Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao đan sâm

1

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge., Lamiaceae) là dược liệu được dùng để
chữa một số bệnh như cao huyết áp, rối loạn nhịp tim, đau thắt ngực, rối loạn
kinh nguyệt…Hiện nay nhu cầu trong nước và thế giới về cao Đan sâm là rất
lớn. Một số công ty dược phẩm trong nước hiện đã sản xuất cao Đan sâm.
Tuy nhiên, việc chiết xuất các cao này vẫn chưa đáp ứng yêu cầu sản xuất tại
các nhà máy đạt GMP vì quy trình chiết xuất chưa được tối ưu hóa nên hiệu
suất chiết chưa cao, chất lượng cao Đan sâm còn thấp, không ổn định. Do đó,
tác dụng điều trị không đảm bảo vì chứa ít hoặc không có các hoạt chất.

Chiết xuất dược liệu là một quá trình dùng dung môi để chiết tách một hoặc
nhiều hoạt chất có tác động sinh học từ pha rắn là các bộ phận của dược liệu
có thể là thân, rễ, quả, lá, hoa… Mối liên quan giữa các điểu kiện chiết xuất
(dược liệu, dung môi và kỹ thuật) với kết quả chiết xuất (hiệu suất, tỷ lệ hoạt
chất, tỷ lệ tạp chất…) được gọi là mối liên quan giữa nhân và quả. Bằng con
đường dò dẫm theo kinh nghiệm, nhà chiết xuất khó lòng xác định các mối
liên quan ấy một cách định lượng nên có thể khảo sát yếu tố thứ yếu mà bo
qua yếu tố trọng yếu, tốn thì giờ mà không tìm ra các thông số phù hợp.
Ngày nay, việc xây dựng một quy trình chiết xuất dược liệu có thể được thực
hiện một cách khoa học bằng cách kết hợp phương pháp thực nghiệm truyền
thống với sự hỗ trợ của bộ ba phần mềm gồm: a). Phần mềm thống kê: thiết
kế mô hình thí nghiệm để định hướng cho thực nghiệm chiết xuất. b). Phần
mềm thông minh sử dụng công nghệ thần kinh-logic mờ có thể phân tích: xu


2

hướng, mức độ và quy luật liên quan giữa điểu kiện chiết xuất và kết quả

chiết xuất. c). Phần mềm thông minh kết hợp mạng thần kinh nhân tạo với hệ
diễn tả gen có thể xác lập mô hình liên quan giữa nhân và quả và trên cơ sở
đó tối ưu hóa điểu kiện chiết xuất sao cho kết quả chiết xuất như mong muốn.
Do đó, đề tài “Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao Đan sâm” được
thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu như sau:
a. Kiểm kiểm nghiệm dược liệu Đan sâm và thẩm định phương pháp định
lượng tanshinon IIA.
b. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng trên hiệu suất, hàm lượng tanshinon IIA
và tạp chất trong quy trình chiết xuất cao Đan sâm.
c. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao Đan sâm sao cho hiệu suất cao nhất,
hàm lượng tanshinon IIA cao nhất và tạp chất tối thiểu.


3

2. TỔNG QUAN

2.1. Dược liệu Đan sâm
2.1.1. Thực vật học
Tên khoa học và phổ thông
Tên khoa học: Salvia miltiorrhiza Bunge., Lamiaceae ( Họ hoa môi).
Tên Việt Nam : Đan sâm, Huyết sâm, Xích sâm, Huyết căn,…
Tên nước ngoài: Dan shen, Chi shen, Zi Dan shen.
Mô tả thực vật
Đan sâm là một loại cây thảo, sống lâu năm, cao 30-80cm, toàn thân mang
lông ngắn màu vàng nhạt. Rễ mảnh có đường kính 0,5-1,5cm, phân nhánh
nhiều, màu đo nâu. Thân vuông trên có các gân dọc. Lá kép lông chim, mọc
đối: 3-5 lá chét, đặc biệt có thể có đến 7, hình trứng hoặc trái xoan. Lá chét
giữa thường lớn hơn cả. Lá kép có cuống dài, cuống lá chét ngắn có dìa. Lá
chét dài 2-7,5cm, rộng 0,8-5cm. Mép lá chét có răng cưa tù. Mặt trên lá chét

màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông
nhưng dài hơn. Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá chét thành múi nho. Cụm
hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu ngọn thành bông gồm nhiều vòng sít nhau ở ngọn,
mỗi vòng có 3-10 hoa màu lơ tím nhạt; đài chia 2 môi, môi trên dài hơn ống


4

tràng và cong hình lưỡi liềm, môi dưới chia 2; nhị 3. Quả bế nho, đầu tù, dài
3 mm. Mùa hoa: tháng 5-8; mùa quả : tháng 6-9. [3,4]

Sơ đồ 2.1. Phân loại thực vật Đan sâm


5

2.1.2. Phân bố và bộ phận dùng
Phân bố
Salvia L. là một chi lớn trong họ Lamiaceae, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới
ấm và cận nhiệt đới, chỉ có ít loài ở vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam có 4-5 loài,
trong đó Đan sâm là cây nhập nội. Cây Đan sâm trồng ở nước ta có xuất xứ từ
Trung Quốc. Cây trồng ở trại thuốc Sa Pa (Viện Dược liệu) to ra thích nghi
với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao. Cây sinh trưởng phát triển tương
đối tốt; ra hoa quả hàng năm; hạt giống thu được đã gieo đi gieo lại nhiều
năm. Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện Dược liệu) sinh trưởng
kém hơn. Đam sâm chưa được đưa vào sản xuất. Những cây còn lại ở Sa Pa
chỉ có ý nghĩa để giữ giống. [2,3,4,12]
Bộ phận dùng

Hình 2.1. Toàn cây Đan sâm

Rễ Đan sâm được thu hái vào mùa xuân hay mùa thu, đào rễ và thân rễ về rửa
sạch đất cát, cắt bo rễ con, phơi âm can hoặc sấy nhẹ đến khô. [8]


6

2.1.3. Thành phần hóa học
Cho đến nay, hơn 70 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ Đan
sâm Salvia miltiorrhiza Bunge. với các hàm lượng rất khác nhau. Các thành
phần chính trong Đan sâm có thể được phân thành 2 nhóm hợp chất: phân cực
như các acid salvianolic và kém phân cực như các tanshinon. [25,26]

Hình 2.2. Hoa và rễ Đan sâm

Nhóm Tanshinon
Nhóm tanshinon trong Đan sâm là các diterpenoid kiểu abietanoid có màu.
Khoảng 50 hợp chất tanshinon đã được phân lập từ rễ của loài Salvia
miltiorrhiza. [28]
Nhóm polyphenol
Cho đến nay, khoảng 30 hợp chất polyphenol phân cực đã được phân lập từ
Đan sâm. Hầu hết là các tổ hợp từ các monomer acid caffeic, isoferulic hay


7

acid protocatechuic. [14]
Một số chất đã gặp nhiều ở các loài khác (acid caffeic, acid isoferulic, acid
rosmarinic, methyl rosmarinat, acid protocatechuic, protocatechualdehyd),
nhưng cũng có 1 số hợp chất tương đối chuyên biệt đối với chi Salvia (acid

salvianic, các acid salvianolic A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, acid lithospermic,
ethyl lithospermat, ethyl lithospermat B, acid prolithospermic, danshensu,
salviaflasid, salvinal...). Dẫn xuất của chúng được chia thành 4 nhóm chính
dựa trên số đơn phân acid caffeic. [14]
− Acid caffeic monomer: nhóm này bao gồm acid isoferulic, acid caffeic,
danshensu và 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-lactamid.
− Acid caffeic dimer: gồm acid rosmarinic, methyl rosmarinate, acid
salvianic C, acid salvianolic D, acid salvianolic F, acid prolithospermic,
acid salvianolic G.
− Acid caffeic trimer: gồm acid salvianolic A, acid lithospermic, methyl
lithospermat, dimethyl lithospermat, acid salvianolic C, acid salvianolic J,
acid salvianolic I.
− Acid caffeic tetramer: nhóm này cũng có thể coi như là dẫn chất dimer của
acid rosmarinic, gồm acid salvianolic E, acid salvianolic B, ethyl
lithospermat, magie lithospermat B và kali-amoni lithospermat B.
Các nhóm hợp chất khác
Ngoài các nhóm hợp chất chính có tác dụng sinh học, trong Đan sâm còn
chứa nhiều hợp chất cao phân tử như các polysaccharid (tinh bột, đường...),
lignan, các polypeptid, protein.... Các hợp chất này dễ tan trong nước và sẽ
được lôi kéo theo trong quá trình chiết xuất cao nên được gọi là các chất


8

không mong muốn cần hạn chế trong quá trình chiết xuất. [25]
Bảng 2.1. Các hợp chất phân lập từ Salvia miltiorrhiza Bunge
Hợp chất phân cực

Hợp chất kém phân cực

Acid salvianic A,B,C

Tanshinon I,IIA,IIB,V, VI

Acid salvianolic A,B,C,D,E,G

Cryptotanshinon

Acid rosmarinic

Isotanshinon I,II,IIB

Methyl rosmarinat

Isocryptotanshinon

Monomethyl lithospermat

Hydroxytanshinon IIA

Dimethyl lithospermat

Methyl tanshinonat

Ethyl lithospermat

Danshenxinkum A,B,C,D

Acid lithospermic B

Dihydroisotanshinon I

Protocatechualdehyd

Neocryptotanshinon

Acid isoferulic

Deoxyneocryptotanshinon

Baicalin

Salviol

Isomperatorin

Nortanshinon

Acid ursolic

Tanshindiol A,B,C

Bêta - sistosterol

Miltiron

Daucosterol

1-dehydromiltiron

Stigmasterol

1-dehydrotanshinon IA

Tigo-genin

1-detoisocryptotanshinon
Cryptoacetalid
Miltiodiol
Miltipolon
Tanshinlacton
Formyltanshinenon
Danshen-spiroketallacton
Miltipolon
Nor-salvioxid


9

O

O

O

O

O

O

O

O

O

tanshinon I

dihydro-tanshinon I

1,2-dihydro-tanshinon I

= tanshiquinon

= dihydrotanshiquinon

= 1,2-dihydrotanshiquinon

O

O

O
O

O

O

*

O

O

O

*

O

O

nortanshinon

dihydro-nortanshinon

O

O

tetrahydro-tanshinon I
O

O

O

OH

O

O

O

tanshinon IIA

dihydro-tanshinon IIA

O

O

O

O

1-hydroxy-tanshinon IIA
O

O
O

O
O

OH

O

OH

tanshinon IIB

CH2OH

dihydro-tanshinon IIB

tanshinon A

Hình 2.3. Công thức hóa học một số chất thuộc nhóm tanshinon.

COOH

O
HO

O

OH
OH
HO

HO
HO

COOH

O

O

HO
OH

HO

O

OH
OH


10

Acid salvianolic A

Acid salvianolic C
OH
OH

O
O
CO2H O

HO

COOH

CO2H

OH

OH

O

OH

O

OH

OH
O

Acid salvianolic I
OH
OH

Acid isosalvianolic C
COOH

HO
HO

O

HO

HO

O

O
HOOC
HO

O
O

HO

OH

Acid salvianolic B
Hình 2.4. Một số công thức hóa học của nhóm polyphenol.

2.1.4. Tác dụng dược lí
Hoạt tính chống ung thư


11

Tanshinon IIA phân lập từ Đan sâm được chứng minh có độc tính trên tế bào
ung thư ở người, là chất có tiềm năng trong điều trị ung thư máu. Cơ chế được
cho là tanshinon IIA có vai trò trong ức chế con đường tăng sinh của tế bào.
Thêm vào đó, tanshinon IIA cũng gây ra sự chết hàng loạt của tế bào ung thư
gan Hep G2. [26]
Hoạt tính chống oxy hóa
Tác dụng chống oxy hóa của polyphenol trong Đan sâm dựa trên 3 cơ chế là

ngăn chặn phản ứng peroxy hóa lipid, loại bo gốc tự do và chống oxy hóa
lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL). Kết quả so sánh về tác dụng chống oxy hóa
giữa 3 loài Salvia miltiorrhiza, S. verticillata và S. przewalskii cho thấy dịch
chiết rễ của S. miltiorrhiza có tác dụng chống oxy hóa cao nhất. Acid
salvianolic B có hiệu quả trên điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh có liên
quan đến stress oxy hóa (oxidative stress). Nó có tác dụng đảo ngược chu
trình chết tế bào gây bởi 6-hydroxydopamin trên tế bào khối u SH-SY5Y. Xử
lý trước tế bào SH-SY5Y với salvianolic B làm giảm đáng kể lượng 6hydroxydopamin gây ra các phản ứng oxy hóa và ngăn ngừa tăng calci nội
bào. Acid salvianolic B còn có tác dụng bảo vệ não khoi tổn thương do thiếu máu
cục bộ ở chuột, bằng cách giảm lipid peroxid, loại bo gốc tự do và cải thiện
chuyển hóa năng lượng [17]. Tác dụng chống oxy hóa của acid salvianolic B
mở ra một con đường cho việc điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh như
Parkinson [22].
Tác dụng trên bệnh thiếu máu cục bộ và nhồi máu cơ tim
Dịch chiết rễ Đan sâm được chứng minh là có tác dụng cải thiện rối loạn tuần
hoàn máu, bảo vệ những cơ quan khoi tổn thương do biến chứng của thiếu


12

máu cục bộ và nhồi máu cơ tim. Tác dụng cải thiện rối loạn tuần hoàn máu
của Đan sâm được giải thích bằng nhiều cơ chế khác nhau như loại bo các
peroxid, ức chế kết tập tiểu cầu, bạch cầu, ngăn sự bám dính bạch cầu, tiểu
cầu lên tế bào nội mô mạch máu, giảm lượng tế bào mast, giảm phóng thích
chất trung gian hóa học gây viêm [26,28]
Thành phần không phân cực và thành phần phân cực trong Đan sâm đều có
tác dụng bảo vệ tim, não, gan, thận, phổi khoi bị tổn thương. 3,4dihydroxyphenyl lactic acid, acid salvianolic B, acid lithospermic B, tanshinon
IIA bảo vệ tim khoi suy. Acid salvianolic A, acid salvianolic B, tanshinon IIA,
tanshinon IIB bảo vệ não. Các chất phân cực trong rễ Đan sâm cải thiện tình
trạng tổn thương của gan và phổi. Acid lithospermic B, magie lithospermat B

bảo vệ thận. Khi bị thiếu máu cục bộ, do suy giảm ATP, các chất dẫn truyền
thần kinh như norepinephrin tăng lên gây tổn hại cho não bằng cách oxy hóa
để sản xuất các gốc oxy hoặc các cơ chế khác. Đan sâm được chứng minh là
có thể giảm việc giải phóng của norepinephrin, dopamin và serotonin trong
não thiếu máu cục bộ do tác dụng ức chế men chuyển [2,3,14,26].
Tác dụng hạ huyết áp
Đan sâm được chứng minh là có tác dụng ức chế men chuyển (tác dụng lên
angiotensin II) gây hạ huyết áp, giãn động mạch và giảm đông máu. Một
nghiên cứu khác đã xác định tác dụng hạ huyết áp của Đan sâm có thể là do
giãn động mạch vành. Uống magie lithospermat B có tác dụng hạ huyết áp
tâm trương và tâm thu trên chuột. Tác dụng này là do magiesium tanshinoat B
kích thích giải phóng oxid nitric (NO) và các chất chuyển hóa của nó, oxid
nitric là một chất giãn mạch mạnh và đóng vai trò trong việc điều hòa trương


13

lực thành mạch. Acid prolithospermic cũng có thể gây ra sự giãn mạch động
mạch chủ chậm nhưng kéo dài trên chuột [2,26].
Tác dụng chống kết tập tiểu cầu
Tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu được giải thích là do tác dụng ức chế men
chuyển và tác dụng lên receptor α2β1. Acid salvianolic B có tác dụng chống
kết tập tiểu cầu do tác dụng lên receptor α2β1. Tác dụng trên receptor α2β1 của
acid salvianolic B có đặc điểm là chỉ tác dụng lên collagen chứ không tác
dụng lên fibrinogen. Acid acetylsalvianolic A là một dẫn xuất bán tổng hợp từ
các acid salvianolic cũng có tác dụng chống kết tập tiểu cầu. Acid rosmarinic
và các acid salvianolic có tác dụng ức chế thomboxan B2, ngăn sự kết tập lại
của các tiểu cầu [2,26].
Tác dụng khác
Acid rosmarinic, lithospermic và dẫn xuất methyl ester của những chất này ức

chế adenylat cyclase trong cả não và hồng cầu chuột. Acid salvianolic A
chống loét do ức chế hoạt động của bơm H +, K+-ATPase . Acid salvianolic B
có thể ức chế mảng ngoại bào β-protein amyloid hình thành, đây là một trong
những nguyên nhân gây bệnh Alzheimer. Các dẫn xuất magie và kali amoni
của acid salvianolic B tác động có lợi trong triệu chứng urê huyết do giảm urê
huyết, creatin, methylguanidin và acid succinic guanidin ở chuột suy thận
mãn tính. Acid salvianolic A, B cũng được chứng minh là chất ức chế 5lipoxygenase và aldose reductase tham gia vào phản ứng dị ứng và chuyển
hóa các galactose. Dịch chiết Đan sâm không có tác dụng giống như insulin ở
liều thử nghiệm 10 µg/ml, nhưng nó lại có tác dụng cảm ứng enzym ở liều


14

trên 1µg/ml. Đan sâm còn được sử dụng để trị sốt xuất huyết, ho gà, mất ngủ,
viêm mũi dị ứng, glaucom [14]

2.1.5. Công dụng và cách dùng
Ðan sâm là một vị thuốc còn dùng trong phạm vi nhân dân để làm thuốc bổ
cho phụ nữ, phụ nữ chưa chồng da vàng, ăn uống thất thường, chữa tử cung
xuất huyết, kinh nguyệt không đều, đau bụng, các khớp xương sưng đau. Còn
dùng để chế thuốc xoa bóp. Liều dùng 6-12 g dưới dạng thuốc sắc [3].

2.1.6. Đơn thuốc và chế phẩm có chứa Đan sâm
Đơn thuốc chứa Đan sâm
Chữa phụ nữ kinh nguyệt không đều, hoặc sớm hoặc muộn, nhiều hay ít, thai
không yên, sinh xong máu hôi ra chưa hết, đau khớp xương (Bản thảo cương
mục): Ðan sâm rửa sạch, thái phơi khô, tán nho. Ngày uống 8 g, chia làm 2
hay 3 lần uống [3]
Chữa kinh nguyệt không ra, đau đớn (Diệp Quyết Tuyền): Ðan sâm 10 g,
Hương phụ 6 g, Đương quy 10 g, Bạch thược 5 g, Xuyên khung 5 g, Địa

hoàng 10 g, Nước 600 ml. Sắc còn 200 ml, chia làm 3 lần uống trong ngày
[8].
Chế phẩm chứa Đan sâm trên thị trường
Đan sâm tam thất

(Domesco)

Thiên sứ hộ tâm đan

(Công ty dược phẩm Á Âu)


15

Ích thận vương

(Công ty dược phẩm Á Âu)

Phụ lạc cao

(Công ty dược phẩm Á Âu)

Đan sâm - Tam thất
(Công ty cổ phần dược phẩm Domesco)

Thiên sứ hộ tâm đan
(Công ty cổ phần dược phẩm Á Âu)

Phụ lạc cao
(Công ty cổ phần dược phẩm Á Âu)

Hình 2.5. Các chế phẩm Đan sâm trên thị trường

2.2. Chiết xuất dược liệu
Chiết xuất dược liệu là một quá trình kỹ thuật dùng dung môi (nước, cồn…)
để chiết tách một hoặc nhiều hoạt chất có tác động sinh học (alkaloid,


16

flavonoid, anthraquinon…) từ pha rắn là các bộ phận của dược liệu (thân, rễ,
quả, lá, hoa…) [10]

2.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu.
Nguyên liệu
Bản chất của nguyên liệu đóng vai trò rất lớn trong quá trình chiết xuất. Bề
dày của vách tế bào, đường kính của ống trao đổi là hai yếu tố quan trọng
nhất. Độ dày của vách tế bào hay chiều dài của các kênh bào tương càng lớn
thì quá trình hòa tan chiết xuất càng chậm. Đường kính các kênh bào tương
càng lớn, các chất qua lại vách tế bào càng dễ dàng. Quá trình chiết xuất càng
xảy ra nhanh. Nguyên liệu càng chia nho thời gian thẩm thấu qua vách giảm
làm cho quá trình chiết nhanh hơn. Tuy nhiên, càng chia nho nguyên liệu, tính
chọn lọc của quá trình càng giảm, dịch chiết càng có nhiều tạp chất [10,11].
Chất tan
Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càng
nhanh. Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng
qua vách tế bào càng giảm [10,11]
Dung môi
Khả năng hòa tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hòa tan càng

nhanh làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. Khả năng hòa tan các chất


17

trong dung môi khác nhau thì khác nhau và phụ thuộc nhiều vào bản chất của
chất tan và dung môi. Độ nhớt của dung môi càng thấp, khả năng thấm vào tế
bào, sự khuếch tán của chất tan và dung môi xảy ra dễ dàng, quá trình chiết
xảy ra càng nhanh [10,11]
Kỹ thuật chiết
Chênh lệch nồng độ càng lớn, tốc độ khuếch tán càng cao. Việc tăng lượng
dung môi làm tăng sự chênh lệch nồng độ nên quá trình chiết xảy ra nhanh
hơn. Sự khuấy trộn làm tăng quá trình cân bằng nồng độ của dung dịch bên
ngoài các tiểu phân dược liệu bằng phương pháp cơ học. Sự chênh lệch nồng
độ giữa trong và ngoài tế bào tăng lên nên quá trình thẩm tích xảy ra nhanh
hơn. Tăng nhiệt độ làm tăng khả năng hòa tan của chất tan vào dung môi và
đẩy nhanh quá trình chiết xuất do làm tăng chuyển động nhiệt của phân tử.
Giảm độ nhớt của dung môi dẫn tới tăng khả năng và tốc độ hòa tan, tăng quá
trình khuếch tán làm cân bằng nồng độ. Sự tăng áp suất làm tăng tốc độ thấm
dung môi vào nguyên liệu [11]. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
được minh họa ở Sơ đồ 2.2.

2.2.2. Các phương pháp chiết xuất
Tùy mục đích sử dụng dịch chiết, căn cứ vào khả năng hòa tan của những chất
trong dược liệu vào dung môi và bản chất dược liệu mà tiến hành chiết xuất
theo một hoặc kết hợp các phương pháp sau: [11]
Phương pháp ngấm kiệt
Phương pháp chiết xuất lấy kiệt hoạt chất trong dược liệu bằng cách cho dung
môi thấm qua lớp dược liệu đã xay nho với kích thước thích hợp.

18

Kỹ thuật

Dược liệu
Thời vụ

Xuất xứ

Phương pháp

- Tháng
- Mùa
Nhiệt độ
Xử lý
- Sự ổn định hóa
- Điều kiện bảo
quản
Khuấy trộn
- Độ mịn
- Độ ẩm

Bộ phận
- Lá
- Thân
- Quả
- Rễ
Dược liệu

Thời gian

Áp suất

Sản phẩm
Chất phụ gia
pH

Tỷ lệ dược liệu/dung môi

Nồng độ dung môi
Loại dung môi

Dung môi

Sơ đồ 2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu.

Ngấm kiệt cổ điển
Là phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua dược liệu theo
một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình ngấm kiệt được


19

thực hiện trong bình chiết gọi là bình ngấm kiệt: hình dạng, cấu tạo và kích
thước của bình có thể thay đổi tùy theo mục đích sử dụng nhưng thường phần
thân chính của bình có dạng hình nón cụt có thể kín và có van điều chỉnh lưu
lượng ở một đầu hay có nắp kín với van điều chỉnh ở cả hai đầu.
Ngấm kiệt cải tiến
Ngấm kiệt ngược dòng: thực hiện ngấm kiệt và rút kiệt dịch chiết kết hợp

nhiều bình nối tiếp nhau, hệ thống được bố trí sao cho dịch chiết loãng của
bình chiết trước sẽ là dung môi đầu cho bình chiết sau và mỗi bình chỉ lấy ra
một lượng dịch chiết đậm đặc nhất định.
Phương pháp ngâm
− Ngâm lạnh: dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng.
− Ngâm nóng: bao gồm sắc, hầm, hãm hay nấu cao trong y học cổ truyền.
Đây là phương pháp chiết ở nhiệt độ sôi với dung môi là nước.
Với các dung môi khác, dụng cụ chiết cần có bộ phận ngưng tụ dung môi nên
gọi là phương pháp chiết hồi lưu.
Ngoài ra, còn chiết ở điều kiện chân không, chiết ở áp suất nén, chiết dưới tác
dụng (siêu âm, chất diện hoạt), chiết bằng CO2 long...

2.3. Áp dụng bộ ba phần mềm nghiên cứu-phát triển
Mối liên quan nhân quả


20

Mối liên quan giữa nhân và quả có tính biện chứng và có tính phổ biến. Trong
ngành Dược, mối liên quan nhân quả có thể được vận dụng trong thành lập
công thức chế phẩm hay xây dựng quy trình (sản xuất dược phẩm, chiết xuất
dược liệu...). Trong chiết xuất dược liệu, nhân (các biến độc lập) là điều kiện
chiết xuất (dược liệu, dung môi và kỹ thuật); quả (những biến phụ thuộc) là
kết quả chiết xuất (hiệu suất, tỷ lệ hoạt chất, tỷ lệ tạp chất…).
Mô hình thí nghiệm
Trong ngành Dược hay gặp 2 loại mô hình thí nghiệm sau đây:
− Mô hình công thức (formulation designs), còn được gọi là mô hình hỗn
hợp (mixture designs): hay được dùng trong bào chế hay hóa học.
− Mô hình quy trình (process designs), còn được gọi là mô hình yếu tố
(factorial designs): hay được dùng cho quy trình sản xuất dược phẩm, quy

trình chiết xuất dược liệu...
Mô hình yếu tố đầy đủ (full factorial design) có ưu điểm là cho phép khảo sát
ảnh hưởng của các yếu tố cũng như tương tác của chúng. Tuy nhiên mô hình
yếu tố đầy đủ đòi hoi phải có một số lượng thí nghiệm rất lớn khi số yếu tố
tăng lên. Mô hình yếu tố giản lược (fractional factorial design) cho phép giảm
bớt rất nhiều số thí nghiệm mà vẫn khảo sát được một số sự ảnh hưởng của
các yếu tố. Thí dụ: D-Optimal, Taguchi OA... Khi thiết kế mô hình thí
nghiệm, nhà phân tích nên chọn các biến độc lập và biến phụ thuộc đã được
thăm dò là có mối liên quan nhân quả. Mô hình thực nghiệm có thể được thiết
kế bởi phần mềm thống kê, thí dụ: FormData [19].
Phân tích liên quan nhân quả


21

Mối liên quan là sự tương ứng (correspondence) giữa hai biến số x và y.
Trường hợp đơn giản trong toán thống kê gọi là tương quan (correlation),
Trường hợp phức tạp gọi là mối liên quan nhân-quả (cause-effect
relationship). Ngày nay, trong phân tích dữ liệu có một lãnh vực mới, đó là
khám phá tri thức (knowledge discovery) hay khai thác dữ liệu (data mining).
Công nghệ thông minh có tên là logic mờ - thần kinh (neurofuzzy logic), thí
dụ: phần mềm thông minh FormRules [20], có thế mạnh về lãnh vực này. Từ
dữ liệu thực nghiệm theo mô hình thiết kế, mối liên quan nhân quả có thể
được phân tích qua các mặt: xu hướng, mức độ và quy luật liên quan.
Tối ưu hóa nhiều biến phụ thuộc
Tối ưu hóa là sự ước tính các biến độc lập (x 1, x2...) sao cho biến phụ thuộc
(y1, y2...) được tối đa hoặc tối thiểu. Trong thành lập công thức chế phẩm, chiết
xuất dược liệu, sắc ký long hiệu năng cao... nhiều khi phải có sự dung hòa để
cho nhiều giá trị y1, y2... đạt được tối ưu (optimal) thay vì một biến (y) tối
thiểu (minimum) hoặc tối đa (maximum). Đây là khái niệm tối ưu hóa nhiều

biến phụ thuộc hay đa đáp ứng (multi-response optimization). Sự tối ưu hóa
nhiều biến phụ thuộc là hiện thực trong ngành Dược, không phù hợp với các
phương pháp thống kê truyền thống, chỉ được thực hiện bởi các phần mềm
thông minh, thí dụ: INForm [23]. Phần mềm thông minh INForm kết hợp 2
công nghệ thông minh chính: mạng thần kinh (neural networks) – để xác lập
các mô hình liên quan nhân quả có tính tương thích – và hệ diễn tả gen (gene
expression programming) – để tối ưu hóa các thông số dựa trên cơ sở là các
mô hình liên quan nhân quả. So với phương pháp thống kê, phương pháp tối
ưu hóa thông minh có nhiều ưu điểm [6]:


22

− Không giới hạn về số biến x1, x2, ..., xk: đáp ứng yêu cầu thiết kế với nhiều
biến về công thức và điều kiện pha chế.
− Có thể tối ưu đồng thời nhiều biến y 1, y2, ..., yk: phù hợp với thực tế mỗi
sản phẩm thường có rất nhiều tính chất.
− Không phụ thuộc mô hình toán học mà dựa vào khả năng luyện mạng với
sự lựa chọn nhiều thông số phù hợp.
− Dự đoán chính xác quả (yi) từ nhân (xi) biết trước dựa trên mô hình liên
quan nhân quả đã được thiết lập.
− Phù hợp với nhiều loại dữ liệu phức tạp, không dùng số (định tính) hay
thiếu trị số (dùng -99999 thay vì số 0).
− Áp dụng một cách dễ dàng nhờ các hàm tối ưu hóa trực quan (Tent, Up,
Down, Flat hay Flat-Tent).
Tình hình áp dụng thực tế
Ngày nay, người ta có xu hướng áp dụng bộ 3 phần mềm trong nghiên cứu
phát triển quy trình. Thí dụ: phần mềm thống kê FormData: thiết kế mô hình
thí nghiệm; phần mềm thông minh FormRules: phân tích xu hướng, mức độ
và quy luật liên quan; phần mềm thông minh INForm: tối ưu hóa thông số

(nhiều biến số phụ thuộc cùng một lúc). Gần đây, ở Việt nam, có một số đề tài
kết hợp phương pháp truyền thống với bộ 3 phần mềm nghiên cứu-phát triển
trong bào chế [9,13] và chiết xuất dược liệu [5,7,15].

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP


23

3.1. Dược liệu, dung môi và trang thiết bị
Danh sách nguyên liệu và chất chuẩn, hóa chất và dung môi, thiết bị chiết
xuất, thiết bị kiểm nghiệm, phần mềm thống kê và phần mềm thông minh lần
lượt được được trình bày trong các Bảng 3.1., Bảng 3.2., Bảng 3.3., Bảng 3.4.
và Bảng 3.5.
Bảng 3.1. Danh sách nguyên liệu và chất chuẩn
STT

Nguyên liệu và chất chuẩn

Tiêu chuẩn

Nguồn gốc

1

Rễ Đan sâm

Tiêu chuẩn cơ sở

Công ty Dược phẩm

Danapha

2

Chất chuẩn Tanshinon IIA
độ tinh khiết 96.1 %

Tiêu chuẩn cơ sở

Công ty Chromadex,
Mỹ

3

Chất chuẩn acid salvianolic
B độ tinh khiết 76.8 %

Tiêu chuẩn cơ sở

Công ty Chromadex,
Mỹ

Bảng 3.2. Danh sách hóa chất và dung môi
STT
1

Hóa chất và dung môi
Ethanol 96%

Độ tinh khiết

Nguồn gốc

Công nghiệp

Công ty hóa chất
Hóa Nam.


24

2

Acetonitril

HPLC

Merk

3

Methanol

PA

Trung Quốc

4

Cloroform

PA

Trung Quốc

5

Thuốc thử Nessler

PA

Trung Quốc

6

Thuốc thử sắt (III) clorid 5%

PA

Trung Quốc

7

Ethyl acetat

PA

Trung Quốc

8

Benzen

PA

Trung Quốc

9

Toluen

PA

Trung Quốc

10

Acid formic

PA

Trung Quốc

Nhãn hiệu

Nguồn gốc

Kottermann

Đức

Shellab

Mỹ

Buchi

Nhật

Nhãn hiệu

Nguồn gốc

Shimadzu Libror

Nhật

Bảng 3.3. Danh sách thiết bị chiết xuất cao
STT

Thiết bị chiết xuất

1

Bếp cách thủy

2

Bếp điện

3

Máy cô quay chân không

Bảng 3.4. Danh sách thiết bị kiểm nghiệm
STT
1

Thiết bị kiểm nghiệm
Cân điện tử 4 số


25

AEX – 120G
2

Cân điện tử 5 số

3

Máy HPLC

4

Lò nung

5

Máy soi UV 2 bước sóng

254 nm và 365 nm

6

Tủ sấy

7

Bản mong tráng sẵn silica
gel F254, cỡ hạt 0,015 –
0,04 mm

Shimadzu AEL –
40SM

Nhật

Shimadzu LC –
10AD

Nhật

Carbolite Funaces

Anh

Vilber Lourmat

Pháp

GallenKamp

Anh

Merck

Đức

Bảng 3.5. Danh sách phần mềm thống kê và phần mềm thông minh
STT

Tên phần mềm

Nhãn hiệu

Nguồn gốc

Thiết kế thí nghiệm

Intelligensys Ltd.,UK

1

FormData v3 (2010)

2

FormRules V3.3
(2007)

Nghiên cứu liên quan

Intelligensys Ltd.,UK

3

INForm V4.0 (2010)

Tối ưu hóa công thức

Intelligensys Ltd.,UK

3.2. Thẩm định & Kiểm nghiệm
3.2.1. Xây dựng quy trình định lượng Tanshinon IIA
Quy trình chuẩn bị mẫu
Đối với mẫu thử dược liệu Đan sâm (Quy trình chuẩn bị mẫu tiến hành theo
Dược điển Trung Quốc tập II, 2005.)
Cân chính xác 0.3 g dược liệu khô đã được xay tới bột thô vào bình nón 250