NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP NẤM Botryodiplodia theobromae Pat TRÊN CÂY CAO SU BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG rDNA ITS VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP
NẤM Botryodiplodia theobromae Pat TRÊN CÂY CAO SU
BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG rDNA - ITS
VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện : NGUYỄN XUÂN ĐÔNG
Niên khóa: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP NẤM

Botryodiplodia theobromae Pat TRÊN CÂY CAO SU
BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG rDNA – ITS
VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR

Hƣớng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

TS. NGUYỄN ANH NGHĨA

NGUYỄN XUÂN ĐÔNG

KS. VŨ THỊ QUỲNH CHI

Tháng 07/2012


LỜI CẢM ƠN
Lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ đã sinh thành và nuôi dạy con nên ngƣời.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Quý thầy cô Trƣờng Đại học Nông
Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình dạy dỗ, tạo
điều kiện tối đa cho tôi cũng nhƣ các bạn sinh viên khác hoàn thành chƣơng trình học
ở trƣờng.
Xin chân thành cám ơn Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, Bộ môn Bảo vệ
Thực vật, Bộ môn Giống đã tiếp nhận và tạo điều kiện cho tôi tôi hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp.
Lời tri ân sâu sắc đến Tiến sĩ Nguyễn Anh Nghĩa, Kỹ sƣ Vũ Thị Quỳnh Chi đã
trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt nhiều kiến thức trong suốt quá trình hoàn
thành khóa luận.
Các cô chú, anh chị trong Bộ môn Bảo vệ Thực vật và Phòng Công nghệ Sinh
học - Bộ môn Giống -Viện nghiên cứu Cao su Việt Nam đã luôn tận tình chỉ bảo, động
viên và giúp đỡ tôi để tôi có thể hoàn thành đƣợc khóa luận này.
Cảm ơn Thạc sĩ Lê Hoàng Ngọc Anh cùng gia đình đã tận tình chỉ dạy và tạo
điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Và cuối cùng xin cám ơn các bạn thân yêu của tôi ở Trƣờng Đại Học Nông
Lâm, các bạn sinh viên thực tập tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật, đã luôn bên tôi, san sẻ
niềm vui nỗi buồn với tôi, động viên tôi trong suốt thời gian qua.

Tháng 7 năm 2012
NGUYỄN XUÂN ĐÔNG

i


TÓM TẮT
Nấm B. theobromae gây ra bệnh nứt vỏ trên cây cao su hay còn gọi là bệnh
Botryodiplodia. Bệnh này gây hại trên thân cây cao su giai đoạn vƣờn ƣơng, vƣờn kiến
thiết cơ bản lẫn vƣờn cây khai thác. Bệnh bùng phát mạnh trong những năm gần đây
và gây thiệt hại đáng kể trên nhiều diện tích cao su trong ngành. Kiểm soát bệnh bằng
thuốc hóa học gây ảnh hƣởng đến môi trƣờng. Kiểm soát bệnh bằng biện pháp di
truyền đang đƣợc hi vọng sẽ đem lại kết quả tốt hơn.
Trong nghiên cứu này, 20 MPL nấm B. theobromae từ các dòng vô tính khác
nhau đƣợc thu thập từ vùng khác nhau đã đƣợc tách đơn bào tử, nhân sinh khối và ly
trích DNA tổng số. Đa dạng di truyền của nấm B. theobromae đƣợc đánh giá bằng
cách khuếch đại vùng rDNA – ITS với cặp mồi ITS1 và ITS4, giải trình tự, so sánh kết
quả để tìm sự khác biệt và bằng chỉ thị ISSR sử dụng 16 mồi đa hình đƣợc sàng lọc từ
bộ sƣu tập gồm 34 mồi ISSR. Ma trận hệ số tƣơng đồng và cây phân loài đƣợc thiết
lập để đánh giá đa dạng di truyền của 20 MPL này.
Kết quả khuếch đại vùng rDNA – ITS cho thấy 20 MPL cho sản phẩm khuếch
đại có kích thƣớc nhƣ nhau, kết quả giải trình tự vùng rDNA – ITS khẳng định chúng
có cùng kích thƣớc là 541 bp và trình tự nucleotide của các MPL giống nhau hoàn
toàn. Tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng với 20 MPL đƣợc dùng trong nghiên cứu này
bằng chƣơng trình BLAST cho thấy trình tự rDNA – ITS của các mẫu nghiên cứu có
mức tƣơng đồng từ 98 – 99% so với trình tự của nấm B. theobromae có sẵn trên
GenBank. Điều này khẳng định các MPL đƣợc nghiên cứu là loài nấm B. theobromae.
Sự giống nhau hoàn toàn trong trình tự nucleotide của vùng rDNA – ITS của 20 MPL
cho thấy tính bảo tồn rất cao của vùng rDNA – ITS trong hệ gen của các MPL đƣợc

nghiên cứu.
Phân tích ISSR sử dụng 16 mồi tạo đƣợc 214 băng trong đó có 76,6 % băng đa
hình. Cây phân loài dựa trên phân tích UPGMA và hệ số tƣơng đồng di truyền DICE
đã chia 20 MPL thành 2 nhóm chính. Kết quả cho thấy có sự phân nhóm theo vị trí địa
lý ở mức độ thấp và không có mối liên quan giữa phân nhóm di truyền và nguồn gốc
ký chủ (dòng vô tính cao su) của các MPL nấm B. theobromae.
Từ khóa : Botryodiplodia theobromae, rDNA-ITS, chỉ thị phân tử ISSR, đa
dạng di truyền

ii


SUMMARY
Nguyen Xuan Dong, Nong Lam University, Ho Chi Minh City. July, 2012
“Genetic diversity of Botryodiplodia theobromae isolated from rubber trees using rDNA –
ITS sequence and ISSR markers”.
B. theobromae is the pathogen causing die-back on rubber tree, which is also known
as Botryodiplodia disease. This disease caused major damages on the trunk and spread
rapidly in recent years, causing significant damage on a large area of rubber growing
regions. Chemical controls are effective but it could harm the environment. Genetic controls
are expected to bring positive effects.
A total of 20 isolates of B. theobromae from different Hevea clones growing in
various rubber plantations in Viet Nam was isolated and purified using single spore
isolation method. Total genomic DNA from these isolates was extracted and amplified
using ITS1 and ITS4 primer. Consequently, PCR products were sequenced and then aligned
to find the differences. Meanwhile, genetic diversity of 20 B. theobromae isolates was
analysed using ISSR markers with 16 polymorphic primers screened from 34 ISSR primers.
Analysis of rDNA - ITS sequences of 20 B. theobromae isolates confirmed that
they have the same size, 541 bp, and these sequences were identical. BLAST search using
the sequence of amplified rDNA - ITS showed that the rDNA – ITS sequences of the

studied isolates was 98 – 99% similarity to that of rDNA – ITS of B. theobromae credited
in GeneBank. These results confirm that the studied isolates are belonged to B. theobromae
species. The identical sequences in rDNA-ITS region implied high conservation of this
region in the genome of the studied isolates.
ISSR analysis using 16 primers produced a total of 214 DNA bands, of which the
polymorphic DNA bands was accounted for 76.6%. The phylogenetic tree produced from
UPGMA analysis based on DICE coefficient divided 20 isolates into two main genetic
clusters. Analysis of these genetic clusters showed the relationship between genetic groups
and geographical origins at low levels and no relationship between genetic groups and the
host origins (rubber clones) from which B. theobromae was isolated.
Keywords : B. theobromae, rDNA-ITS, ISSR markers, genetic diversity
iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
TÓM TẮT ...................................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................viii
CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1
1.1.Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1
1.2.Yêu cầu đề tài ........................................................................................................ 2
1.3. Nội dung thực hiện................................................................................................ 2
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 3
2.1. Sơ lƣợc về cây cao su Hevea brasiliensis .............................................................. 3
2.1.1. Nguồn gốc cây cao su ở Việt Nam ..................................................................... 3
2.1.2. Bệnh hại trên cây cao su ..................................................................................... 3
2.2. Sơ lƣợc về nấm B. theobromae ............................................................................. 4

2.2.1. Phân loại học...................................................................................................... 4
2.2.2. Lịch sử phát hiện nấm B. theobromae ................................................................ 4
2.2.3. Phạm vi phân bố, phổ kí chủ và khả năng gây bệnh ........................................... 5
2.2.4. Đặc điểm hình thái ............................................................................................. 7
2.2.5. Đặc điểm sinh lý ................................................................................................ 8
2.2.6. Sự xâm nhiễm, sự lây lan và khả năng tồn tại ..................................................... 9
2.3. Nấm B. theobromae trên cây cao su ...................................................................... 9
2.3.1. Tình hình và tác hại của bệnh ............................................................................. 9
2.3.2. Triệu chứng bệnh ............................................................................................. 10
2.3.3. Biện pháp phòng trừ ......................................................................................... 13
2.4. Phân tích đa dạng di truyền dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử ............................ 13
2.4.1. Khái niệm đa dạng di truyền ............................................................................ 13
2.4.2. Trình tự ribosomal DNA – Internal Transcribed Spacer (rDNA – ITS) ........... 13
2.4.3. Chỉ thị phân tử phân tích đa dạng di truyền ...................................................... 17
2.5. Những nghiên cứu về B. theobromae trong và ngoài nƣớc .................................. 21
iv


2.5.1. Trong nƣớc ...................................................................................................... 21
CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 23
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 23
3.2. Vật liệu ............................................................................................................... 23
3.2.1. Các MPL nấm B. theobromae .......................................................................... 23
3.2.2. Hóa chất ........................................................................................................... 24
3.2.3. Máy móc và thiết bị ......................................................................................... 26
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 26
3.3.1. Phƣơng pháp tách đơn bào tử nấm B. theobromae ............................................ 26
3.3.2. So sánh quy trình ly trích DNA từ các MPL nấm B. theobromae ..................... 27
3.3.3. Phân tích đa dạng di truyền từ kết quả giải trình tự vùng rDNA-ITS ................ 27
3.3.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị ISSR .................................................. 28

CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 30
4.1. Kết quả ............................................................................................................... 30
4.1.1. So sánh quy trình ly trích DNA từ các MPL nấm B. theobromae ..................... 30
4.1.2. Nhận diện và phân tích đa dạng di truyền của các MPL
nấm B. theobromae dựa trên phƣơng pháp giải trình tự vùng rDNA – ITS ................ 31
4.1.3. Kết quả sàng lọc mồi ISSR............................................................................... 33
4.1.4. Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu phân lập nấm B. theobromae
dựa trên chỉ thị ISSR ................................................................................................. 35
4.2. Thảo luận ............................................................................................................ 38
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 41
5.1. Kết luận .............................................................................................................. 41
5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 42
PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AFLP

: Amplified Fragment Length Polymorphism

BLAST

: Basic Local Alignment Search Tool

CTAB

: Hexacetyltrimethyl ammonium bromide

DNA

: Deoxyribonucleic acid

dNTPs

: Deoxynucleotides

EDTA

: Ethylenediaminetetraacetic acid

ISSR

: Inter Simple Sequence Repeat

ITS

: Internal Transcribed Spacer

mM

: Milimolar

MW

: Molecular weight

MPL

: Mẫu phân lập

NCBI

: National Center for Biotechnology Information

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PDA

: Potato Dextrose Agar

RAPD

: Random Amplified Polymorphic DNA

rDNA

: Ribosomal deoxyribonucleotide acid

RFLPs

: Restriction Fragment Length Polymorphisms

RNA

: Ribonucleic acid

RNase A

: Ribonuclease A

RRIM

: Rubber Research Institute of Malaysia

RRIV

: Rubber Research Institute of Vietnam

SAHN

: Sequential Agglomerative Hierarical Nested cluster analysis

SNPs

: Single Nucleotide Polymorphism

SSR

: Simple Sequence Repeat

SSU

: Small subunit

TAE

: Tris acetate EDTA

TE

: Tris – EDTA

UBC

: University of British Columbia

UPGMA

: Unweighted Paired Group Method with Arithmetic Mean
vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Danh sách các mẫu nấm phân lập từ các vùng địa lý khác nhau .................. 23
Bảng 3.2 Danh sách các mồi, trình tự và nhiệt độ bắt cặp .......................................... 25
Bảng 4.1 Tổng số băng khuếch đại và tỉ lệ đa hình của các mồi ISSR
đã đƣợc sàng lọc trên 4 MPL nấm B. theobromae ...................................................... 34
Bảng 4.2 Tổng số băng DNA đƣợc khuếch đại và tỉ lệ băng đa hình
của 16 mồi ISSR dùng trong phân tích đa dạng di truyền cho 20 MPL
nấm B. theobromae .................................................................................................... 35

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Hình thái nấm B. theobromae ...................................................................... 7
Hình 2.2 Triệu chứng bệnh trên vƣờn stump ............................................................. 12
Hình 2.3 Triệu chứng bệnh trên vỏ xanh ................................................................... 12
Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên cây có vỏ hóa nâu .................................................... 12
Hình 2.5 Cấu trúc của một đơn vị rDNA . ................................................................. 14
Hình 2.6 Vị trí bắt cặp của các mồi ITS). .................................................................. 15
Hình 4.1 Kết quả ly trích các MPL nấm B. theobromae
sử dụng phƣơng pháp CTAB và Dneasy Plant Mini Kit (Quiagen). . ......................... 30
Hình 4.2 Kết quả định tính 21 mẫu DNA của 21 MPL
nấm B. theobromae .................................................................................................... 31
Hình 4.3 Gel điện di sản phẩm PCR của 20 MPL B. theobromae
dùng mồi ITS1 và ITS4. .......................................................................................... 32
Hình 4.4 Kết quả so sánh các trình tự nucleotide vùng ITS1
của 20 MPL B. theobromae ....................................................................................... 32
Hình 4.5 Kết quả BLAST trình tự rDNA-ITS của 20 MPL
trên GenBank (NCBI) ............................................................................................... 33
Hình 4.6 Gel điện di sản phẩm khuếch đại DNA của 4 MPL .........................................
nấm B. theobromae với 3 mồi ISSR Mj 3, Mj 4, Mj 5. .............................................. 33
Hình 4.7 Gel điện di sản phẩm khuếch đại DNA nấm B. theobromae
với 4 mồi Mj5, T39, UBC 826, T27 theo thứ tự bằng chỉ thị ISSR ............................. 36
Hình 4.8 Cây phân nhóm di truyền thu đƣợc từ phân tích UPGMA,
sử dụng hệ số tƣơng đồng DICE dựa trên 214 băng ISSR,
chỉ ra mối quan hệ di truyền của 20 MPL nấm B. theobromae. . ................................ 37

viii


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU

1.1.Đặt vấn đề
Những năm gần đây, bệnh nứt vỏ hay còn gọi là bệnh Botryodiplodia, do nấm
Botryodiplodia theobromae Pat gây ra xuất hiện phổ biến và gây hại đáng kể trên cây
cao su vùng Đông Nam Bộ. Năm 1998, dịch bệnh bùng phát trên vƣờn cây cao su tại
Công ty Cao su Dầu Tiếng, gây hại trên vƣờn kiến thiết cơ bản và vƣờn khai thác.
Hiện nay, bệnh gây hại trên tất cả các giai đoạn của cây cao su từ vƣờn ƣơng, vƣờn
nhân, vƣờn kiến thiết cơ bản đến vƣờn khai thác của các dòng vô tính RRIV 4, PB
260, VM 515, PB 235, trong đó dòng RRIV 4 rất mẫn cảm (Phan Thành Dũng, 2011).
Bệnh gây hại nặng vào mùa mƣa, ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, sản lƣợng và thậm chí
gây chết cây.
Đối với bệnh hại nói chung và bệnh trên cây cao su nói riêng, tuỳ từng điều
kiện cụ thể mà chúng ta có nhiều cách để kiểm soát bệnh cho phù hợp nhƣ: kiểm soát
về mặt di truyền, hoá học, sinh học… hoặc kết hợp chúng để cho ra quy trình kiểm
soát dịch bệnh hiệu quả nhất. Đối với việc phòng trừ bệnh Botrodiplodia, biện pháp
đang đƣợc ứng dụng phổ biến là sử dụng các loại thuốc hóa học. Tuy nhiên, hiệu quả
điều trị còn nhiều hạn chế do nhận diện không đúng triệu chứng bệnh, phun chƣa đúng
loại thuốc và kỹ thuật xử lý chƣa hoàn thiện (Phan Thành Dũng, 2011). Hơn nữa, việc
phun thuốc hóa học đòi hỏi nhiều nhân công lao động và hóa chất sử dụng có ảnh
hƣởng đến sức khỏe ngƣời lao động và môi trƣờng. Những năm gần đây, kiểm soát
bệnh hại bằng biện pháp di truyền học và sinh học đang đƣợc nghiên cứu ứng dụng ở
một số nƣớc trồng cao su nhằm khắc phục những hạn chế của biện pháp hoá học. Một
trong những biện pháp hữu hiệu đang đƣợc áp dụng hiện nay là trồng những dòng vô
tính cao su kháng bệnh. Tuy nhiên, đối với một số bệnh hại, mức độ bảo hộ tính kháng
bệnh ngày càng giảm với mỗi dòng vô tính và ở những vùng địa lý khác nhau thì mức
độ mẫn cảm đối với bệnh cũng khác do trong những năm qua, việc chọn lọc và cải tạo
giống cao su tập trung vào các yếu tố kinh tế nhƣ sản lƣợng cao, sinh trƣởng khỏe đã
làm thất thoát nhiều gen kháng bệnh. Điều này cũng cho thấy có sự tồn tại nhiều nòi
sinh lý khác nhau của nấm bệnh (Ismail và Jeyanayagi, 1999). Do đó, kiểm soát bệnh
bằng biện pháp di truyền (genetic control) đang đƣợc mong đợi sẽ đem lại hiệu quả
tích cực hơn.

1


Cho đến nay, các nghiên cứu liên quan đến hình thái cũng nhƣ phân tử của nấm
B. theobromae gây bệnh cho cây cao su trên thế giới nói chung và đối với nƣớc ta nói
riêng còn khá hạn chế. Việt Nam vẫn chƣa có một nghiên cứu nào đƣợc công bố về
việc đánh giá đa dạng di truyền của loài nấm này. Chính vì vậy việc nghiên cứu đa
dạng di truyền nấm B. theobromae trên cây cao su bằng kỹ thuật phân tử là điều mang
tính cấp thiết. Kết quả của nghiên cứu này sẽ không những tạo thêm nguồn tƣ liệu cho
các nghiên cứu về bệnh này trong nƣớc, mà còn bổ sung thêm tƣ liệu cùng các quốc
gia khác mở rộng hiểu biết về tác nhân gây bệnh, từ đó làm cơ sở cho việc phát triển
các phƣơng pháp phòng trị và quản lý bệnh hiệu quả.
Trên cơ sở đó, đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền một số mẫu phân lập nấm
Botryodiplodia theobromae trên cây cao su bằng phƣơng pháp giải trình tự vùng
rDNA – ITS và chỉ thị phân tử ISSR” đƣợc thực hiện.
1.2.Yêu cầu đề tài
 Xác định quy trình ly trích DNA nấm B. theobromae.
 Tìm hiểu tính đa dạng và mối quan hệ di truyền của một số MPL nấm B.
theobromae đƣợc thu thập tại một số vùng trồng cao su ở Việt Nam bằng phƣơng
pháp giải trình tự vùng rDNA – ITS và chỉ thị phân tử ISSR.
1.3. Nội dung thực hiện
 Phân lập và lƣu giữ nguồn nấm B. theobromae đƣợc thu thập từ một số vùng trồng
cao su khác nhau.
 So sánh 2 phƣơng pháp ly trích DNA: 1) ly trích theo phƣơng pháp CTAB (Doyle
và Doyle, 1987) và 2) sử dụng DNeasy Plant Mini Kit (QUIAGEN) để lựa chọn
quy trình ly trích cho DNA có chất lƣợng tốt nhất.
 Dùng kỹ thuật PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA của các MPL, giải trình tự sản
phẩm PCR, sau đó so sánh trình tự DNA của các MPL nấm B. theobromae nghiên
cứu trên cây cao su ở Việt Nam với nhau và với trình tự của B. theobromae có sẵn

trong ngân hàng gen (GenBank) bằng phần mềm BLAST.
 Dùng kỹ thuật PCR với chỉ thị phân tử ISSR khuếch đại DNA của các MPL. So
sánh sự khác biệt của các băng đƣợc khuếch đại trên gel điện di để phân tích đa
dạng di truyền.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về cây cao su Hevea brasiliensis
2.1.1. Nguồn gốc cây cao su ở Việt Nam
Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) có nguồn gốc Nam Mỹ, mọc hoang
dại trên một vùng địa bàn rộng lớn từ 5-6 triệu km2, bao gồm toàn bộ lƣu vực sông
Amazon và các vùng kế cận. Cây cao su xuất hiện ở Việt Nam năm 1877 sau khi thực
dân Pháp xâm chiếm nƣớc ta. Một ngƣời Pháp có tên là Pierre mang hạt giống từ
Singapore đến, lập vƣờn ƣơng thử ở Bách Thảo Sài Gòn, nhƣng không cây nào sống.
Đến năm 1897, Raul, một dƣợc sĩ hải quân ngƣời Pháp gởi hạt giống ở Java
(Indonesia) về đem gieo trồng ở trạm thí nghiệm Ông Yệm (Bến Cát - Sông Bé). Một
số hạt giống đƣợc gởi cho bác sĩ Yersin cùng với một số hạt giống xin thêm ở Co (Sri
Lanka) đƣa gieo trồng ở trại thí nghiệm của viện Pasteur (Suối Dầu, Nha Trang), tạo
thành đồn điền cao su 400 cây đầu tiên ở Việt Nam. Đến thế kỷ XX, các vƣờn cao su
đƣợc trồng tại vùng Đông Nam Bộ, sau đến thập kỷ 50, cây cao su đƣợc trồng một số
vùng ở Tây Nguyên, miền Trung và một số vùng ở phía Bắc (Đặng Văn Vinh, 2000).
Tính đến năm 2008 Việt Nam có đến hơn 580.000 ha cao su (Tổng cục Thống
kê, 2008), trong đó quốc doanh quản lý hơn 250.000 ha, số còn lại do các thành phần
kinh tế khác quản lý. Hiện nay Việt Nam đã thành lập Hiệp hội cao su và là thành viên
của Hiệp hội các nƣớc sản xuất cao su thiên nhiên (ANRPC).
2.1.2. Bệnh hại trên cây cao su
Trong những thập niên qua sản lƣợng cao su không ngừng đƣợc cải thiện qua
những tiến bộ trong công tác cải tiến giống và kỹ thuật nông nghiệp. Tuy nhiên, thiệt

hại do bệnh gây ra gia tăng đáng kể, một phần do việc chọn lọc giống chủ yếu theo
hƣớng sản lƣợng cao và sinh trƣởng khỏe đã làm thất thoát nhiều gen kháng bệnh, mặt
khác do việc trồng thâm canh tập trung diện tích cao su cao độ đã tạo điều kiện thuận
lợi cho dịch bệnh hại. Hậu quả là nhiều dòng vô tính có sản lƣợng và chỉ tiêu sinh
trƣởng cao nhƣng mẫn cảm với một hoặc nhiều loại bệnh.
Cây cao su bị nhiễm rất nhiều loại bệnh và chủ yếu là do nấm gây ra. Chee
(1987) đã liệt kê hơn 550 loài vi sinh vật có liên quan đến cây cao su, và trong đó có
24 loài gây ra những thiệt hại quan trọng về kinh tế. Tuy nhiên mức độ thiệt hại còn

3


phụ thuộc nhiều vào điều kiện khí hậu, điều kiện canh tác và cũng nhƣ chiến lƣợc
phòng trừ bệnh của từng vùng. Tùy theo vị trí bị hại, bệnh trên cây cao su đƣợc chia ra
thành các nhóm bệnh lá, bệnh thân cành, bệnh mặt cạo và bệnh rễ. Các loại bệnh có
thể kiểm soát đƣợc bằng các biện pháp phòng trị khác nhau.
Những năm gần đây, bệnh nứt vỏ hay còn gọi là bệnh Botryodiplodia, do nấm
Botryodiplodia theobromae Pat gây ra xuất hiện phổ biến và gây hại đáng kể trên cây
cao su vùng Đông Nam Bộ. Năm 1998, dịch bệnh bùng phát trên vƣờn cây cao su tại
Công ty Cao su Dầu Tiếng, gây hại trên vƣờn kiến thiết cơ bản và vƣờn khai thác.
Hiện nay, bệnh gây hại trên tất cả các giai đoạn của cây cao su từ vƣờn ƣơng, vƣờn
nhân, vƣờn kiến thiết cơ bản đến vƣờn khai thác của các dòng vô tính RRIV 4, PB
260, VM 515, PB 235, trong đó dòng RRIV 4 rất mẫn cảm (Phan Thành Dũng, 2011).
Bệnh gây hại nặng vào mùa mƣa, ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, sản lƣợng và thậm chí
gây chết cây.
2.2. Sơ lƣợc về nấm B. theobromae
2.2.1. Phân loại học
Giới

Fungi

Ngành (Phylum) Ascomycota
Lớp (class)

Dothideomycetes

Bộ (Order)

Botryophaeriales

Họ (Family)

Botryophaeriaceae

Giống (Genus)

Botryodiplodia

Loài (species)

Botryodiplodia theobromae Pat.

2.2.2. Lịch sử phát hiện nấm B. theobromae
Nấm Botryodiplodia theobromae Patouillard [Lasiodiplodia theobromae
(Patouillard) Griffon và Maublanc] phân bố rộng ở khu vực khí hậu nhiệt đới và đƣợc
ghi nhận là loại nấm ký sinh có khả năng gây bệnh trên nhiều cây ký chủ. Nấm đƣợc
mô tả đầu tiên bởi Patouillard vào năm 1892 (Griffiths, 1966). Đến năm 1895, đã có
báo cáo đầu tiên ghi nhận loài nấm này là tác nhân gây bệnh chết ngƣợc trên cây cacao
ở Cameroon (Mbenoun và ctv, 2008). Từ đó, nấm xuất hiện và phát triển nhanh chóng
qua nhiều quốc gia, gây hiện tƣợng chết ngƣợc trên xoài (Muhammad và ctv, 2006),

chuối (Williamson và ctv, 1965), cam, quýt (Triwiratno và ctv, 2004) và nhiều cây
trồng khác ở Malaysia, Pakistan, Sri Lanka, Bangladesh và Indonesia. Năm 2008, đã
4


có báo cáo đầu tiên về sự xuất hiện của nấm B. theobromae trên cây mít tại Đài Loan.
Nấm cũng đƣợc ghi nhận là nguyên nhân gây bệnh thối trái trên xoài, đu đủ và chuối
tại quốc gia này (Michael, 2008).
Năm 1954, Zambettakis đã có công trình nghiên cứu về những tên gọi khác
nhau của nấm B. theobromae Pat. Theo đó, nấm có những tên gọi khác nhau nhƣ:
Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff. & Maubl., 1909; Diplodia theobromae (Pat.)
Nowell, 1923; Diplodia gossypina Cooke, 1879; Diplodia cacaoicola Henn, 1895;
Macrophoma vestita Prill. & Delacr., 1894; Lasiodiplodia tubericola Ellis & Everh.,
1896; Diplodia tubericola (Ellis & Everh.) Taub., 1915; Botryodiplodia tubericola
(Ellis & Everh.) Petrak, 1923; Botryodiplodia gossypii Ellis & Barth., 1902;
Botryodiplodia

elasticae

Petch,

1906;

Chaetodiplodia

grisea

Petch,

1906;

Lasiodiplodia nigra Appel & Laubert, 1906; Diplodia rapax Massee, 1910; Diplodia
natalensis Pole Evans, 1911; Lasiodiplodia triflorae Higgins, 1916; Diplodia
ananassae

Sacc.,

1917;

Botryodiplodia

ananassae

(Sacc.)

Petrak,

1929.

(Punithalingam, 1976).
2.2.3. Phạm vi phân bố, phổ kí chủ và khả năng gây bệnh
Nấm B. theobromae phân bố khắp nơi trên thế giới, nhƣng chủ yếu giới hạn ở
khu vực vĩ tuyến 40o Bắc đến 40o Nam, có khả năng ký sinh trên 500 loại cây trồng
khác nhau (Punithalingam, 1976).
Nấm đã đƣợc ghi nhận tại nhiều quốc gia trên thế giới thuộc khu vực khí hậu
nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo Goss Roger và ctv (1961), một số ký chủ của nấm là
cây trồng quan trọng đƣợc nhiều tác giả ghi nhận và nghiên cứu nhƣ cam quýt
(Nowell, 1923; Pole-Evans, 1910), cao su (Cook, 1913; Petch, 1921), chè (Cook,
1913; Johnston, 1960), cacao (Charles, 1906; Cook, 1913; Griffon và Maublanc, 1909;
Petch, 1921; Urquhart, 1961), mía đƣờng (Howard, 1901; Nowell, 1923), bông vải

(Johnston, 1960; Patouillard, 1922), cọ dầu (Johnston, 1960; Zambettakit, 1950), xoài
(Charles, 1906; Zambettakit, 1950), cà phê (Massee, 1909; Riley, 1960), đu đủ (Petch,
1921; Zambettakit, 1950), điều (Riley, 1960), thuốc lá (Averna-Sacca, 1922) đậu
phộng (Wilson, 1947) và chuối (Wardlaw, 1935).
Năm 2004, Ko và ctv (2004) khẳng định, loài nấm gây hại trên cây quất ở Đông
Bắc Đài Loan những năm 1990, làm ảnh hƣởng đến 80% các vƣờn quất chính là nấm
L. theobromae chứ không phải là Phytophthora citrophthora. Ở những cành cây bị
5


nấm tấn công, triệu chứng đầu tiên là lá hóa vàng hoặc nâu, sau đó là rụng lá và rụng
quả, và hậu quả là gây ra hiện tƣợng chết ngƣợc của các cành này. Triệu chứng bệnh
có thể lây lan sang các nhánh khác của cây, gây xì mủ trên thân cây, và cuối cùng là
làm chết cả cây. Ở Indonesia, nấm còn là một trong số những tác nhân gây bệnh trên thân
cho cây thuộc họ cam quýt, làm thiệt hại đáng kể về mặt kinh tế (Triwiratno và ctv, 2004).
Ở Pakistan, nấm đƣợc phát hiện trên hơn 50 loại cây trồng khác nhau, gây hiện
tƣợng chết ngƣợc trên xoài, xì mủ trên thân và thối trái. Nấm tấn công từ đầu mút của
đọt non vào phía gỗ già, các lá non bị nấm tấn công từ phía cuống dọc theo gân lan ra
ngoài mép lá, lá già bị bệnh chuyển sang màu nâu. Lá rụng để lại cành trơ trụi, trƣờng
hợp bị nặng làm chết toàn bộ cây. Nấm tấn công trên thân và cành gây xì mủ, ban đầu
xuất hiện những giọt mủ xì ra sau đó chảy phủ tràn lên thân cành, nếu bị nặng xuất
hiện những vết nứt lớn, mủ có màu từ vàng đến nâu (Muhammad và ctv, 2006).
Ở Cameroon, từ cuối những năm 1980, cây ca cao ở đây đã bị thiệt hại nặng bởi
bệnh chết ngƣợc do nấm B. theobromae gây ra. Bệnh đã đƣợc ghi nhận trên tất cả vƣờn
sản xuất, 100% các trang trại trồng ca cao ở Cameroon đều bị nấm bệnh tấn công. Triệu
chứng đầu tiên là lá trên những cành non bị vàng, sau đó lan ra toàn bộ cành và dọc
xuống thân chính, cuối cùng dẫn đến cái chết của cây. Nấm còn có khả năng gây hại trên
nhiều bộ phận khác nhƣ cành non, vỏ cây và quả cacao (Mbenoun và ctv, 2008).
Những năm gần đây, các nhà khoa học ở Ấn Độ đã tiến hành nghiên cứu về tình
hình bệnh hại trên các loại cây ăn quả. Kết quả cho thấy, nấm B. theobromae có khả

năng gây thiệt hại nặng về kinh tế trên cây chuối, làm giảm sút việc thu hoạch. Từ đó,
đã có nhiều báo cáo ghi nhận nấm B. theobromae là nguyên nhân gây thối rễ và thân
chuối, nhƣng cho đến nay vẫn chƣa có nghiên cứu chi tiết nào đƣợc tiến hành và bệnh
hại vẫn tiếp tục gia tăng ở quốc gia này (Williamson và ctv, 1965).
Nấm B. theobromae đƣợc ghi nhận trên cây cao su tại một số nƣớc nhƣ Trung
Quốc, Ấn Độ, Malaysia nhƣng gây hại không đáng kể. Ở Philippines, nấm tấn công
trên vƣờn cây trồng mới gây ra hiện tƣợng chết ngƣợc trên vƣờn KTCB và KT gây xì
mủ. Tại Việt Nam, nấm đƣợc Vincens phát hiện trên cây cao su vào năm 1921, gây
bệnh chết ngƣợc ở giai đoạn KTCB. Barat (1931) cho biết, nấm gây hại trên cổ rễ
stump trong vƣờn ƣơng.
Tại Venezuela, L. theobromae gây ra bệnh rụng lá chồi và chết ngƣợc trên cây
thông (Pinus caribaea var. hondurensis, P. oocarpa), xoan Ấn Độ (Azadirachta
6


indica), chanh (Citrus aurantiifolia), chè (Camellia sinensis) và chanh dây (Passiflora
edulis)(Cedeno và PalaciosPru, 1992; Cedeno và ctv 1995, 1996); và cũng là một tác
nhân quan trọng của gây ra các vết sọc màu xanh trong gỗ (Mohali và ctv, 2002) làm
suy giảm chất lƣợng của gỗ thông Caribê, do đó làm giảm giá trị của nó lên đến 50%.
2.2.4. Đặc điểm hình thái

Hình 2.1 Hình thái nấm B. theobromae (Punithalingam, 1976)
A, B: Túi bào tử phấn, C: Những tế bào sản sinh bào tử, D: Bào tử đính

Khuẩn lạc nấm trên môi trƣờng yến mạch (oat agar) có màu từ xám nâu đến
màu xám lông chuột hoặc màu đen, trên bề mặt phủ một lớp sợi nấm mịn và dày nhƣ
lông tơ, mặt đáy có màu đen đến đen sậm. Túi bào tử phấn (pycnidia) ở dạng đơn hoặc
phức hợp, thƣờng kết hợp thành khối, bên trong chứa thể nền, có miệng nhỏ và nhiều
lông cứng, túi bào tử phấn có khi rộng đến 5 mm. Cuống bào tử đính (conidiophores)
trong suốt, đơn bào, thỉnh thoảng có vách ngăn, hình trụ ít khi phân nhánh, phát sinh từ

những lớp bên trong của các tế bào nằm ở khoang hình trụ. Những tế bào sản sinh bào
tử (conidiogenous cells) trong suốt, dạng đơn, hình trụ đến hình hơi giống quả lê
ngƣợc, phân cắt hoàn toàn, có phân đốt. Bào tử đính lúc đầu ở dạng đơn bào, trong
suốt, bề mặt có nhiều hạt nhỏ, dạng hơi giống hình trứng đến hình elip thuôn, vách tế
bào dày, đế ngắn. Khi trƣởng thành bào tử đính có một vách ngăn ở giữa, màu vỏ quế

7


đến nâu vàng, thƣờng có nhiều sọc dài theo chiều dọc, chiều dài bào tử biến thiên từ
20 – 30 µm và chiều rộng biến thiên từ 10 – 15 µm. Sợi nấm vô tính trong suốt, hình
trụ đôi khi có vách ngăn, dài khoảng 50 µm. Túi bào tử phấn trên lá, thân cây và quả ở
dạng tìm ẩn, về sau xuất hiện đột ngột, ở dạng đơn hoặc tập hợp thành nhóm, rộng 2 –
4 mm, có miệng nhỏ, thƣờng có nhiều lông mịn với vô số bào tử đính nằm trong một
khối màu đen (Punithalingam, 1976).
2.2.5. Đặc điểm sinh lý
Nhiệt độ giữ vai trò quan trọng và có ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh trƣởng
cũng nhƣ hình thành bào tử của nấm B. theobromae. Theo Shahidul và ctv (2001), tốc
độ phát triển của sợi nấm có mối quan hệ chặt chẽ với nhiệt độ. Ở nhiệt độ dƣới 10oC
và trên 45oC, sợi nấm ngừng sinh trƣởng và không hình thành bào tử, bào tử chỉ hình
thành trong khoảng nhiệt độ 15 – 40oC. Trong đó, bào tử phát triển nhiều nhất ở 30oC
(38 bào tử/0,01 ml) và ít nhất ở 15oC (6 bào tử/0,01 ml). Theo Alasoadura (1970),
trong khoảng từ 48 – 72 giờ sau khi cấy, sợi nấm phát triển chậm và trong suốt. Về sau,
sợi nấm phát triển nhanh dần và bắt đầu chuyển sang màu nâu sậm do có sự sản xuất sắc
tố melanin. Ở nhiệt độ 28oC, sợi nấm mọc nhanh, tốc độ phát triển khoảng 1 mm/giờ.
Khác với nhiệt độ, ánh sáng không ảnh hƣởng nhiều đến quá trình sinh trƣởng
của nấm B. theobromae. Trên môi trƣờng PDA, sợi nấm vẫn sinh trƣởng và hình thành
bào tử dƣới những điều kiện ánh sáng khác nhau. Tuy nhiên, trong điều kiện chiếu
sáng liên tục, đƣờng kính khuẩn lạc và số lƣợng bào tử đạt cao nhất (90 mm và 112
bào tử/0,01 ml). Bào tử hình thành ít nhất trong điều kiện bóng tối liên tục (24 bào

tử/0,01 ml) và kích thƣớc khuẩn lạc trung bình là 78 mm (Shahidul và ctv, 2001).
Số lƣợng bào tử và tốc độ phát triển của sợi nấm trên các môi trƣờng khác nhau
có sự biến thiên lớn. Theo Shahidul và ctv (2001), bào tử nấm hình thành trên môi
trƣờng Czapek’s Dox nhiều hơn trên các môi trƣờng PDA, PCM và Richard’s, sợi nấm
không phát triển trên môi trƣờng Sabouraud’s. Trong đó, khuẩn lạc có nhiều sắc tố
nhất đối với môi trƣờng PDA (75% màu đen và 25% màu trắng), ngƣợc lại ít hình
thành sắc tố trên môi trƣờng PCM (10% màu đen và 90% màu trắng). Theo
Muhammad và ctv (2006), trong các môi trƣờng PSA (potato sucrose agar), WA
(water

agar), CZA (Czapek’ s Dox agar), CMDA (corn mealdextrose agar), PCA

(potato carrot agar), CMA (corn meal agar) và YEMA (Yeast Extract Manitol Agar)
thì 3 môi trƣờng PSA, CMDA và YEMA là thuận lợi nhất cho sợi nấm B. theobromae
8


phát triển. Ở nhiệt độ 30oC, khuẩn lạc nấm trên 3 môi trƣờng này đã mọc đầy đĩa petri
chỉ sau 5 ngày cấy. Trong đó, số lƣợng túi bào tử phấn trên môi trƣờng YEMA là
nhiều nhất, PCA và CMA có số lƣợng túi bào tử phấn ít hoặc không có.
2.2.6. Sự xâm nhiễm, sự lây lan và khả năng tồn tại
Nấm B. theobromae là loài ký sinh vết thƣơng gây hại trên nhiều loại cây trồng
khác nhau. Nấm gây các bệnh thối thân, vỏ, củ và rễ, gây hại trên lá gây bệnh thán thƣ
và đốm lá, triệu chứng phổ biến thấy trên thân là xì mủ và vỏ nổi nhiều vết mụn nhỏ
(Trần Ánh Pha, 2009). Bào tử nấm xâm nhiễm vào cây qua vết thƣơng hoặc xâm nhập
qua vỏ cây. Nấm có khả năng sống tiềm sinh nếu gặp điều kiện môi trƣờng bất lợi.
Ngoài cây cao su, nấm còn ký sinh trên nhiều loại cây khác nhau, chủ yếu là cây thân
gỗ (Phan Thành Dũng, 2004).
Theo Punithalingam (1976), từ những vết bệnh thối rữa trên cây, bào tử nấm
B. theobromae phát tán nhờ gió và nƣớc. Nấm có khả năng lƣu tồn qua hạt giống của

một số cây nhƣ cây cacao, cây bông vải, cây đậu phộng, cây sơn trà Nhật Bản, cây
chuối, cây cao su. Ngoài ra, bào tử đính còn có thể lƣu tồn trong đất và đƣợc lan
truyền nhờ côn trùng. Bào tử đính có thể lƣu tồn trên hạt giống khoảng 4 tháng và sợi
nấm có khả năng tồn tại đến 1 năm.
2.3. Nấm B. theobromae trên cây cao su
2.3.1. Tình hình và tác hại của bệnh
Nấm B. theobromae đƣợc ghi nhận trên cây cao su tại một số nƣớc nhƣ Trung
Quốc, Ấn Độ, Malaysia nhƣng gây hại không đáng kể. Ở Philipine nấm tấn công trên
vƣờn cây trồng mới gây hiện tƣợng chết ngƣợc trên vƣờn kiến thiết cơ bản (KTCB) và
vƣờn cây khai thác (KT) gây xì mủ.
Nấm đƣợc Vincens phát hiện trên cây cao su tại nƣớc ta vào năm 1921, gây hiện
tƣợng bệnh chết ngƣợc ở giai đoạn KTCB. Barat (1931) cho biết, nấm gây hại trên cổ rễ
stump trong vƣờn ƣơng. Bệnh xuất hiện và gây hại trên cây cao su vào năm 1998 trên
vƣờn cây KTCB và vƣờn cây KT tại Nông trƣờng Đoàn Văn Tiến, Công ty Cao su Dầu
Tiếng. Gần đây, bệnh phát triển và gây hại cho nhiều diện tích cao su ở Công ty Cao su
Đồng Nai, Bình Long, Phƣớc Hoà, Lộc Ninh, Tây Ninh và nhất là các diện tích cao su
tƣ nhân tại Đông Nam Bộ, phổ biến trên các dvt RRIV 4, PB 235 và VM 515

9


Bệnh gây hại cho cây cao su ở tất cả các giai đoạn từ vƣờn ƣơng, vƣờn nhân,
vƣờn cây KTCB đến vƣờn cao su khai thác và thƣờng xuất hiện trong mùa mƣa hàng
năm, từ tháng 6 – 11.
- Trên vƣờn ƣơng: Nấm gây hại tại vị trí mắt gh p bắt đầu vào thời điểm mở
băng, dẫn đến hiện tƣợng chết ngƣợc mắt gh p hay chết toàn bộ chồi.
- Trên vƣờn cây cao su KTCB: Gây hại từ 1 năm tuổi trở lên làm chậm sinh
trƣởng và có thể gây chết cây.
- Trên vƣờn cao su KT: Giảm sản lƣợng, bị nặng gây khô miệng cạo hoàn toàn.
Những năm gần đây bệnh do nấm B. theobromae gây hại đáng kể trên các dòng

vô tính (dvt) bảng 1 khuyến cáo cho vùng Đông Nam Bộ, gậy hại nặng ở một số Công
ty Cao su nhƣ Bình Long (gây chết mắt ghép trên vƣờn ƣơng và vƣờn cây trồng mới,
chết chồi trên dvt PB 260 và RRIV 4), Tây Ninh (trên vƣờn cây KTCB của dvt RRIV
4), Phƣớc Hòa (stump bầu có tầng lá dvt PB 255), Đồng Nai (stump bầu có tầng lá dvt
PB 260, trên vƣờn cây KT của dvt PB 235 và VM 515), Phú Riềng (gây hại trên vƣờn
cây KTCB dvt RRIV 4) (Trần Ánh Pha, 2009).
2.3.2. Triệu chứng bệnh
Vƣờn stump trần: Nấm bệnh tấn công gốc gh p xuất hiện những nốt mụn nhỏ
sau đó liên kết lại với nhau làm vỏ sần sùi, ít nhựa và khó bóc vỏ khi gh p gây ảnh
hƣởng đến tỷ lệ sống. Bệnh xuất hiện tại vị trí mắt gh p, bắt đầu vào thời điểm mở
băng, gây ra hiện tƣợng chết lại mắt gh p.
Stump bầu và vƣờn tái canh – Trồng mới (TC-TM): Bệnh xuất hiện trên chồi có
triệu chứng ban đầu với vết l m có màu đậm hơn, sau đó lan rộng và chết khô toàn bộ,
vỏ bị chết xuất hiện những đốm nhỏ màu đen chứa nhiều bào tử. Phần gỗ bị chết có
màu trắng với những vân nhỏ màu nâu đen (là khuẩn ty xâm nhiễm vào gỗ), vỏ chết
khó tách khỏi gỗ.
Vƣờn nhân: Xuất hiện những nốt mụn nhỏ trên vỏ xanh nâu, sau đó liên kết lại
với nhau làm khó bóc vỏ khi gh p và ít nhựa gây ảnh hƣởng đến tỷ lệ sống. Đây là
nguồn nấm có thể lây lan sang gốc gh p và gây ra hiện tƣợng chết lại mắt gh p.
Vƣờn cây 1 – 2 năm tuổi (trên vỏ xanh nâu): Trên chồi với vết nứt có dạng hình
thoi sau đó phát triển theo hƣớng lên trên và xuống dƣới, tại vết bệnh có hiện tƣợng
mủ rĩ ra sau đó bị hóa đen do hiện tƣợng oxy hóa, phần vỏ và gỗ bị khô và xốp. Khi

10


vết bệnh lan rộng, tán lá non sẽ khô và h o rũ nhƣng không rụng, trên phần vỏ bị chết
xuất hiện những đốm có màu nâu đen chứa nhiều bào tử.
Vƣờn cây từ 3 năm tuổi trở lên (vỏ hoá nâu) và vƣờn cây kinh doanh: Ban đầu
xuất hiện những nốt mụn nhỏ 1 – 2 mm, sau đó lan ra toàn bộ thân cành. Các nốt này

liên kết lại tạo các vết nứt trên vỏ, đôi khi có mủ rỉ ra từ những vết nứt. Lớp biểu bì
bên ngoài dày do nhiều lớp tạo thành. Cây bị nhiễm bệnh nặng gây nứt vỏ trên thân,
cành và phần vỏ sát gốc bị thối. Cây chậm phát triển, vỏ nguyên sinh bị u lồi, bề mặt
gồ ghề nên không thể mở cạo hoặc có thể gây chết cây. Trên vƣờn khai thác bệnh làm
giảm sản lƣợng, nếu k o dài sẽ dẫn đến khô miệng cạo (Trần Ánh Pha, 2009).

11


Hình 2.2 Triệu chứng bệnh trên vƣờn stump

Hình 2.3 Triệu chứng bệnh trên vỏ xanh

Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên cây có vỏ hóa nâu

12


2.3.3. Biện pháp phòng trừ
Năm 1999, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam đã kết hợp với Công ty Cao su
Dầu Tiếng tiến hành thử nghiệm một số loại thuốc trên vƣờn cây KTCB và KT ở Nông
trƣờng Đoàn Văn Tiến. Kết quả là đã chọn ra đƣợc một số công thức khuyến cáo đƣa
vào quy trình kỹ thuật của Tập đoàn Công nghiệp Cao su Việt Nam năm 2004. Theo
đó, các loại thuốc chứa hoạt chất carbendazim có thể dùng để phòng trừ hiệu quả bệnh
do nấm B. theobromae gây ra trên cây cao su, bao gồm: Vicarben 50 HP, Bavistin 50
FL, Carbenzim 500 FL, 50 WP với nồng độ là 0,5% (Phan Thành Dũng, 2004). Đến
năm 2007, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam phối hợp với Công ty Cao su Đồng Nai
tiến hành thử nghiệm một số loại thuốc trên vƣờn cây KT ở nông trƣờng Bình Lộc.
Một số công thức đƣợc khuyến cáo: (1) Vicarben 50 HP nồng độ 0,5%
nồng độ 1%; (2) Anvil 5 SC nồng độ 0,5%

super 250 EC 0,2%

BDNH 2000

BDNH 2000 nồng độ 1%; (3) TILUSA

BDNH 2000 nồng độ 1%.

2.4. Phân tích đa dạng di truyền dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử
2.4.1. Khái niệm đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là sự khác biệt về đặc điểm di truyền giữa các loài, giữa các
quần thể cách ly nhau về mặt địa lý cũng nhƣ giữa các các thể cùng chung sống trong
một quần thể.
Sự biến đổi di truyền giữ một vai trò quan trọng đối với khả năng đối phó, tồn
tại của loài và quần thể trƣớc những thay đổi của các yếu tố môi trƣờng. Không có
sinh vật nào dự đoán trƣớc đƣợc tƣơng lai, cũng không có sinh vật nào có khả năng
thích ứng tốt với tất cả điều kiện môi trƣờng. Tuy nhiên, cấu trúc di truyền hiện có của
một loài có ảnh hƣởng đến khả năng thích nghi với các điều kiện môi trƣờng trong
tƣơng lai của các cá thể trong loài. Tính đa dạng cao thì khả năng thích ứng với sự
biến đổi của điều kiện môi trƣờng càng lớn.
2.4.2. Trình tự ribosomal DNA – Internal Transcribed Spacer (rDNA – ITS)
rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong
các nghiên cứu phát sinh loài. rDNA đƣợc quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen có
nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên
tiếp trên một locus và liên quan mật thiết với quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosom hầu
nhƣ tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA
tƣơng đối bảo tồn nên đƣợc xem là cở sở để tìm ra sự tƣơng đồng và các khác biệt khi
13

so sánh với các sinh vật khác nhau. Các mồi và các probe cũng đƣợc thiết kế dựa trên
các vùng bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de Peer và ctv,
1996 ). Mặt khác, thông tin các đoạn DNA đƣợc phát hiện trong các sinh vật đa dạng
có sự biến động số lƣợng trình tự rất lớn để có thể định danh (McCartney và ctv,
2003). Nghiên cứu so sánh trình tự rDNA đóng vai trò qua trọng trong phân loại và
xác định quan hệ di truyền (Woese and Olsen, 1986) và đặc biệt có ý nghĩa trong
ngành phân loại nấm. Trƣớc đây nấm thƣờng đƣợc phân loại dựa trên đặc điểm hình
thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả phân
loại không hoàn toàn chính xác; các so sánh dựa trên trình tự nucleotide đƣợc xem là
cơ sở chính xác và có ý nghĩa nhất trong phân loại nấm (Guarro, 1999).

Hình 2.5 Cấu trúc của một đơn vị rDNA (Nguồn: Vilgalys và ctv, 1992).
Các rDNA 5,8S, 18S và 25S phiên mã thành các tiền rRNA riêng lẻ, nằm xen
kẻ với các vùng phiên mã bên trong (Internal Transcribed Spacer - ITS) và các vùng
phiên mã bên ngoài (ETS). Giữa các nhóm gen gồm nhiều bản sao lặp lại và vùng
không phiên mã. Có một rDNA 5S thƣờng không có vị trí cố định và có chiều sao mã
ngƣợc với các gen còn lại, rDNA 5S thƣờng chỉ có ở nhân, không có ở ty thể một số
loài nấm. Kích thƣớc mỗi vùng lặp lại nằm trong khoảng 7,7- 24 Kbp (Guarro, 1999).
rDNA 5,8S thƣờng đƣợc quan tâm nghiên cứu. rDNA 5,8S có kích thƣớc rất nhỏ và
ít biến đổi song là thành phần không thể thiếu của nu-LSU-rRNA, có vai trò ổn định cấu
trúc ribosom và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein (Szymanski và ctv, 2001). rDNA 25S
mặc dù ít có sự biến đổi song lại rất có ý nghĩa trong phân loại (Guarro,1999).

14


Vùng ITS là vùng rất biến động, mặc dù vùng ITS thƣờng đƣợc sử dụng trong
nghiên cứu tiến hóa của vi sinh vật. Tuy nhiên, phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ
thƣờng sử dụng ở mức độ xác định biệt hóa trong cùng một loài (Guarro, 1999). Các
trình tự gen rDNA đƣợc thu thập bằng cách phân lập và giải trình tự gen từng dòng vô

tính riêng. Trực tiếp giải trình tự rDNA đƣợc thực hiện để thu đƣợc trình tự nhanh
chóng. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cần một lƣợng DNA tƣơng đối lớn và có thể dẫn
đến sai lệch bởi vì chỉ duy nhất 1 chuỗi đƣợc giải trình tự. Việc thực hiện phản ứng
PCR và giải trình tự DNA trực tiếp cho một vài thuận lợi hơn so với việc tạo dòng
(cloning) và giải trình tự DNA trực tiếp. Phƣơng pháp này dùng DNA tổng số từ bộ
gen với một lƣợng rất nhỏ (0,1 – 10 ng cho một phản ứng khuếch đại); cả hai mạch
đơn của gen đều có thể đƣợc dùng để giải trình tự nhằm hạn chế bớt sai sót; và phƣơng
pháp này có thể thích hợp với các thiết bị giải trình tự DNA tự động sử dụng các trình
tự mồi có đánh dấu huỳnh quang hay dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP) (White
và ctv, 1990).
Các mồi ITS đƣợc thiết kế để khuếch đại các đoạn khác nhau của vùng ITS nằm
giữa các gen 18S, 5,8S, và 28S (White và ctv, 1990) (Hình 2.7). Trong số các mồi ITS,
cặp mồi ITS1 và ITS4 đã khuếch đại từ đầu 3’ của rDNA 18S tới đầu 5’ của rDNA
28S, bao gồm cả vùng ITS1, 5,8S rDNA và ITS2 (đƣợc biết đến nhƣ là vùng rDNA –
ITS) đã đƣợc sử dụng rộng rãi (Vilgalys, 2008).

Hình 2. 6 Vị trí bắt cặp của các mồi ITS (internal transcribed spacer), các mồi dùng để
giải trình tự đƣợc tô đậm (Nguồn: Vilgalys và ctv, 1992).
Vùng rDNA – ITS đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS1
và ITS4. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc giải trình tự và trình tự nucleotide sẽ đƣợc so
15