ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC QUI TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI E. COLI VÀ COLIFORMS BẰNG MÀNG PETRIFILM TRÊN MẪU HẢI SẢN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC QUI TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
E. COLI VÀ COLIFORMS BẰNG MÀNG
PETRIFILM TRÊN MẪU HẢI SẢN

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ NGHĨA

Khóa học

: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC QUI TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
E. COLI VÀ COLIFORMS BẰNG MÀNG

PETRIFILM TRÊN MẪU HẢI SẢN

Hướng dẫn khoa học
TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

Tháng 07/2012

Sinh viên thực hiện
NGUYỄN THỊ NGHĨA


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban lãnh đạo Viện Công Nghệ Sinh Học
và Môi Trường - Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã cho phép và tạo
mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi có điều kiện làm nghiên cứu tốt.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Tiến Dũng, người đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này và bước đầu
trong nghiên cứu khoa học.
Tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh,
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã quan tâm, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian
học tập và nghiên cứu tại trường. Xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô đã tận tình
chỉ bảo và truyền lại những kiến thức, kinh nghiệm quí giá trong lĩnh vực công nghệ
sinh học.
Tôi xin chân thành cảm ơn công ty 3M đã hỗ trợ, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt
để tôi có thể nghiên cứu đề tài này.
Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ tôi, người thân
trong gia đình tôi, đây là những người đã nuôi dưỡng, âm thầm theo dõi, động viên
và giúp đỡ tôi có thể hoàn thành tốt 4 năm đại học. Bên cạnh đó tôi đã nhận được rất
nhiều sự giúp đỡ, cổ vũ, động viên của các bạn trong tập thể lớp DH08SH và bạn
Nguyễn Thị Hồng Trâm gắn bó cùng tôi trong suốt đề tài đã cho tôi có động lực để

vượt qua những lúc khó khăn.
Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn đối với mọi sự giúp đỡ quí báu đó.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2012
Sinh viên
Nguyễn Thị Nghĩa

i


TÓM TẮT
Mục tiêu của đề tài là đánh giá hiệu lực quy trình phân tích đồng thời E. coli và
Coliforms trên cùng một màng Petrifilm EC được sản xuất bởi công ty 3M – Mỹ. Các
chủng vi sinh vật dùng cho việc đánh giá được phân lập từ các mẫu cá thương phẩm
ở các chợ trên địa bàn quận Thủ Đức - Tp. Hồ Chí Minh. Việc đánh giá hiệu lực
được thực hiện theo hướng dẫn tại tiêu chuẩn ISO 16140:2003.
Mười hai chủng Coliforms nhiễm tự nhiên trong mẫu thủy sản đã được phân
lập để sử dụng cho quá trình đánh giá này. Quá trình phân lập và định danh được
thực hiện theo quy trình của ISO 3832:2006.
Độ đặc hiệu của phương pháp phân tích Coliforms trong thực phẩm bằng
phương pháp sử dụng màng Petrifilm đã được đánh giá. Quá trình được tiến hành với
12 chủng Coliforms đã được phân lập như trên. Kết quả đánh giá cho thấy khi nuôi
cấy trong khoảng 24 giờ, các dòng Coliforms không thuộc loài E. coli khi nuôi cấy
trên trên màng Petrifilm EC có khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, bên cạnh khuẩn lạc có
bọt khí, các chủng thuộc loài E. coli có khuẩn lạc màu xanh, có bọt khí bên cạnh. Tất
cả các dòng Coliforms đã khảo sát cho kết quả phù hợp với đặc điểm mô tả của nhà
sản xuất.
Quá trình đánh giá cũng đã xác định được giới hạn phát hiện (LOD) của
phương pháp dùng màng Petrifilm EC khi phân tích trên mẫu thủy sản là 6 CFU/g,
với độ tin cậy 95% thì giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp này là 12 CFU/g.
Trong khi đó đối với phương pháp ISO 4832:2006, sử dụng môi trường VRB ( Violet

red bile agar) thì LOD là 12 CFU/g và LOQ là 36 CFU/g. Kết quả này chứng tỏ
phương pháp sử dụng màng Petrifilm EC có độ nhạy phát hiện cao hơn so với
phương pháp sử dụng môi trường VRB agar.
Độ chính xác của phương pháp cũng được đánh giá thông qua độ lặp lại. Kết
quả đánh giá cũng cho thấy độ lặp lại của phương pháp sử dụng màng Petrifilm EC
tốt hơn so với phương pháo nuôi cấy trên môi trường VRB agar.
Đề tài cũng đã thử nghiệm phân tích 20 mẫu thủy sản đồng thời bằng phương
pháp sử dụng màng Petrifilm EC và bằng phương pháp theo hướng dẫn của ISO
3832:2006. Kết quả cho thấy khả năng định lượng Coliforms của hai phương pháp
này là tương đương.
ii


SUMMARY
The objective of the research was to assess the effectiveness of the analysis E.
coli and Coliforms on the same Petrifilm EC plate was manufactured by 3M
Company - United States. The microorganisms used for the evaluation was isolated
from samples of commercial fish in the markets in Thu Duc district – Ho Chi Minh
city. The effective assessment was made under the guidance in ISO 16140:2003.
Isolated 12 strains of Coliforms in naturally infected fish samples were use for
the evaluation process. The process of isolation and identification shall comply with
the process of ISO 3832:2006.
Evaluated the specificity of analytical methods Coliforms in part by method
using Petrifilm plate. The process was conducted with 12 strains of Coliforms have
been isolated as above. Evaluation results show that when grown in about 24 hours,
Coliforms no streams of the species E. coli when cultured on Petrifilm EC plate
colonies red to deep red, next to gas bubbles colonies, the strains of the species E.
coli colonies blue, bubble side. All of the Coliforms used in this study showed the
same characteristics were all the survey results in accordance described by the
manufacturer.

The evaluation process also identified the limit of detection (LOD) of the
Petrifilm EC plate method used when analyzing the sample of fish is 6 CFU / g, with
95% confidence level the limit of quantitation (LOQ) of this method is 12 CFU/g.
Meanwhile, for the ISO 4832:2006 method, using VRB (Violet red bile agar)
medium, the LOD was 12 CFU/g and the LOQ was 36 CFU/g. This result
demonstrates how to use Petrifilm EC plate sensitive detection method than using
VRB agar medium.
The accuracy of the method was essessed through the repeatability. The
assessment results also showed that the repeatability of the method using Petrifilm
EC plate was better than the method culture on VRB agar medium.
Project also analyzed 20 aquatic delirium samples simultaneously using the
method of Petrifilm EC plate and the method following guidance from of ISO
3832:2006. The results showed the ability Coliforms quantitation of the two methods
are equivalent.
iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i
TÓM TẮT ..................................................................................................................... ii
SUMMARY ................................................................................................................. iii
MỤC LỤC.....................................................................................................................iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT..........................................................................vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................................ viii
Chương 1 MỞ ĐẦU....................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
1.1. Yêu cầu ................................................................................................................... 2
1.2. Nội dung.................................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 3

2.1. Tổng quan về Coliforms/E. coli .............................................................................. 3
2.1.1.Tổng quan về Coliforms ....................................................................................... 3
2.1.2. Tổng quan về E. coli ............................................................................................ 4
2.1.2.1. Lịch sử............................................................................................................... 4
2.1.2.2. Phân loại............................................................................................................ 4
2.1.2.3. Đặc điểm hình dạng, nuôi cấy và tính chất sinh hóa tltk .................................. 4
2.2. Các phương pháp phát hiện E. coli/ Coliforms hiện nay ....................................... 6
2.2.1. Phương pháp truyền thống ................................................................................... 6
2.2.2. Phương pháp dùng màng Petrifilm ...................................................................... 8
2.3 Tổng quan về thẩm định phương pháp ..................................................................10
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..............................................................12
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................12
3.2. Vật liệu ..................................................................................................................12
3.2.1.Dụng cụ và thiết bị ..............................................................................................12
3.2.1.1. Dụng cụ ...........................................................................................................12
3.2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................12
3.2.2. Hoá chất và môi trường .....................................................................................12
iv


3.2.2.1. Hoá chất ..........................................................................................................12
3.2.3.2. Môi trường ......................................................................................................12
3.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................13
3.3.1. Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân ..............................................13
3.3.2. Phương pháp phân lập........................................................................................13
3.3.3. Phương pháp xác định độ đặc hiệu ...................................................................15
3.3.4. Phương pháp xác định giới hạn định lượng trong dịch khuẩn pha loãng và trên
mẫu gây nhiễm .............................................................................................................16
3.3.5. Phương pháp xác định độ lặp lại ........................................................................18
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................21

4.1. Kết quả phân lập các chủng Coliforms .................................................................21
4.2. Kết quả xác định độ đặc hiệu ................................................................................23
4.3. Kết quả xác định giới hạn định lượng ..................................................................27
4.3.1. Xác định giới hạn định lượng trong dịch khuẩn pha loãng ...............................27
4.3.2. xác định giới hạn định lượng trên mẫu gây nhiễm ............................................31
4.4. Kết quả xác định độ lặp lại ...................................................................................34
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.........................................................................36
5.1. Kết luận .................................................................................................................36
5.2. Đề nghị ..................................................................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................37
PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BHI

:

Brain Heart Infusion Broth

BGBL

:

Brilliant Green Bile Lactose Salt

EC

:

Escherichia coli Broth

EMB

:

Eozin Methyl Blue

LSB

:

Lauryl Sulfate Broth

MR-VP

:

Methyl Red – Voges Proskauer

NA

:

Nutrient agar

IMViC

:

Indol, Methyl red, Voges Proskauer, Citrate

SPW

:

Saline Peptone Water

TSA

:

Tryptic Soy Agar

VRB

:

Violet Red Bile

E. coli

:

Escherichia coli

CFU

:

Colony forming unit

LC

:

CriticalLevel

LOQ

:

Limit of Quantification

LOD

:

Limit of Detection

VSV

:

vi sinh vật

SS

:

Salmonella-Shigella

p–DMABA

:

p – Dimethylaminobenzaldehyde

MPN

:

Most Probable Number

PF

:

Petrifilm

AOAC

:

Association of Official Analytical Chemists

BAM

:

Bacteriological Analytical Manual

FDA

:

Food and Drug Administration

U.S

:

United States

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Biểu hiện sinh hóa các chủng Coliforms ................................................. 7
Bảng 2.2 Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp vi sinh vật ........................... 11
Bảng 4.1 Biểu hiện sinh hóa của các chủng Coliforms ........................................... 21
Bảng 4.2 Mô tả khuẩn lạc trên màng Petrifilm EC và môi trường VRB ............... 24
Bảng 4.3 Kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
phân tích trên màng Petrifilm EC ............................................................................ 27
Bảng 4.4 Kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
phân tích trên môi trường VRB ............................................................................... 28
Bảng 4.5 Kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

phân tích trên màng Petrifilm EC ............................................................................ 31
Bảng 4.6 Kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
phân tích trên môi trường VRB ............................................................................... 31
Bảng 4.7 Xác định độ lặp lại trên nền mẫu cá ngừ................................................ . 34
Bảng 4.8 Kết quả phân tích mẫu trên màng Petrifilm EC và môi trường VRB ...... 34

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Coliforms bắt màu xanh dưới kính hiển vi điện tử .................................. 4
Hình 2.2 E. coli bắt màu hồng dưới kính hiển vi điện tử ........................................ 5
Hình 2.3 Hệ thống MPN/g(ml) ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp ............................ 6
Hình 2.4 Cách sử dụng hệ thống Petrifilm của 3M Microbiology.......................... 10
Hình 3.1 Phương pháp pha loãng theo dãy thập phân ............................................. 13
Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chủng Coliforms ....................................................... 15
Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các chủng Coliforms ....................................................... 16
Hình 3.4 Sơ đồ xác định giới hạn định lượng/giới hạn phát hiện trên mẫu và
trong dịch khuẩn pha loãng ...................................................................................... 18
Hình 3.5 Sơ đồ xác định độ tái lập và độ lặp lại ..................................................... 19
Hình 3.6 Sơ đồ phân tích mẫu ................................................................................. 20
Hình 4.1 Kết quả biểu hiện sinh hóa của E. coli trên test IMiVC........................... 22
Hình 4.2 Kết quả biểu hiện sinh hóa của Enterobacter trên test IMiVC ................ 22
Hình 4.3 Kết quả biểu hiện sinh hóa của Citrobacter trên test IMiVC .................. 23
Hình 4.4 Kết quả biểu hiện sinh hóa của Klebsiella trên test IMiVC ..................... 23
Hình 4.5 Chủng K1 trên VRB và màng Petrifilm EC ............................................. 25
Hình 4.6 Chủng En6 trên VRB và màng Petrifilm EC ........................................... 25
Hình 4.7 Chủng C1 trên VRB và màng Petrifilm EC ............................................. 26
Hình 4.8 Chủng E2 trên VRB và màng Petrifilm EC ............................................. 26

Hình 4.9 Khuẩn lạc chủng En6 trên màng Petrifilm và môi trường VRB .............. 30
Hình 4.10 Khuẩn lạc chủng E2 trên màng Petrifilm ............................................... 33
Hình 4.11 Khuẩn lạc chủng E2 trên môi trường VRB ............................................ 33

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) là vấn đề đặc biệt quan trọng trên thế
giới nói chung và nước ta nói riêng. Sử dụng thực phẩm không an toàn có thể gây
ngộ độc và mắc các bệnh truyền qua đường thực phẩm, ảnh hưởng xấu đến người sử
dụng, tác động xấu đến kinh tế xã hội và quan hệ quốc tế. Vì vậy vấn đề đảm bảo vệ
sinh an toàn thực phẩm góp phần quan trọng thúc đẩy phát triển kinh tế - xã hội, xoá
đói giảm nghèo và hội nhập quốc tế.
Mỗi năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, gây hậu quả
nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng. Một trong những nguyên nhân lớn nhất gây ra
tình trạng này là sự hiện diện quá mức cho phép của các vi sinh vật gây bệnh trong
thực phẩm. Có hai chỉ tiêu cần được quan tâm hiện nay là số lượng E. coli và
Coliforms có trong thực phẩm, sự hiện diện của các vi sinh vật này sẽ phản ánh được
mức độ an toàn của thực phẩm đó đối với người sử dụng. Do đó cần phải có các
phương pháp phân tích vi sinh vật cho kết quả chính xác để có các biện pháp phòng
tránh, ngăn chặn và giảm bớt số ca ngộ độc thực phẩm, bảo đảm an toàn cho người
tiêu dùng, đóng góp quan trọng vào phát triển kinh tế xã hội của đất nước.
Hiện nay để phân tích E. coli và Coliforms các phòng kiểm nghiệm thực phẩm
sử dụng các phương pháp khác nhau như phương pháp MPN (most probable number
technique), phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp lai v.v. Trong đó phương pháp
phân tích bằng màng Petrifilm EC cho kết quả phân tích nhanh, thao tác thực hiện dễ
dàng, không phải chuẩn bị hóa chất và môi trường như các phương pháp phân tích
khác và đã được chứng nhận bởi các tổ chức uy tín thế giới như AOAC. Tuy nhiên ở

Việt Nam quy trình phân tích bằng màng Petrifilm chưa được đánh giá và sử dụng
rộng rãi tại các phòng kiểm nghiệm. Do đó cần phải được đánh giá để có các thông
số kỹ thuật tin cậy trước khi áp dụng rộng tại Việt Nam.
Xuất phát từ những vấn đề đó, đề tài “Đánh giá hiệu lực qui trình phần tích
đồng thời E. coli và Coliforms bằng màng Petrifilm trên mẫu hải sản” được thực
hiện.

1


1.2. Yêu cầu
Phân tích hai chỉ tiêu E. coli và Coliforms trên mẫu hải sản sử dụng đồng thời hai
phương pháp: phương pháp màng Petrifilm và phương pháp truyền thống để để kiểm
tra các thông số kỹ thuật, mức độ hiện diện của hai chỉ tiêu này trên mẫu thực hiện.
Từ đó so sánh và đánh giá được hiệu lực phân tích của hai phương pháp này. Nêu ra
được ưu điểm và nhược điểm của từng phương pháp.
1.3. Nội dung
Phân lập các chủng Coliforms và E. coli.
Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích truyền thống và phương pháp
màng Petrifilm.
Xác định giới hạn định lượng trong dịch khuẩn pha loãng và trên mẫu gây nhiễm ở
cả hai phương pháp.
Xác định độ lặp lại ở cả hai phương pháp.
Ứng dụng phân tích mẫu bằng hai phương pháp.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Coliforms/E. coli

2.1.1.Tổng quan về Coliforms
Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ
khí tuỳ nghi, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 - 48
giờ. Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả
năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 370C trong môi trường canh
Lauryl Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt. Căn cứ vào nhiệt độ vi
sinh vật có thể phát triển để chia nhóm Coliforms thành hai nhóm. Nhóm Coliforms
có nguồn gốc từ phân của các loài động vật và nhóm này được gọi là Coliforms phân
và nhóm không có nguồn gốc từ phân động vật (Nguyễn Tiến Dũng, 2007).
Vai trò của Coliforms trong thực phẩm: nhóm Coliforms được xem là nhóm vi
sinh vật chỉ thị. Số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại
mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh
khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms của thực phẩm cao thì khả
năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. Tuy nhiên mối quan hệ
giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị này vẫn còn nhiều tranh cãi (Lê Xuân
Phương, 2007).
Nhóm Coliforms gồm 4 giống là : Escherichia với 1 loài duy nhất là E. coli,
Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter. Tính chất sinh hoá đặc trưng của nhóm này
được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer
(VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt chung là IMViC.
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi
trong khoảng thời gian 24 giờ khi được ủ ở 440C trong môi trường canh EC.
Coliforms phân (Feacal Coliforms hay E. coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt
có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,50C trong canh Trypton.
Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh ruột đường ở người và các động vật
máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến,
bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm trong
mẫu môi trường.
3

Hình 2.1 Coliforms bắt màu xanh dưới kính hiển
vi điện tử (www.apswater.com)
2.1.2. Tổng quan về E. coli
2.1.2.1. Lịch sử
E. coli có tên đầy đủ là Escherichia coli hay còn có tên gọi khác là Bacteriam
coli được Buchner tìm ra năm 1885 và được Escherich nghiên cứu đầy đủ vào năm
1886. Sau nhiều tên gọi khác nhau thì vào năm 1991 vi khuẩn này được định danh
thống nhất toàn cầu là Escherichia coli.
2.1.2.2. Phân loại
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc:
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Tộc1: Escherichiae
Giống: Escherichia
Loài: Escherichia coli
(Nguyễn Ngọc Hải, 2010)
2.1.2.3. Đặc điểm hình dạng, nuôi cấy và tính chất sinh hóa
Vi khuẩn E. coli thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, có nhiều
trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc. Trong đường ruột, chúng hiện
diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng. Vi khuẩn E. coli nhiễm vào
đất, nước v.v. từ phân của động vật. Chúng trở nên gây bệnh khi gặp điều kiện thuận
lợi cho sự phát triển của chúng.
4


Hình dạng: E. coli là trực khuẩn Gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế
bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực không có

capsul. Kích thước trung bình (0,5 µm x 1 - 3 µm) hai đầu tròn. Một số dòng có lông
bám (pili).
Đặc điểm nuôi cấy: là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp
370C nhưng có thể mọc trên 400C, pH 7,4.
Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA (nutrient agar) tạo khuẩn lạc tròn ướt
(dạng S) màu trắng đục. Để lâu khóm trở nên khô nhăn (dạng R). Kích thước khóm
2-3 mm.
Trên thạch máu: có chủng dung huyết β, có chủng không dung huyết α.
Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt EMB (Eosin Methyl Blue) tạo khuẩn
lạc tròn đều, tím ánh kim.
Trên môi trường Rapid’ E. coli tạo khuẩn lạc màu tím.
Trên môi trường Maconkey, Endo, SS tạo khuẩn lạc hồng đỏ.
Trên các môi trường đường: lên men sinh hơi lactose, glucose, galactose. Lên
men không đều saccarose và không lên men dextrin, glycogen.
Tính chất sinh hóa: indol dương tính, Methyl Red (phản ứng MR) dương tính,
Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính và Simon Citrat âm tính, H2S âm tính, hoàn
nguyên nitrat thành nitrit, Lysine decarboxylaza dương tính (Đoàn Ngọc Tuấn,
2006).

Hình 2.2 E. coli bắt màu hồng dưới kính hiển
vi điện tử (bacsigiadinhhanoi.vn)

5


2.2. Các phương pháp phát hiện E. coli/ Coliforms hiện nay
2.2.1. Phương pháp truyền thống
Phương pháp MPN (Most Probable Number): phương pháp này dựa trên
nguyên tắc xác xuất thống kê sự phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng khác
nhau của mẫu, mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, 3 hoặc 5 mẫu có độ pha

loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống
durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi
và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm, đây là các ống
dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha
loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số có xác xuất lớn nhất vi sinh vật tương ứng
hiện diện trong 1 g (hoặc 1 ml) mẫu ban đầu. Phương pháp MPN được dùng chủ yếu
để phân tích Coliforms và các vi sinh vật khác khi chúng phát triển trong môi trường
nuôi cấy lỏng cho các tín hiệu dễ dàng nhận dạng như sinh hơi, làm đục môi trường
chọn lọc hay pH môi trường .v.v. (Lê Xuân Phương, 2007).
Phương pháp MPN có hai hệ thống:
Hệ thống 9 ống
Hệ thống 15 ống
Hệ thống 9 ống

Hệ thống 15 ống

Hình 2.3 Hệ thống MPN/g(ml) ở 3 nồng độ pha loãng
liên tiếp (www2.hcmuaf.edu.vn)
Phương pháp đếm khuẩn lạc: phương pháp này được sử dụng rộng rãi để định
lượng vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn. Ở phương pháp này mẫu được đồng nhất hoá
và pha loãng sao cho chứa ít hơn 100 khuẩn lạc trong 1 ml dung dịch pha loãng.
Chuyển 1 ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy
6


mẫu khoảng 15 ml môi trường VRB đã được đun tan và để nguội đến khoảng 450C.
Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 - 5 lần để trộn đều
dịch mẫu với môi trường, chờ đông đặc sau đó bổ sung khoảng 5 ml môi trường
thạch VRB ở nhiệt độ khoảng 450C. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật
ngược đĩa và ủ ở 370±10C trong 24 giờ. Thực hiện trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng

liên tiếp sao cho mỗi đĩa sẽ xuất hiện từ 10 - 100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa
ứng với nồng độ pha loãng (Nguyễn Tiến Dũng, 2007).
Thử nghiệm khẳng định Coliforms: chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng
que cấy vòng cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa môi trường BGBL (trường hợp
khẳng định Coliforms tổng số) hoặc môi trường EC (trường hợp khẳng định
Coliforms phân). Ủ các ống BGBL ở 37±10C và các ống EC ở 440C trong 24 - 48
giờ. Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng làm đục môi trường và sinh hơi
trong ống durham. Tính tỷ lệ khẳng định là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+)
với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định Coliforms phân, các khuẩn
lạc cho kết quả (+) trên EC cần được thực hiện thử nghiệm indol ở 440C.Để phân biệt
được các chủng Coliforms dùng que cấy vòng cấy từ ống BGBL hay EC sinh hơi vào
canh trypton, MR-VP, thạch simon citrate để thử nghiệm IMViC.
Bảng 2.1 Biểu hiện sinh hoá của các chủng Coliforms
Phản ứng

Indol

Methyl Red

Voges

Citrat

Proskauer
Escherichia

+(-)

+

-

-

Citrobacter

-(+)

+

-

+

Klebsiella

-(+)

-

+

+

Enterobacter

-(+)

-

+

+

+: phản ứng dương tính, -: phản ứng âm tính,+(-): đa số là phản ứng dương tính và - (+):
đa số là phản ứng âm tính.

Cách tính kết quả
Dưạ vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ khẳng định, tính mật độ của Coliforms
và E. coli phân theo công thức sau :
A (CFU/g hay CFU/ml) =

7


Trong đó :
A : số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1 g hay 1 ml mẫu
N : tổng số khuẩn lạc đếm được
ni : số lượng đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
V : dung dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
fi : độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
Phương pháp lai khuẩn lạc: đây là phương pháp kết hợp giữa phương pháp lai
phân tử và phương pháp nuôi cấy truyền thống. Sau thời gian nuôi cấy trên bề mặt
môi trường thạch, các khuẩn lạc vi khuẩn được chuyển lên màng lai. Sự phát triển
của các vi sinh vật mục tiêu trong môi trường làm gia tăng số lượng bản sao của các
vi sinh vật mục tiêu, nhờ đó tăng khả năng phát hiện của các mẫu dò. Do đó phương
pháp này phụ thuộc chủ yếu vào sự phát triển của các vi sinh vật mục tiêu trên môi
trường.
Ứng dụng chủ yếu của phương pháp lai khuẩn lạc là phát hiện, định lượng và
phân lập các vi sinh vật có kiểu hình và kiểu gen đặc trưng.

2.2.2. Phương pháp dùng màng Petrifilm
Trong phương pháp dùng màng Petrifilm để phân tích vi sinh vật môi trường
dinh dưỡng dạng đông khô được cố định vào các màng mỏng gọi là Petrifilm. Khi sử
dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên và nhỏ vào 1 ml dịch mẫu rồi đậy lại.
một đĩa petri nhựa được đặt lên màng bảo vệ để tạo một khuôn tròn. Môi trường dinh
dưỡng sẽ hỗ trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian ủ. Có thể đếm trực
tiếp số khuẩn lạc trên màng Petrifilm (Nguyễn Tiến Dũng, 2007).
Phương pháp dùng màng Petrifilm được chứng nhận bởi tổ chức quốc tế
AOAC INTERNATIONAL Officail Methods of Analysis. Màng Petrifilm có thể
kiểm tra hầu hết các loại vi sinh vật phổ biến. Bao gồm:
Aerobic Count: tổng vi khuẩn hiếu khí
Coliforms Count: đĩa dùng cho Coliform
E. coli/Coliforms Count: đĩa dùng chung cho E. coli và Coliforms
Enterobacteriaceae Count: đĩa dùng cho họ vi khuẩn đường ruột
Environmental Listeria: Listeria trong môi trường
High-Sensitivity Coliforms Count: đĩa kiểm tra Coliforms nhạy
Rapid Coliforms Count: đĩa kiểm tra Coliforms nhanh
8


Staph Express Count:đĩa dùng cho Staph. Aureus và các loài khác
Yeast và Mold Count: đĩa dùng cho nấm men và nấm mốc
Màng Petrifilm EC Count (EC) có chứa Violet Red Bile (VRB), chất gel tan
được trong nước lạnh, chất chỉ thị hoạt động của glucuronidase và một chất chỉ thị
giúp cho việc đếm khuẩn lạc dễ dàng hơn. Hầu hết E. coli (khoảng 97%) sinh beta glucuronidase, chất này tạo tủa màu xanh gắn kết với khuẩn lạc. Tấm film phía trên
giữ bọt khí sinh ra từ quá trình lên men lactose của E. coli và Coliforms. Khoảng
95% E. coli có sinh bọt khí, cho khuẩn lạc có màu từ xanh đến xanh – đỏ kèm theo
bọt khí trên màng Petrifilm.
AOAC INTERATIONAL và U.S FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM)
xác định Coliforms là trực khuẩn gram âm, hình que, sinh hơi và acid suốt quá trình

lên men chuyển hoá lactose. Khuẩn lạc Coliforms phát triển trên màng Petrifilm EC
sinh acid, chất chỉ thị pH trong đĩa làm cho lớp keo có màu đỏ. Khí sinh ra được giữ
lại xung quanh khuẩn lạc Coliforms màu đỏ là dấu hiệu để xác định Coliforms.
BẢO QUẢN

1
CHUẨN BỊ MẪU

2

3

4
5
6
1: bảo quản các gói chưa mở ở nhiệt độ 80C, 2: gập lại và dán chặt gói đã mở, 3: giữ
gói đã mở dưới 250C và độ ẩm dưới 50%, 4: chuẩn bị mẫu, 5: thêm dung dịch SPW
vào, 6: trộn hoặc đồng nhất mẫu

9


CHUẨN BỊ MẪU

7

10
Ủ MẪU

8

11
ĐỌC KẾT QUẢ

9

12

13

14
15
Hình 2.4 Cách sử dụng hệ thống Petrifilm của 3M Microbiology
(thanhphuongco.com.vn)
7: đặt đĩa cố định trên bề mặt phẳng, kéo tấm film lên trên, 8: cấy mẫu, 9: cuộn tấm
phim bên trên xuống, 10: đặt miếng dàn trải mẫu trên tấm màng trong vùng cấy, 11:
dùng 1 lực nhẹ ấn lên tấm dàn trải mẫu, 12: lấy dụng cụ dàn trải mẫu ra, 13: ủ, 14:
đếm khuẩn lạc, 15: cách cấy khuẩn lạc
2.3 Tổng quan về thẩm định phương pháp
Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng
chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt
ra (fitness for the purpose). Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng
để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Thẩm định phương pháp
phân tích là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin
cậy (Trần Cao Sơn và các ctv, 2010).

10


Bảng 2.2 Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp vi sinh vật

Phương pháp định tính

Phương pháp định lượng

Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện

Độ đặc hiệu, độ nhạy

Giới hạn định lượng

Độ lệch dương, độ lệch âm

Độ lặp lại

Độ chính xác (độ đúng)

Độ tái lập

Một số định nghĩa về thẩm định phương pháp:
Ngưỡng tới hạn (Critical level – LC): mật độ vi sinh vật thấp nhất (khác 0) mà
phương pháp có thể phát hiện được nhưng không thể cho một giá trị định lượng
chính xác. Dưới ngưỡng này, không thể chắc chắn được mật độ vi sinh vật thật sự
khác 0 hay không. Ở ngưỡng này, xác suất phương pháp phân tích cho kết quả âm
tính giả là 50%.
Giới hạn phát hiện (Limit of detection – LOD): mật độ vi sinh vật thấp nhất
màphương pháp có thể phát hiện được ở độ tin cậy 95%, nhưng không thể cho một
giá trị định lượng chính xác.
Giới hạn định lượng (Limit of quantification – LOQ): mật độ vi sinh vậtnhỏ

nhất thật sự có trong mẫu mà phương pháp có thể định lượng được với một độ chính
xác và độ chụm nhất định trong điều kiện thí nghiệm.
Độ lặp lại (Repeatability - Sr ) Được thực hiện trên cùng mẫu, lặp lại n lần bởi
một kiểm nghiệm viên và cùng một điều kiện: môi trường, nhiệt độ, thời gian nuôi
cấy .v.v.
Độ tái lập (Reproducibility - SR): Được thực hiện n mẫu, mỗi mẫu được thực
hiện phân tích ít nhất 2 lần lặp lại trên cùng một mẫu. Các mẫu được thực hiện tại các
thời gian khác nhau, trong các điều kiện khác nhau: môi trường, thiết bị.

11


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Tiến hành thực hiện thí nghiệm từ tháng 02 đến tháng 06 năm 2012 ở phòng
phân tích vi sinh tại viện Công nghệ sinh học và môi trường – Trường Đại học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu
Mẫu được dùng trong quá trình thí nghiệm là mẫu cá thương phẩm được lấy ở
các chợ trên địa bàn quận Thủ Đức – Tp. Hồ Chí Minh.
3.2.1.Dụng cụ và thiết bị
3.2.1.1. Dụng cụ
Dụng cụ thủy tinh: bình tam giác 250 ml; 500 ml, cốc đựng nước 500 ml; 1000
ml, ống nghiệm, ống durham, đĩa petri
Pipetman, đầu típ vô trùng
Que cấy vòng, bao PE vô trùng
3.2.1.2. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy diệt trùng, tủ mát 40C, tủ lạnh, nồi hấp khử trùng Autoclave, cân
phân tích.
3.2.2. Hoá chất và môi trường

3.2.2.1. Hoá chất
Thuốc thử Kovac’s, thuốc thử Methyl red, dung dịch – naphthol, KOH 40%,
cồn 700, 960 và nước cất.
3.2.3.2. Môi trường
Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC Broth)
Dung dịch Saline Peptone Water (SPW)
Môi trường Eosin Methylene Blue Lactose agar (EMB)
Môi trường Tryptic Soy Agar (TSA)
Môi trường canh Trypton
Môi trường MR–VP Broth
Môi trường Simmons Citrate Agar
Môi trường Brain Heart Broth (BHI)
Môi trường VRB: Violet Red Bile Agar (VRB)
12


3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân
Mẫu được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển
1 ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml SPW vô trùng. Trộn mẫu thật kỹ. Dung dịch
này có độ pha loãng 10-1. Tiếp tục chuyển 1 ml mẫu từ độ pha loãng 10-1 sang ống
nghiệm chứa 9 ml SPW vô trùng thứ 2, trộn mẫu thật kỹ. Dung dịch này có độ pha
loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành tương tự để có độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5…

Nồng độ

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

Độ pha loãng

101

102

103

104

105 …

Hình 3.1 Phương pháp pha loãng theo dãy thập phân
3.3.2. Phương pháp phân lập
Bước 1 - pha loãng mẫu, xát nhuyễn mẫu trong điều kiện vô trùng, cân chính
xác 10 g mẫu vào bao PE, thêm vào lượng mẫu này 90 ml dung dịch pha loãng SPW
vô trùng, đồng nhất mẫu trong một thời gian nhất định (ít nhất là 2 phút). Như vậy
dung dịch mẫu thu được có độ pha loãng là 10 lần so với ban đầu. Tiếp tục pha loãng
dung dịch mẫu theo dãy thập phân để có nồng độ pha loãng là 10-2 .
Bước 2 - cấy mẫu, từ độ pha loãng 10-2, dùng pipetman với đầu típ vô trùng hút
1 ml vào giữa đĩa petri vô trùng, thực hiện 2 lần lặp lại. Sau đó đổ vào mỗi đĩa 10-15
ml môi trường VRB đã được đun tan và làm nguội đến 450C, xoay tròn đĩa để trộn
đều dung dịch mẫu với môi trường, chờ môi trường đông đặc đổ thêm lớp thứ hai
khoảng 5 ml môi trường VRB đã được đun tan và làm nguội đến 45 0C, sau khi đông

13


đặc, lật ngược đĩa lại và ủ các đĩa trong tủ ấm ở 370C trong vòng 24 giờ. Khuẩn lạc
đặc trưng của Coliforms trên môi trường VRB là các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ
đậm, có quầng tủa muối mật, đường kính lớn hơn hay bằng 0,5 mm.
Bước 3 - cấy chuyển, chọn ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng từ đĩa VRB cấy
chuyển sang môi trường canh EC vô trùng có chứa chuông durham, ủ ở 440C trong
vòng 24 giờ. Các ống canh EC dương tính là các ống đục và sinh hơi trong ống
durham.
Bước 4 - thử sinh hóa IMViC, từ những ống canh EC dương tính, dùng que cấy
vòng cấy chuyển vào các môi trường canh trypton, canh MR-VP, thạch simmon
citrate agar, và môi trường thạch ngiêng TSA để giữ giống, ủ ở 370C trong vòng 24
giờ.
Thử Indol: dùng que cấy vòng cấy từ môi trường EC sang môi trường canh
tryptone khoảng 24 - 48 giờ. Nhỏ vài giọt ether vào canh khuẩn nhằm kéo indol lên
bề mặt một trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s hay Erhlich. Quan sát sau vài
phút, phản ứng dương tính nếu trên bề mặt môi trường có vòng màu đỏ xuất hiện.
Ngược lại nếu không có sự xuất hiện của màu đỏ hồng được coi là phản ứng âm tính.
Nguyên tắc: một số enzyme nội bào được gọi chung là tryptophanase tham gia
trong quá trình tạo thành sản phẩm indol trong hoạt động thủy giải tryptophane tham
gia trong quá trình tạo thành sản phẩm indol trong hoạt động thủy giải tryptophane.
Cơ chất chính tham gia phát hiện indol trong môi trường nuôi cấy là
pdimethylaminobenzaldehyde (DMAB), chất này phản ứng với indol tạo thành một
phức hợp màu đỏ, phản ứng này là do pyrrol của indol phản ứng với nhóm andehyde
của DMAB.
Thử nghiệm methyl red (MR): dùng que cấy vòng cấy từ môi trường EC sang
môi trường glucose phosphate (MR - VP broth) ủ trong khoảng 24 giờ ở 370C. Thêm
vào vài giọt thuốc thử methyl red. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang
màu đỏ. Phản ứng âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng.

Thử nghiệm Voges – Proskauer (VP): dùng que cấy vòng cấy từ môi trường
EC môi trường canh glucose phosphate (MR-VP broth), ủ ở nhiệt độ 370C trong
khoảng 24 giờ. Thêm vào canh khuẩn sau nuôi cấy 3 ml dung dịch 1-napthol. Quan
sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng VP dương tính khi môi trường chuyển
sang màu đỏ hay hồng sáng, phản ứng VP âm tính khi không có sự chuyển màu này.
14


Thử Citrate: dùng que cấy vòng cấy ria từ môi trường EC sang môi trường
Simmon citrate agar hay môi trường lỏng Koser. Nên cấy một lượng vi sinh vật vừa
phải, nếu cấy với mật độ quá dày có thể gây nên hiện tượng dương tính giả. Sau khi
cấy, ủ ở nhiệt độ 30-370C, quan sát sự phát triển của vi sinh vật và sự chuyển màu
của môi trường. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang kiềm tính, âm tính
khi môi trường không chuyển màu.
Nguyên tắc: vi sinh vật tách citrate thành oxaloacetate và acetate. Đây là hai
sản phẩm trung gian trong quá trình đồng hóa citrate, còn sản phẩm nhận được từ quá
trình này phụ thuộc vàp pH của môi trường. Nếu pH kiềm thì môi trường sẽ nhận
được nhiều acetate và formate, nếu pH acid thì sản phẩm tạo ra là lactate và CO2.
10 g mẫu + 90 ml dung dịch pha loãng SPW

Pha loãng ra 10-2, 10-3
1 ml

Đĩa petri, bổ sung VRB

Canh EC
Sinh hơi
Thử nghiệm IMiVC
Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chủng Coliforms
3.3.3. Phương pháp xác định độ đặc hiệu

Bước 1 - cấy tăng sinh, dùng que cấy vòng để cấy từ môi trường giữ giống
TSA sang ống nghiệm chứa 10 ml môi trường BHI, sau đó ủ ở 370C trong vòng 24
giờ.
Bước 2 - pha loãng dịch khuẩn theo dãy thập phân để có được độ pha loãng
thích hợp.
Bước 3 - cấy mẫu, từ độ pha loãng thích hợp, dùng pipetman với đầu típ vô
trùng hút 1 ml vào giữa đĩa petri vô trùng và 1 ml vào màng Petrifilm, thực hiện 2 lần
lặp lại. Đối với môi trường VRB đổ vào mỗi đĩa 10-15 ml môi trường đã được đun

15