XÁC ĐỊNH, TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG Bradyrhizobium sp. CỘNG SINH TRÊN CÂY ĐẬU XANH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH, TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG Bradyrhizobium sp.
CỘNG SINH TRÊN CÂY ĐẬU XANH TRONG
PHÒNG THÍ NGHIỆM

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH

Niên khóa:

2008 – 2012

Tháng 7 năm 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH, TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG Bradyrhizobium sp.
CỘNG SINH TRÊN CÂY ĐẬU XANH TRONG
PHÒNG THÍ NGHIỆM

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH

KS. TRẦN THỊ QUỲNH DIỆP

Tháng 7 năm 2012


LỜI CẢM ƠN
Tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm
Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả
thầy cô đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian tôi theo học ở trƣờng.
Cảm ơn PGS.TS. Lê Đình Đôn đã hết lòng vì học trò, tận tình giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện tốt nhất trong thời gian tôi theo học tại trƣờng cũng nhƣ trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận.
KS. Trần Thị Quỳnh Diệp, KS. Võ Khánh Hƣng, KS. Nguyễn Phan Thành, thầy
cô và anh chị đang công tác tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Nghiên Cứu Công
Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi về vật chất và kỹ thuật.
Cảm ơn các bạn cùng lớp DH08SH, em Nguyễn Thị Dƣợc (DH09SH), Nguyễn
Thị Phƣơng Khanh (DH10SH) đã giúp đỡ, góp ý và chia sẻ cùng tôi những khó khăn
trong thời gian học tập và thực hiện khóa luận. Cảm ơn các bạn, chúc các bạn thành

công.
Cuối cùng con muốn gửi đến ba mẹ đã nuôi dƣỡng, ủng hộ, tạo cho con điều
kiện tốt nhất và là chỗ dựa vững chắc để con có đƣợc hôm nay.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2012
Nguyễn Thị Hồng Hạnh

i


TÓM TẮT
Trên thế giới, vi khuẩn cố định đạm đã đƣợc nghiên cứu từ thế kỷ 19 và thu đƣợc
nhiều kết quả quan trọng, ứng dụng hiệu quả cho việc cải tạo đất, tăng năng xuất cây
trồng. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về tiềm năng và ứng dụng của các loài vi khuẩn này
vẫn chỉ là bƣớc đầu. Hiện nay, việc tuyển chọn ra những dòng vi khuẩn cố định đạm để
tạo ra một chế phẩm vi sinh có chứa vi khuẩn này là vô cùng cần thiết cho sự phát triển
của nền nông nghiệp nƣớc nhà. Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên đề tài “Xác
định và tuyển chọn các dòng Bradyrhizobium sp. cộng sinh trên cây đậu xanh trong
phòng thí nghiệm” đã đƣợc thực hiện.
Đề tài bao gồm các thí nghiệm nhƣ xác định mật số vi khuẩn Bradyrhizobium sp.
ở mốc thời gian 24 giờ sau lắc tăng sinh bằng phƣơng pháp đếm sống nhỏ giọt, trồng
đậu xanh trên hệ thống bioassay với các vi khuẩn đã đƣợc phân lập và xác định bằng
sinh hóa cùng với những mật số vi khuẩn khác nhau nhằm xác định chủng vi khuẩn và
mật số vi khuẩn thích hợp có thời gian xuất hiện nốt sần ngắn nhất. Sau đó tiến hành
định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
Mật số vi khuẩn Bradyrhizobium sp. ở mốc thời gian 24 giờ sau khi lắc tăng sinh
đƣợc xác định ở khoảng 109 - 1010 CFU/ml. Năm chủng vi khuẩn có khả năng cộng
sinh trên rễ đậu xanh làm tăng nhanh chiều dài thân và rễ đã đƣợc xác định, mật số vi
khuẩn có thời gian xuất hiện nốt sần sớm nhất trong khoảng 109 - 1010 CFU/ml. Với
cặp mồi đƣợc thiết kế trên vùng bảo tồn 16S rDNA khuếch đại một đoạn DNA có kích
thƣớc khoảng 585 bp của Bradyrhizobium sp. đã tuyển chọn đƣợc 6 chủng vi khuẩn có

khả năng khuếch đại đoạn DNA trên . Cuối cùng đã chọn ra đƣợc 5 chủng vi khuẩn tiếp
tục cho các thí nghiệm sau này là Bradyrhizobium sp. (X4), Bradyrhizobium sp. (A3.2.I),
Bradyrhizobium sp.(A3.2.II), Bradyrhizobium sp. (H1), Bradyrhizobium sp. (H3)

ii


SUMMARY
The thesis "Identification and selection of the symbiotic Bradyrhizobium sp. on Vigna
radiata in the laboratory " was carried out at Research Institute for Biotechnology
Environment, Nong Lam University, from February to July, 2012.
In the world, nitrogen-fixing bacteria have been studied since the 19th century
and obtained many important results, effective applications for soil improvement, and
increase crop capacity. In Vietnam, the potential researches and applications of this
bacterium are only the first step. Currently, the selection of these nitrogen-fixing
bacteria strains to create a microbiological preparations containing bacteria are
extremely necessary for the development of agriculture in the country. Stemming from
the practical requirements our research project: " Identification and selection of the
symbiotic Bradyrhizobium sp. on Vigna radiata in the laboratory" was conducted.
This topip including science experiments: identifying density of bacteria
Bradyrhizobium sp. in time 24 hours after proliferation by Drop plate Count method,
planting Vigna radiata Bioassay system with the bacteria was isolated and identified
by biochemical with the density of different bacterial strains to determine bacteria and
bacterial density which resulted shortest for nodules to appear. Then proceed to
identify them use molecular biology techniques.
The result was identified bacteria Bradyrhizobium sp. at

24 hours after

proliferation is at about 109 to 1010 CFU / ml. At the same time have identified five

strains of bacteria capable of symbiosis on the roots of Vigna radiata accelerates the
body length and root density of bacteria have time to appear as early nodules about 109
- 1010 CFU /ml. With primers designed on conserved regions of 16S rDNA amplified
a DNA fragment about 585 bp size of Bradyrhizobium sp., six strains of the bacteria
were selected. Finally, five strains were selected for use in further experiments, which
are Bradyrhizobium sp. (X4), Bradyrhizobium sp. (A3.2.I), Bradyrhizobium sp. (A3.2.II),
Bradyrhizobium sp. (H1), Bradyrhizobium sp. (H3).
Key words : Bradyrhizobium sp., Drop plate Count method, Vigna radiata.

iii


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN .......................................................................................................... i
TÓM TẮT ................................................................................................................ ii
SUMMARY ............................................................................................................. iii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH....................................................................................... ix
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ............................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu .............................................................................................................. 1
1.3. Nội dung thực hiện ............................................................................................ 2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về cây đậu xanh ................................................................................ 3
2.1.1. Phân loại ......................................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái của cây đậu xanh ............................................................. 3
2.2. Quá trình cố định Nitơ....................................................................................... 4
2.2.1. Vai trò của Nitơ đối với thực vật.................................................................... 4

2.2.2. Các nguồn Nitơ cung cấp cho cây .................................................................. 5
2.2.3. Chu trình cố định Nitơ trong tự nhiên ............................................................ 5
2.3. Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ ................................................................. 6
2.3.1. Phân loại vi khuẩn cố định Nitơ ..................................................................... 6
2.3.2. Đặc điểm vi khuẩn cố định Nitơ .................................................................... 6
2.3.3. Vai trò vi khuẩn cố định Nitơ trong tự nhiên ................................................. 7
2.4. Sơ lƣợc về Bradyrhizobium ............................................................................... 8
2.4.1. Phân loại khoa học ......................................................................................... 8
2.4.2. Đặc điểm......................................................................................................... 8
2.4.3. Cơ chế tạo nốt sần .......................................................................................... 9
2.5. Ly trích DNA và phản ứng PCR ....................................................................... 11
2.5.1. Ly trích DNA.................................................................................................. 11
iv


2.5.2. Phản ứng PCR ................................................................................................ 11
2.5.2.1. Khái niệm .................................................................................................... 11
2.5.2.2. Nguyên lý .................................................................................................... 11
2.5.2.3. Các giai đoạn phản ứng ............................................................................... 12
2.5.2.4. Thành phần của phản ứng PCR ................................................................... 13
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 14
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 14
3.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 14
3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..................................................................................... 14
3.2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng ............................................................... 14
3.2.2.1. Thiết bị và dụng cụ: ..................................................................................... 14
3.2.2.2. Hóa chất ....................................................................................................... 15
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................... 15
3.3.1. Thí nghiệm 1: Xác định mật số vi khuẩn Bradyrhizobium tại thời gian
24 giờ bằng phƣơng pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop plate Count) .......................... 15

3.3.1.1. Nguyên tắc ................................................................................................... 15
3.3.1.2. Phƣơng pháp thực hiện ............................................................................... 15
3.3.2. Thí nghiệm 2: Xác định chủngvi khuẩn và mật số vi khuẩn Bradyrhizobium
khi chủng trên giống đậu xanh trên hệ thống bioassay ............................................ 17
3.3.2.1. Hệ thống dùng trong bioassay ..................................................................... 17
3.3.2.2. Mô tả thí nghiệm ......................................................................................... 17
2.3.2.3 Bố trí thí nghiệm........................................................................................... 18
3.3.2.4. Các chỉ tiêu và phƣơng pháp theo dõi ........................................................ 18
3.3.2.5. Quy trình kỹ thuật: ...................................................................................... 18
3.3.3. Thí nghiệm 3: Phát hiện chủng vi khuẩn Bradyrhizobium
bằng kỹ thuật PCR .................................................................................................... 19
3.3.3.1. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn ............................................................ 19
3.3.3.2. Quy trình điện di kiểm tra DNA tổng số của vi khuẩn ............................... 20
3.3.3.3. Khuếch đại trình tự rDNA 16S của vi khuẩn bằng phản ứng PCR............. 20
3.3.3.4. Điện di và đọc kết quả PCR ........................................................................ 21
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 23
4.1. Kết quả xác định mật số vi khuẩn Bradyrhizobium tại thời gian 24 giờ
v


sau lắc tăng sinh bằng phƣơng pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop plate Count) .......... 23
4.2. Kết quả xác định chủng và mật độ vi khuẩn Bradyrhizobium
làm xuất hiện nốt sần trên giống đậu xanh bằng hệ thống bioassay ........................ 24
4.2.1. Kết quả thí nghiệm ......................................................................................... 24
4.2.1.1.Kết quả chiều dài rễ và thân dƣới tác động của vi khuẩn
sau 6 ngày gieo. ........................................................................................................ 24
4.2.1.2. Kết quả chiều dài rễ và thân dƣới tác động
các mật số vi khuẩn khác nhau sau 6 ngày gieo. ...................................................... 26
4.2.1.3. Kết quả chiều dài rễ và thân dƣới tác động của chủng vi khuẩn
và mật số vi khuẩn sau 6 ngày sau gieo. .................................................................. 27

4.2.1.4. Kết quả đếm số nốt sần qua các lần nhuộm ................................................ 30
4.2.2. Thảo luận ........................................................................................................ 31
4.3. Khuếch đại trình tự rDNA 16S của vi khuẩn bằng phản ứng PCR ................... 32
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 33
5.1. Kết luận ............................................................................................................ 33
5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 33
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
dNTP

: deoxynucleotide triphosphat

Tm

: Melting temperature

YEM

: Yeast Extract Mannitol

YMA

: Yeast Mannitol Agar

Bp

: base pair

SDS

: Sodium dodecyl sulfat

TCVN

: Tiêu chuẩn Việt Nam

PCR

: Polymease Chain Reaction

DNA

: Deoxyribonucleic acid

TBE

: Tris Borate EDTA

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu và địa chỉ thu thập mẫu ............................................................ 15
Bảng 3.2 Primer sử dụng khuếch đại trình tự 16S rDNA của vi khuẩn ..................... 22

Bảng 3.3 Thành phần cho một phản ứng PCR ............................................................. 22
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ............................................................... 22
Bảng 4.1 Mật số vi khuẩn Bradyrhizobium sau thời gian 24 giờ tăng sinh ................. 24
Bảng 4.2 Chiều dài rễ sau 6 ngày gieo dƣới tác động của chủng vi khuẩn ................. 25
Bảng 4.3 Chiều dài thân sau 6 ngày gieo dƣới tác động của chủng vi khuẩn ............. 26
Bảng 4.4 : Chiều dài rễ sau 6 ngày gieo dƣới tác động của
các mật độ vi khuẩn khác nhau..................................................................................... 27
Bảng 4.5: Chiều dài thân sau 6 ngày gieo dƣới tác động của
các mật độ vi khuẩn khác nhau..................................................................................... 28
Bảng 4.6 Chiều dài rễ 3 ngày sau khi gieo dƣới tác động của
chủng vi khuẩn và mật độ vi khuẩn ............................................................................ 29
Bảng 4.7 Chiều dài rễ sau 6 ngày gieo hạt dƣới tác động của chủng vi khuẩn
và mật độ vi khuẩn........................................................................................................ 30
Bảng 4.8 Chiều dài thân sau 3 ngày gieo dƣới tác động của chủng vi khuẩn và mật độ
vi khuẩn ........................................................................................................................ 31
Bảng 4.9 Chiều dài thân sau 6 ngày gieo dƣới tác động của chủng vi khuẩn và mật độ
vi khuẩn ........................................................................................................................ 32
Bảng 4.10 Số nốt sần ở các chủng vi khuẩn tại mật độ vi khuẩn 24 giờ
qua các lần nhuộm ................................................................................................... 33

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây đậu xanh ............................................................................................ 3
Hình 2.2 Hình thái hoa và hạt đậu xanh .................................................................. 4
Hình 2.3 Chu trình cố định nitơ trong tự nhiên ....................................................... 6
Hình 2.4 Vi khuẩn Bradyrhizobium sp. và nốt sần trên rễ ...................................... 9
Hình 2.5 Cơ chế tạo nốt sần trên cây họ Đậu .......................................................... 10

Hình 2.6 Các bƣớc trong phản ứng PCR ................................................................. 13
Hình 3.1 Phƣơng pháp xác định mật số vi khuẩn .................................................... 16
Hình 3.2 Hệ thống Bioassay .................................................................................... 17
Hình 4.1 Khuẩn lạc Bradyrhizobium sau 24 giờ tăng sinh
đƣợc ủ trên môi trƣờng ............................................................................................ 23
Hình 4.2 Đo chiều dài thân và chiều dài rễ .............................................................. 25
Hình 4.3 Rễ sau khi nhuộm thuốc nhuộm fuchsin .................................................. 31
Hình 4.4 Sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 3%,400 mA
trong 30 phút 100 V. ................................................................................................. 32

ix


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển không ngừng của xã hội, ngành nông nghiệp cũng có
những thay đổi rất đáng kể. Nhiều máy móc tiên tiến, công nghệ trồng trọt, giống
mới ra đời, đã đáp ứng kịp với những nhu cầu ngày càng cao của con ngƣời. Việt
Nam là nƣớc nông nghiệp nên phân bón và giống có thể xem là hai yếu tố có tính
quyết định đến năng suất và chất lƣợng. Do sự thiếu cân đối trong việc bón các yếu
tố dinh dƣỡng cũng nhƣ các yếu tố ngoại cảnh khác nên hiệu quả sử dụng phân bón
hóa học không cao, gây lãng phí và ảnh hƣởng xấu đến môi trƣờng. Vì vậy, việc
nghiên cứu sự tƣơng tác có lợi giữa vi sinh vật với cây trồng nhằm sử dụng chúng cải
tạo đất, tăng năng suất cây trồng hứa hẹn nhiều tiềm năng. Trong đó vi khuẩn cố
định đạm là một trong những đối tƣợng điển hình.
Hằng năm trên thế giới có khoảng 120 – 160 triệu tấn nitơ khí quyển đƣợc cố
định và chuyển hóa thành đạm dƣới nhiều dạng khác nhau thông qua quá trình cố
định nitơ trong tự nhiên. Chúng ta cũng đã biết, cây đậu có khả năng đặc biệt là sản
xuất đạm cho chính bản thân nó thông qua mối quan hệ cộng sinh với một số vi
khuẩn đất hay vi khuẩn nốt sần. Vi khuẩn xâm nhập vào tế bào rễ thực vật và bắt đầu

hàng loạt các thay đổi phức tạp dẫn đến việc tạo nốt sần.
Tuy nhiên số lƣợng vi khuẩn này trên đất còn hạn chế chƣa đáp ứng đủ với nhu
cầu của cây. Mặc khác, các chủng vi khuẩn khác nhau thì có khả năng cố định đạm
với các giống đậu khác nhau. Vì vậy việc tuyển chọn ra những dòng vi khuẩn cố
định đạm để tạo ra một chế phẩm vi sinh có chứa vi khuẩn này ở qui mô phòng thí
nghiệm là vô cùng cần thiết cho sự phát triển của nền nông nghiệp nƣớc nhà.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên đề tài: “ Xác định và tuyển chọn các
dòng Bradyrhizobium sp. cộng sinh trên cây đậu xanh trong phòng thí nghiệm” đã
đƣợc thực hiện.
1.2. Yêu cầu
Xác định, tuyển chọn các dòng Bradyrhizobium sp. cộng sinh trên cây đậu xanh
trong phòng thí nghiệm.
1


1.3. Nội dung thực hiện
Xác định thời gian xuất hiện nốt sần, số lƣợng nốt sần của vi khuẩn trên rễ cây
đậu xanh bằng hệ thống bioassay.
Xác định, tuyển chọn Bradyrhizobium sp. bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về đậu xanh
Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ và Trung Á, phân bổ chủ yếu ở các vùng
nhiệt đới và á nhiệt đới, là giống cây trồng khá quen thuộc ở Châu Á và cũng rất phổ
biến ở nƣớc ta.
Cây đậu xanh có khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thích nghi với
các vùng có điều kiện khắc nghiệt. Khu vực Đông và Nam Châu Á, cây đậu xanh đƣợc

trồng nhiều ở các quốc gia nhƣ: Ấn Độ, Pakistan, Bangladesh, Sri Lanka, Nepal Trung
Quốc, Thái Lan, Philippin, Miến Điện, Inđônexia; hiện nay đã đƣợc phát triển tại một
số quốc gia ở vùng ôn đới, ở Châu Úc, lục địa Châu Mỹ. (Phạm Văn Thiều, 1999)
Đậu xanh có danh pháp khoa học Vigna radiata có kích thƣớc hạt nhỏ (đƣờng
kính khoảng 2 – 2,5 mm). Ở Việt Nam đậu xanh là loại đậu thƣờng đƣợc sử dụng để
làm xôi, làm các loại bánh khọt, bánh đậu xanh, bánh ngọt, hoặc đƣợc ủ cho lên
mầm để làm thức ăn (giá đỗ).
2.1.1. Phân loại
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta (hạt kín)
Lớp: Magnoliopsida (2 lá mầm)
Bộ: Fabales
Họ: Fabaceae
Chi: Vigna
Loài: Vigna radiata (L.) R. Wilczek
Thứ: V. radiata var. radiata (L.) R. Wilczek,

Hình 2.1 Cây đậu xanh
(www. vov.vn)

V. radiata var. sublobata (Roxb.) Verdc (www.itis.gov)
2.1.2. Đặc điểm hình thái của cây đậu xanh
Rễ: rễ cây đậu xanh thuộc loại rễ cọc, xung quanh có các rễ con mọc ra. Bình
thƣờng rễ cái ăn sâu khoảng 20 – 30 cm và có thể mọc ra 30 – 40 rễ con, các rễ con
dài 20 – 25 cm, phát triển theo chiều ngang và tập trung nhiều ở lớp đất mặt từ 0 –

3


25 cm. Từ các rễ con này lại mọc ra nhiều rễ nhánh khác làm nhiệm vụ hút nƣớc và

các chất dinh dƣỡng để nuôi cây.
Thân, cành: đậu xanh là cây thân thảo mọc thẳng đứng, hình tròn, có một lớp
lông màu nâu sáng bao bọc, thân cây yếu. Cây ít phân cành và thƣờng phân cành
muộn, trung bình có 1 – 5 cành.
Lá: là loại là kép có 3 là chét, mọc cách. Cả 2 mặt lá đều có lông, gân lá nổi lên
ở phía dƣới mặt lá.
Hoa, quả, hạt: hoa đậu xanh là hoa lƣỡng tính, mọc thành chùm to, xếp xen kẻ
nhau ở trên cuống; khi mới hình thành hoa có hình cánh bƣớm, màu xanh tím và khi
nở có màu vàng nhạt. Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp hình trụ, dài từ 8 – 10 cm, có
dạng tròn hơi dẹp, có 2 gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh quả. Hạt đậu xanh hình trụ,
thuôn, tròn đều có màu xanh hồng, xanh xám, vàng hoặc đen xám, nằm cách nhau
bằng những vách xốp của quả (Phạm Văn Thiều, 1999).

b)

a)
Hình 2.2 Hình thái hoa và hạt đậu xanh a) hoa đậu xanh b) hạt đậu xanh.
(www.longan.gov.vn, xnkbacnghean.com.vn)

2.2. Quá trình cố định Nitơ
2.2.1. Vai trò của Nitơ đối với thực vật
Nitơ là nguyên tố dinh dƣỡng quan trọng không chỉ với cây trồng mà ngay cả
đối với vi sinh vật. Nguồn dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, chỉ tính riêng trong
không khí nitơ chiếm khoảng 78,16% thể tích. Trong cơ thể các loại sinh vật chứa
khoảng 4.1015 tỷ nitơ. Nhƣng tất cả nguồn nitơ trên cây trồng không tự đồng hóa
đƣợc mà phải đƣợc chuyển hóa thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng nhờ các vi

4

sinh vật (Vi sinh vật cố định nitơ, vi sinh vật tham gia vào quá trình amon hóa, vi
sinh vật tham gia vào quá trình nitrat hóa) (www.physicalgeography.net ).
2.2.2. Các nguồn nitơ cung cấp cho cây
Hàm lƣợng nitơ trong thành phần chất khô của thực vật thƣờng từ 1 - 3%. Tuy
hàm lƣợng trong cây thấp, nhƣng nitơ có ý nghĩa quan trọng bạc nhất đối với đời
sống thực vật cũng nhƣ toàn bộ thế giới hữu cơ.
Trong tự nhiên nitơ tồn tại dƣới 2 dạng: dạng khí tự do trong khí quyển (N 2)
chiếm khoảng 79% không khí (theo thể tích), dạng này cây không sử dụng đƣợc;
dạng các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ nitơ liên kết ở 3 dạng hợp chất: hợp chất nitơ
vô cơ trong các muối ammonium (NH4+), muối nitrate (NO3-); Nitơ hữu cơ của các
protein ở dạng xác bã động vật, thực vật chƣa phân giải hoàn toàn, ở dƣới dạng mùn
protein. Các sản phẩm phân giải protein nhƣ các acid amine, các peptide và các
amine.
Trong số các dạng nitơ trên thì cây sử dụng nitơ vô cơ là chủ yếu. Trong đất
nitơ vô cơ chiếm 1 – 2% lƣợng nitơ tổng số có trong đất. Trên những loại đất phì
nhiêu lƣợng nitơ dễ tiêu trong đất có thể đạt 200 kg/ha (www.tailieu.vn).
2.2.3. Chu trình cố định Nitơ trong tự nhiên
Chu trình cố định nitơ trong tự nhiên có 2 giai đoạn: cố định Nitơ và khoáng
hóa nitơ.
Giai đoạn cố định nitơ do các vi sinh vật cố định nitơ nhƣ Rhizobium sống
cộng sinh với rễ cây họ đậu, Azotobacter sống tự do sẽ biến đổi nitơ trong không khí
thành amonia, từ amonia sẽ tổng hợp nên các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho
cây trồng đồng thời làm giàu nitơ cho đất. Phản ứng cố định nitơ đƣợc xúc tác bởi
enzyme nitrogenase theo phƣơng trình sau:
Nitrogenase
2NH4+ + 12ADP + 12Pi + 4H+

N2 + 6e + 12ATP + H2O

Giai đoạn khoáng hóa nitơ có sự tham gia của các chủng vi khuẩn nitrate hóa

nhƣ Nitrosomonate, Nitrobacter để chuyển hóa nitrate là dạng thích hợp nhất cho
cây trồng hấp thu. (www.physicalgeography.net )

5


Hình 2.3 Chu trình cố định nitơ trong tự nhiên
(www.hbwbiology.net)

2.3. Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ
2.3.1. Phân loại vi khuẩn cố định nitơ
Vi khuẩn cố định nitơ đƣợc chia làm 3 nhóm: vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh,
vi khuẩn cố định nitơ sống tự do và vi khuẩn cố định nitơ tƣơng tác với thực vật ký
chủ. Tuy nhiên, sự phân biệt giữa 3 nhóm này, đặc biệt là giữa nhóm vi khuẩn cố
định nitơ sống tự do và nhóm vi khuẩn cố định nitơ tƣơng tác với thực vật thì vẫn
chƣa đƣợc mô tả một cách rõ ràng và một số vi khuẩn đƣợc xếp vào nhiều nhóm
(Gnamanickam, 2006).
2.3.2. Đặc điểm vi khuẩn cố định nitơ
Vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh là những vi sinh vật sống cộng sinh với
thực vật ký chủ theo kiểu hai bên cùng có lợi. Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽ tiến
hành trao đổi chất dinh dƣỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở
nơi vi khuẩn định cƣ, điển hình là hiện tƣợng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ Đậu.
Hiện tƣợng cộng sinh giữa vi khuẩn và thực vật đƣợc xem là sự tƣơng tác gần giữa
vi khuẩn và thực vật, trong đó vi khuẩn đƣợc gọi là sinh vật cộng sinh. Hầu hết
những vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn Gram âm, có khả năng hình thành nốt sần ở
rễ cây họ Đậu; hay là những thành viên của xạ khuẩn chi Frankia- là những vi khuẩn
6


Gram dƣơng có khả năng hình thành nốt sần trên cây thân gỗ, cây hai lá mầm và cây

bụi. Ban đầu những vi khuẩn cộng sinh ở cây họ Đậu đƣợc phân chia thành chi
Rhizobium, do đó những vi khuẩn này thƣờng đƣợc nói đến nhƣ là những vi khuẩn
nốt rễ (rhizobia). Ngày nay, những vi sinh vật cộng sinh ở rễ cây họ Đậu đƣợc phân
loại thành nhiều chi, trong đó, hầu hết các loài thuộc chi Rhizobium, Sinorhizobium
(Ensifer), Mesorhizobium và Bradyrhizobium (Gnamanickam, 2006).
Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do (không cộng sinh) là những vi khuẩn tƣơng
tác thực vật cố định đạm nhƣng không xâm nhập vào một loại cây chủ theo hƣớng
cộng sinh chuyên biệt. Trong số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azobacter,
Pseudomonas và Clostridium (Gnamanickam, 2006).
Vi khuẩn cố định đạm tƣơng tác là những vi khuẩn tham gia vào quá trình trao
đổi chất dinh dƣỡng với thực vật nhƣng không làm thay đổi cấu trúc rễ của thực vật.
Để phân biệt đƣợc vi khuẩn cố định đạm cộng sinh hay tƣơng tác với thực vật ký chủ
thì chủ yếu dựa vào mức độ tƣơng tác. Sự cố định nitơ tƣơng tác đƣợc hiểu là quá
trình cố định nitơ bởi những vi khuẩn sống tự do nhƣng lại chịu ảnh hƣởng trực tiếp
của cây trồng. Theo Klucas (1991), trong mối quan hệ tƣơng tác, cả cây trồng và vi
khuẩn cố định nitơ đều có lợi nhƣng mối quan hệ này diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn
sự cộng tác bắt buộc. Sự cố định nitơ tƣơng tác là một quá trình sinh thái trung gian
giữa quá trình cố định nitơ cộng sinh và tự do. Và vi khuẩn cố định nitơ tƣơng tác
bao gồm những vi khuẩn sống tự do trong vùng lân cận của rễ cây thực vật đến
những vi khuẩn sống nội sinh trong mô tế bào thực vật. Để quá trình cố định nitơ
tƣơng tác có thể diễn ra cần những yêu cầu sau đây: 1) thực vật ký chủ; 2) vi khuẩn
cố định nitơ; 3) chất nền thực vật; 4) môi trƣờng thích hợp để enzyme nitrogenase
hoạt động; 5) quá trình chuyển nitơ đƣợc cố định từ vi khuẩn sang cây trồng. Một số
vi khuẩn tham gia cố định nitơ tƣơng tác điển hình nhƣ: Azosprium, Burkholderia,
Enterobacter, Gluconoacetobacter, Herbaspirillum và Klebsiella (Gnamanickam,
2006).
2.3.3. Vai trò vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên
Vai trò của tất cả những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định nitơ cung
cấp đạm cho cây trồng. Tuy nhiên bên cạnh đó các vi khuẩn cố định nitơ còn đƣợc
biết đến với nhiều vai trò khác có ích cho cây trồng nhƣ: kích thích sinh trƣởng ở

7


thực vật bằng cách tạo ra các enzyme nhƣ ACC deamiase, hay tạo ra các
phytohormone nhƣ auxin, cytokinin và gibberlin. Giảm tác động có hại của các mầm
bệnh bằng cách cạnh tranh về dinh dƣỡng, cạnh tranh về nơi cƣ trú hay tạo ra các
chất kháng sinh, các enzyme thủy phân chống lại bệnh xâm nhập của kẻ thù hay cảm
ứng hệ thống phòng vệ của cây ký chủ (Dracourt và ctv, 2001; Loon, 2007).
2.4. Sơ lƣợc về Bradyrhizobium
2.4.1. Phân loại khoa học:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Alphaproteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Bradyrhizobiaceae
Chi: Bradyrhizobium
Một số loài đã đƣợc định danh:
B. betae Rivas 2004
B. canariense Vinuesa 2005
B. elkanii Kuykendall 1992
B. iriomotense Islam 2010
B. japonicum (Kirchner 1896) Jordan 1982
B. jicamae Ramírez-Bahena 2009
B. liaoningense Xu 1995
B. pachyrhizi Ramírez-Bahena 2009
B. yuanmingense Yao 2002
B. denitrificans van Berkum 2006
(www.bacterio.cict.fr)
2.4.2. Đặc điểm
Đặc điểm của chi Bradyrhizobium spp. là những loài mọc chậm, sản sinh chất

kiềm. Khuẩn lạc hình thành 3 – 5 ngày, có kích thƣớc 0,3 – 1,2 x 2,2 – 3,2 µm, có từ
1 – 2 tiên mao, có khả năng di động đƣợc. Chúng phát triển tốt ở môi trƣờng
pentozơ.( www.d.violet.vn)

8


a)

b)

Hình 2.4 Vi khuẩn Bradyrhizobium sp và nốt sần trên rễ. a) Nốt sần trên rễ
b) Vi khuẩn Bradyrhizobium (vietsciences.free.fr).
2.4.3. Cơ chế tạo thành nốt sần
Vi khuẩn nốt sần xâm nhập vào rễ cây họ đậu thông qua lông hút đôi khi thông
qua vết thƣơng. Một số cây họ đậu tiết ra xung quanh rễ những chất có tác dụng kích
thích những vi khuẩn tƣơng ứng với mình phát triển mạnh hơn (để có thể nhiễm vào
thực vật, vi khuẩn phải đạt mật độ tế bào 104 tế bào/g đất.
Vi khuẩn sau khi tiếp xúc với lông hút của thực vật, tạo thành dãy xâm nhập đi
dần vào bên trong của rễ và xâm nhập vào nhu mô kích thích tế bào thực vật bị phân
chia nhanh chóng thành tế bào mới. Vi khuẩn đi vào tế bào chất và phân chia chuyển
thành thể giả khuẩn. Giả khuẩn không phân chia đƣợc nhƣng phát triển mạnh tăng
nhiều ribosome, nốt sần xuát hiện.
Những cây đậu có đời sống 1 năm và lâu năm cũng có sự khác biệt về tính
chất nốt sần. Ở đậu phộng, đậu nành nốt sần có khả năng cố định nitơ thƣờng có
màu hồng, kích thƣớc lớn, thƣờng nằm trên rễ chính trong khi nốt sần vô hiệu có
màu lục, kích thƣớc nhỏ thƣờng nằm trên rễ phụ. Tuy nhiên ở một số cây đậu lâu
năm thì không theo quy luật đó. Ví dụ nhƣ cây keo tai tƣợng dùng để trồng rừng,
nốt sần hữu hiệu có cả ở rễ phụ và không có màu hồng (Lê Xuân Phƣơng, 2005).
Nốt sần thích hợp ở các điều kiện: Độ ẩm của đất: 60 - 70%, độ thoáng khí:

càng nhiều càng tốt, điều này cho thấy rễ càng sâu lƣợng nốt sần càng kém, pH thích
hợp từ 4,6 - 8,0. Phân đạm thƣờng ức chế tạo thành nốt sần, phân lân, kali có tác dụng
tích cực, phân canxi, magiê và các muối khác cũng có tác dụng tốt đến quá trình tạo
9


thành nốt sần. Chất dinh dƣỡng cacbon nhƣ nƣớc đƣờng, rơm, rạ làm tăng khả năng
xâm nhập và khả năng cố định nitơ, ngƣợc lại những vi sinh vật cho kháng sinh sẽ gây
ức chế vi khuẩn Bradyrhizobium. Thƣờng nốt sần chỉ hình thành ở phần rễ nông, phần
rễ sâu rất ít nốt sần. Nguyên nhân là do tính hiếu khí của vi khuẩn, thiếu oxi sẽ làm
giảm cƣờng độ trao đổi năng lƣợng và khả năng xâm nhập vào rễ cây. Nhiệt độ thích
hợp nhất với hoạt động của vi khuẩn là 24oC, dƣới 10oC nốt sần vẫn có thể hình thành
nhƣng hiệu quả cố định nitơ giảm. Ở nhiệt độ 36oC cây đậu phát triển tốt nhƣng cƣờng
độ cố định nitơ lại kém. Giá trị pH cũng ảnh hƣởng đến sự hình thành và chất lƣợng
nốt sần, có loại vi khuẩn chỉ hình thành nốt sần ở pH từ 6,8 đến 7,4; có loại vi khuẩn
có khả năng hình thành nốt sần ở pH rộng hơn từ 4,6 đến 7,5 (Nguyễn Lân Dũng,
2003).

D
Hình 2.5 Cơ chế tạo nốt sần trên cây họ Đậu; A) Vi khuẩn hiện diện xung quanh rễ
b) Sự xâm nhập của vi khuẩn qua vết thương; C) Sự hình thành nốt sần; D) Nốt sần

(www.britannica.com)
Tính đặc hiệu là một đặc điểm quan trọng trong quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn
nốt sần và cây họ đậu. Một loài vi khuẩn chỉ có khả năng cộng sinh với một hoặc vài
loài đậu. Cũng có một số loài vi khuẩn có khả năng hình thành nốt sần ở cây đậu
không đặc biệt với nó nhƣng số lƣợng nốt sần ít và khả năng cố định nitơ kém. Tuy
nhiên đặc tính này giúp cho vi khuẩn có thể tồn tại ở những nơi không có cậy đậu đặc
biệt với nó. Tính đặc hiệu giữa cây đậu và vi khuẩn đƣợc quyết định bởi hệ gen của
10

chúng. Bởi vậy ngƣời ta có thể cải biến tính đặc hiệu này bằng các tác nhân đột biến
hoặc có thể dùng kỹ thuật di truyền để cải biến hệ gen quy định đặc hiệu cộng sinh (Lê
Xuân Phƣơng, 2001).
2.5. Ly trích DNA và phản ứng PCR ( Polymease Chain Reaction)
2.5.1 Ly trích DNA
Phƣơng pháp tách chiết DNA gồm có 3 bƣớc:
Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote). Thông thƣờng
ngƣời ta nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl) và proteinase
(proteinase K).
Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein. Mẫu đƣợc lắc thật mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform, dung
dịch phenol: chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không làm hòa
tan nucleic acid.
Bƣớc 3: Tủa acid nucleic nhằm thu nhận acid nucleic dƣới dạng cô đặc đồng
thời bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác để có thể hòa tan
chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn.
Có 2 cách tủa DNA đó là tủa trong ethanol (có muối), tủa trong isopropanol
(không muối).
Thu nhận acid nucleic lại bằng cách ly tâm. Sau đó, kết tủa đƣợc rửa trong
ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc các dấu vết của ethanol còn dính trên mẫu (Hồ
Quỳnh Thùy Dƣơng, 2008).
2.5.2 Phản ứng PCR
2.5.2.1 Khái niệm
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các
đoạn DNA với tốc độ nhanh, chính xác cao đƣợc thực hiện trên máy luân nhiệt.
Kỹ thuật PCR đƣợc Karry Mullis phát minh năm 1985 và đƣợc tiếp thu hoàn thiện
thông qua việc phát hiện và sản xuất đƣợc enzyme DNA polymerase chịu nhiệt từ vi
khuẩn Thermophilus aquaticus và một số vi khuẩn khác ( Trịnh Đình Đạt, 2006)

PCR đƣợc dựa trên cách sử dụng khả năng của DNA polymerase để tổng hợp sợi
DNA mới bổ sung cho sợi mẫu đƣợc cung cấp (www.ncbi.nlm.nih.gov).
2.5.2.2 Nguyên lý
11


Kỹ thuật tổng hợp DNA cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép
DNA trong cơ thể nhƣ đoạn DNA cần nhân bản mở xoắn thành 2 mạch đơn, các cặp
mồi (mồi xuôi, mồi ngƣợc), enzyme DNA polymerase, nguyên liệu cũng nhƣ điều
kiện môi trƣờng thích hợp. Tuy nhiên, khác ở chổ dùng nhiệt độ cao (94 oC) để tháo
xoắn thay cho enzyme helicase kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt và
hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với
các đoạn mồi đƣợc thiết lập chủ động. Nhờ kỹ thuật PCR mà với lƣợng nhỏ DNA
ban đầu ta có thể đủ lƣợng DNA cần thiết để tiến hành các thí nghiệm DNA (Trịnh
Đình Đạt, 2006)
2.5.2.3 Các giai đoạn phản ứng
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau và mỗi chu kì gồm ba
bƣớc sau:
Bƣớc 1: Giai đoạn biến tính
Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao
chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thƣờng là
94oC – 95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút.
Bƣớc 2: Giai đoạn lai
Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với
khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi
sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài
Nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là
polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của
trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Mỗi chu kỳ

gồm 3 bƣớc nhƣ trên, lặp lại 25 đến 50 lần tùy thuộc mục đích, yêu cầu nghiên cứu.
Tuy nhiên, nếu thời gian kéo dài quá 30 chu kỳ thì khả năng sai xót sẽ tăng theo. Số
lƣợng bản sao sau n chu kỳ là a 2n (a là số đoạn khuôn DNA) (Hồ Quỳnh Thùy
Dƣơng, 2008).

12


Hình 2.6 Các bƣớc trong phản ứng PCR
(www.flmnh.ufl.edu)
2.5.2.4 Thành phần của phản ứng PCR
Mẫu DNA - DNA mẫu chứa các chuỗi mục tiêu. Vào lúc bắt đầu phản ứng,
nhiệt độ cao đƣợc áp dụng cho các phân tử DNA sợi đôi ban đầu tách sợi từ mỗi khác.
DNA polymerase - một loại enzyme tổng hợp sợi DNA bổ sung cho trình tự
mục tiêu. Việc đầu tiên và đƣợc sử dụng phổ biến nhất của các enzym này là Taq
DNA polymerase (từ Thermis aquaticus), trong khi đó DNA polymerase PFU (từ
Pyrococcus furiosus) đƣợc sử dụng rộng rãi bởi vì độ trung thực cao hơn của nó khi
sao chép DNA. Mặc dù các enzyme này là tinh tế khác nhau, cả hai đều có hai khả
năng mà làm cho họ thích hợp cho PCR; chúng có thể tạo ra các sợi ADN mới bằng
cách sử dụng một mẫu DNA và mồi, và khả năng chịu nhiệt.
Mồi – đoạn ngắn DNA sợi đơn đƣợc bổ sung trình tự mục tiêu. Polymerase bắt
đầu tổng hợp ADN mới từ cuối đoạn mồi (www.ncbi.nlm.nih.gov). Mồi là chỉ tiêu
quan trọng nhất để đạt đƣợc một sự khuếch đại đặc trƣng và có hiệu quả.
Nucleotides (các dNTP hoặc triphosphate deoxynucleotide): gồm 4 loại dATP,
dTTP, dCTP, dGTP là những nguyên liệu tham gia tạo DNA mạch mới.
Mg++ cũng là nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến quá trình PCR (Hồ Quỳnh Thùy
Dƣơng, 2008)
Dung dịch đệm (buffer): Thành phần dung dịch đệm phản ứng PCR thƣờng phụ
thuộc vào loại enzyme DNA polymerase sử dụng trong PCR (Trịnh Đình Đạt, 2006).
13

Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 1/1/2012 đến ngày 7/7/2012 tại Viện Nghiên
cứu Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh,
khu phố 6, Phƣờng Linh Trung, Quận Thủ Đức, Tp Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Giống đậu xanh APN 208 của Công ty An Phú Nông.
Vi khuẩn cố định đạm chi Bradyrhizobium đã đƣợc xác định bằng sinh hóa từ
trƣớc và đƣợc kí hiệu nhƣ bảng 3.1 sau:
Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu và địa chỉ thu thập mẫu
STT

Kí hiệu

Địa chỉ lấy mẫu

1

X4

Thủ Đức – HCM

2

M2.6

Châu Thành - Tây Ninh

3

A3.2.I

Đăk Lăk

4

A3.2.II

Đăk Lăk

5

H1

Hóc Môn – HCM

6

H3

Hóc Môn – HCM

7

H7

Hóc Môn – HCM

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng
3.2.2.1 Thiết bị và dụng cụ
Tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp.
Ống nghiệm, đèn cồn, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại ống đong.
Đĩa petri, micropipette, cân, kính hiển vi, eppendoft 0,2 ml, eppendoft 1,5 ml.
Que cấy: que cấy thẳng, que cấy vòng, que cấy trang.
Máy nƣớc cất, máy lắc, máy Vortex, máy ly tâm.
Máy PCR, máy điện di, bồn ủ nhiệt.

14