NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA THỨ CẤP BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA THỨ CẤP BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG
CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: LÊ THỊ HIỀN TRANG

Niên khóa

: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA THỨ CẤP BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG

CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. ĐỖ ĐĂNG GIÁP

LÊ THỊ HIỀN TRANG

CN. NGUYỄN THỊ KIM LOAN

Tháng 07/2012


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được đề tài tốt nghiệp này và trưởng thành như ngày hôm nay tôi
xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:
Thầy - Thạc sĩ Đỗ Đăng Giáp, Thầy đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất, đưa ra
những ý tưởng, định hướng giúp em hoàn thành đề tài của mình.
Chị Nguyễn Thị Kim Loan và anh Trần Trọng Tuấn, là những người đã dành cho
em những sự quan tâm rất lớn, đưa ra những lời khuyên, góp ý chân thành cho những
sai sót của em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận, anh chị đã nhiệt tình chỉ bảo,
hướng dẫn và truyền đạt rất nhiều kinh nghiệm, kỹ năng, không những về chuyên môn
mà còn là những bài học trong cuộc sống.
Em xin cảm ơn Ban lãnh đạo phòng thí ngiệm trọng điểm phía Nam về Công nhệ
tế bào thực vât – Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài.
Em xin gởi lời cảm ơn đến các anh, chị tại phòng thí ngiệm trọng điểm phía Nam
về Công nhệ tế bào thực vât: anh Tứ, chị Trang, chị Phòng, chị Thư, chị Hà đã cho em
những lời khuyên cần thiết khi những ngày đầu bỡ ngỡ mới bước chân vào Viện và đã

giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Cảm ơn những người bạn: chị Ngọc Anh, Trường, chị Thoan, anh Tuấn, Tài đã
luôn ở bên cạnh động viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm đề tài.
Cảm ơn những người bạn thân và tập thể lớp DH08SH đã luôn ở bên cạnh, động
viên nhắc nhở, chia sẻ những niềm vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học.
Xin cảm ơn Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm TPHCM đã tạo điều kiện
cho em trong suốt 4 năm học tập tại trường. Cảm ơn các Thầy Cô đã từng dạy dỗ,
truyền đạt kinh nghiệm trong học tập và cuộc sống cùng các Thầy Cô thuộc Bộ môn
Công nghệ Sinh học luôn quan tâm và truyền đạt các kiến thức chuyên ngành bổ ích.
Con xin dành lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, những người dù ở xa nhưng luôn
bên cạnh quan tâm, động viên, lo lắng cho con. Con xin cảm ơn Bố Má, người đã cho
con tình yêu thương và động lực rất lớn để con có thể vượt qua được những khó khăn
trong cuộc sống.
TPHCM, ngày 16 tháng 6 năm 2012
Lê Thị Hiền Trang
i


TÓM TẮT
Đề tài : “Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma thứ cấp bằng phương pháp nuôi cấy
lớp mỏng tế bào cây Cọc rào (Jatropha curcas L.)” được thực hiện từ tháng 1 năm
2012 đến tháng 6 năm 2012 tại phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Công nghệ
tế bào thực vật - Viện Sinh học Nhiệt đới.
Ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất nhiên liệu sinh học thay thế nhiên liệu
hóa thạch trong thời điểm dầu mỏ, khí đốt đang ngày càng cạn kiệt như hiện nay là
một vấn đề đáng quan tâm. Do đó, phát triển một hệ thống phát sinh phôi thứ cấp từ
phôi sơ cấp cây Cọc rào hứa hẹn sẽ đem lại một tiềm năng to lớn cho công nghệ vi
nhân giống cây Cọc rào nhằm phục vụ cho sản xuất nhiên liệu sinh học.
Đề tài được thực hiện nghiên cứu về phương pháp nhân giống vô tính cây Cọc rào
thông qua hệ thống phát sinh phôi thứ cấp từ lớp mỏng tế bào phôi sơ cấp. Các mô sẹo

thu được từ nuôi cấy mảnh lá cây Cọc rào được nuôi cấy trên môi trường MS chứa
2,4-D (0,01; 0,03; 0,05; 0,07 (mg/l)) và kinetin (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 (mg/l)) riêng biệt.
Sau 4 tuần nuôi cấy, phôi sơ cấp được nhận thấy phát sinh tốt nhất ở nghiệm thức 1
mg/l kinetin với tỉ lệ hình thành phôi là 76,67%. Phôi sơ cấp được cắt theo kỹ thuật cắt
lớp mỏng tế bào (ngang và dọc) và được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1,5
mg/l kinetin kết hợp 0,05 mg/l 2,4-D. Phôi thứ cấp chỉ nhận thấy được phát sinh ở các
lắt cắt dọc sau 5 tuần nuôi cấy với tỉ lệ 53,33%, trên các lát cắt ngang không nhận thấy
phôi thứ cấp phát sinh. Các phôi thứ cấp sau đó được khảo sát sự trưởng thành bằng
cách nuôi cấy chúng trên môi trường chứa ABA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 (mg/l)) và TDZ
(0,05; 0,10; 0,15; 0,20 (mg/l)) riêng lẻ, kết quả thu được, nghiệm thức bổ sung ABA
nồng độ 1,0 mg/l cho hiệu quả trưởng thành phôi tốt nhất sau 4 tuần nuôi cấy. Khi
khảo sát sự tạo rễ của cây con tái sinh từ phôi trên 5 môi trường khoáng khác nhau
(MS, ½ MS, B5, WPM, White) và sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng với các nồng
độ khác nhau (IBA: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 (mg/l); NAA: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 (mg/l)), rễ cây
được nhận thấy hình thành tốt trên môi trường B5 bổ sung 1,5 mg/l IBA với tỉ lệ tạo rễ
khoảng 80 - 100%. Bộ rễ của cây từ hạt, từ phôi soma và từ giâm cành được thu nhận
lại và so sánh về hình thái và cấu trúc, kết quả so sánh cho thấy rễ cây từ phôi và từ hạt
có hình thái và cấu trúc giống nhau, cây từ phôi có thể thay thế cho cây trồng bằng hạt.
ii


SUMMARY
“Secondary somatic embryogenesis from thin cell layers of Jatropha curcas L.”
Jatropha curcas L. is one potential source of biofuel-producing enery crop.
Secondary somatic embryogenesis, a system improvement of somatic embryogenesis
for more than, faster and quality plant production has been successfully applied to
regenerate plants in Jatropha curcas in first time.
Embryogenic calli were obtained from leaf explants cultured on MS basal medium
supplemented with 2,4-D and kinetin distinct with different concentrations of 0.01 0.07 mg/l 2,4-D and 0.5 - 2.0 mg/l kinetin within 4 weeks. Induction of primary
somatic embryos from 76,67% of the culture was achieved on MS medium with 1.0

mg/l kinetin. Thin cell layers were excised through and length (2 mm) from torpedo
primary somatic embryos of Jatropha curcas L then cultured on MS basal medium
supplemented with 1.5 mg/l kinetin and 0,05 mg/l 2,4-D. After 4 weeks, a total
53,33% secondary embryos obtained from lTCLs of primary somatic embryos. In
order to progress developmentally beyond proliferation cycles, secondary somatic
embryos were cultured on MS with 0.5 – 2.0 mg/l ABA or 0.05 - 0.2 mg/l TDZ for 4
weeks to achive maturation. Most embryos matured were obtained in the presence of
1.0 mg/l ABA. The best rooting percentage (80 - 100%) was observed on the B5
medium supplement with 1.5 mg/l IBA after 4 weeks of incubation of harvested
shoots. Roots derived-embryos were cropped and compared roots derived-seedlings
and roots derived-planlets. Comparison showed results roots derived-embryos and roots
derived-planlets was the same morphology and structure and different from roots
derived-seedlings. This study of secondary somatic embryogenesis in Jatropha curcas
L. may be an ideal system for future transgenic research or production nuclear.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt .............................................................................................................................ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................vii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
Danh sách các hình ......................................................................................................... ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 2
1.2. Yêu cầu của đề tài..................................................................................................... 2

1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về cây Cọc rào ......................................................................................... 3
2.1.1. Vị trí phân loại ....................................................................................................... 3
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố cây Cọc rào ....................................................................... 3
2.1.3. Đặc điểm thực vật .................................................................................................. 4
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái.............................................................................................. 4
2.1.3.2. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển .................................................................... 4
2.1.4. Thành phần hóa học............................................................................................... 5
2.1.5. Giá trị sử dụng của cây Cọc rào ............................................................................ 5
2.1.5.1. Nhiên liệu sinh học - Giá trị về kinh tế, xã hội .................................................. 5
2.1.5.2. Bảo vệ môi trường .............................................................................................. 6
2.1.5.3. Làm phân hữu cơ và thức ăn chăn nuôi.............................................................. 7
2.1.5.4. Công dụng làm thuốc.......................................................................................... 7
2.1.6. Các phương pháp nhân giống cây Cọc rào ............................................................ 8
2.1.6.1. Phương pháp nhân giống cổ điển ....................................................................... 8
2.1.6.2. Phương pháp nhân giống hiện đại ...................................................................... 9
2.2. Giới thiệu về phôi soma.......................................................................................... 12
iv


2.2.1. Khái niệm phôi soma ........................................................................................... 12
2.2.2. Các con đường phát sinh phôi soma .................................................................... 13
2.2.3. Các giai đoạn của quá trình phát sinh phôi soma ................................................ 14
2.2.4. Phôi soma thứ cấp................................................................................................ 15
2.2.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh phôi soma ........................................ 17
2.2.5.1. Mẫu cấy ............................................................................................................ 17
2.2.5.2. Auxin ................................................................................................................ 17
2.2.5.3. Kiểu gen ............................................................................................................ 18
2.2.5.4. Các chất điều hòa sinh trưởng khác.................................................................. 18

2.2.5.5. Nguồn nitrogen ................................................................................................. 19
2.2.5.6. Một số yếu tố khác ........................................................................................... 19
2.3. Hệ thống nuôi cấy TCL trong nghiên cứu tái sinh, nhân giống thực vật ............... 20
2.3.1. Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào ................................................................. 20
2.3.2. Những đặc điểm của hệ thống lớp mỏng tế bào .................................................. 21
2.3.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào......................................... 22
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 24
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 24
3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 24
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................. 24
3.2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .................................................................................. 24
3.2.2.1. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................................... 24
3.2.2.2. Hóa chất, môi trường ........................................................................................ 24
3.2.3. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................................... 25
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 25
3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D, kinetin lên sự hình thành
phôi sơ cấp từ mô sẹo cây Cọc rào .............................................. 25
3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự phát sinh phôi soma thứ cấp từ lớp mỏng tế
bào phôi soma cây Cọc rào ......................................................... 26
3.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của ABA, TDZ lên sự trưởng thành
và nảy mầm của phôi soma cây Cọc rào ..................................... 26
3.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình
thành rễ của cây con tái sinh từ phôi soma cây Cọc rào ............. 27
v


3.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA lên sự hình thành rễ
của cây con tái sinh từ phôi soma cây Cọc rào ............................ 27
3.3.6. Thí nghiệm 6: So sánh hình thái và cấu trúc rễ của cây Cọc rào từ phôi
soma, hạt, giâm cành .................................................................. 28

3.3.7. Phương pháp nhuộm, quan sát hình thái giải phẫu của rễ ................................... 28
3.3.8. Xử lý số liệu ........................................................................................................ 29
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 30
4.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của 2,4-D, kinetin lên sự hình thành phôi sơ
cấp từ mô sẹo cây Cọc rào ............................................................ 30
4.2. Thí nghiệm 2: Sự phát sinh phôi soma thứ cấp từ lớp mỏng tế bào phôi
soma cây Cọc rào.......................................................................... 33
4.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của ABA, TDZ lên sự trưởng thành và nảy
mầm của phôi soma cây Cọc rào ................................................. 37
4.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành rễ của
cây con tái sinh từ phôi soma cây Cọc rào ..................................... 41
4.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của IBA, NAA lên sự hình thành rễ của cây
con tái sinh từ phôi soma cây Cọc rào .......................................... 43
4.6. Thí nghiệm 6: So sánh hình thái và cấu trúc rễ của cây Cọc rào từ phôi
soma, hạt, giâm cành .................................................................... 46
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 49
5.1. Kết luận................................................................................................................... 49
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 49
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

vi


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

:

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

BA

:

Benzyladenine

BAP

:

Benzylaminopurine

CĐHSTTV :

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

EC

:

Embryogenic callus

GA3

:

Gibberellic acid

IAA

:

3-Indoleacetic acid

IBA

:

3-Indolebutyric acid

IEDC

:

Induced embryogenic determined cell

Kinetin

:

6-furfurylaminopurine

lTCL

:

longitudial thin cell layer

MS

:

Murashige và Skoog, 1962

NAA

:

α-Naphthaleneacetic acid

PEDC

:

Pre - embryogenic determined cell

PEM

:

Proembryogenic mass

TCL

:

Thin cell layer

TDZ

:

Thidiazuron

tTCL

:

transverse thin cell layer

WPM

:

woody plant medium

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của kinetin hoặc 2,4-D lên sự hình thành phôi
soma cây Cọc rào........................................................................................... 25
Bảng 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của ABA hoặc TDZ lên sự trưởng thành phôi
soma cây Cọc rào........................................................................................... 26
Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành rễ của
cây con tái sinh từ phôi soma ........................................................................ 27
Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA hoặc NAA lên sự hình thành
rễ của cây con tái sinh từ phôi soma cây Cọc rào......................................... 28

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D, kinetin lên sự phát sinh phôi cây Cọc
rào .................................................................................................................. 30
Bảng 4.2 Sự phát sinh phôi soma thứ cấp từ tế bào lớp mỏng phôi soma cây
Cọc rào .......................................................................................................... 34
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ ABA, TDZ lên sự trưởng thành và nảy
mầm của phôi soma cây Cọc rào .................................................................. 38
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành rễ của cây con
tái sinh từ phôi soma cây Cọc rào.................................................................. 41
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ IBA, NAA lên sự hình thành rễ của cây con
tái sinh từ phôi soma cây Cọc rào.................................................................. 44

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây Cọc rào và nhiên liệu sinh học từ cây Cọc Rào ....................................... 3
Hình 2.2 Quy trình sản xuất diesel sinh học ................................................................... 6
Hình 2.3 Mô hình giả thuyết các sự kiên xảy ra trong quá trình phát sinh phôi.
soma ............................................................................................................... 14
Hình 4.1 Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự trưởng thành và nảy mầm của phôi
soma cây Cọc rào sau 4 tuần nuôi cấy ......................................................... 33
Hình 4.2 Ảnh hưởng của kinetin lên sự trưởng thành và nảy mầm của phôi
soma cây Cọc rào sau 4 tuần nuôi cấy ..............................................................
Hình 4.3 Sự phát sinh phôi soma thứ cấp từ tế bào lớp mỏng phôi soma cây
Cọc rào trên môi trường chứa 1,5 mg/l kinetin kết hợp 0,05 mg/l
2,4-D sau 5 tuần nuôi cấy ............................................................................. 36
Hình 4.4 Ảnh hưởng của ABA lên sự trưởng thành và nảy mầm của phôi
soma cây Cọc rào sau 4 tuần nuôi cấy ......................................................... 39
Hình 4.5 Ảnh hưởng của TDZ lên sự trưởng thành và nảy mầm của phôi soma

cây Cọc rào sau 4 tuần nuôi cấy .................................................................... 40
Hình 4.6 Rễ hình thành từ cây con tái sinh từ phôi soma cây Cọc rào......................... 45
Hình 4.7 Hình thái và cấu trúc của 3 bộ rễ từ cây giâm cành, từ hạt, từ phôi
soma .............................................................................................................. 48

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Công nghệ sinh học là một ngành khoa học, kinh tế - kỹ thuật đang rất phát triển
trên toàn thế giới. Đối với nước ta, một nước nông nghiệp, việc đầu tư phát triển công
nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ sinh học thực vật là một việc làm đem lại nhiều
lợi ích cho nền kinh tế.
Trong công nghệ sinh học thực vật, có nhiều phương pháp nhân giống in vitro từ
các cơ quan, mô, tế bào khác nhau của thực vật. Gần đây, phương pháp nghiên cứu sự
phát sinh phôi vô tính ở thực vật đang được ứng dụng ngày càng rộng rãi và tỏ ra là
một công cụ mạnh với nhiều ưu điểm như: tạo ra cây giống đồng nhất, chất lượng cao
với số lượng lớn, tránh hiện tượng biến dị di truyền, làm công cụ cho các nghiên cứu
về di truyền học, sinh học phân tử, chuyển gen thực vật, sự dụng trong nghiên cứu tạo
hạt nhân tạo. Nghiên cứu phát sinh phôi vô tính ngày càng được mở rộng với nhiều
loài thực vật khác nhau. Hiện nay, hơn 200 loài cây trồng đã được nhân giống thành
công bằng công nghệ phôi vô tính. Hơn thế, việc phát triển hệ thống phát sinh phôi thứ
cấp từ phôi sơ cấp sẽ làm tăng hiệu quả của việc nhân giống. Phôi thứ cấp có nhiều
thuận lợi đáng kể: tỉ lệ nhân nhanh cao, không phụ thuộc vào nguồn mẫu ban đầu và
có mức độ đồng nhất cao. Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) cũng là một
phương pháp mới, nghiên cứu về khả năng biệt hóa của tế bào. Hệ thống tế bào lớp
mỏng với đặc tính mỏng có nhiều ưu điểm quan trọng có thể hỗ trợ cho việc tạo phôi.
Việc ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất nhiên liệu sinh học - một loại nhiên
liệu tái sinh và thân thiện với môi trường - để thay thế nhiên liệu hóa thạch trong thời

điểm dầu mỏ, khí đốt đang ngày càng cạn kiệt như hiện nay là một vấn đề đáng quan
tâm. Trong nhiều loài thực vật được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học như: sắn,
mía, ngô, Cọ dầu, Hướng dương,… Cọc rào có vẻ là một loài cây còn khá mới mẻ,
nhưng với nhiều ưu điểm như: phủ đất tốt, dễ trồng, khả năng chống chịu tốt, mang lại
nhiều lợi ích về môi trường, xã hội, hàm lượng dầu trong hạt khá cao,… thì Cọc rào
cho thấy là một lựa chọn tiềm năng.

1


Từ những vấn đề đã nêu, nhằm hình thành một phương pháp mới, hiệu quả, tạo
được nguồn giống có chất lượng cao, đồng nhất và số lượng lớn cây Cọc rào, đề tài
“Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma thứ cấp bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế
bào cây Cọc rào (Jatropha curcas L.)” được tiến hành thực hiện.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Xác định được loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp cho sự
phát sinh phôi soma từ mô sẹo cây Cọc rào.
Xác định vị trí cắt lớp mỏng thích hợp trên phôi soma sơ cấp cho sự hình thành
phôi soma thứ cấp cây Cọc rào.
Xác định loại và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự trưởng
thành và nảy mầm của phôi soma cây Cọc rào.
Xác định loại và nồng độ môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng thích hợp
cho sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi soma cây Cọc rào.
Đánh giá sự khác nhau về hình thái, cấu trúc của cây từ phôi, từ hạt, từ cây giâm
cành của cây Cọc rào.
Tạo được nguồn phôi thứ cấp phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo như: chuyển
gen, tạo hạt nhân tạo.
1.3. Nội dung thực hiện
Xác định ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự phát sinh phôi
soma từ mô sẹo cây Cọc rào.

Khảo sát sự phát sinh phôi soma thứ cấp từ tế bào lớp mỏng phôi soma sơ cấp cây
Cọc rào.
Khảo sát sự ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên sự trưởng thành và
nảy mầm của phôi soma cây Cọc rào.
Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng lên sự
hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi soma cây Cọc rào.
So sánh hình thái, cấu trúc rễ của cây Cọc rào từ phôi soma, từ hạt, từ giâm cành.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây Cọc rào
2.1.1. Vị trí phân loại cây Cọc rào
Giới

:

Plantae

Ngành

:

Magnoliophyta

Lớp

:

Magnoliopsida

Bộ

:

Euphorbiale

Họ

:

Euphorbiacea

Chi

:

Jatropha

Loài

:

Jatropha curcas L.
Hình 2.1 Cây Cọc rào và nhiên liệu
sinh học từ cây Cọc Rào (Nguồn:
).

Jatropha có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, ghép từ hai chữ Iatrós (bác sĩ) và trophé

(thức ăn), ám chỉ công dụng làm thuốc của cây này. Curcas là tên gọi thông thường
của cây ở Malabar, Ấn Độ. Tên thông dụng ở các nước hiện nay là Jatropha, ở Việt
Nam gọi là cây Cọc rào, Cọc dậu, Cây li, Ba đậu nam, Dầu mè...
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố cây Cọc rào
Jatropha là một loài cây có lịch sử 70 triệu năm, có nhiều bằng chứng cho thấy cây
Jatropha có nguồn gốc từ Mexico (nơi duy nhất có hóa thạch của cây này) và Trung
Mỹ, được người Bồ Đào Nha đưa qua Cape Verde, rồi lan truyền sang Châu Phi, Châu
Á, sau đó được trồng ở nhiều nước, trở thành cây bản địa ở khắp các nước nhiệt đới,
cận nhiệt đới trên toàn thế giới (Nguyễn Công Tạn, 2008). Ở Việt Nam, Cọc rào có
mặt từ rất sớm, mọc nhiều ở những vùng núi, chủ yếu được người dân trồng để làm
hàng rào. Cây Cọc rào được phát hiện ở nhiều vùng sinh thái khác nhau như:
– Vùng trung du miền núi phía Bắc: tỉnh Lào Cai (Sa Pa), tỉnh Lai Châu (Tam
Đường, Sìn Hồ, TX Lai Châu), tỉnh Điện Biên (Thành Phố Điện Biên), tỉnh Sơn
La (Thuận Châu, Yên Châu, Thị xã Sơn La), tỉnh Hòa Bình (Lạc Thủy, Hương
Sơn, Lương Sơn), tỉnh Lạng Sơn (Chi Lăng, Lộc Bình, Mẫu Sơn, Tân Thanh).
– Vùng Bắc Trung Bộ: tỉnh Thanh Hóa (Cẩm Thủy, Sao Vàng, Bá Thước, Thạch
Thành), tỉnh Quảng Trị (Hưng Hóa).
3


– Vùng duyên hải Nam Trung Bộ: tỉnh Ninh Thuận (Ninh Sơn, Ninh Hòa), tỉnh Bình
Thuận (Hàm Thuận Nam, Hàm Thuận Bắc, Bắc Bình), tỉnh Khánh Hòa (Cam
Ranh, Diên Khánh, Khánh Sơn).
– Vùng Đông Nam Bộ: TP Hồ Chí Minh (Hóc Môn), tỉnh Đồng Nai (Định Quán ),
tỉnh Lâm Đồng (Đức Trọng).
2.1.3. Đặc điểm thực vật
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái
Cây Cọc rào là cây bụi, vỏ xám nhẵn, có nhựa màu hơi ngà, loãng. Cây thường cao
3 - 5 m, trong các điều kiện thích hợp cây có thể cao 8 - 10 m. Lá mọc so le, gốc hình
tim, dài 10 - 13 cm, rộng 8 - 11 cm, 5 - 7 gân chính, lá hình chân vịt, cuống lá dài 7 12 cm, phình lên ở gốc. Hoa đực có đài 5 phiến, tràng có 5 cánh, 10 nhị (5 cái rời và 5

cái dính nhau ở phần giữa). Hoa cái có đài và tràng giống nhau, không có nhị hoặc có
5 nhị lép, bầu hình trứng thắt lại ở đầu. Cuống lá 6 - 23 cm. Cụm hoa ở nách lá, hoa
đơn tính và hoa cái thường to hơn hoa đực, ra hoa vào mùa hè. Quả nang, đen, hình
trứng, dài và rộng 2 - 2,5 cm, mỗi quả có 3 hoặc 4 hạt. Cây thụ phấn nhờ côn trùng,
đặc biệt là ong mật. Quả hình thành vào mùa đông khi có sự rụng lá hoặc hình thành
quả trong năm nếu có độ ẩm tốt và nhiệt độ thích hợp tương đối cao. Mỗi cụm hoa cho
khoảng 10 bầu quả. Vỏ quả hình thành sau khi hạt trưởng thành và thịt quả khô. Hạt
trưởng thành sau khoảng 2 - 4 tháng khi vỏ quả chuyển từ xanh sang vàng. Hạt có vỏ
hơi đen, hình thuôn dài. Thông thường, có 5 rễ được tạo ra khi hạt nảy mầm, một rễ
chính và 4 rễ phụ (Nguyễn Công Tạn, 2008). Cây Cọc rào nảy chồi rất dễ, có thể giâm
hom, nếu trồng bằng hạt, cây có rễ chính và rễ ngang, nếu giâm hom thì không có rễ
chính. Cây sinh trưởng và có thể khai thác trong vòng 30 - 40 năm.
2.1.3.2. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển
Theo vùng khí hậu, cây Cọc rào thấy ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nóng,
mặc dù sống tốt ở vùng nhiệt độ thấp và có thể chịu lạnh nhẹ. Nhu cầu nước rất thấp
và có thể chịu hạn trong một thời gian dài bằng cách rụng lá để giảm lượng thoát hơi
nước. Cọc rào cũng thích hợp cho ngăn chặn xói mòn đất và rửa trôi cát. Thích hợp
với độ cao 0 - 500 m, nhiệt độ trung bình: 18 - 28°C, lượng mưa trung bình 300 - 1000
mm. Sinh trưởng trên đất thoát nước và thoáng khí, thích nghi với vùng đất khó canh
tác do nghèo dinh dưỡng. Trên đất nặng, sự hình thành rễ giảm. Cọc rào sinh trưởng ở
nhiều nơi, trên đất sỏi, đất cát, đất mặn, thậm chí, chúng có thể sinh trưởng tốt trên đất
4


đá nghèo hay ngay cả trên vách núi đá. Cọc rào là loài có khả năng thích nghi rộng
nhưng chúng thể hiện tiềm năng sinh trưởng ưu thế nhất trên đất khô và nghèo kiệt.
2.1.4. Thành phần hóa học
Cây Cọc rào được sử dụng hạt là chính, để ép dầu. Thành phần hóa học của hạt:
18,2% protein; 38% dầu béo; 17,08% carbohydrate; tinh bột; acid hữu cơ; hai chất độc
và một chất nhựa. Dầu béo chứa acid myristic, acid palmitic, acid stearic, acid

arachidic, acid oleic (37 - 63%), acid linoleic (19 - 40%), chất độc trong dầu béo là
diterpen và 12-desoxy-16-hydroxyphorbol. Hàm lượng dầu trong hạt là 20 - 40% và
trong nhân là 46 - 58%.
Lá tươi có vitexin, isovitexin. Thân, cành, lá chứa triacontanol, 7-ceto-betasitosterol. Vỏ cây chứa tanin (37%), sáp, đường khử, saponin, một ít tinh dầu. Nhựa
mủ có curcain và 2 peptid mạch vòng là curcacyclin A và curcacyclin B.
2.1.5. Giá trị sử dụng của cây Cọc rào
2.1.5.1. Nhiên liệu sinh học - Giá trị về kinh tế, xã hội
Phát hiện quan trọng nhất từ cây Jatropha đó là lấy hạt làm nguyên liệu sản xuất
dầu diesel sinh học. Hạt Jatropha có hàm lượng dầu trung bình 20 - 40%, từ hạt ép ra
dầu thô, từ dầu thô tinh luyện được diesel sinh học và glyxerin. Mặc dầu diesel sinh
học được sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau: Cải dầu, Hướng dương, Dầu
cọ, mỡ động vật,… Nhưng sản xuất từ Jatropha vẫn có giá thành rẻ nhất, chất lượng
tốt, tương đương với dầu diesel hóa thạch truyền thống. Đây là nguồn năng lượng mới
an toàn, chi phí thấp, tái sinh được, hứa hẹn sẽ là nguồn năng lượng thay thế cho thủy
điện, dầu diessel, dầu lửa, khí hóa lỏng (LPG), than, củi,… Nếu 1 ha Jatropha đạt
năng suất 8 - 10 tấn hạt/ha/năm có thể sản xuất được 3 tấn diesel sinh học. Loại dầu
này sẽ thay thế được 1 phần dầu diesel truyền thống đang cạn kiệt, giảm thiểu lượng
khí thải gây hiệu ứng nhà kính, là loại dầu cháy hết và không có lưu huỳnh, là dầu
sạch, thân thiện với môi trường.
Hạt Jatropha sau khi ép dầu, 30% là sản phẩm dầu, 70% là khô dầu, có hàm lượng
protein khoảng 30%, dùng làm phân hữu cơ quý, nếu khử hết độc tố có thể làm thức ăn
gia súc cao đạm. 1 ha Jatropha, giả thiết đạt 10 tấn hạt/ha/năm sẽ thu được các loại
sản phẩm chủ yếu có giá trị cao như sau:
- Dầu diesel sinh học: 3 tấn x 700 USD/tấn = 2.100 USD
- Bã khô dầu: 7 tấn x 300 USD/tấn = 2.100 USD
5


Hình 2.2 Quy trình sản xuất diesel sinh học (Nguồn: http:/www.hoahocngaynay.com).
Như vậy, 1 ha Jatropha tạo ra giá trị khoảng 4.200 USD/năm (hơn 60 triệu

đồng/ha/năm), lợi nhuận thu được sẽ phân phối cho nông dân sản xuất nguyên liệu và
nhà đầu tư công nghiệp chế biến dầu.
Cây Jatropha còn tạo ra hiệu ứng xã hội cực kỳ to lớn. Do trồng ở các vùng miền
núi nghèo túng, cây Jatropha sẽ tạo nhiều việc làm và thu nhập khả quan cho đồng bào
các dân tộc, trong khi cho đến nay, trên đất dốc còn lại của các vùng này vẫn chưa tìm
kiếm được bất cứ cây gì khả dĩ trồng được trên diện tích lớn, có thu nhập cao, lại có thị
trường ổn định. Ngày 19/6/2008, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã có quyết
định 1842/QĐ-BNN-LN về phê duyệt Đề án “Nghiên cứu, phát triển và sử dụng sản
phẩm cây Cọc rào (Jatropha curcas L.) ở Việt Nam giai đoạn 2008 - 2015 và tầm nhìn
đến 2025”.
2.1.5.2. Bảo vệ môi trường
Jatropha là cây lâu năm, phủ đất tốt, tuổi thọ 50 năm, sinh trưởng phát triển được ở
hầu hết các loại đất xấu, nghèo kiệt, đất dốc, đất trơ sỏi đá, không cháy, gia súc không
ăn. Bởi vậy cây Jatropha trồng trên các vùng đất dốc sẽ được coi là cây “lấp đầy” lỗ
hổng sinh thái ở các vùng sinh thái xung yếu miền núi, sớm tạo ra thảm thực bì dày
đặc chống xói mòn, thân mọng nước rất khó cháy nên không gây cháy rừng mà có thể
làm hàng rào ngăn lửa (băng cản lửa), nâng cao độ phì của đất. Không những vậy,
6


Jatropha còn có thể trồng ở các vùng đất sa mạc hóa, bãi thải khai thác khoáng sản,
góp phần phục hồi hệ sinh thái các vùng này. Khả năng hấp thụ CO2 của cây Cọc rào
cao, có thể hấp thụ 10 tấn khí thải CO2/ha/năm (Lê Võ Định Tường, 2005). Diesel sinh
học từ cây Cọc rào có đặc tính là khó cháy nổ, có thành phần O2 trong phân tử và
không có lưu huỳnh nên được đốt cháy hết, giảm thiểu 40 - 80% khí gây hiệu ứng nhà
kính. Tăng độ ẩm cho môi trường, tăng dự trữ nước và cải tạo đất tốt. Tạo vi khí hậu
cho vùng trồng xen hoa màu, các loại cây kinh tế khác. Góp phần nâng độ che phủ của
thảm cây xanh, tăng cường phòng hộ đồng ruộng, đê điều, bảo vệ các công trình giao
thông, thuỷ lợi và cải thiện được môi trường sinh thái. Đây là nguồn năng lượng có
khả năng tái tạo có tính ổn định và bền vững cao. Vì vậy cây Jatropha được đánh giá

là “vệ sĩ sinh thái”, tạo ra hiệu ứng to lớn về bảo vệ môi trường.
2.1.5.3. Làm phân hữu cơ và thức ăn chăn nuôi
Sau khi ép dầu, bã khô dầu có hàm lượng N4: 14 - 4,78%; P2O5: 0,5 - 0,66%; CaO:
0,60 - 0,65%; MgO: 0,17 - 0,21%, được sử dụng làm phân hữu cơ rất tốt để bón cho
các loại cây trồng, nhất là cho vùng sản xuất nông nghiệp hữu cơ, nông nghiệp sạch,
vừa góp phần sản xuất sản phẩm sạch, vừa nâng cao độ phì của đất. Trong thành phần
hạt Jatropha có độc tố curcin, có thể gây tử vong cho người và gây hại cho vật nuôi.
Nếu khử hết độc tố thì bã khô dầu Jatropha trở thành một loại thức ăn giàu đạm cho
các loài gia súc, gia cầm, tạo ra nguồn thức ăn chăn nuôi quý, góp phần giải quyết nhu
cầu thức ăn công nghiệp sẽ thiếu hụt trầm trọng đối với ngành chăn nuôi nước nhà
trong tương lai gần.
2.1.5.4. Công dụng làm thuốc
Trong thành phần cây Cọc rào, đã phân tích được những hợp chất chủ yếu như
tecpen, flavon, coumarin, lipid, sterol, alkaloid. Nhiều bộ phận của cây có thể chữa
bệnh như lá, vỏ cây, hạt và rễ. Rễ trị tiêu viêm, cầm máu, trị ngứa; dầu của hạt có thể
nhuận tràng; dịch nhựa trắng tiết ra từ vết thương của cành có thể trị viêm lợi, làm lành
vết thương, chữa trị bệnh trĩ và mụn cơm; nước sắc từ lá dùng để chữa bệnh phong
thấp, đau răng,… Trong cây có một số độc tố, nhất là phytotoxin (curcin) trong hạt,
nếu được nghiên cứu sâu hơn rất có thể cung cấp cho chúng ta một loại dược liệu mới.
 Nhựa mủ: Nhựa cây Cọc rào có chứa các alkaloid như jatrophine, jatropham,
jatrophone và curcain là những chất có tính kháng bệnh ung thư. Lá có chứa apigenin,
vitecin và isovitecin. Ngoài ra trong lá và cành non còn chứa amyrin, stigmosterol và
7


stigmastene là những chất có tính kháng khuẩn, chống viêm, chống dị ứng và oxy hóa.
Chất béo có trong hạt cây giàu palmitic, oleic acid và linoleic acid. Hạt cây có tính độc
là do thành phần alkaloid curcin của nó. Nhựa cây được dùng để trị các bệnh ngoài da
như u nhọt, hắc lào, xuất huyết da. Cành non có tác dụng làm sạch răng miệng.
 Lá, vỏ và rễ cây: Lá cây được chú ý với khả năng kích thích tạo sữa, gây xung

huyết da và kháng kí sinh trùng. Lá được sử dụng để chống ghẻ, thấp khớp, tê liệt, u
xơ. Rễ cây có tác dụng tẩy giun sán, chữa rắn cắn. Vỏ cây dùng để thuốc cá, và dùng
điều trị các vết thương ngoài da. Nước sắc của vỏ và rễ cây dùng điều trị thấp khớp,
bệnh hủi, chứng khó tiêu và tiêu chảy.
 Hạt và dầu: Hạt cây là loại thuốc trị bệnh phù, bệnh gút (gout), chứng liệt và
các bệnh về da. Dầu cây Cọc rào có tính tẩy rửa.
2.1.6. Các phương pháp nhân giống cây Cọc rào
Những nghiên cứu về nhân giống cây Cọc rào trên thế giới và ở Việt Nam còn rất
hạn chế. Cho đến nay phương pháp nhân giống cây Cọc rào chủ yếu vẫn theo lối cổ
truyền là giâm cành và gieo hạt. Các phương pháp nhân giống hiện đại áp dụng trên
cây Cọc rào chỉ mới phát triển trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây.
2.1.6.1. Phương pháp nhân giống cổ điển
Ở Nam Phi, người dân trồng cây Cọc rào làm rào dậu hoặc trồng cây để chống xói
mòn và bảo vệ đất thường sử dụng phương pháp giâm cành vì ưu điểm của phương
pháp này là nhanh chóng tạo được cây trưởng thành. Cành được cắt từ các cây Cọc rào
đã trưởng thành cắm xuống đất, nếu được chăm sóc cẩn thận thì sau khoảng 2 đến 3
tháng là có được cây đủ lớn để đem trồng. Cây tạo ra từ phương pháp giâm cành sau
khoảng 1 năm sẽ bắt đầu sinh sản.
Trồng cây để khai thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống bằng gieo hạt
được sử dụng nhiều hơn. Bởi những nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cây tạo thành từ nhân
giống bằng giâm cành có đời sống ngắn hơn và khả năng chống hạn và bệnh tật kém
hơn cây nhân giống bằng hạt. Rễ của cây giâm cành phát triển yếu dễ bị gãy đổ
(Heller, 1996). Rễ của cây con mọc từ hạt phát triển, thường có 1 rễ cái và 4 rễ bên.
Cây trồng ngoài thực địa sẽ sinh sản sau khoảng 3 - 4 năm (Heller, 1996). Nhược điểm
của phương pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con không đồng nhất bởi cây
Cọc rào là cây thụ phấn chéo nên giữa các hạt có sự khác nhau về mặt di truyền. Như
xét tính trạng hàm lượng dầu trong hạt, các cây tạo ra bằng gieo hạt có hàm lượng dầu
8

trong hạt không ổn định, giao động từ 4 đến 40 % (Jha và cộng sự, 2007). Trong khi
kiểm tra chất lượng hạt giống là một việc khó khăn thì tỉ lệ sống và nảy mầm của hạt
thấp do đó nhân giống bằng phương pháp gieo hạt không thể đáp ứng đủ nhu cầu cây
giống chất lượng tốt cho việc trồng cây trên qui mô công nghiệp.
2.1.6.2. Phương pháp nhân giống hiện đại
Để đáp ứng nhu cầu to lớn của thị trường, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên
cứu các phương pháp nhân giống hiện đại trên cây Cọc rào. Các phương pháp nhân
giống này có ưu điểm lớn là có khả năng tạo giống cây với số lượng lớn trong khoảng
thời gian ngắn với chất lượng cao và đồng nhất.
Sujatha và Mukta (1996) đã phát triển kỹ thuật tái sinh cây Cọc rào từ nhiều bộ
phận khác nhau của cây như phần trụ dưới lá mầm, cuống lá và lá. Sự tạo thành chồi
non bất định được chứng minh là hiệu quả nhất ở môi trường MS bổ sung 2,22 M BA
và 4,9 M IBA. Sau đó, mô sẹo được tái sinh gián tiếp trên môi trường MS bổ sung
0,44 M BA và 0,49 M IBA. Chồi non hình thành được nuôi và tạo rễ trong môi
trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho đến khi phát triển thành cây
hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm.
Sujatha và cộng sự (2005) đã có báo cáo về tăng sinh chồi nụ từ đốt cành và mảnh
cắt lá của giống cây Jatropha curcus L. không độc. Không cần chú ý nồng độ BA
trong môi trường cấy chuyền, tỉ lệ nhân chồi tối ưu (10 - 12,3) được nhận thấy khi
nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,3 - 4,5 M TDZ. Tỉ lệ tốt nhất (80 - 90%) của
sự tái sinh chồi bất định từ mô lá đạt được với sự nuôi cấy trên môi trường chứa 8,9 44,4 M BA và 4,9 M IBA, sau đó chuyển sang môi trường bổ sung 8,9 M BA và
2,5 M IBA. Sự tương đồng về di truyền của các giống Ấn Độ độc và không độc được
đánh giá dựa trên maker 435 RAPD là 96,3%. Qua nghiên cứu đo lượng phorbol ester
cho thấy rằng sự thụ phấn cùng giống với giống Jatropha curcus độc không ảnh hưởng
đến lượng phorbol ester chứa trong hạt của giống Jatropha curcus không độc.
Cây Cọc rào đã được tạo dòng in vitro từ các mẫy cấy đốt thân (Datta và cộng sự,
2007; Kalimuthu và cộng sự, 2007; Singh và cộng sự, 2010). Các chồi được tái sinh từ
đốt thân trên môi trường có bổ sung auxin và cytokinin riêng lẻ hoặc kết hợp. Các chồi
được cấy chuyền sang môi trường khác để nhân nhanh số lượng chồi (Datta và cộng

9


sự, 2007) hoặc cấy sang môi trường chỉ có auxin để hình thành rễ. Cây con sau khi
chuyển ra vườn ươm có tỉ lệ sống sót cao (trên 80%).
Một quy trình tái sinh đơn giản, cho hiệu quả cao để cảm ứng chồi bất định và tái
sinh cây con từ mẫu cấy lá của cây của Cọc rào đã được báo cáo (Deore và cộng sự,
2008; Kumar và cộng sự, 2010). Các chồi bất định được cảm ứng từ các mẫu cấy lá
trên môi trường MS có bổ 2,27 M TDZ; 2,22 M BA và 0,49 M IBA, các chồi này
sẽ được nhân nhanh và phát triển sau khi chuyển sang môi trường MS có bổ sung 4,44
M BA; 2,33 M Kn; 1,43 M IAA và 0,72 M GA3. Các chồi phát triển tốt sẽ hình
thành rễ trên môi trường MS có bổ sung 0,5 M IBA sau 30 ngày (Deore và cộng sự,
2008). Trong khi đó, Kumar và cộng sự (2010) đã nuôi cấy lá của cây Cọc rào 2 năm
tuổi trên môi trường MS có bổ sung TDZ, BAP và IBA riêng lẻ. Số chồi hình thành
cao nhất (9,7chồi/mẫu cấy) đã đạt được sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ
sung 3 M của BAP. Các chồi hình thành rễ trên môi trường MS có bổ sung 1,5 M
IBA với tỉ lệ 53,3%. Ngoài ra, việc thêm 200 M phloroglucinol vào môi trường nuôi
cấy giúp tăng cường tỉ lệ hình thành rễ lên 76,7%. Cây con tái sinh được chuyển ra
vườn ươm đã thích nghi với điều kiện tự nhiên. Quy trình này có thể được sử dụng
trong sản xuất hàng loạt các cây con và sản xuất cây trồng chuyển gen.
Shrivastava và Banerjee (2008) đã báo cáo về nghiên cứu ảnh hưởng của các chất
bổ trợ trong nhân giống cây Jatropha curcus. Sử dụng mẫu đốt cây từ cây 3 tháng tuổi
nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l IBA và 25 mg/l adenin
sulfat và 50 mg/l glutamin và 15 mg/l L-arginin và 25 mg/l citric acid trong 3 tuần.
Trung bình, trong 1 chu kì 3 lần cấy chuyền, từ 1 mẫu đốt đơn ban đầu phát sinh ra
100 chồi tương ứng, do đó sẽ giúp tiết kiệm chi phí cho vật liệu và thời gian. Cây được
tạo rễ trên môi trường 1/2MS bổ sung 1,0 - 4,0 mg/l IBA và 1,0 - 4,0 mg/l NAA. Sự
cảm ứng tạo rễ tốt nhất được nhận thấy khi nuôi cấy chồi trên môi trường 1/2 MS có
bổ sung 3 mg/l IBA. Những cây con có chồi và rễ phát triển tốt được chuyển sang túi
polythene nhỏ có chứa hỗn hợp đất vườn, chất khoáng bón cây và cát (1:1:1) và sau đó

được thích nghi dần dần với khí hậu tự nhiên.
Phương pháp phát sinh phôi từ tế bào soma (somatic embryogenesis) - một công cụ
mạnh của ngành công nghệ sinh học để tạo giống cây trồng - đã được áp dụng thành
công lần đầu tiên trên cây Cọc rào bởi Jha và cộng sự (2007). Mô sẹo có khả năng phát

10


sinh phôi được thu nhận bằng cách nuôi cấy mẫu lá trên môi trường MS có bổ sung 2,0
mg/l kinetin. Các khối mô sẹo này được chuyển sang môi trường có bổ sung 0,5 mg/l
kinetin và 0,25 mg/l IBA cho thấy tần suất mô sẹo phát sinh phôi hình cầu cao nhất.
Phôi được kích thích phát triển bằng cách bổ sung thêm adenine sulphate trong môi
trường. Các phôi soma trưởng thành sẽ tạo các cây con trên môi trường ½ MS. Toàn
bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 - 16 tuần. Quá trình phát sinh phôi soma ở cây Cọc
rào có thể trở thành một hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu chuyển gen trong tương lai.
Nuôi cấy phôi soma đã được biết đến để tích lũy các chất dự trữ như chất béo, và
có khả năng tiếp tục phát triển thành cây con, vì vậy phôi soma được nuôi cấy trên quy
mô lớn bằng cách sử dụng bioreactor. Ismidianty và Esyanti (2010) đã nghiên cứu xác
định thành phần của các acid béo trong các phôi soma được nuôi cấy bằng bioreactor
với mục đích là thu được phôi soma trưởng thành, tối ưu lưu lượng không khí để duy
trì tăng trưởng, tạo ra thành phần acid béo thích hợp cho dầu diesel sinh học. Các mẫu
hypocotyl được nuôi cấy trên MS có bổ sung vitamin B5; 13,5 M 2,4-D; 4,4 M
kinetin và 30 g/l sucrose để cảm ứng mô sẹo có khả năng sinh phôi. Các mô sẹo bở sau
bốn tuần tuổi được chuyển vào môi trường MS lỏng có bổ sung vitamin B5; 6,75 µM
2,4-D; 0,4 µM kinetin và 20 g/l sucrose để khởi đầu nuôi cấy tạo huyền phù các tế bào
phôi soma. Ban đầu, các mô sẹo tạo ra khối tiền phôi (PEM), chủ yếu là phôi hình cầu
với một cấu trúc bề mặt tròn trơn nhỏ gọn. Dịch huyền phù được nuôi cấy trong môi
trường MS lỏng có bổ sung vitamin B5; 6 g/l K-citrat monohydrat; 13,5 M 2,4-D; 0,4
µM kinetin, 20 g/l sucrose và nuôi cấy trong hai tuần. Ở giai đoạn này, các cấu trúc
hình cầu đã được hình thành nhiều hơn và phôi ở giai đoạn hình tim bắt đầu phát triển.

Tiếp tục nuôi cấy trong môi trường trưởng thành phôi là môi trường ½ MS, có bổ sung
10 mg/l acid ascorbic; 50 mg/l acid citric; 25 mg/l adenin sulphat; 100 mg/l glutamin;
0,5 ppm IAA; 0,3 ppm GA3 và 20 g/l sucrose. Ở giai đoạn này, các phôi hình cầu và
hình tim hình thành nhiều hơn. Sau đó, các phôi được nuôi cấy trong bioreactor với
các tỉ lệ trao đổi khí khác nhau là 0,1, 0,2 và 0,4 l/min ở 16 giờ chiếu sáng trong 10
ngày. Kết quả cho thấy rằng tốc độ dòng chảy không khí 0,2 l/phút cho tăng trưởng
cao nhất (7,85 g) và tổng số lipid (63,6%) với hàm lượng acid béo chủ yếu là palmitic
acid (53%), acid stearic (12%), acid oleic (33%) và acid linoleic (2%). Do đó cần tiếp
tục tối ưu hóa cho việc cảm ứng acid béo với thành phần thích hợp để phát triển dầu
diesel sinh học.
11


Đỗ Vũ Tuyết Trinh (2009) đã nghiên cứu sự tạo mô sẹo có khả năng phát sinh chồi
và rễ từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào mảnh lá cây Cọc rào trên môi trường WPM có bổ
sung 0,1 mg/l IBA và 1,0 mg/l BA. Môi trường WPM có bổ sung 1,0 mg/l BA thích
hợp cho sự tái sinh chồi từ mô sẹo trong khi NAA ở nồng độ 1,0 mg/l có khả năng
kích thích sự tạo rễ từ mô sẹo rất tốt.
Bùi Văn Thế Vinh và cộng sự (2011) đã nghiên cứu tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu
cấy lá cây Cọc rào trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l kinetin. Các
chồi này được cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l GA3 và 20% nước
dừa để kéo dài chồi và ngăn hiện tượng rụng lá. Các chồi phát triển tốt được chuyển
sang môi trường cảm ứng ra rễ là môi trường MS½ có bổ sung 0,5 mg/l NAA. Cây tái
sinh sau 4 tháng được chuyển ra vườn ươm với tỉ lệ sống sót đạt trên 80%. Đây là một
quy trình hiệu quả để tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy lá cây Cọc rào, quy trình này
có thể được áp dụng trong các nghiên cứu chuyển gene nhằm nâng cao hàm lượng dầu
trong hạt mà không qua giai đoạn tạo mô sẹo.
2.2. Giới thiệu về phôi soma
2.2.1. Khái niệm phôi soma
Có nhiều con đường dẫn tới sự phát triển phôi ở thực vật bậc cao. Sự phát sinh phôi

ở phần lớn những thực vật bậc cao bắt đầu với sự thụ phấn kép. Tuy nhiên, ở một số
loài và trong một số điều kiện nhất định, việc phát sinh phôi có thể khởi đầu trong túi
phôi mà không cần quá trình thụ phấn (sinh sản vô phối). Ở một số loài thực vật khác
(Kalanchoe sp.), phôi (có vai trò giống các chồi mầm) có thể xuất hiện ở mép lá (quá
trình phát sinh phôi vô tính in planta). Quá trình phát sinh phôi cũng có thể được kích
thích nhân tạo đối với các tế bào sinh dưỡng hoặc các tế bào giao tử trong nuôi cấy in
vitro (Dương Tấn Nhựt, 2009). Phôi hình thành từ các tế bào sinh dưỡng qua quá trình
nuôi cấy in vitro được gọi là phôi vô tính.
Phôi soma rất giống phôi hợp tử về hình thái, quá trình phát triển và sinh lý, nhưng
không phải do sản phẩm của sự thụ tinh giữa một giao tử đực và một giao tử cái, do đó
không có quá trình tái tổ hợp di truyền. Phôi soma có nội dung di truyền giống hệt với
các tế bào soma sinh ra chúng (Nguyễn Văn Uyển, 1996)
Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là cùng một khái
niệm để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới

12


những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn
chỉnh (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Các giai đoạn phát triển phôi vô tính ở thực vật một lá mầm và hai lá mầm không
giống nhau:
- Đối với thực vật hai lá mầm: hình cầu  hình tim  hình thủy lôi  lá mầm.
- Đối với thực vật một lá mầm: hình cầu  hình vảy  hình diệp tiêu.
2.2.2. Các con đường phát sinh phôi soma thực vật
Sự phát sinh phôi vô tính là một quá trình mà trong đó cấu trúc lưỡng cực giống
phôi hữu tính (cấu trúc chứa đầy đủ các bộ phận của một phôi, bao gồm mầm chóp rễ
và chồi đỉnh) phát triển từ một tế bào sinh dưỡng và không có liên kết mao mạch với tế
bào gốc ban đầu. Tất cả các tế bào sinh dưỡng của thực vật đều có chứa toàn bộ thông
tin di truyền cần thiết cho sự hình thành nên một cơ thể thực vật hoàn chỉnh, với đầy đủ

các chức năng cần thiết. Tính toàn năng của tế bào thực vật là nền tảng trong phát sinh
phôi vô tính.
Đặc điểm của tế bào phát sinh phôi: là những tế bào nhỏ, được bao bọc bởi khối tế
bào chất dày và không bào nhỏ, nhân nằm ở vị trí trung tâm, có những ống siêu nhỏ
nổi bật ở gần nhân và những sợi nhỏ actin.
Có 2 con đường phát sinh phôi soma:
 Biệt hóa trực tiếp từ mẫu cấy: sử dụng các tế bào có nguồn gốc từ phôi
(PEDC – pre-embryogenic determined cell) như: các vi bào tử, noãn bào, phôi hữu
tính hoặc phôi vô tính, những tế bào này đã có sẵn chương trình biểu hiện của các gen
sinh phôi, vì vậy, chỉ cần một sự kích thích phân chia tế bào là đủ để hình thành phôi.
 Gián tiếp thông qua giai đoạn tạo mô sẹo: xảy ra ở các tế bào chưa biệt hóa
(tế bào phát sinh phôi - IEDC (induced embryogenic determined cell)) và đầu tiên sẽ
tạo thành các mô sẹo không biệt hóa. Do các mô cấy là những tế bào đã phân hóa
không còn khả năng phát sinh phôi, chúng phải trải qua nhều lần phân chia tế bào liên
tiếp dưới sự cảm ứng của auxin trong suốt quá trình để được tái lập trình đi vào con
đường sinh phôi. Tuy nhiên, trong thực tế, mô sẹo được tạo thành có thể là những mô
sẹo có khả năng phát sinh phôi (embryogenic callus) hoặc không có khả năng phát
sinh phôi (non-embryogenic callus). Mô sẹo có khả năng sinh phôi bao gồm các cụm
tiền phôi (PEM-proembryogenic mass). Thông thường, dễ phân biệt mô sẹo có khả

13


năng phát sinh phôi và mô sẹo không có khả năng phát sinh phôi dựa vào hình thái và
màu sắc của chúng (Dương Tấn Nhựt, 2009).

Hình 2.3 Mô hình giả thuyết các sự kiên xảy ra trong quá trình phát
sinh phôi soma (Dương Tấn Nhựt, 2009).
2.2.3. Các giai đoạn của quá trình phát sinh phôi soma
Sự tái sinh thực vật thông qua con đường phát sinh phôi vô tính gồm 5 giai đoạn:

 Nuôi cấy tạo phôi bằng cách chọn lựa mẫu cấy sơ cấp cấy vào môi trường bổ
sung chất điều hòa sinh trưởng: các tế bào sinh dưỡng thực vật có chứa đầy đủ các
thông tin di truyền cần thiết để tạo nên một cơ thể thực vật có chức năng hoàn chỉnh.
Việc cảm ứng quá trình phát sinh phôi, trước hết phải tác động để làm kết thúc sự biểu
hiện gen hiện tại và thay nó bằng chương trình biểu hiện gen phát sinh phôi. Một cơ
chế có thể ngừng biểu hiện gen là methyl hóa DNA, có thể tiến hành bằng auxin
(Loschiavo và cộng sự, 1989). Hai cơ chế quan trọng trong phát sinh tế bào phôi in
vitro là: sự phân chia tế bào bất đối xứng và sự kéo dài tế bào (de Jong và cộng sự,
1993; Emons, 1994).

14