ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR TRONG ĐỊNH LƢỢNG VÀ ĐỊNH KIỂU GIEN VI RÚT VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN 175

BỘ GIÁO DỤC VÀ ÐÀO TẠO
TRƢỜNG ÐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG
ĐỊNH LƢỢNG VÀ ĐỊNH KIỂU GIEN VI RÚT
VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN 175

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: HUỲNH THÁI QUI

Niên khóa

: 2008 - 2012

Tháng 7/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ÐÀO TẠO
TRƢỜNG ÐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG
ĐỊNH LƢỢNG VÀ ĐỊNH KIỂU GIEN VI RÚT

VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN 175

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS.BS. VŨ BẢO CHÂU

HUỲNH THÁI QUI

CN. CHU THỊ THU HÀ

Tháng 7/2012


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên con xin gửi lời cám ơn đến cha mẹ cùng những ngƣời thân trong gia
đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.
Em chân thành gửi lời cám ơn đến:
 TS.BS. Vũ Bảo Châu và CN. Chu Thị Thu Hà đã tận tình dạy bảo, hƣớng
dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
 Ban chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm
Tp.Hồ Chí Minh cùng tất cả các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em
trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.
 Ths. Tôn Bảo Linh đã tận tình giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình
thực hiện khóa luận.
 Tập thể lớp DH08SH và bạn bè đã cổ vũ, động viên trong suốt quá trình học
tập.
Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2012
Huỳnh Thái Qui

i


TÓM TẮT
Bệnh viêm gan siêu vi do vi rút viêm gan C (Hepatitis C virus – HCV) là bệnh rất
nguy hiểm và là tác nhân gây viêm gan chuyển sang dạng mạn tính có tần suất rất cao
đến 70 - 80%. Khoảng 20 - 30% các trƣờng hợp viêm gan C mạn tính có thể tiến triển
thành xơ gan hoặc ung thƣ gan. Ở nhiều nƣớc, HCV là tác nhân chính gây ung thƣ
gan. Việc xác định đúng kiểu di truyền sẽ giúp cho nghiên cứu dịch tễ học nhiễm HCV
và định lƣợng phác đồ điều trị, đồng thời là cơ sở cho những nghiên cứu hoàn thiện
sinh phẩm chẩn đoán và sản xuất các vaccin phòng ngừa trong tƣơng lai.
Đây là một nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử real-time PCR để định
lƣợng và định kiểu gien HCV trong huyết thanh của bệnh nhân. Phát hiện, định lƣợng
và định kiểu gien HCV để tiên lƣợng phác đồ điều trị thích hợp. Thống kê số liệu về
số ca nhiễm và xác định kiểu gien các ca đƣợc định lƣợng HCV tại Bệnh viện 175.
Kết quả nghiên cứu cho thấy kỹ thuật real-time PCR sử dụng Taqman probe với
probe phát hiện tác nhân gây bệnh đƣợc đánh dấu màu FAM và probe phát hiện chứng
nội đƣợc đánh dấu màu HEX đã phát hiện 9 trƣờng hợp dƣơng tính với RNA-HCV.
Kỹ thuật ứng dụng cho định kiểu gien HCV cho kết quả có 3 ca nhiễm kiểu gien 1 và
có 1 ca nhiễm kiểu gien 6. Kỹ thuật real-time PCR là kỹ thuật nhạy và đặc hiệu để
chẩn đoán phát hiện, định lƣợng và định kiểu gien HCV.

ii


SUMMARY
The title of thesis “Using real-time PCR for detect quantitative and genotype
hepatitis C virus (HCV) at Hospital 175”.
Viral hepatitis caused by hepatitis C virus (Hepatitis C vius - HCV) is a very

dangerous disease and hepatitis is the cause of come to chronic highly (70 - 80%).
20 - 30% of cases of chronic hepatitis C may progress to cirrhosis or liver cancer. In
many countries, HCV is the main cause of liver cancer. Determination the right
genotype of genetic will allow epidemiologists and quantitative HCV treatment
regimens, and is the basis for the research and complete diagnostic biologicals and
vaccines to prevent the production of future.
With in the research techniques real-time PCR was applied for quantitative and
qualitative HCV genotype in the serum of the patients at Hospital 175. Base on those
results, HCV type to predict things away appropriate treatment. Statistical data in HCV
infection at Hospital 175 was collected.
Using real-time RT-PCR could detect 9 of cases positive for HCV. There were
three patients infected with genotype 1, one patient infected with genotype 6.
Real-time PCR is a sensitive and specific technique for the diagnosis, detection,
quantitation and determination the HCV.
Key words: hepatitis C virus, liver cancer, quantitation, determination, genotype
hepatitis C virus.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ............................................................................................ i
Tóm tắt ................................................................................................ ii
Summary ............................................................................................. iii
Danh sách các chữ viết tắt ................................................................... vii
Danh sách các bảng ............................................................................ viii
Danh sách các hình ảnh ......................................................................... ix
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1

1.2. Yêu cầu đề tài ....................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................ 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3
2.1. Bệnh viêm gan do vi rút viêm gan C (Hepatitis C Virus, HCV)............................. 3
2.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan C ..................................................................... 3
2.1.2. Dịch tễ học bệnh viêm gan C .............................................................................. 3
2.1.3. Dịch tễ học phân tử vi rút viêm gan C ................................................................ 5
2.2. Vi rút viêm gan C (HCV) ...................................................................................... 6
2.2.1. Cấu trúc HCV..................................................................................................... 6
2.2.2. Bộ gien của HCV ............................................................................................... 6
2.2.3. Kiểu gien và khái niệm “quasi - species” HCV ................................................... 9
2.3. Các phƣơng pháp định lƣợng HCV ..................................................................... 10
2.3.1. Phƣơng pháp bDNA (branched DNA) .............................................................. 10
2.3.2. PCR định lƣợng cạnh tranh (quantitative competitive PCR) ............................. 11
2.4. Phƣơng pháp real-time RT-PCR.......................................................................... 11
2.4.1. Phản ứng RT (reverse transcription) ................................................................. 11
2.4.2. Phƣơng pháp real-time PCR ............................................................................. 12
2.4.3. Một số khái niệm dùng trong định lƣợng real-time PCR ................................... 17
2.5. Định kiểu gien HCV ........................................................................................... 18
2.5.1. Phƣơng pháp giải trình tự ................................................................................. 18

iv


2.5.2. Định kiểu gien bằng phƣơng pháp real-time PCR ............................................. 19
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 20
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 20
3.2. Vật liệu ............................................................................................................... 20
3.2.1. Đối tƣợng và số lƣợng mẫu .............................................................................. 20
3.2.2. Mồi và mẫu dò ................................................................................................. 20

3.2.3. Vật liệu và hóa chất dùng để tách chiết RNA ................................................... 20
3.2.4. Vật liệu và hóa chất dùng cho phản ứng RT ..................................................... 21
3.3.5. Vật liệu và hóa chất dùng cho xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng .................... 21
3.2.6. Vật liệu và hóa chất dùng cho phản ứng real-time PCR .................................... 21
3.2.7. Vật liệu và hóa chất dùng cho phản ứng xác định kiểu gien HCV .................... 21
3.2.8. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 21
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu và kỹ thuật nghiên cứu ................................................ 21
3.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 21
3.3.2. Kỹ thuật nghiên cứu ......................................................................................... 22
3.3.3. Lấy máu và ly trích huyết thanh ....................................................................... 22
3.3.4. Phƣơng pháp tách chiết RNA ........................................................................... 22
3.3.5. Phƣơng pháp real-time RT-PCR....................................................................... 23
3.3.5.1. Phƣơng pháp RT ........................................................................................... 23
3.3.5.2. Phƣơng pháp real-time PCR định lƣợng HCV ............................................... 24
3.3.5.3. Phƣơng pháp real-time PCR định kiểu gien HCV .......................................... 26
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 28
4.1. Kết quả chạy real-time RT-PCR .......................................................................... 28
4.1.1. Phân tích kết quả mẫu dƣơng tính .................................................................... 28
4.1.1.1. Mẫu dƣơng tính cao ...................................................................................... 28
4.1.1.3. Mẫu dƣơng tính yếu ...................................................................................... 31
4.1.2. Phân tích kết quả mẫu dƣơng tính dƣới ngƣỡng ............................................... 32
4.1.3. Phân tích kết quả mẫu âm tính.......................................................................... 33
4.2. Phân tích kết quả mẫu chạy kiểu gien HCV ........................................................ 33
4.2.1. Kiểu gien 1....................................................................................................... 34
4.2.2. Kiểu gien 6....................................................................................................... 34
4.3. Tình hình nhiễm HCV tại Bệnh viện 175 ............................................................ 35
v


4.4. Kết quả xác định kiểu gien HCV ......................................................................... 36

Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................... 38
5.1. Kết luận .............................................................................................................. 38
5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 38
Tài liệu tham khảo ............................................................................... 39

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A

:

Adenine

AMV

:

Avian Myeloblastosis Virus

bDNA

:

Branched Deoxyribonucleic Acid

C

:

Cytocine

Ct

:

Chu kỳ ngƣỡng, Threshold Cycle

DEPC

:

Diethylpyrocarbonate

DNA

:

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

:

Deoxyribonucleotide

ELISA

:

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

G

:

Guanine

HAV

:

Vi rút viêm gan A, Hepatitis A Virus

HBV

:

Vi rút viêm gan B, Hepatitis B Virus

HCV

:

Vi rút viêm gan C, Hepatitis C virus

HVR

:

Vùng siêu biến, Hypervariable Region

M-MLV

:

Moloney Murine Leukemia Virus

NCR

:

Vùng không mã hóa, Non Coding Region

NS

:

Không cấu trúc, Non Structure

PCR

:

Polymerase Chain Reaction

RNA

:

Ribonucleic Acid

RT

:

Reverse Transcriptase

RT-PCR

:

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

RFLP

:

Restriction Fragment Length Polymorphism

Taq

:

Thermus Aquaticus

T

:

Thymine

UTR

:

Untranslated Region

U

:

Uracil

WHO

:

Tổ chức y tế thế giới, World Health Organization

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Tình hình nhiễm viêm gan C trên thế giới (WHO, 1999) ................................. 4
Bảng 3.1 Thành phần bộ kít trích biệt RNA toàn phần từ các bệnh phẩm ..................... 20
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt chạy cDNA cài đặt cho máy real-time PCR........................... 24

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt định lƣợng HCV ................................................................... 26
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt định kiểu gien cài đặt cho máy real-time PCR ....................... 27
Bảng 4.1 Phân bố kiểu gien HCV ................................................................................. 36

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH

Trang
Hình 2.1 Tình hình bệnh viêm gan C mạn tính trên thế giới ........................................... 4
Hình 2.2 Tình hình phân bố kiểu gien HCV trên thế giới ............................................... 5
Hình 2.3 Cấu trúc HCV ................................................................................................. 6
Hình 2.4 Tổ chức bộ gien vi rút viêm gan C ................................................................... 7
Hình 2.5 Nguyên tắc hoạt động của molecular beacon ................................................. 15
Hình 2.6 Nguyên tắc hoạt động của Taqman probe ...................................................... 16
Hình 3.1 Quy trình real-time PCR chẩn đoán HCV ...................................................... 22
Hình 4.1 Kết quả chạy real-time PCR mẫu dƣơng tính phân tích dạng log ................... 28
Hình 4.2 Kết quả chạy real-time PCR mẫu dƣơng tính phân tích dạng linear ............... 29
Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa số chu kỳ và tín hiệu huỳnh quang ........... 29
Hình 4.4 Kết quả chạy real-time PCR mẫu dƣơng tính trung bình ................................ 30
Hình 4.5 Kết quả chạy real-time PCR mẫu dƣơng tính yếu .......................................... 31
Hình 4.6 Kết quả chạy real-time PCR mẫu dƣơng tính dƣới ngƣỡng ............................ 32
Hình 4.7 Kết quả chạy real-time PCR mẫu âm tính ...................................................... 33
Hình 4.8 Kết quả chạy real-time PCR mẫu ức chế ........................................................ 33
Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn nhiễm kiểu gien 1 ................................................................ 34
Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn nhiễm kiểu gien 6 .............................................................. 34
Hình 4.11 Biểu đồ tỷ lệ nhiễm HCV của bệnh nhân tại Bệnh viện 175 ......................... 35

ix

Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Theo thống kê của tố chức y tế thế giới năm 2002, có khoảng 170 triệu ngƣời
tƣơng đƣơng 3% dân số thế giới bị nhiễm viêm gan C (Hepatitis C Virus - HCV).
Viêm gan do vi rút C là một bệnh nguy hiểm vì thƣờng đƣợc phát hiện muộn, trong
khi đó hậu quả của bệnh để lại thƣờng là nặng nề nhƣ: 50% - 80% chuyển thành mạn
tính, và có tới 20% - 25% trong số đó tiến triển thành xơ gan và ung thƣ gan.
Việc chẩn đoán chính xác tác nhân HCV là một vấn đề hết sức quan trọng đối với
hiệu quả điều trị, theo dõi diễn tiến, biến chứng của bệnh và phòng ngừa sự lây lan của
HCV trong cộng đồng.
Cho đến nay, xét nghiệm thƣờng quy để chẩn đoán nhiễm HCV là anti-HCV. Xét
nghiệm này cũng đƣợc dùng trong tầm soát ở những ngƣời cho máu. Nhờ đó đã hạn
chế rất nhiều tỷ lệ nhiễm HCV sau truyền máu. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp
nhƣ: giai đoạn sớm của viêm gan siêu vi C, khi mà chƣa có kháng thể ; ở bệnh nhân bị
suy giảm miễn dịch hay do dùng thuốc ức chế miễn dịch; nồng độ anti-HCV thấp... sẽ
có kết quả anti-HCV âm tính giả. Mặt khác, khi mà bệnh nhân đã nhiễm trong quá khứ
thì kháng thể sẽ tồn tại một thời gian dài có khi đến 10 năm dù đã hết bệnh, đồng thời
trong một số trƣờng hợp nhƣ viêm gan tự miễn sẽ có kết quả anti-HCV dƣơng tính giả
(Phạm Thị Thu Thủy, 2002).
Hiện nay, việc ứng dụng kỹ thuật phân tử để chẩn đoán HCV đã trở nên phổ biến.
Đây là một phƣơng pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao và điều quan trọng là tránh
đƣợc một số trƣờng hợp âm tính hoặc dƣơng tính giả trong chẩn đoán tầm soát phát
hiện anti-HCV.
Bên cạnh đó, việc ứng dụng real-time PCR trong định lƣợng và xác định kiểu gien
HCV cũng đóng góp nhiều cho điều trị và tiên lƣợng bệnh.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài :“Ứng dụng kỹ
thuật Real-time PCR trong định lƣợng và định kiểu gien vi rút viêm gan C tại Bệnh
viện 175”, nhằm mục tiêu :

- Tìm hiểu phƣơng pháp định lƣợng, định kiểu gien HCV bằng kỹ thuật real-time
PCR sử dụng bộ kít do công ty Việt Á sản xuất.

1


- Phân tích kết quả định lƣợng và định kiểu gien HCV từ phản ứng real-time PCR
sử dụng Taqman probe với hai màu đánh dấu là màu FAM và HEX.
- Khảo sát tỷ lệ RNA-HCV dƣơng tính ở bệnh nhân có anti-HCV dƣơng.
1.2. Yêu cầu đề tài
Nắm vững, hiểu rõ và ứng dụng quy trình định lƣợng và định kiểu gien HCV.
Tìm hiểu tình hình nhiễm RNA-HCV tại Bệnh viện 175 từ 29/12/2012 đến
15/06/2012.
1.3. Nội dung thực hiện
Ứng dụng kỹ thuật real time RT-PCR để định lƣợng HCV kiểm tra sự xuất hiện
của RNA-HCV trong huyết thanh, sau đó tiến hành định kiểu gien.
Khảo sát tình hình nhiễm viêm gan C qua nghiên cứu nhằm xác định số bệnh nhân
và xác định kiểu gien của số bệnh nhân nhiễm HCV.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Bệnh viêm gan do vi rút viêm gan C (Hepatitis C Virus, HCV)
2.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan C
Viêm gan siêu vi C xuất hiện từ rất lâu. Đến giữa thập niên 1970, Alter và cộng tác
viên (ctv) nhận thấy máu sau khi đƣợc sàng lọc viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi
A có khả năng gây bệnh viêm gan. Alter gọi các trƣờng hợp đó là viêm gan không A
hay không B. Năm 1975, tinh tinh (chimpanzée) đƣợc sử dụng thành công trong mô
hình nghiêm cứu tác nhân gây bệnh viêm gan không A hay không B. Cũng trong năm

này, Prince và ctv nhận định rằng có một chứng bệnh viêm gan siêu vi sau truyền máu
không do HBV (Hepatitis B virus) và có thời kỷ ủ bệnh dài hơn thời kỳ ủ bệnh HAV
(Hepatitis A virus). Sau đó, các tác giả khác chứng minh về mặt huyết thanh học rằng
bệnh viêm gan siêu vi loại này không có liên quan gì đến bệnh viêm gan siêu vi A và
viêm gan siêu vi B. Vào tháng 5 năm 1989, có một phát hiện mới về viêm gan siêu vi
không A không B đƣợc công bố. Bằng phƣơng pháp ly tâm siêu tốc huyết tƣơng thu từ
những con tinh tinh bị bệnh viêm gan siêu vi, Choo và ctv đã tách chiết nucleic acid
của vi rút, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chuyển vào bộ gien của lamdaT11 và
xâm nhiễm Escherichia coli. Trong số hàng triệu dòng thu đƣợc có một dòng có phản
ứng đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh ngƣời bị bệnh viêm gan siêu vi không
A không B sau truyền máu. Cuối cùng, họ xác định rằng bệnh viêm gan siêu vi không
A không B do một loại siêu vi mới gây ra, đó là siêu vi C.
Hiện nay, bằng những kỹ thuật sinh học phân tử, ngƣời ta chứng minh HCV là
nguyên nhân quan trọng của bệnh viêm gan siêu vi sau truyền máu, chiếm tỷ lệ từ 70%
đến 95% các trƣờng hợp nhiễm. Ngoài ra, HCV cũng có thể xảy ra ở bệnh nhân chƣa
từng đƣợc truyền máu và cũng không có các yếu tố nguy cơ rõ rệt. HCV có khuynh
hƣớng diễn tiến sang mạn tính làm cho nguồn dự trữ bệnh trong cộng đồng ở mức cao.
2.1.2. Dịch tễ học bệnh viêm gan C
2.1.2.1. Tình trạng lây nhiễm viêm gan C trên thế giới
Hiện nay, số ngƣời nhiễm HCV trên thế giới ƣớc tính khoảng 170 triệu ngƣời
(WHO, 1999). Số ngƣời nhiễm HCV và phân bố HCV trên thế giới thể hiện trong
bảng 2.1 và hình 2.1.

3


Bảng 2.1 Tình hình nhiễm viêm gan C trên thế giới
Dân số
Tỷ lệ nhiễm
Phân vùng

(triệu)
(%)
Châu Phi
602
5,30

Dân số nhiễm
(triệu)
31,9

Châu Mỹ

785

1,70

13,1

Trung Cận Đông

466

4,60

31,3

Châu Âu

858

1,03

8,9

Đông Nam Á

1500

2,15

32,3

Tây Thái Bình Dƣơng

1600

3,90

62,2

Tổng

5811

3,10

169,7
(WHO, 1999)

Hình 2.1. Tình hình bệnh viêm gan C mạn tính trên thế giới.

(www.nathnac.org)

2.1.2.2. Tình hình nhiễm viêm gan C tại Việt Nam
Việt Nam nằm trong vùng có nguy cơ cao nhiễm HCV. Theo nghiên cứu của WHO
1999, tỷ lệ viêm gan C của Việt Nam là 6,1%. Nhiều công trình đã đề cập đến tình
hình nhiễm HCV. Nghiên cứu của Trƣơng Xuân Liên tại TP HCM năm 1994 cho thấy
tỷ lệ nhiễm ở ngƣời bình thƣờng là 2,53%, ngƣời nghiện chích ma túy là 96,2%. Tỷ lệ
nhiễm HCV ở những ngƣời bình thƣờng tại Thanh Hóa năm 1998 theo Hoàng Thủy
Long là 0,38%, tại Hải Phòng theo Hoàng Đang Mịch là 1,69%. Trong số các bệnh
nhân bị bệnh gan đến khám tại Bệnh viện Chợ Rẫy TP HCM năm 1999 có 12,64%
bệnh nhân có anti-HCV dƣơng. Nghiên cứu của Châu Hữu Hầu tại Tân Châu, An
Giang tỷ lệ nhiễm HCV cộng đồng là 4,1%. Tỷ lệ nhiễm HCV cộng đồng theo nghiên
cứu của Nguyễn Thu Vân tại Hà Nội năm 2002 là 1,34% và của Bùi Trọng Chiến
4


(2002) tại khu vực Miền Trung là 1,6%. Tại khu vực Tây Nguyên, tỷ lệ nhiễm viêm
gan C trên đối tƣợng tiêm chích ma túy là 70,2% theo nghiên cứu của Hoàng Anh
Vƣờng năm 2005 (trích dẫn bởi Nguyễn Hoàng Chƣơng, 2003 – 2005).
2.1.3. Dịch tễ học phân tử vi rút viêm gan C
Theo Bùi Hữu Hoàng (2000), có sự phân bố khác nhau về kiểu gien và kiểu gien
phụ theo các vùng địa dƣ khác nhau. Hiện tƣợng này hình thành nên dịch tễ học phân
tử của nhiễm HCV. Những thông tin về kiểu gien rất có giá trị để xác định vùng dịch
tễ của HCV. Sự phân bố kiểu gien theo các vùng địa dƣ tƣơng đối ổn định. Tuy nhiên
do vấn đề di dân và du lịch phổ biến hiện nay, sẽ ảnh hƣởng phần nào đến bản đồ phân
bố kiểu gien. Nếu tiếp xúc nhiều lần với nguy cơ gây bệnh sẽ có thể có nhiều kiểu gien
khác nhau trên cùng một ngƣời. Sự phân bố các kiểu gien khác nhau trên khắp thế giới
trong hình 2.2.

Hình 2.2 Tình hình phân bố kiểu gien HCV trên thế giới.

(www.epgonline.org)
Kiểu gien 1, 2, 3 là các kiểu gien đƣợc phân bố khắp nơi trên thế giới. Kiểu gien 1a
thƣờng gặp ở Bắc Âu, Bắc Mỹ; kiểu gien 1b thƣờng gặp ở Nhật, vùng Nam và Đông
Âu; kiểu gien 2c thƣờng không có triệu chứng; Kiểu gien 3 hay gặp ở các vùng nội
dịch ở Đông Nam Á; kiểu gien 4 thƣờng gặp ở Trung Đông, Ai cập, Trung Phi; kiểu
gien 5 thƣờng ở Nam Phi; kiểu gien 6 ở HongKong, Macau, Việt Nam (WHO, 1999).
Riêng các kiểu gien 7, 8, 9, 10, 11 đƣợc phân lập ở các nƣớc Đông Nam Á nhƣ
Việt Nam, Lào, Indonesia… Tuy nhiên, ngƣời ta có thể xếp các kiểu gien 7, 8, 9, 11
chung với kiểu gien 6, kiểu gien 10 xếp chung với kiểu gien 3a.

5


Sự phân bố kiểu gien theo vùng địa dƣ tƣơng đối ổn định. Tuy nhiên, hiện nay do
vấn đề di dân và du lịch xảy ra khá phổ biến cho nên có thể ảnh hƣởng phần nào đến
bản đồ phân bố kiểu gien của HCV trên thế giới.
2.2. Vi rút viêm gan C (HCV)
2.2.1. Cấu trúc HCV
HCV là vi rút thuộc họ Flaviviridae (Bùi Hữu Hoàng, 2000). Đây là một vi rút nhỏ,
có vỏ lipid, kích thƣớc khoảng 35-50 nm. Vật liệu di truyền của HCV là một chuỗi
RNA mạch dƣơng , chứa khoảng 9.400 nucleotide mã hóa cho một polyprotein tiền thể
gồm 3.011 amino acid. Bộ gien chứa một khuôn đọc mở đƣợc mô tả trong hình 2.3.

Hình 2.3 Cấu trúc HCV. Envelope protein: protein vỏ bao;
Nuclecapsid: thể nucleocapsid; Core protein: protein lõi; Viral
genome (RNA):bộ gien RNA vi rút; Enzyme co-factor: đồng yếu tố
của enzyme (Brechot C, 1995).

2.2.2. Bộ gien của HCV
Bộ gien của HCV là một chuỗi đơn RNA có cực tính dƣơng, gồm khoảng 9.400

nucleotide, đƣợc chia làm 3 vùng là vùng 5’NC, vùng nằm giữa 5’NC và 3’NC, 3’NC.
Vùng 1 là đầu 5' không mã hóa (5'UTR - untranslated region hay 5'NCR noncoding region) gồm 341 - 344 nucleotide. Đây là vùng tƣơng đối ít bị biến đổi nhất
giữa các kiểu gien (kiểu gien phụ) khác nhau. Do đó, ngƣời ta sử dụng vùng này nhƣ
là một chất mồi (primer) để phát hiện RNA của HCV bằng phƣơng pháp PCR. Chức
năng của vùng này là tham gia vào việc điều hòa quá trình nhân đôi của siêu vi. Tại
đây, có một số cấu trúc uốn lƣợn (stem - loop structures) gồm 27 nucleotide, giữ vai
6


trò ức chế quá trình giải mã theo cơ chế điều hòa âm tính (negative regulation). Vùng
này còn là vị trí gắn kết với ribosom, đƣợc gọi là IRES (internal ribosome entry site),
để khởi phát quá trình giải mã cho việc tổng hợp chuỗi polyprotein tiền chất của siêu
vi.

Hình 2.4 Tổ chức bộ gien vi rút viêm gan C (Brechot C, 1995).
Vùng 2 là vùng đƣợc mã hóa nằm giữa hai đầu 5' và 3'. Vùng này chỉ có một khung
đọc mở duy nhất (open reading frame) gồm 9.379 - 9.481 nucleotide, đƣợc giải mã để
tổng hợp một polyprotein tiền chất của siêu vi gồm khoảng 3.000 acid amin. Sau đó,
polyprotein này sẽ đƣợc các enzyme protease của siêu vi và các enzyme peptidase tín
hiệu của tế bào phân cắt thành các protein cấu trúc và protein không cấu trúc.
Các protein cấu trúc: đƣợc tạo ra từ các gien C, E1 và E2. Protein capsid hay
protein C (21 kDa) tạo nên phần nucleocapsid bao bọc bên ngoài chuỗi bộ gien RNA
của siêu vi. Protein C còn có khả năng ức chế sự sao chép của siêu vi B và sự nhân đôi
của HIV cũng nhƣ có thể làm thay đổi quá trình sao chép và giải mã của một số gien ở
tế bào ký chủ. Trong môi trƣờng canh cấy và trên súc vật thực nghiệm, ngƣời ta nhận
thấy protein này cũng có khả năng sinh ung thƣ. Ngoài ra, protein C của siêu vi dƣờng
nhƣ có liên quan đến cơ chế gây hiện tƣợng thoái hóa mỡ ở tế bào gan cho nên tổn
thƣơng này rất thƣờng gặp ở những bệnh nhân bị viêm gan siêu vi C mạn tính.
Protein E1 (37 kDa) và E2 (61 kDa) là hai glycoprotein của lớp vỏ, liên kết với
nhau thành các phức hợp dimer. Ở protein E2 có hai vùng siêu biến (HVR hypervariable region) là HVR1 (ở vị trí acid amin 390 - 410) và HVR2 (ở vị trí acid

amin 474 - 480). Vùng siêu biến này thƣờng xuyên bị biến đổi qua mỗi lần siêu vi
nhân đôi, tạo ra sự khác biệt giữa các bộ gien của HCV trong cùng một bệnh nhân.
7


HVR1 còn là nơi kích thích hệ thống miễn dịch tạo ra kháng thể trung hòa. Vì vậy,
kháng thể mà cơ thể tạo ra không theo kịp sự biến đổi liên tục tại vùng HVR1. Đây là
cơ chế giúp cho siêu vi trốn tránh đƣợc đáp ứng miễn dịch của ký chủ và làm cho tình
trạng nhiễm HCV thƣờng diễn tiến sang mạn tính. Gần đây, ngƣời ta vừa mới phat
hiện ra protein CD81 (thuộc họ tetraspanin) đƣợc biểu hiện trên bề mặt của tế bào gan
và lympho bào, có thể gắn kết với E2. Protein CD81 chính là thụ thể hoặc là đồng thụ
thể của HCV trên bề mặt tế bào gan. Do đó, các kháng thể trung hòa HCV tác dụng
thông qua cơ chế làm ngăn cản E2 gắn vào CD81.
Chức năng của potein p7 (7 kDa) vẫn chƣa đƣợc biết rõ.
Các protein không cấu trúc gồm có protein NS2, NS3, NS4 và NS5. Protein NS2
(23 kDa) là một enzyme metalloproteinase, phân cắt polyprotein tiền chất tại chỗ nối
NS2/NS3. Protein NS3 (68 kDa) có rất nhiều chức năng nhƣ men serine protease nằm
ở đầu tận -N (N-terminal) và men NTPase phụ thuộc RNA/helicase nằm ở đầu cận -C
(C-terminal). Enzyme serine protease sẽ cắt chuỗi polyprotein tiền chất tại các vị trí
NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, NS5A/NS5B. Enzyme helicase tham gia vào
quá trình nhân đôi của RNA siêu vi. Protein NS4 gồm có NS4A và NS4B. NS4A (6
kDa) là một đồng yếu tố cần thiết cho hoạt tính của men protease NS3. Chức năng của
NS4B (26 kDa) vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ nhƣng có lẽ nó có liên quan đến sự gắn kết của
siêu vi vào màng tế bào. Protein NS5gồm NS5A và NS5B. Protein NS5A (56- 58 kDa)
có liên quan đến chuyển hóa lipid vì nó tƣơng tác với thành phần apolipoprotein A1.
Vùng NS5A còn đƣợc xem là vùng quyết định cho tính nhạy cảm của HCV đối với αinterferon (ISDR - interferon sensibilization determination region). Vùng này làm mất
tác dụng của interferon qua trung gian việc ức chế, nó sẽ không ức chế quá trình nhân
đôi của siêu vi. Nếu có đột biến xảy ra ở vùng NS5A có thể tạo đƣợc sự đáp ứng tốt
với interferon. Vùng NS5B (65 kDa) chính là men RNA polymerase phụ thuộc RNA.
Men này dùng để tổng hợp chuỗi RNA từ khuôn mẫu là RNA.

Vùng 3 là đầu 3' không mã hóa (3'UTR hay 3'NCR) bao gồm 3 vùng nhỏ là vùng
đầu tiên có chiều dài thay đổi từ 28 đến 42 nucleotide, tiếp theo là vùng poly(U) hoặc
poly(A) để báo hiệu kết thức quá trình giải mã. Tận cùng là một đoạn X gồm 98
nucleotide, ít biến đổi, giữ vai trò quan trọng trong quá trình nhân đôi của siêu vi vì
đây là nơi khởi đầu quá trình tổng hợp sợi RNA(-). Vùng này còn có chức năng điều

8


hòa quá trình giải mã, tạo đƣợc sự ổn định cho RNA và quá trình bao bọc bộ gien bằng
phần capsid.
2.2.3. Kiểu gien và khái niệm “quasi - species” HCV
Một đặc tính khá quan trọng của HCV là tính không thuần nhất. Ngƣời ta ghi nhận
có sự khác biệt về bộ gien của các HCV phân lập đƣợc từ các vùng địa dƣ khác nhau.
Ngƣời ta cũng nhận thấy có sự hiện diện của nhiều “dân số” siêu vi không hoàn toàn
giống nhau về trình tự nucleotide của bộ gien ngay cả trong cùng một bệnh nhân
nhiễm HCV. Sự khác biệt giữa các bộ gien với nhau (inter - bộ gienic) hình thành nên
các kiểu gien (kiểu gien) và các kiểu gien khác nhau.
Các kiểu gien và kiểu gien của HCV: bằng cách phân tích hàng loạt các mẫu huyết
thanh của những bệnh nhân và khỉ Chimpazée bị nhiễm HCV đƣợc theo dõi trong một
thời gian dài và so sánh trình tự nucleotide của các RNA-HCV ở những bệnh nhân bị
nhiễm HCV từ các vùng địa dƣ khác nhau, ngƣời ta ghi nhận có sự khác biệt giữa các
chuỗi nucleotide của các HCV phân lập đƣợc. Tùy theo mức độ khác biệt này mà
ngƣời ta phân loại HCV theo các kiểu gien hoặc các kiểu gien khác nhau.
Khi các bộ gien siêu vi khác nhau lớn hơn 20% về trình tự nucleotide thì chúng
thuộc các kiểu gien (kiểu gien hay còn gọi là “clade”) khác nhau.
Cùng một kiểu gien nhƣng có khác biệt nhỏ hơn 20% trình tự nucleotide thì đƣợc
xếp thành các kiểu gien (kiểu gien phụ) khác nhau. Các kiểu gien đƣợc ký hiệu bằng
các chữ cái “a” đến “g” theo thứ tự đƣợc phát hiện (ví dụ 1a, 1b, 2a, 2b,…).
Ngay cả trong cùng một kiểu gien của cùng một kiểu gien thì trình tự nucleotide

của bộ gien cũng có thể khác nhau nhỏ hơn 10%.
Sở dĩ có sự khác biệt về kiểu gien nhƣ vậy là do men RNA polymerase phụ thuộc
RNA của HCV thiếu chức năng sửa chữa sai sót (proofreading) và tỷ lệ đột biến này là
khoảng 1,4 x 10-3 đến 2,0 x 10-3 nucleotide đƣợc thay thế/vị trí/năm.
Việc xếp loại các kiểu gien đƣợc dựa trên sự so sánh các vùng khác nhau trên bộ
gien của siêu vi. Nếu dựa trên vùng 5’ không mã hóa để so sánh thì ngƣời ta phân biệt
ra 6 kiểu gien và 11 kiểu gien khác nhau. Nếu căn cứ trên vùng E1 thì có đến ít nhất 12
kiểu gien khác nhau. Hiện nay, ngƣời ta còn dựa vào sự khác việt ở vùng NS5B và
capsid để phân loại kiểu gien.
Sự khác biệt bên trong bộ gien (intra - bộ gienic) và khái niệm “quasi - species”. Ở
cùng một bệnh nhân bị nhiễm một loại kiểu gien nào đó, sau một thời gian diễn tiến
9


bệnh, ngƣời ta nhận thấy trong huyết thanh của bệnh nhân có sự hiện diện của nhiều
“quần thể” siêu vi với số lƣợng khác nhau. Các “quần thể” này gần giống “quần thể”
ban đầu nhƣng chỉ khác nhau nhỏ hơn 5% về trình tự nucleotide và đƣợc gọi là hiện
tƣợng “quasi - species”. Sở dĩ có sự khác biệt trong bộ gien nhƣ thế, trƣớc tiên là do sự
sai sót của men RNA polymerase. Thêm vào đó, còn do sự hiện diện của “vùng siêu
biến” HVR1 (gồm 27 acid amine) nằm ở đầu tận –N của protein E2. Ngƣời ta ghi nhận
sự đột biến của bộ gien xảy ra lớn hơn 50% tại HVR1. Tuy nhiên, cần lƣu ý rằng trong
hiện tƣợng “quasi - species”, sự đột biến nói trên không dẫn đến làm thay đổi kiểu gien
của bệnh nhân trong quá trình diễn tiến của bệnh.
2.3. Các phƣơng pháp định lƣợng HCV
2.3.1. Phƣơng pháp bDNA (branched DNA)
Kỹ thuật bDNA là một kỹ thuật lai phân tử giữa RNA-HCV với những probe bắt
cặp bổ sung với một trình tự có tính bảo tồn cao ở vùng 5' không mã hóa. Đây là một
phƣơng pháp phát hiện và định lƣợng trực tiếp. Ngƣời ta xử lý huyết tƣơng hoặc huyết
thanh ngƣời bệnh với proteinase K nhằm giải phóng RNA-HCV từ các hạt vi rút. RNA
đƣợc lai với các probe đặc hiệu. Sau đó, phức hợp RNA-HCV-probe đƣợc cố định trên

một vi giếng (microwell) và tiếp tục đƣợc lai với các probe khuếch đại tín hiệu, mỗi
probe này liên kết với nhiều phân tử alkaline phosphatase.
Cuối cùng, cơ chất của enzyme đƣợc cho vào vi giếng và tín hiệu hóa quang
(chemiluminescent) sẽ đƣợc thu nhận bởi máy đọc tín hiệu ánh sáng.
Trong phƣơng pháp định lƣợng bằng bDNA thì việc thiết kế các probe mục tiêu là
vô cùng quan trọng. Cả hai loại probe (probe cố định RNA-HCV vào vi giếng và
probe khuếch đại tín hiệu RNA-HCV) phải đƣợc thiết kế sao cho có thể định lƣợng
mọi kiểu gien HCV với hiệu quả nhƣ nhau. Các loại probe này thƣờng có kích thƣớc
từ 16 - 24 nucleotide và nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 700C nhằm đảm bảo tính đồng
nhất của phản ứng lai và tính đặc hiệu tối đa (Bùi Đình Thi, Nông Văn Hải, 2000).
Phƣơng pháp cho kết quả tuyến tính đối với các mẫu huyết thanh có nồng độ RNAHCV từ 200.000 đến 120.000.000 phân tử RNA-HCV/1 ml máu. Các kiểu gien của
HCV cũng có ảnh hƣởng trên việc định lƣợng RNA-HCV bằng bDNA. Ngƣời ta thấy
rằng sự định lƣợng RNA-HCV giữa kiểu gien 1 và 2 có độ nhạy chênh lệch nhau vào
khoảng 3 lần và giữa kiểu gien 3a và 6a là 1,5 lần.

10


2.3.2. PCR định lƣợng cạnh tranh (quantitative competitive PCR)
Theo Nguyễn Hoàng Chƣơng (2003), phƣơng pháp này nhân bản trong cùng
eppendorf một trình tự mục tiêu cần định lƣợng và một trình tự đƣợc gọi là quantative
standard (chứng định lƣợng) có nồng độ biết trƣớc. Các nồng độ giảm dần của chứng
định lƣợng đƣợc cho vào từng phản ứng. Ở phản ứng nào mà tín hiệu sau nhân bản của
chứng định lƣợng và trình tự mục tiêu bằng nhau thì nồng độ của trình tự mục tiêu
chính là nồng độ của chứng định lƣợng trong phản ứng đó. Thông thƣờng, chứng định
lƣợng đƣợc thiết kế sao cho gần giống với trình tự mục tiêu nhất về kích thƣớc, thành
phần nucleotide để sự nhân bản của trình tự mục tiêu không bị ức chế bởi chứng định
lƣợng và chứng định lƣợng ức chế mục tiêu.
Tuy nhiên, chứng định lƣợng cũng phải phân biệt đƣợc với trình tự mục tiêu bằng
cách tăng kích thƣớc hay thêm vị trí nhận biết của một enzyme cắt giới hạn vào trịnh

tự của chứng định lƣợng.
2.4. Phƣơng pháp real-time RT-PCR
2.4.1. Phản ứng RT (reverse transcription)
Giai đoạn phiên mã ngƣợc (RT) là một giai đoạn hết sức quan trọng quyết định sự
thành công của RT-PCR. Enzyme đƣợc sử dụng trong giai đoạn này là reverse
transcriptase đƣợc tách chiết từ Moloney murine leukemia virus (M-MLV) gây bệnh
ung thƣ bạch cầu trên chuột, hay từ Avian myeloblstosis vi rút (AMV) gây bệnh ung
thƣ tủy trên gia cầm. Enzyme reverse transcriptase là một loại DNA polymerase không
chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA đơn làm sợi khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung,
do vậy giai đoạn RT còn gọi là giai đoạn tổng hợp cDNA. Để enzyme reverse
transcriptase có thể tổng hợp đƣợc cDNA từ sợi khuôn là mạch đơn RNA, cần phải có
mồi đặc hiệu bám lên trên sợi khuôn RNA và cũng cần dNTP để enzyme reverse
transcriptase khi trƣợt trên mạch khuôn RNA có thể kéo dài đƣợc mạch cDNA.
Mồi đƣợc sử dụng trong giai đoạn RT có thể là mồi đặc hiệu cho trình tự RNA sẽ
đƣợc phiên mã ngƣợc thành cDNA và mồi này có thể là mồi xuôi hay mồi ngƣợc của
giai đoạn PCR tùy chiều 5’ đến 3’ của RNA đích bắt cặp đƣợc mồi nào. Nhà nghiêm
cứu cũng có thể sử dụng một loại mồi chỉ có 6 nucleotide có thứ tự ngẫu nhiên gọi là
mồi ngẫu nhiên (random hexamer) để phiên mã ngƣợc toàn bộ RNA có trong mẫu
thành cDNA. Tuy nhiên mồi ngẫu nhiên chỉ có hiệu quả để phiên mã ngƣợc đƣợc các
đoạn cDNA dài dƣới 600 bases, còn nếu muốn có những đoạn cDNA dài trên 600
11


bases thì phải dùng mồi đặc hiệu mới hiệu quả. Ngoài mồi đặc hiệu là mồi ngẫu nhiên,
nếu muốn có cDNA của RNA biểu hiện từ một gien, nhà nghiêm cứu có thể dùng mồi
Oligo(dT)15 (gọi là mồi poly T) vì RNA luôn có đuôi là poly(A). Mồi oligo(dT)15
thƣờng đƣợc dùng để làm thƣ viện cDNA của biểu hiện gien hay là dùng để phát hiện
vi khuẩn sống trong bệnh phẩm (Phạm Hùng Vân, 2008).
Đối tƣợng của RT là RNA đích. Bản chất của RNA là rất dễ bị phân hủy trong môi
trƣờng cũng nhƣ bị enzyme RNase tiết ra từ các vi sinh vật ở trong môi trƣờng, chai

lọ, thiết bị, dụng cụ và dung dịch. Enzyme RNase lại rất bền, khó hủy bởi nhiệt độ. Do
vậy thao tác trong pha chế các thuốc thử để pha phản ứng RT phải tuyệt đối tôn trọng
nguyên tắc vô trùng. Để pha dung dịch RT, phải chuẩn bị đầy đủ các điều kiện nhƣ là
cách pha PCR mix. Tùy thuộc vào enzyme reverse transcriptase là loại nào, do hãng
nào sản xuất mà có thể pha dung dịch phản ứng RT.
2.4.2. Phƣơng pháp real-time PCR

2.4.2.1. Nguyên lý của real-time PCR
Real-time PCR kiểm soát lƣợng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng từ đó
có thể biết đƣợc lƣợng sản phẩm PCR trong từng thời điểm (chu kỳ) của quá trình
khuếch đại, trái ngƣợc với PCR truyền thống chỉ biết đƣợc lƣợng sản phẩm đƣợc
khuếch đại ở thời điểm cuối cùng của phản ứng khuếch đại.
Real-time PCR là một phản ứng động. Cho phép phát hiện “Huỳnh quang phát ra
nhờ sự khuếch đại của sản phẩm PCR” tại mỗi chu kỳ của phản ứng PCR. Phân tích
kết quả phản ứng PCR mà không cần bƣớc điện di trên gel. Phân tích kết quả huỳnh
quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR bằng máy tính (Quyền Đình
Thi và Nông Văn Hải, 2008).
2.4.2.2. Ứng dụng của real-time PCR
Định lƣợng nucleic acid là ứng dụng đầu tiên của kỹ thuật này. Không có sự khác
biệt lớn giữa bốn kiểu phản ứng real-time PCR về độ nhạy, tính chính xác và sự tiện
dụng, mặc dù việc sử dụng các loại probe có phần đặc hiệu hơn phƣơng pháp sử dụng
chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi và molecular beacon thì có phần đặc hiệu hơn so
với Taqman probe. Ngƣời ta sử dụng Taqman probe để nghiêm cứu mức độ phiên mã
của từng tế bào riêng rẽ (Fink và ctv, 1998), để nghiêm cứu sự phân bố các protein
trong các mô, kết hợp với sự chuyển tín hiệu (Bustin và McKay, 1999), hoặc để định
lƣợng thành phần RNA của telomerase ở ngƣời (Yajuma và ctv, 1998). Các ứng dụng
12


định lƣợng trong y dƣợc lâm sàng của kỹ thuật này rất rộng rãi nhƣ nghiêm cứu huyết

thanh để chẩn đoán các bệnh di truyền (Kaplan và ctv, 1992), phát hiện các virus gây
bệnh (Morris và ctv, 1996; Berger và ctv,1992), phát hiện các vi khuẩn gây bệnh
(Norton và Batt, 1999), nghiêm cứu sự phiên mã của gene c-myc và ERBB2 (Bieche
và ctv, 1999) trong bệnh ung thƣ vú. Molecular beacon đƣợc sử dụng để nghiêm cứu
RNA từ tế bào đơn (Steuerwald và ctv, 1999) và từ các tế bào sống ( Matsuo và ctv,
1998) hoặc đƣợc sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng nhƣ nghiêm cứu các tế bào ung
thƣ trong ổ màng bụng ở các bệnh nhân bị viêm dạ dày ác tính (Nakanishi và ctv,
1999), theo dõi sự phân bố, biểu hiện và duy trì của các gien chuyển (Thorpe và
Porteous, 1999) (trích dẫn bởi Nguyễn Hoàng Chƣơng, 2005).
2.4.2.3. Màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA (SYBR Green I)
Chất nhuộm này gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi. Khi ở trạng thái tự do, chất
nhuộm không phát huỳnh quang nhƣng sau khi gắn vào DNA mạch đôi thì phát huỳnh
quang và cƣờng độ huỳnh quang phát ra tỷ lệ thuận với hàm lƣợng DNA có trong phản
ứng PCR. Các chất nhuộm phát huỳnh quang thƣờng đƣợc sử dụng SYBR green I,
ethidium bromide.
Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm sẽ gắn vào các DNA mới đƣợc tổng hợp
trong bƣớc kéo dài mạch và rời ra khi các phân tử DNA bị biến tính trong bƣớc biến
tính. Mọi DNA mạch đôi hiện diện trong phản ứng đều có khả năng bắt chất nhuộm và
phát huỳnh quang nên nếu có các sản phẩm ký sinh trong phản ứng thì sự định lƣợng
trở nên không chính xác. Để phát hiện các sản phẩm ký sinh trong phản ứng, ngƣời ta
xây dựng một đƣờng cong "nóng chảy" (melting curve) bằng cách nâng dần nhiệt độ
phản ứng và đo giá trị cƣờng độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tại các thời điểm nhiệt
độ khác nhau. Nhiệt độ nóng chảy của phản ứng DNA phụ thuộc vào số lƣợng và
thành phần nucleotide. Dựa vào đƣờng cong "nóng chảy", ngƣời ta có thể phát hiện sự
hiện diện của các sản phẩm ký sinh và tiến hành các biện pháp khắc phục.
Các biện pháp khắc phục rất đa dạng nhƣ việc thiết kế primer sao cho hiệu quả bắt
cặp với trình tự DNA mục tiêu là tối ƣu, khảo sát nồng độ các thành phần tham gia
phản ứng nhƣ Taq polymerase, MgCl2, dNTP... sao cho việc nhân bản là đặc hiệu.
2.4.2.4. Phƣơng pháp sử dụng mẫu dò
Molecular beacon: đây là loại probe có cấu trúc dạng kẹp tóc, trong đó cấu trúc

dạng vòng bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự nucleic acid mục tiêu. Phần cấu trúc
13


dạng cuống của phân tử probe đƣợc hình thành từ các liên kết hydro giữa các base bắt
cặp bổ sung nằm ở hai đầu mút của probe. Một chất hóa học phát huỳnh quan đƣợc
gắn vào một đầu của probe có nhiệm vụ "dập tắt" đƣợc gắn ở đầu bên kia. Quencher là
một chất màu không phát huỳnh quang có nhiệm vụ làm tiêu giảm năng lƣợng mà nó
nhận đƣợc từ chất phát huỳnh quang dƣới dạng nhiệt và vì thế không cho ánh sáng
huỳnh quang nào đƣợc phát ra. Trong dung dịch phản ứng, một beacon ở trạng thái tự
do sẽ có cấu trúc dạng vòng và cuống. Lúc đó, phần cấu trúc dạng cuống làm cho hai
đầu của probe ở gần với nhau trong không gian; lúc đó quencher sẽ phát huy tác dụng
và ngăn cản sự phát huỳnh quang của chất phát huỳnh quang. Khi probe bắt cặp bổ
sung với một mạch của trình tự DNA mục tiêu ở nhiệt độ lai của phản ứng thì probe
mất cấu trúc dạng vòng và cuống trở thành dạng thẳng. Điều này làm gia tăng khoảng
cách không gian giữa chất phát huỳnh quang và quencher. Chất phát huỳnh quang lúc
đó sẽ phát ánh sáng mà các thiết bị có thể tiếp nhận và phân tích. Nếu beacon không
bắt cặp bổ sung hoàn toàn với trình tự DNA thì sự lai giữa beacon và trình tự DNA sẽ
không xảy ra và vì thế không có sự phát huỳnh quang. Sở dĩ nhƣ vậy là vì, về mặt
nhiệt động học, sự hình thành cấu trúc kẹp tóc ở beacon thuận lợi hơn là sự hình thành
phân tử lai không hoàn chỉnh. Điều đó giải thích cho tính đặc hiệu cao của beacon.
Khó khăn lớn nhất khi sử dụng probe dạng beacon chính là việc thiết kế probe.
Trình tự nucleotide của cấu trúc dạng cuống phải đƣợc thiết kế sao cho quencher và
chất phát huỳnh quang tiếp xúc với nhau. Nếu không thì một phần ánh sáng huỳnh
quang sẽ đƣợc phóng thích một cách không đặc hiệu, làm gia tăng mức độ tín hiệu nền
(background signal) của phản ứng dẫn đến việc sai lệch trong đánh giá kết quả định
lƣợng. Ngƣợc lại, nếu các liên kết trong cấu trúc dạng cuống của phân tử quá mạnh thì
beacon sẽ khó bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu và tín hiệu huỳnh quang phát ra cũng
không phản ánh đúng hàm lƣợng sản phẩm PCR có trong phản ứng. Vì vậy, tìm thế
cân bằng giữa một cấu trúc ổn định và khả năng bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu là

điều quan trọng khi thiết kế một beacon.

14