng trƣởng vì nó ảnh hƣởng trực tiếp đến hệ thống nội tiết [20].Nghiên cứu
trên loài Cua (Scylla serrata): yếu tố quy định tốc độ tăng trƣởng eyestalk factor
dựa trên sự tăng trƣởng của tim, vai trò của eyestalk factor và hormone gây lột
xác
điều khiển sự tăng trƣởng ở tim[5].
17.Moult inhibitng hormone (MIH):giữ vai trò điều chỉnh quan trọng steroid trong YO (Yorgans), hormone này đƣợc sản xuất bởi các tế bào soma neurosecretory ở hành
não của XO (X-organs)duy trì trong cơ thể động vật ở thời kì lột xác, trong khi 2
hormone MIH và CHH liên quan đến quy định độ dài thời kì lột xác.
18.Candidate muscle build-up or degradation genes involved in moultng:sự tăng trƣởng
mô cơ ở động vật giáp xác là không liên tục và chúng chỉ tăng trƣởng sau khi xảy
ra quá trình lột xác. Trong suốt quá trình lột xác, sự phục hồi các mô cơ và dự trữ
năng lƣợng gồm: glycogen và lipid đƣợc

tích lũy trong huyết tƣơng và ruột giữa cho quá trình lột xác tiếp theo. Nói


10

chung tổng hợp protein cho mô cơ là rất quan trọng cho sự tăng trƣởng, sinh sản
và các hoạt động trao đổi chất khác trong động vật giáp xác.
19.Methyl farnesoate (MF)and farneosoic acid O-methyltransferase (FAMeT): MF là
tiền thân của hormone JHIII (juvenile hormone III), là một sesquiterpenoid đƣợc
tổng hợp trong cơ quan hàm dƣới giáp xác. Hợp chất sesquiterpenoid phục vụ
trong vai trò tiến hóa đƣợc bảo tồn chức năng nhƣ: điều chỉnh hoặc điều khiển
lột xác, sinh sản, phát triển của ấu trùng, tăng trƣởng, hình thái, hành vi, stress và
sự tổng hợp protein nói chung. Vai trò của MF và FAMeTnhƣ một morphogene,
FAMeT
đƣợc tìm thấy rất nhiều trong giai đoạn lột xác ở loài Cua xanh.
20.Heat shock proteins (HSPs): là protein phổ biến, phong phú nhất, đƣợc tm thấy

trong tất cả các sinh vật. HSP tham gia vào nhiều chức năng tế bào thiết yếu, bao
gồm sự trao đổi chất, tăng trƣởng, quá trình biệt hóa và giết chết tế bào.
21.Myosin heavy chain: Myosins là thành phần quan trọng của bộ máy co bóp, bao gồm
hai chuỗi nặng và bốn chuỗi nhẹ liên quan. Là một siêu họ của protein, myosins
tƣơng tác với actin, thủy phân ATP, hình thành chức năng phát triển cơ và duy trì hiệu
lực.
22.Ubiquitn: thƣờng gắn các protein khác trong tế bào nhƣ một monomer hay
polymer để điều chỉnh hoạt động của chúng. Thoái hóa protein đƣợc thực hiện chủ
yếu ở các hệ thống Ubiquitin, kiểm soát chu kỳ tế bào, truyền tín hiệu, sửa chữa
choromatn, quy định phiên mã, quá trình vận chuyển hạt nhân và các thụ thể
màng. Ở động vật có vú, nơi tăng biểu hiện Ubiquitn xảy ra trong quá trình teo cơ.
1.2.4 Một số nghiên cứu về tính tăng trƣởng
Thành phần cơ bản của một chƣơng trình chọn giống bao gồm xác định mục têu
chọn giống và ƣớc tính các thông số di truyền cơ bản bao gồm hệ số


11

di truyền, tƣơng quan di truyền giữa các tnh trạng. Hầu hết các chƣơng trình chọn giống
trên động vật nuôi đều bắt đầu bằng việc nâng cao tốc độ sinh trƣởng[28]. Tốc độ tăng
trƣởng nhanh có thể cho phép rút ngắn thời gian nuôi hoặc sản xuất đƣợc những con
vật nuôi có trọng lƣợng lớn hơn trong cùng một khoảng thời gian nuôi. Cả 2 trƣờng hợp
đều đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn cho ngƣời nuôi.
Tuy vậy, gần đây cũng có những nghiên cứu nhằm ƣớc tính các thông số di truyền
tính trạng tăng trƣởng hoặc nhiều tính trạng khác nhau trong đó có tính trạng tăng
trƣởng trên giáp xác, những nghiên cứu này bao gồm: tôm thẻ chân trắng (P. vannamei)
[12]; [33][31, 32], tôm sú (P. monodon) [26].Một số nghiên cứu nhằm ƣớc tính hệ số di
truyền tnh trạng tăng trƣởng ở nhiều độ tuổi khác nhau hoặc giữa con đực và con cái
[22].
1.3 Hệ phiên mã

Hệ phiên mã (transcriptomes) là một bộ các phân tửRNA tại một thời
điểm xác định, biểu hiện trong một tế bào, mô, sinh vật cụ thể. Đó là một bộ các ARN mã
hóa và không mã hóa. Hệ phiên mã trải qua các thay đổi về số
lƣợng và chất lƣợng, phản ánh các quá trình sinh lý tự nhiên hoặc do các kích thích bên
ngoài [19]. Việc phân tích thành phần hệ phiên mã giúp hiểu thêm
cơ chế hoạt động của sinh vật.Không giống nhƣ một bộ gen, transcriptomerất linh
hoạtvới các biến thể, nó làmộtliên kết độnggiữacácgen vàđặc tnh vật
lýcủa một sinh vật[43]. Có thể hiểutranscriptomecung cấpthông tinvề các khía cạnhkhác
nhaucủasinh học tế bàovàsinh hóa; ví dụ sốlƣợnggen hoạt độngtrong các giai
đoạnphát triển khác nhauhoặcthay đổibiểu hiện genliên quan đếnmột căn bệnhđặc
biệt[27].
Mục đíchchính củamột nghiên cứutranscriptomeđể xác định vị trí chotất cả
cácRNA thể hiện trong cácmôđƣợc nghiên cứu, xác định cấu trúcphiên mãcủacác gen(5
'và 3' kết thúc, mô hìnhnốivàsửa đổisauphiên


12

mãkhác) và để định lƣợngmức độ biểu hiệncủa mỗiRNAđiều kiện sinh lýkhác
nhau[45].Hiểuphức

tạp

hơn

chức

năngcủamộtranscriptomelàmột

nhiệm vụđầy

thách thứcnhƣphần lớn các genđƣợc phiên mãtheo hai chiều [30].
1.4 Chỉ thị phân tử SNP
1.4.1 Giới thiệu về SNP
Đa hình đơn nucleotide, hoặc SNP là những biến dị trong trình tự DNA xảy ra khi
một nucleotide đơn (A, T, C, hoặc G) trong trình tự hệ gen bị thay đổi. Ví dụ, một SNP có
thể thay đổi trình tự GGCTAAA thành GGCTAAT. Nếu một biến thể đƣợc coi là có một
SNP thì SNP này phải đƣợc quan sát ít nhất là 1% toàn bộ số lƣợng nucleotde. SNP tạo
nên khoảng 90% biến dị di truyền của con ngƣời. Phần lớn SNP liên quan đến sự thay
thế của cytosine (C) với thymine (T).

Hình 1.2Mô hình SNP
Chỉ thị phân tử SNP (Single Nucleotide Polymorphism), có nghĩa là các dạng đa hình
đơn nucleotide. Marker này thƣờng đƣợc dùng để phân tch genome ngƣời và hiện nay
đƣợc áp dụng (qua đột biến điểm tại một nucleotide trên genome) với số lƣợng lớn
nhất từ trƣớc đến nay cho nhiều genome của sinh vật khác. SNP có thể nằm trong trình
tự mã hóa của gen, các

khu vực không mã hóa, hoặc nằm giữa các gen. SNP phân bổ trong hệ gen


13

không đồng nhất nhƣng phần lớn chúng nằm trong vùng không mã hóa
thƣờng xuyên của gen. Khi SNP nằm trong một trình tự mã hóa thì không nhất thiết
sẽ thay đổi trình tự axit amin của protein đƣợc sản xuất do tính thoái hóa của mã di
truyền. SNP nằm trong vùng mã hóa có hai loại chính là SNP đồng nghĩa và SNP vô nghĩa.
SNP đồng nghĩa sẽ không ảnh hƣởng đến trình tự của chuỗi polypeptide. SNP nằm ở
vùng không mã hóa hoặc nằm giữa các gen có thể ảnh hƣởng đến các yếu tố phiên mã
hay các loại RNA [42].

Chỉ thị SNP xảy ra thƣờng xuyên trong toàn bộ DNA của một ngƣời. Trung bình
một SNP đƣợc quan sát thấy một lần trong 300 nucleotide, có nghĩa là có khoảng 10
triệu SNP trong hệ gen của con ngƣời. Thông thƣờng, những SNP này đƣợc tm thấy trong
DNA giữa các gen. Nó đƣợc xem nhƣ là dấu chuẩn sinh học giúp xác định vị trí các gen liên
quan đến bệnh. Khi SNP xảy ra trong gen hoặc trong một khu vực gần một gen quy định,
nó có thể có vai trò trực tiếp trong việc biểu hiện bệnh bằng cách ảnh hƣởng đến
chức năng của gen[42].
Mặc dù hơn 99% trình tự DNA của con ngƣời đều giống nhau nhƣng sự thay đổi
trong chuỗi DNA có thể có tác động lớn đến việc nghiên cứu mối tƣơng quan giữa cơ thể
con ngƣời và các yếu tố gây bệnh nhƣ vi khuẩn, virus, độc tố,... Điều này chứng tỏ SNP
có giá trị trong nghiên cứu y sinh học và phát triển các sản phẩm dƣợc phẩm hoặc
chẩn đoán y khoa. SNP cũng tiến hóa ổn định, không thay đổi nhiều từ thế hệ này sang
thế hệ khác làm cho chúng ta dễ dàng hơn khi nghiên cứu dân số[46].
Chỉ thị phân tử SNP là những biến dạng của chuỗi DNA đƣợc tìm thấy với tần suất
cao trong genome ngƣời[39]. Chúng ta có thể sử dụng SNP marker để phân lập các
yếu tố di truyền có liên quan đến tnh trạng bệnh lý vô cùng phức tạp[40]. Ngƣời ta có thể
dự đoán 100.000 hoặc nhiều hơn nữa SNP

marker trong genome ngƣời[9]. Những phƣơng pháp đánh giá kiểu gen có kết


14

quả cao đòi hỏi lƣợng kiến thức về chuỗi trình tự rất chính xác của SNP. Do
đó, bất cứ công bố nào về SNP phải hàm chứa hai nội dung:
(1) Xác định chuỗi trình tự DNA (2)
Tần số alen
Có hai phƣơng pháp để tạo ra SNP, một là dùng trực tiếp mã trình tự di truyền và
thứ hai là phân biệt các đột biến điểm thông qua tách sắc ký lỏng (High Performance
Liquid Chromatography).

1.4.2 Ứng dụng của chỉ thị SNP
Một chiến lƣợc nghiên cứu giúp cho việc phát hiện nhanh chóng những SNP từ số
liệu lƣu trữ Expressed Sequence Tag (EST)[34]. Việc phát triển kỹ thuật in-vitro nhằm
khuếch đại những trình tự ở vị trí đặc biệt (ví dụ nhƣ PCR) và khám phá marker có
tính đa hình cũng nhƣ có thông tin di truyền cao nhƣ microsatallite, STR,... đã và đang tạo
điều kiện thuận lợi để lập bản đồ di truyền có mật độ thấp (low density map) của ngƣời.
Những dạng bản đồ này ngoài những ứng dụng hiệu quả trong lĩnh vực nghiên cứu
khoa học động thực vật nó còn ứng dụng trong y khoa, ví dụ xét nghiệm bệnh u xơ, bệnh
Huntington, bệnh tiểu đƣờng …[7].
Chỉ thị SNP không gây bệnh, nhƣng nó có thể giúp chúng ta chẩn đoán một căn
bệnh di truyền cụ thể. Các nhà khoa học tin rằng bản đồ SNP sẽ giúp họ xác định đƣợc
nhiều gen liên quan đến các bệnh phức tạp nhƣ ung thƣ, bệnh tiểu đƣờng. Bằng cách
nghiên cứu mối liên quan của SNP với một đặc
điểm bệnh, các nhà nghiên cứu đã phát hiện các gen có liên quan đến một căn bệnh. Xác
định và hiểu biết về vai trò của yếu tố di truyền của bệnh cũng sẽ cho phép các nhà
nghiên cứu đánh giá tốt hơn vai trò của yếu tố di truyền, chẳng hạn nhƣ hành vi, chế độ
ăn uống, lối sống và hoạt động thể chất của bệnh.


15

Hầu hết các chỉ thị phân tử SNP không có ảnh hƣởng đến sức khỏe hoặc sự
phát triển. Một số những sai khác di truyền đã đƣợc chứng minh là rất quan trọng trong
việc nghiên cứu về sức khỏe con ngƣời. Các nhà nghiên cứu đã phát hiện SNP có thể
giúp dự đoán phản ứng của một cá thể với một số loại thuốc nhất định, dự đoán độ
nhạy với các yếu tố môi trƣờng nhƣ chất độc và nguy cơ phát triển các bệnh cụ thể.
SNP cũng có thể đƣợc sử dụng để nghiên cứu quá trình di truyền của các gen bệnh
trong gia đình. Các nghiên cứu trong tƣơng lai sẽ xác định SNP liên quan đến các
bệnh phức tạp nhƣ bệnh tm, tiểu đƣờng và ung thƣ.
Ngoài ý nghĩa nghiên cứu pharmacogenomic trong chẩn đoán, y sinh học, bản đồ

SNP còn giúp để xác định hàng ngàn các dấu hiệu bổ sung trong bộ gen, do đó hƣớng
nghiên cứu của bản đồ hệ gen là rất lớn. SNP không thay đổi nhiều từ thế hệ này sang thế
hệ khác làm cho chúng ta dễ dàng hơn khi nghiên cứu về tiến hóa. Nghiên cứu về SNP
cũng có vai trò cực kì quan trọng trong việc sàng lọc hay tuyển chọn các giống cây trồng,
vật nuôi bằng marker di truyền.
1.4.3 Triển vọng của SNP
 SNP và chẩn đoán bệnh
Vật liệu di truyền của mỗi ngƣời có một mẫu hình SNP duy nhất đƣợc tạo thành từ
các biến dị di truyền khác nhau. Các nhà nghiên cứu đã tm thấy rằng hầu hết SNP không
đại diện cho một bệnh nào. Thay vào đó, nó nhƣ là các dấu hiệu sinh học để xác định
chính xác một căn bệnh trên bản đồ hệ gen của con ngƣời, vì nó thƣờng nằm gần một gen
đƣợc tm thấy mà có liên quan đến một căn bệnh nào đó. Thỉnh thoảng, SNP vẫn có thể
gây ra một căn bệnh, do đó nó có thể đƣợc sử dụng để tìm kiếm và phân lập các gen gây
bệnh.
Để thực hiện một thí nghiệm di truyền, gen gây bệnh nào đó đƣợc xác định bởi
các nhà khoa học bằng cách thu thập mẫu máu từ một nhóm các cá


16

nhân bị ảnh hƣởng bởi căn bệnh này và phân tch SNP trên các mẫu DNA của họ. Tiếp
theo, các nhà nghiên cứu so sánh các mẫu hình này với các mẫu hình SNP thu đƣợc bằng
cách phân tch SNP trên các mẫu DNA từ một nhóm các cá nhân không bị ảnh hƣởng bởi
căn bệnh này. Loại so sánh này có thể phát hiện sự khác biệt giữa các mẫu hình SNP của
hai nhóm và qua đó cho thấy mẫu hình có thể có liên quan nhiều đến gen gây bệnh. Cuối
cùng, hồ sơ SNP đặc trƣng của nhiều loại bệnh khác nhau sẽ đƣợc thành lập. Sau đó, chỉ là
vấn đề thời gian, các bác sĩ có thể xác định một ngƣời có thể nhạy với một căn bệnh nào
đó chỉ bằng cách phân tích các mẫu DNA của họ đối với một mẫu hình SNP cụ thể.
 Phát triển SNP và dược phẩm
Hiện nay, không có phƣơng pháp đơn giản nào để xác định một bệnh nhân sẽ đáp

ứng miễn dịch với một loại thuốc cụ thể nhƣ thế nào. Một loại thuốc cụ thể có hiệu quả
cho một bệnh nhân nhƣng cũng có thể không có hiệu quả ở những ngƣời khác. Tệ hơn
nữa, một số bệnh nhân có thể trải qua một phản ứng miễn dịch bất lợi với chính loại
thuốc đó.
Trong tƣơng lai, các loại thuốc thích hợp nhất cho một cá nhân có thể
đƣợc xác định trƣớc điều trị bằng cách phân tích hồ sơ SNP của bệnh nhân. Mục têu là
tạo một loại thuốc phù hợp cho cá nhân đó. Điều này sẽ cho phép các công ty dƣợc
phẩm sản xuất nhiều loại thuốc hơn cho thị trƣờng và cho phép các bác sĩ kê đơn phù
hợp điều trị cho từng cá nhân cụ thể.
 SNP và National Center for Biotechnology Informaton (NCBI)
Chỉ thị phân tử SNP xảy ra thƣờng xuyên trong hệ gen và tƣơng đối ổn định về mặt
di truyền, nên nó là dấu chuẩn sinh học. Dấu chuẩn sinh học là các đoạn DNA có một vị
trí xác định, dễ dàng nhận dạng cũng nhƣ theo dõi. Dấu chuẩn này cho phép các nhà khoa
học nghiên cứu và xác định những kết

quả từ sự tƣơng tác của nhiều gen. NCBI đóng một vai trò quan trọng trong