SO SÁNH KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ COLIFORMS TRONG MẪU THỊT BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRÊN MÀNG PETRIFILM VÀ PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRUYỀN THỐNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
SO SÁNH KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG TỔNG VI KHUẨN
HIẾU KHÍ VÀ COLIFORMS TRONG MẪU THỊT BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRÊN MÀNG PETRIFILM
VÀ PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRUYỀN THỐNG

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ HỒNG TRÂM

Niên khóa

: 2008 - 2012

Tháng 7/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
SO SÁNH KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG TỔNG VI KHUẨN

HIẾU KHÍ VÀ COLIFORMS TRONG MẪU THỊT BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRÊN MÀNG PETRIFILM
VÀ PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRUYỀN THỐNG

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGUYỄN THỊ HỒNG TRÂM

Tháng 7/2012
2


LỜI CẢM ƠN
Để có điều kiện học tập và hoàn tất cuốn luận vặn tốt nghiệp tôi xin chân thành
gửi lời cảm ơn tới:
Ban giám hiệu Đại học Nông Lâm TPHCM, ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ
Sinh học, cùng tất cả các quý thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích
trong suốt quá trình học tập tại trƣờng
Tiến sĩ Nguyễn Tiến Dũng đã tận tình hƣớng dẫn và tạo điều kiện để tôi thực
hiện đề tài một cách tốt nhất
Thạc sĩ Võ Văn Giàu đã giúp đỡ tôi rất nhiều để hoàn thành tốt luận văn này
Thầy cô tại viện Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trƣờng đã giúp đỡ, hỗ trợ cho
tôi trong quá trình thực hiện đề tài này
Cùng tất cả các bạn lớp DH08SH nói chung và các thành viên của lớp làm đề tài
tại viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng nói riêng đã chia sẻ những khó khăn, vui
buồn đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài cũng nhƣ trong suốt 4 năm học tại

trƣờng
Cha mẹ và gia đình đã không quản gian khó nuôi dƣỡng, dạy dỗ, luôn dành
những điều kiện tốt nhất và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi.

Trân trọng
NGUYỄN THỊ HỒNG TRÂM

i


TÓM TẮT
Mục tiêu của đề tài là đánh giá hiệu lực quy trình phân tích tổng số vi sinh vật
hiếu khí và Coliforms trên các màng petrifilm đƣợc sản xuất bởi công ty 3M - Mỹ. Các
chủng vi sinh dùng cho việc đánh giá đƣợc phân lập từ các mẫu thịt lấy ở các chợ trên
địa bàn quận Thủ Đức. Việc đánh giá hiệu lực đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn tại tiêu
chuẩn ISO 16140:2003.
Để tạo bộ sƣu tập chủng phục vụ cho việc đánh giá, đề tài đã phân lập đƣợc 15
chủng Coliforms nhiễm tự nhiên trong các loại thực phẩm. Quá trình phân lập và định
danh đƣợc thực hiện theo quy trình của ISO 3832:2006.
Những kết quả đánh giá cho thấy, đối với chỉ tiêu Coliforms, độ đặc hiệu của
phƣơng pháp phân tích trên màng Petrifilm CC tƣơng đƣơng với phƣơng pháp phân
tích truyền thống theo ISO 4833:2003. Sau khi nuôi cấy 24 giờ, khuẩn lạc Coliforms
trên petrifilm CC có khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, bên cạnh khuẩn lạc có bọt khí.
Kết quả xác định giá trị giới hạn định lƣợng (LOQ – limit of quantitation) của
phƣơng pháp phân tích coliforms sử dụng màng Petrifilm CC là tƣơng đƣơng với giới
hạn định lƣợng của phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng VRB theo ISO 3832:2006.
Đối với chỉ tiêu tổng khuẩn hiếu khí, phƣơng pháp nuôi sử dụng màng Petrifilm có
LOQ cao hơn phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng PCA (Plate Count Agar) theo tiêu
chuẩn ISO 4832:2006.
Kết quả đánh giá độ lặp lại khi định lƣợng coliforms bằng petrifilm CC và định

lƣợng tổng vi sinh vật hiếu khí bằng petrifilm TPC cho thấy các phƣơng pháp này có
độ lặp lại tốt hơn so với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống.
Đề tài cũng đã áp dụng phƣơng pháp dùng màng petrifim TPC song song với
phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống theo ISO 8432:2006 để phân tích tổng số vi sinh
vật hiếu khí trên 15 mẫu thịt heo thu nhận từ địa bàn quận Thủ Đức. Kết quả nhận
đƣợc cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa hai phƣơng pháp.

ii


SUMMARY
The objective of the research was to evaluate the effectiveness of the method
that analysis total aerobic bacteria and Coliforms on petrifilm membranes were
produced by 3M Company - USA. The bacteria strains used for the validation process
were isolated from food samples collected from markets in the Thu Duc district. The
validation process is performed according to instructions by ISO 16140:2003 standard.
Fifteen strains of Coliforms from naturally infected food samples have been
isolated for use in these validation processes. The protocol of isolation and
identification is followed the ISO 3832:2006 standard.
For coliforms criteria, the validation results show that, specificity of the
methods that using Petrifilm membrane is equivalent to cultural methods according to
ISO 4833:2003. After 24 hours culture, Coliforms colonies on Petrifilm membranes
are red to dark red with gas bubbles beside.
The result of validation process show that limit of quantification (LOQ) of the
method for coliforms determination using Petrifilm CC is equivalent to quantification
limit of the culture method using VRB agar medium according to ISO 3832:2006. For
total aerobic bacteria, LOQ of Petrifilm method is higher than LOQ of cultural method
using Plate Count Agar (PCA) according to ISO 4832:2006.
The results of the evaluation for accuracy by repeatability of the method for
determination of coliforms by Petrifilm CC and the method for determination of total

aerobic bacteria in food by Petrifilm TPC show that repeatability of these method are
better than the culture methods according to ISO 4833:2003 and ISO 4832:2006.
This thesis also applied the method using petrifilm TPC as the same time as the
cultural method according to ISO 8432:2006 to analyze the total aerobic bacteria on 15
pork samples from markets in Thu Duc District. The result showed that there was no
difference between two methods.

iii


MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................................ viii
1.1.

Đặt vấn đề ............................................................................................................1

1.2.

Yêu cầu của nghiên cứu ......................................................................................2

1.3.

Nội dung cần thực hiện .......................................................................................2

Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................3
2.1.

Tổng quan về tổng số vi khuẩn hiếu khí .............................................................3

2.2.

Tổng quan về Coliforms ......................................................................................3

2.2.1.

Định nghĩa Coliforms ......................................................................................3

2.2.2.

Nguồn gốc Coliforms .......................................................................................4

2.2.3. Phân loại Coliforms ..........................................................................................4
Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu Coliforms ..................................................5

2.2.5.
2.3.

Phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống....................................................................5

2.3.1.

Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc ............................................................................6

2.3.2.

Uớc đoán số lƣợng vi sinh bằng kỹ thuật MPN (Most Probable Number) .....7

2.4.

Kỹ thuật nuôi cấy trên màng Petrifilm ................................................................8

2.4.1.

Giới thiệu chung về màng Petrifilm.................................................................8

2.4.2.

Giới thiệu test thử nhanh 3M Petrifilm ..........................................................8

2.5.

Một số khái niệm trong quy trình xác nhận hiệu lực phƣơng pháp ..................10

Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................11
3.1.

Thời gian và địa điểm thực hiện ........................................................................11

3.2.

Nguyên vật liệu .................................................................................................11

3.2.1.

Chủng thuần và mẫu thực phẩm ....................................................................11

3.2.2.

Thiết bị và dụng cụ chính...............................................................................11

3.2.3.

Môi trƣờng và hóa chất ..................................................................................11

3.2.3.1.

Môi trƣờng ..................................................................................................11

3.2.3.2.

Hóa chất ......................................................................................................12

3.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................12

3.3.1.

Phƣơng pháp phân lập Coliforms ..................................................................12

3.3.2.

Phƣơng pháp gây nhiễm các chủng Coliforms vào mẫu thực phẩm .............13

3.3.3.

Phƣơng pháp xác định giới hạn định lƣợng của các chủng Coliforms ..........14

iv


3.3.3.1.

Giới hạn định lƣợng trên chủng thuần ........................................................14

3.3.3.2.

Giới hạn định lƣợng trên mẫu.....................................................................15

3.3.4.

Phƣơng pháp xác định độ đặc hiệu ................................................................16

3.3.5.

Phƣơng pháp xác định độ lặp lại ....................................................................16

3.3.6.

Xác định giới hạn định lƣợng tổng số vi khuẩn hiếu khí ...............................17

4.1. Phân lập các chủng Coliforms ..............................................................................18
4.2. Độ đặc hiệu trong phân tích Coliforms ................................................................19
4.3. Giới hạn định lƣợng trong phân tích Coliforms ...................................................23
4.3.1. Giới hạn định lƣợng của các chủng Coliforms ..................................................23
4.3.1.1. Với chủng vi khuẩn thuần ..............................................................................23
4.3.1.2.
4.3.2.

Giới hạn định lƣợng trên mẫu.....................................................................24
Giới hạn định lƣợng vi khuẩn hiếu khí ..........................................................25

4.4. Độ lặp lại trong phân tích Coliforms ....................................................................26
4.4.2. Độ lặp lại trong phân tích vi khuẩn hiếu khí .....................................................27
4.5. Thử phân tích trên đối tƣợng tổng khuẩn hiếu khí ...............................................28
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................29
5.1. Kết luận.................................................................................................................29
5.2. Đề nghị .................................................................................................................29

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACP

Aerobic Count Plate

BGBL

Brilliant Green Bile Lactose Broth

BHI

Brain heart infusion

CC

Coliform Count Plate

LSB

Lauryl Sulphate Broth

MR

Phản ứng thử Methyl Red

MRVP

Methyl Red Voges- Prokauer

PCA

Plate Count agar

SPW

Saline Peptone Water

TSA

Tryptone Soya Agar

VP

Phản ứng thử Voges- Prokauer

VRB

Violet Red Bile Agar

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang

Bảng 2.1 Tính chất sinh hóa của Coliforms .................................................................... 5
Bảng 3.1 Các phản ứng sinh hóa đặc trƣng của Coliforms........................................... 14
Bảng 4.1 Kết quả phân lập của các chủng Coliforms ................................................... 24
Bảng 4.2 Đặc điểm khuẩn lạc của các loại Escherichia coli khác nhau ....................... 26
Bảng 4.3 Đặc điểm khuẩn lạc của các loại Citrobacter khác nhau ............................. 26
Bảng 4.3 Đặc điểm khuẩn lạc của các loại Enterobacter khác nhau ............................ 27
Bảng 4.5 Đặc điểm khuẩn lạc của các loại Klebsiella khác nhau ................................ 29
Bảng 4.6 Kết quả giới hạn định lƣợng của hai chủng K2 và E2 thuần ....................... 29
Bảng 4.7 Kết quả xác định giới hạn định lƣợng trên mẫu của chủng K2 và E2 .......... 30
Bảng 4.8 Kết quả giới hạn định lƣợng của tổng khuẩn hiếu khí .................................. 31
Bảng 4.9 Kết quả độ lặp lại của Coliforms tổng số ...................................................... 32
Bảng 4.10 Kết quả độ lặp lại của tổng khuẩn hiếu khí ................................................. 34
Bảng 4.11 Kết quả đếm khuẩn lạc trong thử phân tích tổng khuẩn hiếu khí ............. 35

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang

Hình 1.1 Các bƣớc thao tác với màng 3M Petrifilm..................................................... 10

Hình 4.1 Một số hình ảnh thử sinh hóa của các chủng Coliforms ............................... 25
Hình 4.2 Hình ảnh khuẩn lạc của các chủng Coliforms .............................................. 28

viii


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề luôn đƣợc sự quan tâm đặc biệt của các cơ

quan chức năng và toàn xã hội trong những năm gần đây, đƣợc tiếp cận với thực phẩm
an toàn đang trở thành quyền cơ bản đối với mỗi con ngƣời. Ngộ độc thực phẩm không
chỉ gây tác động trực tiếp đến sức khỏe của ngƣời sử dụng mà còn ảnh hƣởng đến sự
phát triển, an ninh xã hội.
Có nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhƣ ngộ độc
vật lý do các hoạt chất phóng xạ, ngộ độc hóa học do hàm lƣợng lớn các chất hóa học
gây độc có trong thực phẩm, ngộ độc sinh học với nguồn gốc là từ các vi sinh vật gây
độc, từ động vật, hay thực vật có chứa độc tố. Trong số các nguyên nhân này thì ngộ
độc thực phẩm do vi sinh vật gây nên chiếm tỷ lệ cao nhất ( Cục an toàn vệ sinh thực
phẩm, 2012)
Việc biết đƣợc các chủng loại vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong thực phẩm là
một việc hết sức cần thiết để chẩn đoán và điều trị một cách chính xác các trƣờng hợp
ngộ độc, hoặc mắc bệnh do vi sinh vật có trong thực phẩm gây ra kịp thời. Cho đến nay
đã có nhiều sự cải tiến các phƣơng pháp chẩn đoán để có thể xác định nhanh chóng
nguyên nhân gây bệnh giúp dễ dàng hơn trong việc kiểm soát và điều trị ngộ độc do vi
sinh vật. Tiếp nối cho xu hƣớng cải tiến này phƣơng pháp phân tích vi sinh vật trên
màng Petrifilm ngày càng đƣợc quan tâm. Do những lợi thế trong sử dụng, nhƣ khả
năng cho kết quả phân tích nhanh chóng vi sinh vật mà màng Petrifilm ứng dụng ngày

càng nhiều. Tuy nhiên, hiệu quả của kỹ thuật này phải đƣợc đánh giá để đảm bảo sự
khả dụng cũng nhƣ an toàn cho ngƣời sử dụng.
Tổng số vi sinh vật hiếu khí và Coliforms tổng số là các chỉ tiêu vi sinh vật
thƣờng đƣợc yêu cầu phân tích để đánh giá mức độ an toàn của thực phẩm. Đây là
nhóm đối tƣợng đƣợc sử dụng trong đề tài để nghiên cứu đánh giá hiệu lực của phƣơng
pháp sử dụng màng Petrifilm so với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống.
Xuất phát từ những yêu cầu trên, đề tài" So sánh kết quả định lượng tổng vi
khuẩn hiếu khí và Coliforms trên mẫu thịt bằng phương pháp nuôi cấy trên màng
Petrifilm và phương pháp nuôi cấy truyền thống" đã đƣợc thực hiện.

1


1.2.

Yêu cầu của nghiên cứu
So sánh giữa phƣơng pháp nuôi cấy trên màng Petrifilm và phƣơng pháp nuôi

cấy truyền thống theo ISO 4833 từ đó có thể đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp nuôi
cấy trên màng Petrifilm.
1.3.

Nội dung cần thực hiện
Xác định giới hạn định lƣợng, độ đặc hiệu, độ lặp lại của phƣơng pháp nuôi cấy

trên màng Petrifilm so với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống.
Áp dụng phƣơng pháp nuôi cấy trên màng Petrifilm để khảo sát số mẫu thực
phẩm đối chiếu với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống

2

Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Tổng quan về tổng số vi khuẩn hiếu khí
Chỉ số này còn có các tên gọi khác là: số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm trên

đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa chuẩn. Chỉ tiêu này đƣợc dùng để đánh giá
mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và sản phẩm. Từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh và
các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hƣ hỏng của sản phẩm.
Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật phát triển và hình thành khuẩn lạc trong
điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong
mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm, đánh giá chất lƣợng của mẫu về vi sinh
vật, mức độ tạp nhiễm của mẫu về nguyên liệu và về sản phẩm, nguy cơ hƣ hỏng, thời
gian bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản thực
phẩm. Sự tăng trƣởng của vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm dẫn đến biến đổi chất
lƣợng, 106 tế bào/g(ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hƣ hỏng hay
không tuy nhiên một vài trƣờng hợp vi sinh vật ở mức 106 tế bào/g(ml) chƣa có dấu
hiệu hƣ hỏng rõ ràng về mặt hóa học, đặc biệt là ở sữa (Nguyễn Tiến Dũng, 2007).
Tổng số vi sinh vật hiếu khí đƣợc đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu
khí ở 30oC trong 72 giờ ± 6 giờ.
Chỉ số này đƣợc xác định bằng cách đếm khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch
dinh dƣỡng từ một lƣợng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là một sinh khối
phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và đƣợc biểu diễn dƣới dạng số đơn vị hình
thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lƣợng thực phẩm.
2.2.

Tổng quan về Coliforms

2.2.1. Định nghĩa Coliforms
Coliforms là nhóm vi sinh vật chỉ thị vì số lƣợng hiện diện của chúng trong thực
phẩm, nƣớc hay các loại mẫu môi trƣờng đƣợc dùng nhƣ dấu hiệu chỉ thị khả năng hiện
diện của vi sinh vật gây bệnh khác. Theo một định nghĩa khác, Coliforms có nghĩa là
các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong canh trƣờng Brilliant Green Lactose
Bile Salt (BGBL) ở 37oC trong 24 - 48 giờ.

3


2.2.2. Nguồn gốc Coliforms
Năm 1880, Von Fritsch mô tả Klebsiella pneumoniae và Klebsiella
rhinoscleromatis nhƣ là vi sinh vật đặc trƣng đƣợc tìm thấy trong phân ngƣời
(Geldreich, 1978).
Vào năm 1885, Escherich mô tả Coli Bacillus, sau đó năm 1919 Castellani và
Chalmers đổi tên thành Escherichia coli.
Năm 1885 Percy và Grace Frankland lần đầu tiên kiểm tra vi khuẩn thƣờng gặp
trong nƣớc ở London, sử dụng môi trƣờng gelatin rắn của Robert Koch để đếm vi
khuẩn (Hutchinson và Ridgway, 1977).
Năm 1892, Schardinger đã đề xuất “ vi khuẩn E.coli” là một thành phần đặc trƣng
của hệ vi sinh vật trong phân. Sự hiện diện của nó trong nƣớc có thể chỉ thị nhƣ một
dấu hiệu của sự ô nhiễm phân và đó cũng là tiềm năng của các tác nhân gây bệnh.
Năm 1893, vi khuẩn coli đƣợc đếm bằng phƣơng pháp Wurtz từ mẫu nƣớc xi mạ
trực tiếp trên môi trƣờng thạch lactose. Đây là cơ sở của các khái niệm sản xuất acid và
khí với sự ra đời của ống Durham (Durham, 1893).
Năm 1905, MacConkey mô tả MacConkey's broth, chẩn đoán vi khuẩn lên men
lactose có khả năng sử dụng muối mật.
Winslow và Walker vào năm 1907 tuyên bố các quan sát quan trọng của vi khuẩn
E.coli phần lớn có nguồn gốc từ phân, một số Coliforms không có nguồn gốc từ phân.
Tiếp đó, các hệ thống phân loại khác nhau cho Coliforms đã nổi lên. Sớm nhất là

Mac Conkey trong năm 1909, công nhận 128 các loại Coliforms khác nhau, trong khi
Bergey và Deehan năm 1908 xác định 256 loại. Đến đầu năm 1920, sự khác biệt của
Coliforms đã cho một loạt các tƣơng quan cho sản xuất Indol, hóa lỏng gelatin, lên men
đƣờng sucrose và phản ứng Voges- Proskauer nằm trong số các kiểm tra quan trọng để
xác định bị nhiễm phân (Hendricks, 1978). Những phát triển lên đến đỉnh điểm trong
kiểm tra IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Prokauer và Citrate) cho sự phân biệt các
chủng Coliforms khác nhau (Parr, 1938).
2.2.3. Phân loại Coliforms
Dựa vào nhiệt độ tăng trƣởng, Coliforms đƣợc chia làm 2 nhóm nhỏ là
Coliforms và Coliforms phân. Coliforms phân đƣợc quan tâm nhiều hơn có nguồn gốc

4


từ ruột ngƣời và các động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia với một số
loài đó là Escherichia coli, Klebsiella và Enterobacter
2.2.4. Đặc điểm Coliforms
Đặc điểm chung của Coliforms tổng số là nhóm vi sinh vật hiếu khí tùy nghi,
thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, có hình que, có khả năng sinh acid,
sinh hơi, lên men lactose từ nguồn carbon này trong vòng 24 - 48 giờ ở nhiệt độ 37oC.
Đặc điểm sinh hóa của Coliforms là có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng
48 giờ khi đƣợc ủ ở 37oC trong môi trƣờng canh BGBL. Coliforms chịu nhiệt là những
Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi đƣợc ủ ở 44oC
trong môi trƣờng canh Escherichia coli Broth. Coliforms phân (Feacal Coliforms hay
E. coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh Indol khi đƣợc ủ ở 44,5oC
khoảng 24 giờ trong canh trypton.
Bảng 2.1 Tính chất sinh hóa của Coliforms
Phản ứng

Indol

Methyl red

Voges Proskauer

Citrate

Escherichia

+(-)

+

-

-

Citrobacter

-(+)

+

-

+

Klebsiella

-(+)

-

+

+

Enterobacter

-(+)

-

+

+

+ phản ứng dương tính, - phản ứng âm tính, +(-): đa số là phản ứng dương tính và -(+): đa số
là phản ứng âm tính.

2.2.5. Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu Coliforms
Coliforms đƣợc xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị. Số lƣợng hiện diện của chúng
trong thực phẩm, nƣớc đƣợc dùng để chỉ thị cho khả năng hiện diện của vi sinh vật gây
bệnh khác. Coliforms chịu nhiệt là thành phần trong hệ vi sinh vật đƣờng ruột ở ngƣời
và các động vật máu nóng. Đƣợc xem là vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá
trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nƣớc uống cũng nhƣ chỉ sự ô nhiễm
phân trong môi trƣờng (Nguyễn Tiến Dũng, 2008).
2.3. Phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống
Phƣơng pháp nuôi cấy có 2 cách định lƣợng, phƣơng pháp đếm khuẩn lạc và
phƣơng pháp ƣớc đoán số lƣợng vi khuẩn (MPN). Để đảm bảo độ chính xác khi định

lƣợng bằng các phƣơng pháp nuôi cấy yêu cầu các tế bào phải tách rời nhau.
5


2.3.1. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc
Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc dựa trên nguyên tắc một tế bào có thể phân chia
theo cấp số nhân đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể nhìn thấy đƣợc bằng mắt
thƣờng. Các tế bào ở phase tăng trƣởng hay giai đoạn sớm của phase ổn định đều có
khả năng hình thành khuẩn lạc. Do đó, số lƣợng khuẩn lạc đếm đƣợc gần tƣơng đƣơng
với số lƣợng tế bào sống (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2006).
Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa đƣợc sử dụng rất phổ biến. Agar thƣờng
đƣợc thêm vào môi trƣờng nuôi cấy, có tác dụng làm đặc môi trƣờng. Ngoài ra cũng có
một số tác nhân làm đặc môi trƣờng khác nhƣ silica gel. Các mẫu nuôi cấy đƣợc pha
loãng sau đó cấy trải lên bề mặt môi trƣờng trong quy trình cấy trải hoặc đƣợc phân tán
trong môi trƣờng thạch qua phƣơng pháp cấy đổ đĩa. Đối với vi sinh vật kị khí bắt buộc,
một phƣơng pháp cải biên của phƣơng pháp đổ đĩa ra đời đó chính là phƣơng pháp ống
cuộn. Các đĩa hay các ống sau khi nuôi cấy đƣợc ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian
thích hợp để vi sinh vật phát triển thành những khuẩn lạc có thể nhìn thấy bằng mắt
thƣờng. Số lƣợng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sẽ đƣợc đếm. Mẫu phải đƣợc phân tán
đều trong môi trƣờng hay bề mặt môi trƣờng rắn. Những đĩa có quá nhiều khuẩn lạc thì
không cho số lƣợng đếm chính xác bởi vì chúng có thể chồng lấp lên nhau. Những đĩa
có quá ít khuẩn lạc cũng phải bỏ đi vì không có ý nghĩa về mặt thống kê. Điều kiện và
thời gian nuôi ủ là vấn đề đặc biệt quan trọng. Môi trƣờng cần có các thành phần dinh
dƣỡng khác nhau thích hợp và cần thiết cho sự phát triển của từng loại vi sinh vật khác
nhau. Hàm lƣợng dinh dƣỡng cao và độc tính của môi trƣờng ở mức thấp nhất.
Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc ngày càng đƣợc cải tiến một cách đặc hiệu cho từng
đối tƣợng vi sinh vật khác nhau thông qua cơ chất sử dụng và các điều kiện nuôi ủ.
Kỹ thuật này gồm các bƣớc sau:
Chuẩn bị dung dịch pha loãng: một số dung dịch thƣờng sử dụng nhƣ nƣớc
muối sinh lý và dịch pepton water là dung dịch pha loãng đƣợc sử dụng nhiều nhất và

đƣợc xem là dung dịch pha loãng cho tất cả các loại mẫu.
Chuẩn bị các dãy nồng độ pha loãng mẫu: đối với chất lỏng, trƣớc khi pha loãng
mẫu cần phải lắc kỹ (votex), hút ra 1 ml cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha
loãng để đƣợc nồng độ 10-1, trộn đều hút 1 ml cho vào ống nghiệm mới chứa 9 ml dung
dịch pha loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng tiếp theo. Cứ tiếp tục nhƣ vậy cho đến khi
6


đạt đƣợc mật độ pha loãng mong muốn. Đối với các mẫu bán rắn hay bán lỏng, các thao
tác đƣợc tiến hành nhƣ sau: cân 10 g mẫu vào các túi PE vô trùng hay các máy xay vô
trùng, thêm 90 ml dung dịch pha loãng và đồng nhất mẫu trong 30 giây. Sau khi mẫu đã
đồng nhất ta đƣợc dung dịch pha loãng 10-1.
Cấy mẫu vào môi trƣờng: một số phƣơng pháp cấy mẫu cơ bản nhƣ phƣơng
pháp đổ đĩa, cấy mẫu bề mặt đƣợc trình bày cụ thể nhƣ sau
Phƣơng pháp đổ đĩa: môi trƣờng agar đƣợc đun chảy và đƣợc giữ ấm trong bể
điều nhiệt 45oC. Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mỗi dung dịch pha loãng cho vào giữa
đĩa petri vô trùng. Mỗi độ pha loãng thƣờng cấy vào hai đĩa petri hay nhiều hơn tùy yêu
cầu cụ thể của từng phƣơng pháp. Đổ môi trƣờng vào, lắc 5 lần theo chiều kim đồng hồ
và 5 lần ngƣợc chiều kim đồng hồ, đặt đĩa lên mặt phẳng ngang đến khi môi trƣờng
trong đĩa đông đặc. Lật ngƣợc đĩa và ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian xác định.
Cấy mẫu bề mặt: trải đều một thể tích mẫu phù hợp lên môi trƣờng đã đông đặc
bằng que cấy trang hay que cấy vòng. Ủ các đĩa đã cấy ở điều kiện nhiệt độ và thời gian
phù hợp. Đếm khuẩn lạc đặc trƣng hay tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.
Đếm khuẩn lạc: đối với phƣơng pháp cấy trang hay cấy đổ đĩa, đếm tất cả các
khuẩn lạc đơn lẻ trong các đĩa cấy đã chọn, thƣờng chọn các đĩa có số lƣợng khuẩn lạc
trong khoảng 30 - 300 CFU/ml. Tính toán số đơn vị hình thành khuẩn lạc theo công
thức thống kê dựa trên thể tích mẫu cấy, số lƣợng khuẩn lạc trên các đĩa, độ pha loãng
đã cấy và số lƣợng đĩa của mỗi độ pha loãng. Thông thƣờng số đơn vị hình thành khuẩn
lạc trong 1 g mẫu hay 1 ml đƣợc tính toán ít nhất từ hai độ pha loãng liên tiếp của mẫu.
Kết quả đƣợc biểu diễn dƣới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc/g (CFU/g)

2.3.2. Uớc đoán số lƣợng vi sinh bằng kỹ thuật MPN (Most Probable Number)

Dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vi sinh vật trong các độ pha
loãng khác nhau của mẫu. Mỗi độ pha loãng đƣợc nuôi cấy lặp lại nhiều lần, thƣờng từ
3 - 10 lần trong các môi trƣờng lỏng đã đƣợc chọn. Các độ pha loãng đƣợc tiến hành
sao cho trong các lần lặp lại có một số lần cho biểu hiện dƣơng tính và một số lần cho
dấu hiệu âm tính. Số lần lặp lại cho dấu hiệu dƣơng tính và âm tính đƣợc ghi nhận để
đối chiếu với bảng thống kê sẽ đƣợc giá trị ƣớc đoán số lƣợng vi sinh vật trong mẫu.
Qui trình MPN cho khoảng tin cậy rất lớn. Qui trình MPN cũng đƣợc sử dụng các môi
trƣờng chọn lọc, không chọn lọc hay môi trƣờng phân biệt. Giống với qui trình đếm đĩa,
7


trong phƣơng pháp MPN, môi trƣờng và nồng độ nuôi cấy cũng đƣợc điều chỉnh để
chọn lọc hay phân biệt các nhóm vi sinh vật với nhau.
2.4.

Kỹ thuật nuôi cấy trên màng Petrifilm

2.4.1. Giới thiệu chung về màng Petrifilm
Thiết kế bằng cách cố định môi trƣờng dinh dƣỡng dạng đông khô vào các màng
mỏng gọi là Petrifilm. Khi sử dụng lớp màng bảo vệ bên trên đƣợc nâng lên và nhỏ 1
ml dịch mẫu sau đó đậy lại. Mỗi đĩa Petrifilm nhựa đƣợc đặt lên màng bảo vệ một
khuôn tròn để mẫu đƣợc dàn đều. Môi trƣờng bên trong sẽ hỗ trợ cho sự phát triển của
vi sinh vật trong thời gian ủ. Có thể đếm trực tiếp số khuẩn lạc xuất hiện trên màng
Petrifilm.
Petrifilm đã đƣợc dùng để kiểm tra nhiều đối tƣợng nhƣ tổng số vi khuẩn hiếu
khí, Coliforms, Coliforms phân, nấm mốc, nấm men. Ƣu điểm của kỹ thuật này là dễ
thao tác, tiết kiệm không gian ủ. Thời gian sử dụng lâu do môi trƣờng đông khô nên dễ
bảo quản và không cần xử lý nhiệt nhƣ phƣơng pháp thông thƣờng. Có thể dùng nƣớc

cất vô trùng để làm ƣớt môi trƣờng đông khô. Sau khi môi trƣờng đông lại có thể dùng
trực tiếp Petrifilm để đếm tạp khuẩn trên bề mặt.
2.4.2. Giới thiệu test thử nhanh 3M Petrifilm
3M petrifilm là một loại đĩa môi trƣờng đông khô chuẩn bị sẵn để nuôi cấy và
đếm vi khuẩn, nấm. Bao gồm: gel tan và đông đặc nhanh trong nƣớc lạnh, các chất dinh
dƣỡng cần thiết và chỉ thị màu.
Ƣu điểm: tiện lợi cho việc sử dụng, không phải trải qua các bƣớc kiểm sinh hóa,
cho kết quả kiểm vi sinh của nguyên liệu cũng nhƣ thành phẩm đƣợc sớm hơn.
Cấu tạo: Gồm một túi đựng các đĩa môi trƣờng, dụng cụ dàn mẫu (spreader), các
dụng cụ và môi trƣờng kèm theo nhƣ: dung dịch pha loãng mẫu, kéo, thìa xúc mẫu vô
trùng, túi xử lý mẫu, pipet, ống nghiệm và giá cắm, cân điện tử, NaOH 1N và HCl 1N.
Bảo quản: các túi chƣa sử dụng ở ≤ 8oC. Sử dụng trƣớc ngày hết hạn ghi trên túi.
Để đạt hiệu quả tốt cần đƣa túi về nhiệt độ phòng trƣớc khi sử dụng. Mở túi theo hƣớng
dẫn. Bảo quản túi còn lại ở chỗ khô ráo, nhiệt độ ≤ 25oC trong vòng 1 tháng.
Pha loãng mẫu theo tỉ lệ 1/10 trong túi đồng nhất mẫu. Sử dụng đệm pepton hoặc
pepton muối để pha loãng mẫu. Không sử dụng nƣớc đệm có citrate, bisulphite hoặc

8


thiosulphate vì ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Đồng nhất mẫu, chỉnh pH trong
khoảng 6 - 8. Sử dụng NaOH 1N cho sản phẩm acid, HCl 1N cho sản phẩm kiềm.

Đặt mẫu lên màng petrifilm maønPetrifilm

Dàn đều mẫu trên màng

Ủ petrifilm, đếm trực tiếp hoặc phân lập

Hình 2.1 Các bƣớc thao tác với màng 3M Petrifilm (Nguyễn Tiến Dũng, 2007)

Quy trình thực hiện với màng 3M Petrifilm đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Bƣớc 1 - Đặt đĩa Petrifilm lên mặt phẳng ngang
Bƣớc 2 - Nâng màng đậy đĩa lên, dùng pipetman nhỏ 1ml mẫu vào giữa đĩa
Bƣớc 3 - Cẩn thận đặt màng phim sao cho không tạo thành bọt khí
Bƣớc 4 - Nhẹ nhàng đặt spreader lên
Bƣớc 5 - Dàn đều mẫu trƣớc khi gel đông đặc. Để yên spreader trong 1 phút
Bƣớc 6 - Nhấc spreader lên
Bƣớc 7- Chú ý làm tuần tự từng đĩa một ủ ấm đĩa đã nuôi cấy ở 37oC ± 1oC
trong 24 giờ. Mỗi chồng để tối đa 20 đĩa.
Bƣớc 8 - Đọc kết quả, nếu không có khuẩn lạc nào xuất hiện sau 24 ± 2 giờ, nếu
có các khuẩn lạc điển hình theo đặc trƣng của từng loại vi khuẩn
Bƣớc 9 - Có thể dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên màng Petrifilm, sử dụng cho
các mục đích khác.
9


2.5.

Một số khái niệm trong quy trình xác nhận hiệu lực phƣơng pháp
Xác nhận hiệu lực phƣơng pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp

bằng chứng khách quan chứng minh rằng phƣơng pháp đó đạt yêu cầu đặt ra. Kết quả
của xác nhận hiệu lực phƣơng pháp có thể sử dụng để đánh giá chất lƣợng, độ tin cậy
của các kết quả phân tích. Đây là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả
phân tích đáng tin cậy
Nhiều thuật ngữ khác nhau đƣợc sử dụng để chỉ khái niệm này nhƣ định trị
phƣơng pháp, thẩm định phƣơng pháp, đánh giá phƣơng pháp, xác nhận giá trị sử
dụng của phƣơng pháp, phê duyệt phƣơng pháp. Tất cả các thuật ngữ nà y đều là
cách gọi khác nhau của xác nhận hiệu lực phƣơng pháp. Sau đây là một số khái
niệm cơ bản trong quy trình xác nhận phƣơng pháp phân tích vi sinh vật:

Ngƣỡng tới hạn (Critical level – LC): mật độ vi sinh vật thấp nhất (khác 0) mà
phƣơng pháp có thể phát hiện đƣợc nhƣng không thể cho một giá trị định lƣợng chính
xác. Dƣới ngƣỡng này, không thể chắc chắn đƣợc mật độ vi sinh vật thật sự khác 0 hay
không. Ở ngƣỡng này, xác suất phƣơng pháp phân tích cho kết quả âm tính giả là 50%.
Giới hạn phát hiện (Limit of detection – LOD): đối với phƣơng pháp định lƣợng,
giới hạn phát hiện là nồng độ vi sinh vật thấp nhất mà phƣơng pháp đó có thể phát hiện
đƣợc ở độ tin cậy 95% nhƣng không thể cho một giá trị định lƣợng chính xác.
Giới hạn định lƣợng (Limit of quantification – LOQ): là nồng độ vi sinh vật thấp
nhất thật sự có trong mẫu mà phƣơng pháp có thể định lƣợng đƣợc với một độ chụm
mong muốn
Độ lặp lại (Repeatability - Sr ): chỉ độ chụm đƣợc thực hiện trong những điều
kiện giống nhau, bởi cùng một kiểm nghiệm viên và trong một khoảng thời gian tƣơng
đối ngắn (Trần Cao Sơn và ctv, 2010)
Độ tái lặp (Reproducibility - SR): chỉ độ chụm đƣợc thực hiện bởi các kiểm
nghiệm viên khác nhau ( độ tái lặp nội bộ phòng thử nghiệm hay còn gọi là độ chụm
trung gian) hoặc các phòng thử nghiệm khác nhau (độ tái lặp liên phòng thử
nghiệm)(Trần Cao Sơn và ctv, 2010)

10


Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
Luận văn đƣợc thực hiện từ tháng 02/2012 đến tháng 06/2012 tại phòng thí
nghiệm vi sinh, Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng, trƣờng Đại học Nông Lâm
Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Nguyên vật liệu
3.2.1. Chủng thuần và mẫu thực phẩm
Chủng chuẩn Coliforms: phân lập từ mẫu thịt heo lấy từ các quán bán thức ăn tại
khu vực quận Thủ Đức Thành phố Hồ Chí Minh bằng phƣơng pháp đổ đĩa truyền thống

Mẫu thực phẩm: mẫu thịt heo tƣơi vì đƣợc lấy từ các quán bán thức ăn tại khu
vực Thủ Đức Thành Phố Hồ Chí Minh và các mẫu thịt heo của Vissan lấy từ siêu thị
Coopmart quận Thủ Đức Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ chính
Nghiên cứu sử dụng một số thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm vi sinh nhƣ:
Thiết bị: tủ ủ Stuart Scientific (Anh), cân phân tích (Golo Series), tủ cấy , tủ ấm
(Memmert, Đức), tủ sấy ( Carbolite, Anh), nồi hấp Autoclave
Dụng cụ: ống nghiệm (Trung Quốc), đĩa petri (Germany), que cấy vòng (Việt
Nam), que cấy thẳng (Việt Nam), pipette (Trung Quốc)
3.2.3. Môi trƣờng và hóa chất
3.2.3.1. Môi trƣờng
Saline Pepton Water (SPW, Trung Quốc): dung dịch dùng để pha loãng mẫu
thực phẩm hay huyền phù vi khuẩn
Plate Count agar (PCA, Merck): môi trƣờng định lƣợng tổng khuẩn hiếu khí
Tryptone Soya Agar (TSA, Merck): môi trƣờng giữ giống các chủng Coliforms
Môi trƣờng Violet Red Agar (VRB, Ấn Độ): môi trƣờng định lƣợng Coliforms
Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL, Merck): thử sinh hơi của Coliforms
Canh trypton (Trung Quốc): môi trƣờng thử Indol
Simone Citrate Agar (Merck): thử khả năng sử dụng Citrate của vi khuẩn
Brain heart infusion (BHI, Merck): môi trƣờng tăng sinh các chủng Coliforms
Methyl red Voges- Prokauer (MRVP, Merck): môi trƣờng thử Methyl Red
11


3M Petrifilm trong phân tích Coliforms và phân tích tổng khuẩn hiếu khí
3.2.3.2. Hóa chất
Thuốc thử Kovac’s
Chất chỉ thị Methyl red
Thuốc thử Voges- Prokauer
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

3.3.1. Phƣơng pháp phân lập Coliforms
Quy trình phân lập các chủng Coliforms gồm các bƣớc sau:
Đồng nhất mẫu phân tích: cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0,85% vô trùng (
hoặc H2O vô trùng) vào túi PE vô trùng. Tiến hành đồng nhất mẫu trong vòng 30 giây
thu đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1.
Pha loãng mẫu phân tích: chuẩn bị các ống nghiệm vô trùng. Dùng pipet lấy 9 ml
NaCl 0,85% vô trùng vào các ống nghiệm. Lấy 1 ml từ nồng độ 10-1 cho vào ống
nghiệm thứ nhất. Vortex đều thu đƣợc nồng độ 10-2. Thực hiện tƣơng tự để đƣợc các
nồng độ pha loãng tiếp theo.
Cấy mẫu vào môi trƣờng: chuyển 1 ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri.
Mỗi nồng độ cấy lặp lại ít nhất vào hai đĩa petri, chọn 2 nồng dộ pha loãng liên tiếp để
cấy sao cho sau khi ủ mỗi đĩa xuất hiện dƣới 100 khuẩn lạc. Cho vào mỗi đĩa đã cấy
khoảng 15 ml môi trƣờng VRB đã đƣợc đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở
45oC, trộn đều dịch mẫu với môi trƣờng bằng cách lắc đều đĩa petri xuôi và ngƣợc
chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 - 5 lần. Để trên mặt phẳng ngang, chờ đông đặc. Đổ
thêm 5 ml môi trƣờng VRB lên trên lớp thứ nhất. Chờ cho môi trƣờng trong đĩa đông
đặc, lật ngƣợc đĩa và ủ ở 37oC trong vòng 24 giờ.
Chọn khuẩn lạc đặc trƣng: khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm và
có đƣờng kính > 0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật.
Thử sinh hóa: các phản ứng sinh hóa đặc trƣng của Coliforms gồm Indol, thử
Methyl Red, thử Citrate, Voges – Proskauer đƣợc trình bày cụ thể nhƣ sau
Thử Indol: vi sinh vật thử nghiệm đƣợc nuôi trong môi trƣờng canh trypton
khoảng 24 giờ. Nhỏ vài giọt ether vào canh khuẩn nhằm kéo Indol lên bề mặt một
trƣờng, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s hay Erhlich. Quan sát sau vài phút, phản ứng

12


dƣơng tính nếu trên bề mặt môi trƣờng có vòng màu đỏ. Ngƣợc lại nếu không có sự
xuất hiện của màu đỏ hồng đƣợc coi là phản ứng âm tính

Thử nghiệm methyl red ( MR): nuôi cấy vi sinh vật trong môi trƣờng glucose
phosphate (MR - VP broth) ủ trong khoảng 24 giờ ở 37oC. Thêm vào vài giọt thuốc thử
methyl red. Phản ứng dƣơng tính khi môi trƣờng chuyển sang màu đỏ. Phản ứng âm
tính khi môi trƣờng giữ nguyên màu vàng.
Thử nghiệm Voges – Proskauer (VP): cấy vi sinh vật vào trong môi trƣờng canh
glucose phosphate (MR-VP broth), ủ ở nhiệt độ 37oC trong khoảng 24 giờ. Thêm vào
canh khuẩn sau nuôi cấy 3 ml dung dịch 1-napthol 5% trong cồn, bổ sung thêm 3 ml
dung dịch KOH hay NaOH 40%, lắc mạnh. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút.
Phản ứng VP dƣơng tính khi môi trƣờng chuyển sang màu đỏ hay hồng sáng, phản ứng
VP âm tính khi không có sự chuyển màu.
Thử Citrate: môi trƣờng sử dụng cho quá trình lên men citrate còn chứa muối
vô cơ amonium. Một vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate là nguồn carbon duy nhất
cũng có thể sử dụng ammonium nhƣ là nguồn nitơ duy nhất, amonium bị phân huỷ để
tạo thành amonia, chất này sẽ làm kiềm môi trƣờng nuôi cấy. Để sử dụng cho việc thử
nghiệm citrate, có thể sử dụng môi trƣờng Simmon Citrate Agar hay môi trƣờng lỏng
Koser. Sau khi cấy, ủ ở nhiệt độ 30 - 37oC, quan sát sự phát triển của vi sinh vật và sự
chuyển sang kiềm của môi trƣờng
3.3.2. Phƣơng pháp gây nhiễm các chủng Coliforms vào mẫu thực phẩm
Quy trình thực hiện gồm các bƣớc chính nhƣ sau:
Cấy tăng sinh: cấy các chủng Coliforms vào canh BHI, nuôi ủ 24 giờ ở 37oC.
Pha loãng dịch khuẩn và chọn mật độ pha loãng thích hợp: pha loãng dịch tăng
sinh đến nồng độ thích hợp và cấy 1 ml dịch pha loãng ở mỗi nồng độ đã chọn vào các
đĩa petri, mỗi nồng độ cấy 2 đĩa. Ủ đĩa ở 37oC, 20 giờ. Chọn đếm các đĩa có số khuẩn
lạc nằm trong khoảng 15 - 150 CFU. Tính ra mật độ tế bào ở ống canh khuẩn gốc và
các ống dịch khuẩn pha loãng tƣơng ứng.
Chuẩn bị mẫu thực phẩm: mẫu đã đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp của Health
Protection Agency và khẳng định là không nhiễm Coliform (vi sinh vật mục tiêu). Cân
10 g mẫu vào bao PE vô trùng, pha loãng mẫu với 90 ml SPW. Đồng nhất mẫu.

13

Gây nhiễm mẫu: từ ống gốc BHI đã xác định đƣợc mật độ vi khuẩn, tính toán độ
pha loãng và thể tích dịch khuẩn cần lấy để đƣa vào mẫu. Đồng nhất để huyền phù vi
khuẩn phân bố đều trong dịch mẫu.
3.3.3. Phƣơng pháp xác định giới hạn định lƣợng của các chủng Coliforms
3.3.3.1. Giới hạn định lƣợng trên chủng thuần
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên 2 chủng Coliforms thuần là Klebsiella (K2) và
Escherichia coli (E2) với quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Từ môi trƣờng giữ giống TSA

Dùng que cấy vòng cấy tăng sinh lên môi trƣờng BHI,
ủ ở 37oC trong 24 giờ
Pha loãng đến độ pha loãng thích hợp (khoảng 10-8, 10-9, 10-10), mỗi nồng
độ cấy vào 6 đĩa petrifilm, 6 đĩa VRB. Ủ ở 37oC trong 24 - 48 giờ
Tính số đĩa có khuẩn lạc xuất hiện
Xác định mật độ vi sinh vật tại độ pha loãng có 2 - 4 đĩa có xuất hiện
khuẩn lạc mật độ vi sinh vật đó là LC
Cấy trên đĩa Petrifilm 3 nồng độ, LC, 10LC, 1/10LC( cấy 1ml
và ủ ở 37oC trong 24 - 48 giờ) để xác định LC trên Petrifilm
thuộc nồng độ nào  tính LOD, LOQ
Sơ đồ 3.1 Phƣơng pháp xác định giới hạn định lƣợng
Công thức tính:
; LOD = 3,3x So; LOQ =10 x So
Trong đó: So là giá trị ngƣỡng đặc trƣng cho nền mẫu; LOD (CFU/g): là giới hạn phát
hiện; LOQ (CFU/g): là giới hạn định lƣợng.
14


3.3.3.2. Giới hạn định lƣợng trên mẫu

Thí nghiệm khảo sát trên 2 chủng Coliforms phân lập. Loại nền mẫu thực phẩm
đƣợc chọn là thịt heo. Các mẫu này đã đƣợc kiểm tra trƣớc bằng phƣơng pháp định tính
bằng cách pha loãng tới nồng độ 10-1 sau đó hút 1 ml cho vào môi trƣờng LSBI
(Phƣơng pháp Health Protection Agency) và khẳng định là không nhiễm Coliforms. Thí
nghiệm thực hiện gồm các bƣớc sau:
Chuẩn bị mẫu: với mỗi mẫu, cân một loạt gồm 10 mẫu, mỗi mẫu 10 g vào các túi
PE vô trùng. Mẫu đƣợc pha loãng với 90 g dịch pha loãng SPW. Đồng nhất mẫu
Chuẩn bị dịch huyền phù Coliforms: dịch tăng sinh Coliforms đã xác định đƣợc
mật độ bằng phƣơng pháp đếm đĩa trƣớc đó. Pha loãng dịch tăng sinh ở các độ pha
loãng thích hợp (10-7, 10-8,10-9, 10-10) để đạt đƣợc mật độ tế bào Coliforms ở các mức
10, 20, 30, …, 150, 200 CFU/ml.
Gây nhiễm mẫu: cấy 1 ml dịch huyền phù ở các độ pha loãng khác nhau vào 10
g mẫu thịt heo đã pha loãng. Cấy đồng thời 1 ml dịch pha loãng vào các đĩa petri vô
trùng để kiểm tra lại mật độ Coliforms gây nhiễm. Đồng nhất mẫu với huyền phù vi
khuẩn trong 30 giây.
Cấy mẫu: cấy 1 ml dịch mẫu đã gây nhiễm ở các mật độ vi khuẩn khác nhau vào
đĩa petri vô trùng. Mỗi mẫu cấy lặp lại 6 đĩa (6 đĩa petrifilm và 6 đĩa VRB). Ủ các đĩa
trong điều kiện hiếu khí ở 37oC, 24 giờ.
Đọc và ghi nhận kết quả: đếm số đĩa có khuẩn lạc trong số 6 đĩa cấy từ cùng một
mẫu và ghi nhận kết quả dƣới dạng n/6 (n: số đĩa có khuẩn lạc). Chọn ra mức 3 mật độ
gây nhiễm vào mẫu (ngƣỡng gây nhiễm dƣới, giữa và trên) sao cho tỷ lệ phát hiện
tƣơng ứng với 3 ngƣỡng đạt 0/6 hoặc1/6, 2/6 hoặc 3/6, 5/6 hoặc 6/6.
Xác định giá trị tới hạn ƣớc lƣợng (LC): từ kết quả đếm tỷ lệ (n/6) đĩa có khuẩn
lạc hiện diện ở trên, xác định đƣợc giá trị tới hạn ƣớc lƣợng là mật độ vi khuẩn gây
nhiễm vào mẫu cho tỷ lệ phát hiện là 2/6 đến 4/6 (xác suất khoảng 50%).
Tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp:
LC = 1,65 x S0 (CFU/ khối lƣợng hoặc thể tích mẫu thử).
S0 (threshold hay estimate of spread) là giá trị ngƣỡng.
Giới hạn phát hiện: LOD (CFU/g) = (3,3 x S0)/m hay LOD (CFU/ml) = (3,3 x S0)/v.
Giới hạn định lƣợng: LOQ (CFU/g) = (10 x S0)/m hay LOQ (CFU/ml) = (10 x S0)/v

m : khối lƣợng mẫu thử nghiệm (mẫu rắn), v : thể tích mẫu thử nghiệm (mẫu lỏng).
15