Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính của chủng nấm đảm thu thập từ vườn quốc gia bidoup núi bà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI
VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ THU HIỀN

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG NẤM ĐẢM
THU THẬP TỪ VƢỜN QUỐC GIA BIDOUP- NÚI BÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội tháng 12 năm 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




Lời Cảm Ơn
Trước hết, tôi xin bày tỏ sự biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà
đã tận tình chỉ bảo, quan tâm hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên
cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong
nghiên cứu khoa học.
Xin cám ơn Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ kinh phí từ đề
tài: “Phân lập và chọn lọc vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào ở vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà
để tạo nguồn nguyên liệu cho phát triển các chế phẩm ứng dụng trong nông nghiệp, lâm
nghiệp” để tôi hoàn thành công trình này. Tôi cũng xin cám ơn chủ nhiệm đề tài và các thành
viên tham gia đã tạo điều kiện giúp tôi thu thập số liệu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Đinh Thị Thu Hằng, Th.S Đào Thị Ngọc Ánh, Th.S. Nguyễn
Thị Lan Anh, Th.S Phạm Quang Huy, Th.S Ngô Thị Huyền Trang, KS. Nguyễn Hải Vân, KS.

Nguyễn Đăng Thắng, KS. Hoàng Thị Nhung, CN. Nguyễn Văn Huynh phòng Công nghệ sinh
học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đối với thầy cô viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật, viện Công nghệ sinh học đã tận tình dạy dỗ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa
học và thực hiện luận văn này.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn bố mẹ, chồng và những người thân yêu nhất đã tạo điều
kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành
khóa luận này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




Trần Thị Thu Hiền

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi kết
quả thu được không sao chép từ các nghiên cứu khác. Các số liệu, sơ đồ kết quả
của luận văn này chưa từng được công bố.
Mọi dữ liệu hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu
thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!
Tác giả

Trần Thị Thu Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN LỜI
CAM ĐOAN MỤC
LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH
MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU
.................................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3
1.1. Đặc điểm tự nhiên của Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà........................................... 3
1.2. Enzyme
laccase............................................................................................................... 4
1.2.1. Giới thiệu về laccase
................................................................................................ 4
1.2.2. Cấu trúc của phân tử laccase
.................................................................................. 5
1.2.3. Cơ chế xúc tác của laccase
...................................................................................... 7
1.2.4.Chất gắn kết
.............................................................................................................. 8
1.2.5. Tính chất của laccase
.............................................................................................. 8
1.2.5.1. pH tối ưu và độ bền pH...................................................................................... 8

1.2.5.2. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt ..........................................................................
9
1.2.5.3. Hằng số động học của phản ứng laccase .......................................................... 9
1.2.5.4. Chất ức chế laccase .......................................................................................... 9
1.2.6. Sự phân bố của laccase và vi sinh vật sinh enzyme laccase ................................
10
1.2.7. Gene mã hóa enzyme laccase
................................................................................ 12
1.2.8. Ứng dụng của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

ĐHTN


laccase............................................................................................ 13
1.2.8.1. Xử lý rác thải và loại màu thuốc nhuộm.......................................................... 13
1.2.8.2. Ứng dụng xử lý khí độc môi trường ô nhiễm và chuyển hóa polymer mạch dài
......................................................................................................................................
14
1.2.8.3. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm ............................................................
15
1.2.8.4. Ứng dụng trong công nghệ dược phẩm và công nghệ nano ............................
15
1.2.8.5. Các ứng dụng khác của laccase ...................................................................... 16
1.2.9. Chi Polyporus và những đặc tính của nó .............................................................
17
1.3. Thuốc nhuộm và các đặc tính cơ bản của chúng ...................................................... 20
1.3.1 Khái quát và phân loại về thuốc nhuộm ................................................................
20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




1.3.2. Khả năng phân hủy, loại màu thuốc nhuộm bởi vi sinh vật sinh laccase........... 23
1.3.3. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và tác hại .............................................................
26
1.3.3.1. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm do thuốc nhuộm ..............................................
26
1.3.3.2. Tác hại của ô nhiễm thuốc nhuộm ..................................................................
26
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................. 28
2.1 Vật liệu và phƣơng pháp ..............................................................................................
28
2.1.1. Vật liệu
................................................................................................................... 28
2.1.2 Hóa chất
.................................................................................................................. 28
2.1.3 Thiết
bị..................................................................................................................... 28
2.1.4 Các môi trường nuôi cấy ........................................................................................
28
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................................
29
2.2.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào ................................................
29
2.2.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào .................................................
29

2.2.3. Phương pháp thu dịch laccase trên môi trường lên men lỏng để xác định hoạt
tính................................................................................................................................
.... 29
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase ............................................................
30
2.2.5. Phân loại chủng nấm............................................................................................
30
2.2.5.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống ......................................................
30
2.2.5.2 Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS ............. 31
2.2.5.3. Phương pháp xác định trình tự vùng ITS......................................................... 31
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng


hợp laccase
....................................................................................................................... 31
2.2.6.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ...............................................................
32
2.2.6.2. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng....................................................................
32
2.2.6.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ........................................................ 32
2.2.6.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon .........................................................................
32
2.2.6.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ .....................................................................
32
2.2.6.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ ..................................................................
32
2.2.7. Đánh giá hiệu quả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase thô từ chủng
nấm FBD154
.................................................................................................................... 33

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………………..34
3.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào ...................................................... 34
3.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào .......................................................
35
3.3. Đặc điểm hình thái, phân loại và định danh chủng nấm FBD154........................... 38
3.3.1. Đặc điểm hình
thái................................................................................................. 38
3.3.2. Phân loại chủng FBD154......................................................................................
39


3.3.2.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống .....................................................
39
3.3.2.2. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8
S - ITS2) ........................................................................................................................ 39
3.4. Chọn lọc môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy ...............................................................
41
3.4.1. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp laccase
của chủng Polyporus sp. FBD154...................................................................................
41
3.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng
Polyporus sp. FBD154 .....................................................................................................
43
3.4.3. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp laccase của
chủng Polyporus sp. FBD154..........................................................................................
44
3.4.4. Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng
Polyporus sp. FBD154 .....................................................................................................
46
3.4.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng

Polyporus sp. FBD154 .....................................................................................................
47
3.4.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng
Polyporus sp. FBD154 .....................................................................................................
48
3.4.6.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ .....................................................................
48
3.4.6.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ ..................................................................
50
3.5. Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng enzyme thô sinh tổng hợp từ chủng nấm
Polyporussp. FBD154 ..........................................................................................................
51
3.5.1. Khả năng loại màu nhóm anthraquinone (RBBR, NY5) bởi laccase thô từ chủng
Polyporus sp. FBD154 .....................................................................................................
52
3.5.2. Khả năng loại màu azo (NY1, NY7) bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.
FBD154 ...........................................................................................................................
. 54
3.5.3. Khả năng loại màu thương mại (CLS và LF-2B) bởi laccase thô của chủng


Polyporus sp. FBD154 .....................................................................................................
55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 60
Kết
luận................................................................................................................................ 60
Kiến
nghị.............................................................................................................................. 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 62
Tiếng

Việt............................................................................................................................. 62
Tiếng Anh
............................................................................................................................ 62
PHỤ LỤC.................................................................................................................................
74


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABTS

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid

Ace

Acetosyringone

bp

Base pair

CLS

Dimaren Black CLS

CGK

Chất gắn kết

DDT

Dichloro - Trichloroethane Diphenyl

DNA

Deoxyribonucleic acid

Đtg

Đồng tác giả

HCH

Hexachlorocyclohexane

HBT

Hydroxybenzotriazole

ITS

Internal transcribed spacer

Lac

Laccase

LF-2B

Everzol Red Lignin

LiP

peroxidase Manganese

MnP

peroxidase Acid red 299

NY1

Acid blue 281

NY5

Acid red 266

NY7

Polymerase Chain Reaction

PCR

Remazol brilliant blue R

RBBR

Sinapic acid

Si

Syringaldehyde

Sy

Violuric acid

VIO

Vi sinh vật

VSV


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase ..................................................11
Bảng 1.2. Một số loại thuốc nhuộm hoạt tính ................................................................23
Bảng 3.1. Các chủng nấm sinh enzym ngoại bào ..........................................................35
Bảng 3.2. Hoạt tnh laccase và hình ảnh khuẩn lạc của 7 chủng nấm trên môi trường
PDA …………………………………………………………………………………..36
Bảng 3.3. Hiệu suất loại màu của thuốc nhuộm hoạt tnh bằng laccase của FBD154 khi
có mặt các chất gắn kết khác nhau .................................................................................58
Bảng 3.4. So sánh hiệu suất loại màu bởi laccase của chủng nấm FBD154 so với
laccase thu được của các chủng nấm khác .....................................................................59


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh không gian ba chiều của laccase từ M. albomyces .......................... 6
Hình 1.2. Trung tâm hoạt động của laccase ............................................................... ...... 6
Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của laccase [40] ............................................................... ........ 7
Hình 3.1. Hoạt tnh tự nhiên của các mẫu nấm từ Bidoup .............................................34

Hình 3.2. Hoạt tnh laccase của 7 chủng nấm phân lập từ Bidoup – Núi Bà................38
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm FBD154 ................................................38
Hình 3.4. Hệ sợi nấm dưới kính hiển vi quang học ......................................................39
Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loài của chủng FBD154 ................................................40
Hình 3.6. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh laccase ở chủng
Polyporus sp. FBD154 ...................................................................................................42
Hình 3.7. Ảnh hưởng pH môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus
sp.FBD154 .....................................................................................................................43
Hình 3.8. Ảnh hưởng của chất cảm ứng lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus
sp. FBD154 ....................................................................................................................45
Hình 3.9. Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng
Polyporus sp. FBD154 ...................................................................................................46
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh laccase của chủng ..........47
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ lên khả năng sinh laccase của chủng
Polyporus sp.FBD154 ....................................................................................................49
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ lên khả năng sinh laccase của chủng
Polyporus sp.FBD154 ....................................................................................................50
Hình 3.13. Khả năng loại màu thuốc nhuộm RBBR (A); NY5 (B) của dịch enzyme thô
của chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không cómặt các chất gắn kết .................52
Hình 3.14. Sự thay đổi màu RBBR bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 khi
có và không có mặt các chất gắn kết ..............................................................................52
Hình 3.15. Sự thay đổi màu NY5 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 khi
có và không có mặt các chất gắn kết ..............................................................................52
Hình 3.16. Khả năng loại màu thuốc nhuộm NY1 (A); NY7 (B) của enzyme thô của
chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết .......................54


Hình 3.17. Sự thay đổi màu NY1 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi
có và không có mặt các chất gắn kết ..............................................................................54
Hình 3.18. Sự thay đổi màu NY7 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi

có và không có mặt các chất gắn kết ..............................................................................54
Hình 3.19. Khả năng loại màu thuốc nhuộm CLS (A); LF-2B (B) của dịch enzyme thô
của chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết ................55
Hình 3.20. Sự thay đổi màu CLS bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi
có và không có mặt các chất gắn kết ..............................................................................56
Hình 3.21. Sự thay đổi màu LF-2B bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi
có và không có mặt các chất gắn kết ..............................................................................56


MỞ ĐẦU
Hiện nay, ô nhiễm môi trường ngày càng trở nên nghiêm trọng và đang là một vấn đề
cấp thiết được toàn thế giới quan tâm. Sự ô nhiễm ngày càng gia tăng do tác động của thiên
tai và do các hoạt động của con người. Việt Nam cũng là một trong những nước mà tình
trạng ô nhiễm môi trường đang trở nên báo động, trong đó có tình trạng ô nhiễm bởi nguồn
thuốc nhuộm không được xử lý. Cùng với sự phát triển của nhiều ngành công nghiệp khác
nhau sử dụng màu tổng hợp như giấy in, photo màu hay được thêm vào các sản phẩm dầu
mỏ, đặc biệt là ngành công nghiệp dệt nhuộm thì một lượng lớn nước thải màu cũng được
thải ra môi trường. Thông thường, các chất có trong thuốc nhuộm không bám hết vào sợi
vải trong quá trình nhuộm mà bao giờ cũng còn lại một lượng dư nhất định tồn tại trong
nước thải. Đây chính là nguyên nhân làm cho nước thải dệt nhuộm có độ màu cao và nồng
độ chất ô nhiễm lớn, nếu không được xử lý triệt để chúng sẽ gây ô nhiễm nguồn nước mặt
và nước ngầm.Cụ thể là thuốc nhuộm gây nên rất nhiều bệnh hiểm nghèo đặc biệt là bệnh
ung thư và gây nên đột
biến.
Do những ảnh hưởng xấu đến môi trường nên xử lý thuốc nhuộm đang là vấn đề
được toàn xã hội rất quan tâm. Một số phương pháp xử lý nước thải từ các nhà máy dệt
nhuộm được sử dụng hiện nay là phương pháp vật lý và hóa học thường không triệt để. Loại
màu và phân hủy thuốc nhuộm bằng con đường sinh học đang được quan tâm trong những
năm gần đây vì công nghệ sinh học vừa mang lại hiệu quả kinh tế và rất thân thiện với môi
trường. Trong các phương pháp xử lý màu thuốc nhuộm bằng vi sinh vật thì sử dụng hệ

enzyme ngoại bào từ đại diện của hai ngành Basidomycota và Ascomycotanhư laccase,
manganese peroxidase (MnP), lingnin peroxidase (LiP) đang được quan tâm bởi hiệu quả về
cả kinh tế và môi trường.
Những năm gần đây việc nghiên cứu sàng lọc để tiến tới sản xuất enzyme ngoại bào
từ nấm đảm đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và giành
được sự quan tâm đăc biệt là laccase. Các nguyên cứu tìm kiếm và khai thác

1


enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoredase và peroxidase từ nấm đảm đã đạt được thành
tựu cao. Đã phát hiện trên 100 loại laccase có trọng lượng phân tử khác nhau với hoạt tnh và
tnh chất khác nhau. Chúng có khả năng phá vỡ các liên kết trong các hợp chất hữu cơ hoặc
xúc tác chuyển hóa chúng thành các chất ít độc hơn và các dạng dễ phân hủy hơn để tiến tới
khoáng hóa hoàn toàn chất ô nhiễm. Laccase xuất hiện ở các loại thực vật bậc cao và nhiều
nhất ở nấm lớn, có dải pH tối thích rộng và cũng có loại laccase có khả năng chịu nhiệt cao.
Chúng có khả năng phân hủy phenol và các hợp chất của phenol. Ngoài ra, laccase còn được
ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như khử độc và loại màu thuốc nhuộm và các màu khác do
các ngành công nghiệp thải ra, xử lý nước thải, làm trắng giấy và có ứng dụng trong công
nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, công nghệ nano, dược phẩm v.v.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số
đặc tính của chủng nấm đảm thu thập từ vƣờn quốc gia Bidoup - Núi Bà” đã được tiến
hành. Luận văn bao gồm những nội dung chủ yếu sau:
- Phân lập và sàng lọc các chủng nấm đảm có khả năng sinh laccase cao từ vườn
quốc gia Bidoup- Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng;
- Phân loại chủng nấm đã được chọn lọc có hoạt tnh cao nhất bằng phương pháp
truyền thống và xác định trình tự vùng ITS;
- Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy phù hợp để chủng đã được chọn sinh tổng hợp
laccase với hoạt tính cao;
- Đánh giá khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tnh (tổng hợp và thương

mại)bởi laccase thô thu được từ chủng nghiên cứu có và không có chất gắn kết.

2


CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm tự nhiên của Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà
Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà là một trong hai mươi tám vườn quốc gia nằm trong
hệ thống các khu rừng đặc dụng Việt Nam. Khu vực Bidoup – Núi Bà thuộc địa giới hành
chính Huyện Lạc Dương Tỉnh Lâm Đồng chiếm gần trọn cao nguyên
Langbiang (còn gọi là cao nguyên Lâm Viên), cách thành phố Đà Lạt 50 km theo tỉnh lộ 273.
Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà nằm trong tọa độ địa lý Từ 12 độ 00' 00” đến
12 độ 52' 00” vĩ độ Bắc và từ 108 độ 17'00” đến 108 độ 42' 00” kinh độ Đông.
Địa hình núi trung bình và núi cao, chia cắt mạnh, độ cao phổ biến từ 1.500m 0
1.800m. Ðịa hình thấp dần theo hướng Nam Bắc. Nhiệt độ trung bình năm là 18 C. Lượng
mưa trung bình 1.755 mm/năm, mùa khô lượng mưa chiếm khoảng 20%, mùa mưa lượng
mưa chiếm khoảng 80%; số ngày mưa trung bình 170 ngày/năm. Số ngày có sương mù
khoảng 80 ngày/năm, tập trung vào các tháng 2, 3, 4, 5. Khu vực Vườn quốc gia Bidoup-Núi
Bà là thượng nguồn của các hệ sông Krông-Knô, sông Ða Nhim, duy trì nguồn nước cho một
loạt hồ của Ðà Lạt như: hồ Ðan Kia, hồ Ða Thiện, hồ Than Thở, hồ Xuân Hương.
Vườn quốc gia Bidoup-Núi Bà là một mẫu chuẩn hệ sinh thái rừng kín thường xanh
mưa ẩm á nhiệt đới của Việt Nam đặc trưng cho vùng cao nguyên, là một địa điểm lý
tưởng trong nghiên cứu khoa học, bảo tồn và đa dạng sinh học.
Đa dạ ng si nh h ọc về l oài thực vật : với khoảng 1.468 loài bao gồm họ Lan 250 loài; họ
Cúc 78 loài; họ Ðậu 65 loài; họ Cỏ 58 loài; họ Cà phê 45 loài; họ Dẻ 41 loài; họ Thầu dầu 35
loài; họ Cói 33 loài; họ Hoa hồng 33 loài; họ Long não 29 loài; họ Dâu tằm 28 loài; họ Ðơn
nem 25 loài; họ Bạc hà 22 loài; họ Ðỗ quyên 21 loài; họ Chè 21 loài…
Đa dạng về nguồn gen e : có nhiều nguồn gene quý hiếm và đặc hữu; riêng về đặc hữu
hẹp đã thống kê được 91 loài: Thông tre, Thông đỏ, Du sam, Pơ mu Bách xanh, Thông hai lá
dẹt, Thông 5 lá Ðà Lạt, Ðỉnh tùng, Hoàng đàn giả. Côm Bidoup, Chè gò đồng Bidoup, Lan

Hoàng Thảo Ðà Lạt, Lan Hoàng thảo Lang Biang, Trà hoa Langbiang,

3


Chân chim Langbian, Cung nữ Langbian, 250 loài phong lan, cho hoa đẹp và quý, 9 loài Ðỗ
quyên, 5 loài Thu hải đường, 6 loài Thích là các nguồn gen quý.
Đa dạng về loài đ ộng v ật: Về thú: Bao gồm các họ: họ Cầy, họ Chuột, họ Khỉ, họ Mèo, họ
Sóc cây, họ Chồn, họ Hươu nai, họ Gấu, họ Trâu bò, họ Nhím, họ Chuột chù, Chồn bay, họ
Dơi quả, họ Cu li, họ Vươn, họ Chó, họ Lợn, họ Cheo cheo, họ Tê tê, họ Sóc bay, họ Dúi. Về
Chim: họ Khướu, họ Trĩ , họ Cu cu, họ Chào mào, họ chim chích; đặc biệt có những loài đặc
hữu hẹp như: Mi Langbian, Khướu đầu đen, Khướu má xám, Sẻ thông họng vàng. Về Bò sát:
họ Rắn nước, họ Nhông, họ Rắn hổ, họ Tắc kè, họ Kỳ đà, họ Rùa núi, họ Thằn lằn bóng, họ
Trăn, họ Rắn mống, họ Rắn lục, họ Ba ba. Về Ếch
Nhái: có các họ: họ Ếch nhái, họ Nhái bầu, họ Cóc nhà, họ Ếch cây; … vv.
Tuy nhiên cho đến nay, các nghiên cứu về hệ nấm tại vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà
còn ít, mới chỉ có đề tài điều tra, đánh giá, phân loại các loài nấm dưới tán rừng thông tập
trung vào điều tra các loài nấm cộng sinh ngoại bào của ThS Tôn Thất Minh, còn hệ nấm ngoại
sinh và các nhóm vi sinh khác chưa có một nghiên cứu cụ thể. Đặc biệt, với đặc điểm rừng
cây tán lá rộng, độ che phủ cao, ẩm quanh năm thì hệ vi sinh vật nơi đây được kỳ vọng là
khá đa dạng, cần được nghiên cứu và khai thác bền vững. Vì vậy đề tài mở ra một hướng
nghiên cứu mới, vừa góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu đa dạng sinh học cho Vườn quốc gia
Bidoup – Núi Bà, vừa đưa ra hướng khai thác hiệu quả hệ sinh thái rừng phục vụ cho việc
phát triển kinh tế và môi trường bền vững.
1.2. Enzyme laccase
1.2.1. Giới thiệu về laccase
Laccase (p–benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2 )

thuộc nhóm

enzyme oxy hóa khử. Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất
sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các enzyme khác, laccase có
phổ cơ chất rất đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine,
amine thơm, benzenethiol, PCB, dioxin và cả các hợp chất vô cơ như iot. Các loại laccase
tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng

4


phân tử, tnh chất glycosyl hóa và tnh chất động học.
Trong những năm gần đây, laccase đặc biệt được quan tâm bởi các enzyme này có
những ứng dụng hữu ích trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau trong xử lý khử độc bằng
công nghệ phân hủy sinh học, dệt nhuộm, tổng hợp hữu cơ, thực phẩm, dược phẩm v.v.
1.2.2. Cấu trúc của phân tử laccase
Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng isozyme này
khác nhau về trình tự axit amin và một số tnh chất về động học xúc tác. Nấm có thể tạo ra
nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cả về mức độ glycosyl hóa và cả thành phần các
gốc cacbonhydrat. Loài nấm Trametes versicolor có 5 dạng isozyme chỉ khác nhau về thành
phần cacbonhydrat, thành phần cacbonhydrat của chúng thay đổi từ 10-45% so với khối
lượng của thành phần protein. Phân tử laccase thường là monomeric protein, chỉ một số là
oligomeric protein, có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60-90 kDal. Phần lớn
laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lượng cacbonhydrat chiếm khoảng 1025% [35]. Ngoài ra còn có nhiều loại enzyme giống laccase (laccase-like).
Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử
đồng. Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: Loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại
3 (T3), chúng khác nhau về tnh chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử. Các nguyên tử đồng
T1 và T2 có tnh chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên
tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với
anion mạnh.

5

Hình 1.1. Hình ảnh không gian ba
chiều của laccase từ M. albomyces
Tiểu phần A, B, C được kí hiệu đỏ,
xanh lam và xanh lá cây

Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần chính (vùng) A, B, C có khối lượng
tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase. Vị trí liên
kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng
C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C. Trung
tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa một nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptit
có hai gốc histidin và một gốc cystein. Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử lưu
huỳnh của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo
cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng. Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử
đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ
trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ (Hình 1.2).

Hình 1.2. Trung tâm hoạt động của laccase

6


1.2.3. Cơ chế xúc tác của laccase
Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất
có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các loại enzyme
khác, laccase có phổ cơ chất rộng. Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi
hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự
phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme. Các đại lượng
này phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của cơ chất. Thế oxy hóa khử của laccase dao động

trong khoảng 0,4 đến 0,8 V [43]. Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccase thường
tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính
laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không
cần xúc tác enzyme như hydrat hóa, phân ly hoặc polymer hóa.
Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa cơ
chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu

2+

) trở

+
thành dạng Cu , hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử
+
(Cu ). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4
electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptit bảo thủ
His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian
peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước (Hình 1.3)

7


Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của laccase [40]

8


Ngoài ra, cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế sau. Cơ chế đơn
giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4
nguyên tử đồng đảm nhiệm. Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh

hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của
laccase. Trong trường hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian đó là chất gắn kết
(CGK). Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị
laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do [77]. Sự tham gia của các chất trung gian đã làm tăng
phổ cơ chất xúc tác và tnh không đặc hiệu cơ chất của laccase.
1.2.4.Chất gắn kết
Như đã trình bày ở trên, laccase có khả năng loại và khử độc nhiều màu trong công
nghiệp [45]. Tuy nhiên, một số màu không thể bị oxy hóa, hoặc chỉ bị oxy hóa một phần
bởi laccase. Bởi vì các phần tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế oxi hóa khử
quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của laccase. Trong trường
hợp này cần một chất gắn kết (mediator) có vai trò quan trọng để có thể tiếp xúc với trung
tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do [77]. Sau đó CGK ở
dạng oxy hóa nhận một điện tử của cơ chất và trở thành dạng khử, tiếp tục tham gia vào chu
kỳ xúc tác. Ngược lại, laccase sau khi cho CGK một điện tử thì trở thành dạng khử, sau đó bị
oxy hóa thành dạng oxy hóa và tiếp tục tham gia vào chu kỳ tiếp theo. Do đó, các CGK có vai
trò quan trọng đối với các phản ứng enzyme trong những trường hợp này. Hơn 100 loại CGK
được biết đến nhưng các CGK thường được sử dụng nhiều nhất là HBT,VIO, ABTS, Ace, Si, Sy.
Những CGK này đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc oxy hóa các loại màu khác
nhau [45].
1.2.5. Tính chất của laccase
1.2.5.1. pH tối ưu và độ bền pH
Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4-6 đối với cơ chất phenolic. Khi

9


tăng pH sang vùng trung tnh hoặc vùng kiềm thì hoạt tnh của laccase bị giảm, nguyên nhân
do anion nhỏ là ion hydroxyt đã ức chế laccase. Mặt khác, tăng pH còn làm giảm thế oxy hóa
khử của các cơ chất phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxy hóa bởi laccase hơn. Do vậy,
hoạt tnh laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng đối lập của pH là sự tăng

chênh lệch thế oxy hóa khử laccase-cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên
tử của ion hydroxit. Đối với các cơ chất không phải phenolic như ABTS thì phản ứng oxy hóa
không liên quan đến sự vận chuyển ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2-3.
Ngược lại, tính bền của laccase cao nhất trong khoảng pH kiềm nằm trong khoảng 8-9.
1.2.5.2. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt
Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của VSV. Nhìn
o
o
chung, laccase bền ở 30-50 C và nhanh chóng mất hoạt tnh ở nhiệt độ trên 60 C.
Laccase bền nhiệt nhất được phân lập chủ yếu từ các loài thuộc sinh vật nhân sơ. Ví dụ thời
o
gian bán hủy của laccase của Streptomyces lavendulae là 100 phút ở 70 C và của protein
o
cotA từ loài Bacillus subtilis là 112 phút ở 80 C. Thời gian bán hủy của laccase
o
o
có nguồn gốc từ nấm thường dưới 1 giờ ở 70 C và dưới 10 phút ở 80 C [43].
1.2.5.3. Hằng số động học của phản ứng laccase
Hoạt tnh xúc tác của enzyme được đặc trưng bởi hằng số Michaelis-Menten
(Km). Hằng số này của laccase dao động trong một giới hạn khá rộng, trong khoảng 2500 µM phụ thuộc vào nguồn enzyme và cơ chất. Giá trị Km thấp nhất đối với cơ chất là
syringaldazine. Ái lực đối với oxy ít phụ thuộc vào enzyme hơn và chỉ dao động trong
khoảng 20-50µM.
1.2.5.4. Chất ức chế laccase
Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như azit, cyanit, fluorit. Các ion này
sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên và cản trở các dòng điện tử đi đến các nguyên tử
này. Các chất ức chế laccase khác là ethylenediaminetetraaxetic axit, axit béo, tropolon và
axit coumaric nhưng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao hơn.

10

Các hợp chất chứa sulfydryl như L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic axit cũng được
coi là các chất ức chế laccase.
1.2.6. Sự phân bố của laccase và vi sinh vật sinh enzyme laccase
Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng được tìm thấy ở thực vật, nấm,
một số vi khuẩn và côn trùng. Laccase lần đầu tiên được phát hiện ở cây Rhus vernicifera.
Nghiên cứu laccase trên đối tượng đầu tiên là thực vật và nấm đảm là các cơ thể sinh tổng
hợp laccase rất phổ biến. Laccase từ nấm được nghiên cứu và khảo sát rất kỹ đặc biệt là
laccase từ nấm đảm thuộc chi Basidiomyces. Ngoài ra, laccase còn được phát hiện trong các
loài nấm của các chi Ascomyces,Deuteromyces và các loài nấm có khả năng phân hủy
lignocellulose như Agaricus bisidomyces, Botrytis cinerea, Chaetomiumthemophilum, Coprius
cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiate, Pleurotusostreatus, Pycnoporus cinnabarius,
Trametes versicolor v.v. Tuy nhiên, các nghiên cứu về laccase trên các đối tượng nấm sợi,
xạ khuẩn và vi khuẩn lại không nhiều. Một số VSV có khả năng tạo laccase được trình bày ở
bảng 1.1.

11


Bảng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase
VSV

Nấm đảm

Nấm sợi

Xạ khuẩn

Vi khuẩn

Tên chủng

Tài liệu tham khảo

Phanerochaete chrysosporium

Viswanath et al., 2008 [96]

Pycnoporus coccineus

Jaouani et al. 2005 [33]

Pycnoporus sanguineus

Pointing et al. 2000 [67]

Pycnoporus cinnabarinus

Recordet al. 202 [74]

Cerrena unicolor

Michniewicz A et al., 2005 [53]

Trametes versicolor

Moldes et al., 2012 [54]

Pleurotus ostreatus

Hou Het al., 2004 [30]

Pleurotus florida

Sathishkumaret al., 2010 [81]

Polyporus pseudobetulinus

Songserm et al., 2012 [89]

Polyporus arcularius

Jegatheesan, Eyini, 2014 [34]

Coriolopsis polyzona

Cui et al., 2009 [18]

Aspergillus ochraceus

Saratale et al., 2006 [64]

Trichoderma harzianum

Sadhasivam S et al., 2008 [63]

Aspergillus niger

Téllez-Juradoet al., 2006 [94]

Penicillium simplicissimum

Zenget al., 2006 [67]

Penicillium pinophilum

Dhakar et al.,2014 [21]

Myrothecium verrucaria 24G-4

Sulistyaningdyahet al.,2003 [92]

Streptomyces lavendulae

Suzuki et al., 2003 [93]

Streptomyces psammoticus

Niladeviet al., 2009 [56]

Streptomyces lydicus

Mahmoud et al., 2013 [50]

Streptomyces coelicolor

Machczynski et al., 2004 [49]

Bacillus halodurans

Ruissenaars, Hartmans, 2004[78]

Bacillus subtilis

Wang et al., 2011 [99]

Stenotrophomonas maltophilia

Galai, Marzouki, 2009 [24]

Azospirillum lipoferum

Givaudan et al., 1993 [26]
12