KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CÁC PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT TỪ CÂY TƠ XANH (Cassytha filiformis L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ HOẠT TÍNH
CHỐNG OXY HÓA CÁC PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT
TỪ CÂY TƠ XANH (Cassytha filiformis L.)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: ONG TUẤN KHOA

Niên khóa

: 2008 - 2012

Tháng 07 năm 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ HOẠT TÍNH
CHỐNG OXY HÓA CÁC PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT
TỪ CÂY TƠ XANH (Cassytha filiformis L.)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. BÙI THẾ VINH

ONG TUẤN KHOA

Tháng 07 năm 2012


LỜI CẢM ƠN
Xin gửi lời cảm ơn đến Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM đã tạo điều kiện cho
tôi thực hiện đề tài này.
Em xin cảm ơn PGS TS. Lê Đình Đôn trưởng BM Công Nghệ Sinh Học, thầy
đã tạo điều kiện cho em được thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn PGS TS. Trần Công Luận Giám Đốc Trung Tâm Sâm và Dược
Liệu, thầy đã tạo điều kiện cho em được thực hiện đề tài ở trung tâm.
Em xin cảm ơn TS. Đặng Thị Lệ Minh phó trưởng BM Công Nghệ Sinh Học,
cô đã đưa đường, dẫn lối cho em được làm việc ở trung tâm.
Lời cảm ơn chân thành này em xin gửi đến ThS. Bùi Thế Vinh, thầy đã tận tình
hướng dẫn, không ngại gian khó, theo sát chỉ bảo, em trong suốt quá trình thực hiện đề
tài. Thầy còn nhiệt tình giảng dạy , giải đáp thắc mắc và đặc biệt rất tỉ mỉ trong việc
chỉnh sửa luận văn.

Em xin cảm ơn các thầy cô đã truyền đạt kiến thức trong suốt những năm em
theo học ở trường.
Em xin cảm ơn tập thể các anh chị (Thảo, Phương, Thịnh, Phong, Đan, Trúc,
Huấn), vì các anh chi đã không ngại khó khăn mà tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn trong
những lần đầu khi bước chân vào phòng thí nghiệm cho đến khi kết thúc đề tài.
Cảm ơn các bạn Phương, Dung, Mạnh, Linh, Thương, Mai, Diệu, Sơn đã chia
sẽ những niềm vui, nỗi buồn và cùng tôi vượt qua những khó khăn trong suốt những
ngày tháng làm việc ở phòng thí nghiệm Hóa Chế Phẩm.
Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình. Đặc biệt là cha mẹ, hai người đã
dày công gian khổ nuôi nấng con khôn lớn thành người và cho con có được tương lai
như ngày hôm nay.
Ong Tuấn Khoa

i


TÓM TẮT
Đối tượng nghiên cứu là cây Tơ xanh có tên khoa học Cassytha filiformis L.
(Lauraceae), một loại cây sống ký sinh. Tơ xanh thường được sử dụng trong bài thuốc
dân gian ở châu Phi để điều trị bệnh ung thư và một số bệnh khác. Alkaloid aporphine
được phân lập từ cây này đã được chứng minh có hoạt tính gây độc tế bào in vitro. Ở
Việt Nam, hầu như chưa có báo cáo nào về nghiên cứu trên cây Tơ xanh, do đó đề tài:
“Khảo sát thành phần hóa học và thử hoạt tính chống oxy hóa các phân đoạn cao chiết
từ cây Tơ xanh Cassytha filiformis L.” được tiến hành để tìm ra các nguồn dược liệu
mới, định hướng cho các nghiên cứu trên đối tượng này.
Cây Tơ xanh được thu hái ở tỉnh Long An, phơi khô và được nghiền thành bột.
Bột mẫu được ngâm trong methanol, một ít dịch chiết methanol được cô giảm áp để
thu được cao tổng, dịch chiết còn lại tiếp tục được hòa với nước theo tỷ lệ (1:4, v:v) và
sau đó lắc phân đoạn với diethyl ether và dichloromethane, thu được cao ether và cao
alkaloid tổng. Tất cả các phân đoạn đã được thử nghiệm cho hoạt tính chống oxy hóa:

đánh bắt gốc Hydroxyl tự do và đánh bắt gốc tự do DPPH (2,2– diphenyl – 2 –
picrylhydrazyl). Cao alkaloid tổng được phân tách tiếp bằng sắc ký cột để thu các
alkaloid tinh sạch và các alkaloid này được xác định cấu trúc bằng dữ liệu phổ NMR.
Kết quả đạt được bởi việc chiết xuất từ bột dược liệu bằng phương pháp chiết
ngấm kiệt và chiết bằng dung môi hữu cơ thu được 3,4 kg cao thô (cao methanol);
227,3 g cao ether; 39 g cao dichloromethane. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật
cho thấy trong mẫu cao tổng có hiện diện của các chất như: triterpenoid, alkaloid,
proanthocyanidin, acid hữu cơ, hợp chất khử và polyuronid. Cao alkaloid tổng được
định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng cho thấy có sự hiện diện của
alkaloid. Chỉ có cao nước áp dụng được phương pháp thử hoạt tính đánh bắt gốc
hydroxyl tự do vì các cao còn lại không tan trong đệm. Cao nước có hoạt tính cao nhất
54,53 % ở nồng độ 1000 µg/ml. Về hoạt tính đánh bắt gốc tự do DPPH: các cao tổng,
ether, alkaloid tổng đều có hoạt tính cao. Trong đó cao tổng có hoạt tính cao nhất (IC50
= 1,15), thứ hai là cao alkaloid tổng (IC50 = 6,11). Trong khi đó cao nước có hoạt tính
thấp nhất (IC50 = 207,8). Alkaloid tinh sạch phân lập từ cao alkaloid tổng đã được xác
định cấu trúc bởi dữ liệu phổ NMR và so sánh với các tài liệu tham khảo.

ii


SUMMARY
The thesis: "Survey the chemical composition and antioxidant activities of the
frationated extracts of Cassytha filiformis L.".
Cassytha filiformis L. (Lauraceae ) is a parasitic herb. Dodder is often used in
African folk medicine to treat cancer and other diseases. The aporphine alkaloid
isolated from dodder has proved possess in vitro cytotoxic properties. In Viet Nam,
there is no reported for study on this plant. Thus, this study was conducted to find out
the new medicinal plant, orientate for further research on this object.
Cassytha filiformis was collected from Long An province in March, 2011. Powder
of those sample was percolated in methanol. Then, the methanol extract was

evaporated at low pressure to obtain the residue of total extract, which was disolved
with water (1:4, v:v) and then fractionated with diethyl ether and dichloromethane, to
obtain ether extract and the total alkaloid extract. All fractions were tested for
antioxidant activity by DPPH free radical assay. The total alkaloid residue was
continuously purified by column chromatography to collect the pure alkaloid of which
the structure was elucidated by NMR spectrum data.
Extraction of raw material by methol percolation and solvent extraction, resulted
in 3.4 kg of total extract, 227.3 g of ether extract, 39 g of dichloromethane extract.
Survey chemical components showed that the total extract, involved: triterpenoid,
alkaloid, troanthocyanidin, organic acids, reductant and polyuronid. Total alkaloid
extract is qualified by the chemical reaction and thin-layer chromatography showed
the presence of the alkaloid. Only aqueous extract is applicable methods hydroxyl
radical scavenging assay because other extract is not soluble in buffer. Aqueous
extract has the highest activity of 54.53% at a concentration of 1000 mg/ml. DPPH
radical scavenging assay: the total extract, ether extract, total alkaloids extract were
highly active. In the total extract highest activity (IC50 = 1.15), the second is the total
alkaloid extract(IC50 = 6.11). While water extract is the lowest activity (IC50 = 207.8).
The structure of alkaloid isolated from total alkaloid extract was elucidated by NMR
spectra and the compared of previous reference.
Key words: aporphine alkaloid, Cassytha filiformis, extraction, chemical

components, antioxidant activity, Hydroxyl, DPPH
iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn............................................................................................................................. i
Tóm tắt.................................................................................................................................. ii
Summary..............................................................................................................................iii

Mục lục ................................................................................................................................ iv
Danh sách các bảng ............................................................................................................. vi
Danh sách các hình ............................................................................................................. vii
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................viii
Chương 1 GIỚI THIỆU........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu ...................................................................................................................... 1
1.3 Nội dung thực hiện..................................................................................................... 1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................... 2
2.1. Giới thiệu cây Tơ xanh ............................................................................................. 2
2.1.1 Đặc điểm của cây Tơ xanh................................................................................... 2
2.1.2 Sự phân bố và vùng sinh thái của cây Tơ xanh ................................................... 3
2.1.3 Tính vị, công năng ............................................................................................... 3
2.1.4 Công dụng chữa bệnh .......................................................................................... 4
2.1.5 Phân biệt Tơ xanh và Tơ hồng nam..................................................................... 4
2.1.6 Một số nghiên cứu về cây Tơ xanh...................................................................... 5
2.2. Giới thiệu alkaloid..................................................................................................... 6
2.2.1. Khái niệm về alkaloid ......................................................................................... 6
2.2.2. Danh pháp ........................................................................................................... 6
2.2.3. Các đặc tính hóa - lý của alkaloid....................................................................... 6
2.2.4. Phân loại alkaloid................................................................................................ 7
2.2.5. Sự phân bố alkaloid trong thiên nhiên ................................................................ 8
2.2.6. Sự tạo thành alkaloid trong cây .......................................................................... 8
2.2.7. Chiết xuất, tinh chế và phân lập alkaloid............................................................ 9
2.2.8. Tầm quan trọng của alkaloid trong dược liệu ................................................... 11
2.3. Kỹ thuật chiết tách hợp chất tự nhiên ..................................................................... 11
2.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng .................................................................................. 12
2.3.2 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt .................................................................................... 12
iv

2.4. Phương pháp sắc ký ................................................................................................ 12
2.4.1 Sắc ký lớp mỏng ................................................................................................ 13
2.4.2 Sắc ký cột........................................................................................................... 13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................................... 14
3.1. Thời gian và địa điểm ............................................................................................. 14
3.2. Vật liệu.................................................................................................................... 14
3.2.1 Mẫu .................................................................................................................... 14
3.2.2 Dung môi, hóa chất ............................................................................................ 14
3.2.3 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu............................................................................... 14
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 14
3.3.1. Chiết xuất alkaloid từ bột nguyên liệu.............................................................. 14
3.3.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật của cao Tổng..................................... 17
3.3.3. Định tính hợp chất alkaloid............................................................................... 22
3.3.4. Thử hoạt tính chống oxy hóa các phân đoạn cao chiết. .................................... 22
3.3.5 Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc của hợp chất alkaloid...................... 25
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................... 27
4.1. Chiết xuất alkaloid .................................................................................................. 27
4.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật của cao Tổng........................................... 27
4.3. Định tính hợp chất alkaloid..................................................................................... 29
4.3.1 Định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học ........................................................ 29
4.3.2. Định tính alkaloid bằng sắc ký lớp mỏng ......................................................... 29
4.4. Hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn cao chiết ........................................... 30
4.4.1 Hoạt tính đánh bắt gốc Hydroxyl tự do ............................................................. 30
4.4.2 Hoạt tính đánh bắt gốc tự do DPPH .................................................................. 31
4.5. Tách chiết, tinh sạch alkaloid từ phân đoạn alkaloid tổng...................................... 35
4.5.1. Phân lập alkaloid bằng sắc ký cột ........................................................................ 35
4.5.2. Xác định cấu trúc A2 .......................................................................................... 43
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 49
5.1 Kết luận .................................................................................................................... 49

5.2 Đề nghị..................................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 50
PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Qui trình thử hoạt tính đánh bắt gốc Hydroxyl tự do ....................................23
Bảng 3.2 Dãy nồng độ các cao thử hoạt tính đánh bắt gốc tự do DPPH ......................24
Bảng 3.3 Qui trình thử hoạt tính đánh bắt gốc tự do DPPH .........................................25
Bảng 4.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học cao Tổng chiết từ cây Tơ xanh ..........28
Bảng 4.2 Giá trị IC50 của các mẫu cao và Vitamin C....................................................34
Bảng 4.3 Các thông số của các cột sắc ký ....................................................................36
Bảng 4.4 Kết quả các phân đoạn cột A .........................................................................37
Bảng 4.5 Kết quả các phân đoạn cột A1 ........................................................................38
Bảng 4.6 Kết quả các phân đoạn cột A1.1 ......................................................................39
Bảng 4.6 Kết quả các phân đoạn cột A2 ........................................................................41
Bảng 4.8 Kết quả các phân đoạn cột A2.1 ......................................................................42
Bảng 4.9 Kết quả phổ proton, carbon, HMBC, COSY của A2 ....................................45
Bảng 4.10 So sánh phổ Proton và Carbon của A2 và cassythine ..................................47

vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây Tơ xanh.....................................................................................................2
Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất alkaloid tổng sử dụng trong nghiên cứu .............................16

Hình 3.2 Sơ đồ khảo sát thành phần hóa học trên cao Tổng ........................................21
Hình 3.3 Phản ứng giữa DPPH và chất thưt nghiệm ....................................................24
Hình 4.1 Sắc ký lớp mỏng bột màu đỏ cam..................................................................27
Hình 4.2 Định tính Alkaloid bằng phản ứng hóa học...................................................29
Hình 4.3 Định tính Alkaloid bằng sắc ký lớp mỏng.....................................................29
Hình 4.4 Biểu đồ hiệu quả đánh bắt gốc trên OH của Vitamin C ..............................30
Hình 4.5 Biểu đồ hiệu quả thử hoạt tính đánh bắt gốc OH của cao Nước ..................30
Hình 4.6 Đồ thi hiệu quả đánh bắt gốc tự do DPPH của cao Tổng ..............................31
Hình 4.7 Đồ thị hiệu quả đánh bắt gốc tự do DPPH của cao Diethyl Ether.................32
Hình 4.8 Đồ thị hiệu quả đánh bắt gốc tự do DPPH của cao Alkaloid tổng ................32
Hình 4.9 Đồ thị hiệu quả đánh bắt gốc tự do DPPH của phân đoạn chứa kết tinh.......33
Hình 4.10 Đồ thị hiệu quả đánh bắt gốc tự do DPPH của cao Nước ...........................33
Hình 4.11 Đồ thị hiệu quả đánh bắt gốc tự do DPPH của Vitamin C ..........................34
Hình 4.12 Giá trị IC50 của các mẫu cao thử nghiệm và Vitamin C ..............................35
Hình 4.13 Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn ..................................................................35
Hình 4.14 Sơ đồ các cột sắc ký.....................................................................................36
Hình 4.15 Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn cột A.........................................................37
Hình 4.16 Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn cột A1 .......................................................38
Hình 4.17 Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn cột A1.1 .....................................................39
Hình 4.18 Chế hóa phân đoạn 71-100 của cột A1.1.......................................................40
Hình 4.19 Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn cột A2 .......................................................40
Hình 4.20 Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn cột A2.1 .....................................................41
Hình 4.21 Sắc ký lớp mỏng phân đoạn chứa kết tinh và kết tinh.................................42
Hình 4.22 Kết tinh của phân đoạn 47 – 55 ...................................................................43
Hình 4.23 Tương quan HMBC và COSY của A2 .........................................................45
Hình 4.24 Công thức cấu tạo của Cassythine ...............................................................48

vii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
CHCl3

Chloroform

COSY

Ccorrelation spectroscopy

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

MeOH

Methanol

NMR

Nuclear magnetic resonance

PĐ

Phân đoạn

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

viii


Chương 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Từ xưa đến nay, sức khỏe luôn là mối quan tâm hàng đầu, vì nhờ nó con người
mới có thể thực hiện các chức năng của cuộc sống. Trong đó, vấn đề thuốc chữa bệnh
có thể nói là mục tiêu con người nhắm tới để cải thiện sức khỏe một cách tích cực hơn.
Theo thời gian, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đã làm cho các sản phẩm
dược ngày càng phong phú và đa dạng. Các phương thuốc chữa bệnh có thể ở dạng cổ
truyền hay tân dược. Tuy nhiên, người ta nhận thấy rằng những loại thuốc có nguồn
gốc tổng hợp hóa học thường có tác dụng phụ không mong muốn. Hiện nay, việc sử
dụng dược phẩm có xu hướng quay về với vị thuốc có nguồn gốc tự nhiên. Cho nên,
trong việc nghiên cứu chế tạo dược phẩm trên thế giới và Việt Nam đang chuyển dần
từ loại thuốc tổng hợp sang loại thuốc tự nhiên. Những loại thuốc có nguồn gốc từ các
hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học mong muốn và ít tác dụng phụ hơn.
Cây tơ xanh được biết có tác dụng chữa: thận hư, liệt dương, mắt mờ, chân tay
yếu mỏi theo Phạm Thanh Kỳ (2007); cây lại rất thích hợp với điều kiện Việt Nam, dễ
dàng tìm thấy, nguồn nguyên liệu dồi dào là đối tượng lý tưởng để phục vụ nghiên cứu

khoa học về thành phần hóa học và dược tính của cây. Điều này mở ra một cơ hội
trong việc tìm tòi nguồn nguyên liệu mới thay thế các chế phẩm dược không phù hợp.
Tuy nhiên, nghiên cứu về đối tượng này trên thế giới còn rất ít, ở Việt Nam chưa tìm
thấy nghiên cứu nào về cây Tơ xanh. Cùng với tầm quan trọng đó đề tài “ Khảo sát
thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh hóa các phân đoạn cao chiết từ cây Tơ Xanh
Cassytha filiformis L.” đã được thực hiện.
1.2 Yêu cầu
Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết từ cây tơ xanh. Xác định hoạt
tính chống oxy hóa của các phân đoạn cao chiết . Định tính, phân lập, tinh sạch và xác
định cấu trúc hợp chất alkaloid.
1.3 Nội dung thực hiện
Chiết xuất alkaloid để cung cấp các cao phân đoạn làm nguồn nguyên liệu cho
các thí nghiệm: khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật; định tính hợp chất alkaloid;
thử hoạt tính chống oxy hóa; phân lập, tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất alkaloid
trong cao alkaloid tổng.
1


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu cây Tơ xanh
Cây Tơ hồng xanh hay còn được gọi là cây Tơ xanh
Tên khoa học: Cassytha filiformis L.
Tên nước ngoài: Dodder (Anh), Goutte – de – lin (Pháp)
Phân loại khoa học (www.botanyvn.com)
Ngành: thực vật có hoa (Magnoliophyta)
Lớp: hai lá mầm (Magnoliopsida)
Bộ: Long não (Laurales)
Họ: Long não (Lauraceae.)
Chi: Cassytha
2.1.1 Đặc điểm của cây Tơ xanh

Cây thân leo, khi non có lông sau nhẵn.Thân cành dạng sợi, mọc xoắn vào nhau,
màu lục sẫm. Lá không có hoặc tiêu giảm thành vảy. Cụm hoa mọc thành bông không
cuống, dài 1,5 – 5 cm, hoa nhỏ, màu trắng, lá bắc hình tròn, có lông dạng mi, bao hoa
có ống ngắn, gồm 6 thùy, 3 thùy ngoài nhỏ, tròn, có lông, 3 thùy trong lớn hơn, nhị 6
hoặc 9. Quả bế, hình cầu nhẵn, bao bọc bởi ống bao hoa nạc, đồng trưởng trông giống
1 quả mọng. Hàng năm vào khoảng tháng 10 - 12 cây cho hoa và kết quả. Tơ xanh
chứa khoảng 0,1 % alkaloid gồm cassyfiline, cassythine, cassythidine và laurotenanin.

B

A
Hình 2.1 Cây Tơ xanh. A: dây Tơ xanh, B: hoa Tơ xanh, C: quả Tơ xanh
(www.marinelifephotography.com)
2

C


2.1.2 Sự phân bố và vùng sinh thái của cây Tơ xanh
Chi Cassytha L. gồm khoảng gần 20 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, nhất
là Australia có 15 loài, trong đó 13 loài là đặc hữu (Wardini, 2001; được trích dẫn bởi
Đỗ Huy Bích, 2004). Ở Việt Nam chi này có 2 loài. Tơ xanh phân bố rộng rãi khắp các
vùng nhiệt đới ở cả 2 bán cầu, Từ châu Phi đến châu Đại Dương và châu Á. Ở châu Á
Tơ xanh có mặt hầu như khắp các nước vùng Nam Á (Ấn Độ, Srilanca) đến vùng
Đông Nam Á (Indonesia, Philipineses, Thái Lan, Malaysia, Campuchia, Lào, Mianma,
Việt Nam), đảo Hải Nam và vùng Trung và Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, cây Tơ
xanh cũng phân bố phổ biến khắp các tỉnh miền núi (dưới 1500 m), trung du và đôi khi
gặp ở các tỉnh đồng bằng, ven biển và hải đảo.
Tơ xanh là một dạng sống khá đặc biệt. Toàn cây có dịp lục, nhưng lại sống bán
ký sinh trên các loài cây cỏ thuộc nhiều họ thực vật khác nhau. Cây ưa sáng, chịu được

khí hậu khô nóng ở các vùng đồi cây bụi, nương rẫy củ và rừng thưa. Khi tơ xanh bám
trên các loại cây 2 lá mầm như sim, mua, thảu táu, găng, nó thường cắm các “giác
mút” vào lớp vỏ cây chủ để trở thành đối tượng ký sinh. Ngược lại khi nó bám trên các
thân, lá của cây cỏ (cây 1 lá mầm) như cỏ tranh, cỏ lông, cỏ bông thì không thấy có
giác mút nữa mà chỉ là cây phụ sinh, các tế bào dịp luc trên thân làm chức năng quang
hợp bảo đảm quá trình dinh dưỡng của cây.
Tơ xanh ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu là từ hạt. Tuy
nhiên, quá trình nảy mầm của hạt cần có sự cộng sinh của 1 loại vi khuẩn làm mềm vỏ
hạt. Cây còn có khả năng tái sinh vô tính khỏe từ những đoạn thân, cành khi được tiếp
xúc với cây chủ hoặc cây giá thể.
2.1.3 Tính vị, công năng
Tơ xanh có vị ngọt, đắng, tính hàn, vào 2 kinh can, thận, có tác dụng thanh nhiệt,
lợi thấp, lương huyết, chỉ huyết, giải độc, tiêu thũng, lợi tiểu. Cây Tơ xanh, có thể
được thu hái quanh năm, chủ yếu vào mùa hè, dây thu hái về được cắt ngắn rửa sạch,
phơi trong bóng râm, bó lại dùng. Tơ xanh còn có tác dụng dược lý làm giảm đột biến
trong thí nghiệm gây đột biến trên chủng Salmonella typhi TA 98. Alkaloid
laurotenanin có tác dụng giống Strychnin, gây co giật với liều lớn có thể gây tử vong.

3


2.1.4 Công dụng chữa bệnh
Ở Việt Nam, nhân dân dùng tơ xanh làm thuốc bổ, chữa thận hư, liệt dương, mắt
mờ, chân tay yếu mỏi. Ngày 10 – 20 g, sắc nước uống. Có thể kết hợp với cà gai leo,
ngũ gia bì, dây gắn, dây đau xương. Còn dùng chữa ho, bệnh lậu. Dùng ngoài chữa lở
loét. Ở Trung Quốc, Tơ xanh chữa phế nhiệt sinh ho, gầy mòn do can nhiệt, vàng da,
ho ra máu, chảy máu mũi, mụn nhọt, bỏng.
Ở Ấn Độ, Tơ xanh chữa bệnh gan mật, viêm niệu đạo, lỵ mạn tính, bệnh ngoài
da, vết loét. Bột Tơ xanh trộn với dầu vừng bôi làm thuốc dưỡng tóc. Ở indonesia, Tơ
xanh là thuốc tẩy giun sán, phối hợp với nhục đậu khấu chữa đau bụng, đau dạ dày. Ở

Philipines, các thầy lang dùng nước sắc cây Tơ xanh tươi để thúc đẻ. Ở quần đảo
Solomon, quả Tơ xanh ăn với trầu không chữa cảm lạnh. Ở Châu Phi, nước sắc cây tơ
xanh dùng chữa bệnh cảm, bệnh kí sinh trùng hay bệnh ung thư (Hoets, 2004).
Những nghiên cứu gần đây của Hausatu và ctv (2007) về ảnh hưởng của dịch
chiết nước tơ xanh đến các thông số sinh hóa máu trên chuột, kết quả cho thấy dịch
chiết nước tơ xanh có nồng độ LD50 cao, trên 500 mg/kg thể trọng, và không ảnh
hưởng đến công thức máu. Năm 2008, Tsai và ctv đã công bố chiết tách được 2
aporphine alkaloid mới đặt tên isofiliformine và cassythic acid cùng 22 hợp chất
alkaloid và flavonoid khác đã biết khác, nhóm tác giả này cũng đánh giá hoạt tính giãn
mạch trên thực nghiệm co động mạch chủ ở chuột bởi phenylendrin của các hợp chất
cassythic acid , cassythine, neolitsine, và dicentrine với IC50 trong khoảng 0,08 – 2,48
µM so với đối chứng acetylcholin 3 µM.
Một số bài thuốc có Tơ xanh: chữa trẻ em gầy mòn do can nhiệt, chân tay nóng,
tinh thần sút kém có thể dùng 15 – 30 g Tơ xanh ở dạng tươi, thêm 200 ml nước, sắc
còn 100 ml, uống làm 2 lần trong ngày. Điều trị bệnh vàng da ở trẻ em dùng 15 – 30 g
Tơ xanh ở dạng tươi, đậu phụ 2 miếng, hầm nhừ, ăn cả cái lẫn nước. Chữa mũi hay
chảy máu dùng 15 g Tơ xanh hầm chung với thịt nạc và rượu dùng ăn trong ngày.
2.1.5 Phân biệt tơ xanh và tơ hồng nam
Tơ hồng nam có tên khoa học là Cuscuta australis thuộc họ tơ hồng
Cuscutaceae. Cây sống kí sinh hoàn toàn, không có diệp lục, thân bóng nhẵn, lóng dài,
màu vàng hay da cam, có vòi hút nhựa cây chủ. Lá teo thành vảy nhỏ. Hoa nhỏ, tràng
màu lục, nhị đính ở miệng tràng, bầu có hai vòi nhụy. Quả nang chứa 1 - 2 hạt. Loài
4


của châu Âu, Nhật Bản, Trung Quốc, cũng được truyền bá vào nước ta, nay gặp thông
thường ở miền nam, ít khi gặp hoa. Theo (Võ Văn Chi, 1997; Đỗ Tất Lợi, 1999).
2.1.6 Một số nghiên cứu về cây Tơ xanh
Những nghiên cứu gần đây của Stevigny và ctv (2002), đánh giá các
aporphinoid alkaloid là thành phần hoạt chất có họat tính trong tơ xanh gồm

actinodaphnine, cassythine, dicentrine, có tác dụng độc tế bào trên một số dòng tế bào
ung thư như HeLa, Mel-5, HL-60, chống ngưng tập tiểu cầu và kháng ký sinh trùng
Trypanosoma brucei brucei gây bệnh ngủ, đặc biệt, nghiên cứu dược lý của tác giả này
chứng minh: neolitsine có hoạt tính cao nhất chống lại dòng tế bào Hela (IC50: 21,6
µM) và 3t3 (IC50: 21,4 µM). Cassythine và actinodaphnine có hoạt tính cao nhất chống
lại dòng Mel-5 (với IC50 lần lượt: 24,3 µM và 25,7 µM) và HL-60 (với IC50 lần lượt:
19,9 µM và 15,4 µM). Đây cũng là báo cáo đầu tiên về hoạt tính gây độc tế bào của
Neolitsine và cassythine tách chiết từ C. filiformis. Đây cũng là công bố đầu tiên về dữ
liệu phổ NMR của cassythine và actinodaphnine.
Đến năm 2004, Hoet và ctv, đã so sánh hoạt tính gây độc tế bào của 7 hợp chất
aporphine trên dòng tế bào Hela. Glaucine có hoạt tính cao nhất (IC50 = 8,2 µM). Để
làm rõ cơ chế hoạt động, sự gắn kết với phân tử DNA được nghiên cứu bằng độ hấp
thu tia tử ngoại. Kết quả đo quang cho thấy tất cả 7 aporphine đều gắn kết hiệu quả với
DNA như một chất xúc tác điển hình. Thử nghiệm sinh hóa cho thấy actinodaphnine,
cassythine và dicentrine cũng ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của topoisomerases trái
với 4 aporphine khác. Cũng trong năm 2004, một hướng nghiên cứu khác của Stevigny
và ctv về: “Đánh giá và phát triển phương pháp HBLC để định lượng aporphine từ các
mẫu khác của Cassytha filiformis” đã phát triển giới hạn định lượng của Cassythine
được tìm thấy 13 – 20 µg/ml. Kết quả cho thấy sự thay đổi trên mẫu chứa alkaloid tổng
từ 0,11 – 0,43 %.
Wu (1997), đã phân lập được hai alkaloid aporphine mới là cathafiline và
cathaformine, cùng với sáu alkaloid đã biết actinodaphine, cassythine, isoboldine,
cassameridine, cassamedine and lysicamine, đã được phân lập và xác định đặc tính từ
cây Tơ xanh.

5


2.2. Giới thiệu alkaloid
2.2.1. Khái niệm về alkaloid

Meissner là người đầu tiên đưa ra khái niệm về alkaloid, có định nghĩa: Alkaloid
là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản ứng kiềm và được lấy từ thực vật ra.
Sau này Polonopski đã đưa ra định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ,
có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và
đôi khi trong động vật, thường có hoạt tính sinh học mạnh và cho phản ứng hoá học với
một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid”.
2.2.2. Danh pháp
Các alkaloid trong dược liệu thường có cấu tạo phức tạp nên người ta thường
gọi chúng theo một tên riêng. Tên của các alkaloid luôn có đuôi “in” và xuất phát từ:
- Tên chi hoặc tên loài của cây + in. Ví dụ:

Papaverin

từ

Papaver

somniferum, Strychnin từ Strychnos. Đôi khi dựa vào tác dụng của alkaloid đó. Ví dụ:
Emetin do từ emetos có nghĩa là gây nôn, morphin do từ morpheus là gây ngủ. Có thể
xuất phát từ tên người. Ví dụ: Pelletierin từ tên riêng Pelletier, nicotin từ tên riêng J.
Nicot.
- Những alkaloid phụ tìm ra sau hoặc có cấu trúc tương tự thường được gọi tên
bằng cách thêm tiếp đầu ngữ hoặc biến đổi vĩ ngữ của alkaloid chính (biến đổi
in→idin, amin, alin, imin…), hoặc biến đổi vần (narcotin → cotarnin, tarconin,…).
Tiếp đầu ngữ Nor diễn tả một chất đã mất 1 nhóm methyl. Ví dụ: Ephedrin
(C10H15ON)→norephedrin (C9H13ON). Các đồng phân thường có tiếp đầu ngữ: Pseudo,
iso, epi, neo, allo, homo, meso (Phạm Thanh Kỳ, 2007).
2.2.3. Các đặc tính hóa - lý của alkaloid
Đa số các alkaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn với điểm nóng chảy xác
định hoặc có khoảng nhiệt độ phân hủy. Một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình,

một vài alkaloid ở dạng lỏng (nicotin, coniin) và một vài alkaloid có màu (berberin
màu vàng, betanidin màu đỏ) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ.
Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R

6


(mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nitơ. Các alkaloid tính base yếu
thì phải cần môi trường acid mạnh để tạo thành muối, tan trong nước.
Các alkaloid ở dạng base tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan
tốt trong dung môi hữu cơ như chloroform, diethyl ether, alcol bậc thấp. Các muối của
alkaloid thì tan trong nước, acol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như
chloroform, diethyl ether, benzen. Các protoalkaloid và giả alksloid thường dễ tan
trong nước. Tính hòa tan của các alkaloid đóng vai trò quan trọng trong việc chiết tách
alkaloid ra khỏi cây cũng như trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống.
Nói chung, alkaloid là hợp chất tương đối bền, tuy vậy, một số hợp chất thuộc
loại dẫn xuất của indol dễ bị hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng hoặc các tác nhân
oxy hóa.
2.2.4. Phân loại alkaloid
Alkaloid là những base bậc 1, bậc 2, hay bậc 3 đôi khi là các amoni hydrat bậc 4.
Hầu hết các alkaloid có nitơ tham gia vào nhân dị vòng, nhưng cũng có alkaloid mà nitơ
ở ngoài vòng. Alkaloid thường được phân loại theo cấu trúc của nhân:
- Alkaloid không có nhân dị vòng: những alkaloid thuộc nhóm này có nitơ nằm ở
mạch thẳng. Ví dụ: capsaicin trong ớt.
- Alkaloid có nhân dị vòng: các alkaloid loại này có thể có một vòng hay có
nhiều vòng. Có các nhóm chính: những alkaloid là dẫn xuất của nhân: pyrrol hoặc
pyrrolidin, pyridin hoặc piperidin, tropan, quinolin, purin, isoquinolin, quinolizidin,
imidazol, quinazolin, acridin, pyrrolizidin. Những alkaloid là dẫn xuất của nhân indol:
đây là nhóm rất quan trọng, nhiều alkaloid trong nhóm này được sử dụng trong điều trị.

- Alkaloid có nhân sterol: có một khung cyclopentanoperhydrophenantren và có
một hoặc hai nitơ trong mạch nhánh đã đóng vòng ở vị trí C – 17 hoặc ở vị trí C – 3.
- Alkaloid có cấu trúc terpen: có rất ít alkaloid có cấu tạo monoterpen và
sesquiterpen, cấu tạo diterpen có nhiều hơn nhóm mono và sesquiterpen (Phạm Thanh
Kỳ, 2007).

7


2.2.5. Sự phân bố alkaloid trong thiên nhiên
Alkaloid có phổ biến trong thực vật, ngày nay đã biết khoảng trên 16000
alkaloid từ hơn 5000 loài theo Harborne (1973), hầu hết ở thực vật bậc cao chiếm
khoảng 15 – 20 % tổng số các loài cây, tập trung ở một số họ: Apocynaceae (họ Trúc
Đào) có gần 800 alkaloid, Papaveraceae (họ Thuốc Phiện) gần 400 alkaloid…Có
những họ có trên 50 % loài cây chứa alkaloid như Ranunculaceae, Berberidaceae,
Papaveraceae, Buxaceae.
Ở nấm, alkaloid có trong nấm cựa khỏa mạch (Claviceps purpurea), nấm
Amanita phalloides. Ở động vật, cũng đã tìm thấy alkaloid ngày càng tăng.
Samandarin, samandaridin, samanin có trong tuyến da của loài kỳ nhông Salamandra
maculosa và Salamandra altra. Trong cây, alkaloid thường tập trung ở một số bộ phận
nhất định. Ví dụ: alkaloid thường tập trung ở hạt (cà phê); quả (thuốc phiện); lá (thuốc
lá, chè); hoa (cà độc dược); thân (ma hoàng); vỏ (canhkina); rễ (ba gạc); củ (bình
vôi…). Rất ít trường hợp trong cây chỉ có một loại alkaloid duy nhất mà thường có hỗn
hợp nhiều alkaloid, trong đó alkaloid có hàm lượng cao gọi là alkaloid chính. Những
alkaloid trong cùng một cây thường có cấu tạo tương tự nhau nghĩa là chúng có cùng
một nhân cơ bản chung. Các alkaloid ở trong những cây thuộc cùng một họ thực vật
cũng thường có cấu tạo rất gần nhau. Nhưng cũng có những cây trong cùng họ thực vật
mà chứa những alkaloid hoàn toàn khác nhau về cấu trúc hóa học. Cũng có alkaloid có
thể gặp ở nhiều cây thuộc họ khác nhau.
Hàm lượng alkaloid trong cây thường rất thấp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như

khí hậu, ánh sáng, chất đất, phân bón, giống cây, bộ phận thu hái và thời kì thu hái.
Một dược liệu chứa 1 – 3 % alkaloid đã được coi là có hàm lượng alkaloid khá cao.
Trong cây, alkaloid ít khi ở trạng thái tự do, mà thường ở dạng muối của các acid hữu
cơ như citrat, tactat, malat, oxalat, acetat… (đôi khi có ở dạng muối của acid vô cơ), ở
một số cây alkaloid kết hợp với tanin hoặc kết hợp với acid đặc biệt của chính cây đó.
Có một số ít trường hợp alkaloid kết hợp với đường tạo ra dạng glycoalkaloid.
2.2.6. Sự tạo thành alkaloid trong cây
Ngày nay bằng phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ)
người ta đã chứng minh được alkaloid được tạo ra từ các acid amin. Qua làm thực
nghiệm đã chứng minh được nguyên tử nitơ và hầu như mọi trường hợp các nguyên tử
8


carbon của acid amin đều nằm trong cấu trúc nhân cơ bản của alkaloid. Ngoài ra, trong
cấu trúc alkaloid còn có những hợp chất khác như gốc acetat, hemi, monoterpen tham
gia vào. Qua định tính và định lượng alkaloid trong các bộ phận khác nhau của cây và
theo dõi sự thay đổi của chúng trong quá trình phát triển của cây người ta thấy nơi tạo
ra alkaloid không phải luôn luôn là nơi tích tụ alkaloid. Nhiều loại alkaloid được tạo ra
ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những biến đổi thứ
cấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt.
2.2.7. Chiết xuất, tinh chế và phân lập alkaloid
2.2.7.1 Chiết xuất alkaloid
Có hai phương pháp căn bản để chiết tách cũng như sơ chế các alkaloid ra khỏi
bột cây khô, dựa vào tính base đặc trưng của các alkaloid. Người ta có thể chỉnh sao
cho alkaloid ở dạng base tự do thì alkaloid tan tốt trong dung môi hữu cơ và chỉnh sao
cho alkaloid ở dạng muối (N+) thì sẽ tan tốt trong nước. Tuy vậy, mỗi phương pháp
đều có ưu và nhược điểm riêng, tùy theo cần chiết tách loại alkaloid nào để chọn
phương pháp cho thích hợp (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
- Phương pháp chiết tách alkaloid bằng dung môi hữu cơ được thực hiện theo
nguyên tắc: bột cây được tẩm với dung dịch kiềm để chuyển đổi các alkaloid ở dạng

muối trở thành dạng base tự do; kế tiếp, bột cây tẩm này được chiết với một trong các
dung môi hữu cơ như: benzen, diethyl ether, chloroform, ethyl acetat.
- Phương pháp chiết tách alkaloid bằng dung dịch nước acid được thực hiện theo
nguyên tắc: bột cây được tận chiết với methanol, dung môi rất tốt có thể chiết hết tất cả
các alkaloid ở dạng base tự do, alkaloid dạng tứ cấp N+, dạng N – oxid (N+ → O), dạng
glycosid, alkaloid loại phân cực mạnh và dĩ nhiên chiết luôn các hợp chất hữu cơ khác.
2.2.7.2 Tinh chế và phân lập alkaloid
Sau khi chiết tách ít khi thu được một alkaloid tinh khiết mà thường là một hỗn
hợp các alkaloid còn lẫn tạp chất (Phạm Thanh Kỳ, 2007).
Nếu chỉ có một alkaloid thô thì có thể tinh chế bằng cách chuyển nó nhiều lần từ
dung môi hữu cơ sang dung môi nước và ngược lại, cuối cùng làm bốc hơi dung môi ta
được một alkaloid tinh khiết. Nếu là hỗn hợp nhiều alkaloid, để tinh chế và phân lập
riêng từng alkaloid trước đây thường dùng phương pháp kết tinh phân đoạn bằng các
dung môi, ngày nay người ta sử dụng thêm một số phương pháp khác.
9


- Phương pháp trao đổi ion dựa vào sự trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong
dung dịch muối alkaloid và các ion đã bị hấp phụ trên chất mang (nhựa trao đổi ion).
Các nhựa trao đổi ion được dùng là các cationit (những cao phân tử rắn mang nhóm
acid có khả năng hấp phụ các cation) và các anionit (những cao phân tử rắn mang
nhóm base có khả năng hấp phụ các anion). Các nhựa trao đổi này không tan trong
nước và các dung môi hữu cơ.
Các alkaloid trong hỗn hợp thường có độ kiềm khác nhau, do đó khi cho qua cột
trao đổi ion có sự hấp phụ khác nhau và trong lớp ionit xảy ra sự trao đổi kép nối tiếp
nhau, chất có độ kiềm lớn bị giữ lại ở trên và chất có độ kiềm nhỏ chuyển sâu vào cột
ionit do đó người ta có thể lấy tách riêng các alkaloid ra. Ngoài ra, trong một số trường
hợp người ta dùng các ionit lưỡng tính chứa các nhóm acid lẫn base.
- Phương pháp sắc ký cột dựa trên nguyên tắc các thành phần trong hỗn hợp
alkaloid có độ hấp phụ khác nhau trên chất hấp phụ đã nạp trong cột. Chất hấp phụ

thường dùng là oxit nhôm, silicagel dùng cho sắc ký cột, bột cellulose…khi cho dịch
chiết alkaloid qua cột, các alkaloid sẽ phân bố lần lượt trong cột, ở phần trên của cột sẽ
tập trung chất bị hấp phụ mạnh nhất, còn ở phần dưới của cột tập trung chất bị hấp phụ
kém nhất. Tuy nhiên các miền chưa được phân thành ranh giới rõ rệt, nghĩa là chưa
phân chia rõ rệt các chất trong cột. Do đó để tách hoàn toàn các alkaloid trong cột
người ta phải dùng một dung môi hay một hệ dung môi chạy qua cột để rửa giải các
alkaloid đã hấp phụ trong cột (Trần Hùng, 2011).
- Sắc ký lớp điều chế dựa theo nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng, dịch chiết đậm
đặc alkaloid được chấm lên những tấm kính đã tráng chất hấp phụ tương đối dày thành
một đường thẳng. Sau khi khai triển bằng một hệ dung môi thích hợp, các chất khác
nhau có tốc độ di chuyển khác nhau nên được tách ra ở những vị trí khác nhau. Để xác
định vị trí các alkaloid đã tách ra một cách dễ dàng dưới ánh sáng tử ngoại người ta
thường dùng chất hấp phụ có trộn thêm chất phát quang. Ví dụ silicagel GF254, silicagel
GF254+366, oxit nhôm GF254, oxit nhôm GF254+366 của hãng MERCK. Nếu chất hấp phụ
không có chất phát quang thì người ta dùng tấm kính khác phủ lên tấm sắc ký, phun
thuốc thử lên một phần nhỏ ở bên phải và bên trái tấm sắc ký, trên cở sở ấy đánh dấu
từng dải chứa alkaloid. Sau đó cạo lấy riêng từng phần chất hấp phụ có chứa các

10


alkaloid riêng biệt, rồi chiết riêng lấy từng chất bằng dung môi thích hợp, sau khi cho
bốc hơi sẽ thu được từng alkaloid riêng biệt.
2.2.8. Tầm quan trọng của alkaloid trong dược liệu
Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc.
Tác dụng của alkaloid thường khác nhau và tác dụng của vị dược liệu không phải bao
giờ cũng giống như các alkaloid tinh khiết đã được phân lập (Phạm Thanh Kỳ, 2007).
Nhiều Alkaloid có tác dụng trên hệ thần kinh trung ương gây ức chế: morphin,
codein, scopolamin, reserpin hoặc gây kích thích: strychnin, cafein, lobelin. Nhiều chất
tác dụng lên hệ thần kinh giao cảm gây kích thích: ephedrin, hordenin; hoặc kích thích

phó giao cảm: pilocaroin, eserin. Trong số alkaloid có chất gây tê tại chỗ: cocain. Có
chất làm giãn cơ trơn, chống co thắt: papaverin. Có alkaloid làm tăng huyết áp
(ephdrin), có chất làm hạ huyết áp, một số ít alkaloid có thể tác dụng trên tim như
quinidin được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim. Có alkaloid diệt kí sinh trùng: quinin
độc với kí sinh trùng sốt rét, emetin và conessin độc với amip dùng để chữa lỵ.
Isopelletierin, arecolin dùng để trị sán.
Trên thế giới hiện nay dùng nhiều thuốc tổng hợp nhưng vẫn không bỏ được các
alkaloid lấy từ cây cỏ, vì có chất chưa tổng hợp được, và cũng có nhiều thuốc sản xuất
tổng hợp không rẻ hơn chiết xuất hoặc tác dụng của chất tổng hợp chưa bằng tác dụng
của chất lấy từ cây. Do đó có nhiều chất người ta vẫn dùng phương pháp chiết xuất từ
cây.
Bảo quản: nói chung, ở dược liệu khô chứa alkaloid dễ bảo quản hơn các
glycosid. Tuy vậy, ở một vài dược liệu như: lá coca thì hàm lượng alkaloid cũng giảm
đi trong quá trình bảo quản, một số cây họ Cà có sự racemic hoá hyoscyamin thành
astropin, ở cựa khoả mạch có sự phân huỷ alkaloid nhưng đa số dược liệu chứa alkaloid
còn giữ được hoạt tính trong nhiều năm.
2.3. Kỹ thuật chiết tách hợp chất tự nhiên
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Các kỹ thuật đều
xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết rắn lỏng (Nguyễn Kim
Phi Phụng, 2007).

11


2.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng
Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi (Solvent extraction). Cao
alcol thô ban đầu (thí dụ bột cây được tận trích với methanol 80 %, đuổi dung môi thu
được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều
chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập
được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo. Kỹ thuật

chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban
đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ ether dầu hỏa…) sẽ
hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo…),
dung môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, chloroform…) hòa tan tốt các hợp
chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức eter -O-, aldehyd –
CH=O, ceton –CO-, ester –COO- …)và dung môi phân cực mạnh (các hợp chất có
chứa nhóm chức –OH, -COOH…)
2.3.2 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt
Phương pháp sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp.
Bột cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm. Mẫu không nên to hơn vì sẽ
chiết không kiệt, mẫu được xay quá mịn hoặc mẫu có tính nhầy nhựa hoặc có thể
trương nở… sẽ cản trở dòng chảy. Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy
tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần
đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi
thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi cần
thiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt. Có thể dùng dung
môi nóng hoặc nguội.
Để yên bình ngấm kiệt trong khoảng thời gian 12 – 24 giờ. Mở van bình ngấm
kiệt cho dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình lóng để dung
môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh
khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này.
2.4. Phương pháp sắc ký
Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp
chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại
12


hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha
tĩnh). Có rất nhiều loại hệ sắc ký khác nhau và người ta có thể phân chia chúng dựa

vào bản chất pha, cơ chế tách hay cấu hình của hệ sắc ký.
2.4.1 Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một
dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất
hấp thu trơ, thí dụ như: silica gel hoặc oxit alumin. Pha tĩnh này được trán thành một
lớp mỏng, đều , phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic.
Nguyên tắc: một dung dịch mẫu thử được chấm lên một lớp mỏng chất hấp phụ
trán trên nền phẳng đóng vai trò là pha tĩnh. Một dung môi khai triển di chuyển dọc
theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau
tạo thành một sắc đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau (Trần Hùng, 2011).
Sắc ký lớp mỏng có ưu điểm: sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích (vi
lượng), quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay
kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau.
2.4.2 Sắc ký cột
Sắc ký cột sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng với đầu trên có thể hở
hoặc kín, đầu dưới có gắn một khóa. Pha tĩnh là những hạt có kích thước khác nhau sẽ
được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu cần tách được đưa lên trên bề mặt của pha tĩnh. Pha
động là dung môi sẽ được rót liên tục vào đầu cột.
Nguyên tắc: sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều
loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của
những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và
một pha tĩnh). Một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt vào một
hệ thống gồm hai pha, mỗi loại hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với hai pha, vì
thế sẽ có tương tác mạnh/ yếu khác nhau đối với pha tĩnh. Hệ quả là mỗi loại hợp chất
sẽ di chuyển ngang qua pha tĩnh với một vận tốc khác nhau, nhờ vậy, kỹ thuật sắc ký
có thể tách riêng các loại hợp chất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Ưu điểm của phương pháp này là: pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền dể
kiếm, có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất.

13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm
Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 07/2012, tại Trung tâm Sâm và
Dược Liệu TP. HCM (Địa chỉ: 41 Đinh Tiên Hoàng, Phường Bến Nghé, Q 1, TP.
HCM).
3.2. Vật liệu
3.2.1 Mẫu
Cây Tơ xanh được thu hái vào tháng 09/2011 tại Mộc Hóa, Long An, được định
danh ở phòng Tài Nguyên – Dược Liệu, trung tâm Sâm và Dược Liệu. Sau đó mẫu
được phơi khô và xay thành bột. Bột nguyên liệu được bảo quản ở nhiệt độ phòng tại
Trung tâm Sâm và Dược Liệu.
3.2.2 Dung môi, hóa chất
Dung môi: acetone, ether (Trung Quốc); chloroform, dichloromethane, methanol
(công nghiệp).
Hóa chất: H2SO4; H2O2 (3 %); phosphate buffer (pH 7,4); FeSO4 40 mM; EDTA
40 mM; DPPH 0,6 mM.
Thuốc thử: Dragendorff, Mayer, Bouchardat, Fehling, Erdman; Safranine - O
3.2.3 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu
Bồn chiết siêu âm ELMA LC60H (Đức), bếp đun cách thủy MEMMERT (Đức)
Cân phân tích METLER TOLEDO AB-204 (Thụy Sĩ), tủ sấy SANYO MOV-112
(Nhật)
Tủ sấy chân không VWR S/P, đèn soi UV-VIS DESAGA SARSTEDT GRUPPE
Máy cô quay BUCHI R-114 (Thụy Sĩ), máy chụp ảnh KTS
Cột sắc ký, bình khai triển sắc ký lớp mỏng, bản mỏng trán sẵn silicagel 60 F254
(Merck), máy đo quang phổ UV-Vis Thermo Spectronic H.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Chiết xuất alkaloid từ bột nguyên liệu
3.3.1.1 Chiết xuất alkaloid bằng phương pháp chiết ngấm kiệt

Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém,
phức tạp (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

14


Tiến hành lấy 10 kg nguyên liệu khô được xay thô (mẫu được cho lọt qua lỗ ray
3 mm, mẫu không nên to hơn vì sẽ chiết không kiệt). Một lớp bông thuỷ tinh được
chuẩn bị để lót dưới đáy bình, lớp kế tiếp là 1 tờ giấy lọc phủ trên bề mặt lớp bông.
Bột cây được cho vào bình lên trên tờ giấy lọc. Đậy bề mặt lớp bột bằng 1 tờ giấy lọc
và đặt lên trên những viên bi thuỷ tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp
bột. Từ từ rót dung môi methanol vào bình cho đến khi dung môi phủ gần bằng phía
trên bề mặt lớp bột.
Để yên bình ngấm kiệt chứa bột nguyên liệu với dung môi khoảng 1 ngày, để
dung môi có thể đẩy các chất ra khỏi bột nguyên liệu, sau đó mở van bình ngấm kiệt
cho dung môi chiết chảy ra từng giọt nhanh. Tiếp tục thêm dung môi vào bình và chiết
cho đến khi dịch chiết nhạt màu.
3.3.1.2 Chiết xuất alkaloid bằng dung môi hữu cơ
Từ 10 kg bột dược liệu chiết bằng dung môi methanol theo phương pháp ngấm
kiệt ta thu được dịch chiết methanol, cô thu hồi dung môi dưới áp suất lỏng cho tới cắn
thu được mẫu cao thô. Hoà tan hoàn toàn cao thô với nước (khoảng 6 lít). Sau đó chiết
lần lượt với dung môi từ kém phân cực đến dung môi phân cực: diethyl ether,
dichloromethane.
- Chiết phân đoạn với dung môi diethyl ether dùng 6 lít dịch methanol-nước lắc
với dung môi dietyl ether trong bình lắng gạn 2 lít (theo tỷ lệ: 1 lít dịch methanolnước/0,5 lít diethyl ether/lần), ngừng lắc cho đến khi thấy dịch chiết ether trong và
nhạt màu. Gộp chung dịch chiết ether lại cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, ta
được cao ether.
- Chiết phân đoạn với dung môi dichloromethane, trước tiên 6 lít dịch methanolnước được kiềm hóa đến pH 10 bằng NH4OH 10 % rồi lắc với dung môi
dichloromethane trong bình lắng gạn 2 lít (theo tỷ lệ: 1 lít dịch methanol-nước/0,5 lít
dichloromethane/lần), ngừng lắc cho tới khi dịch chiết dichloromethane không còn

phản ứng với thước thử Dragendorff nữa. Gộp chung dịch chiết dichloromethane vào
bình lắng gạn, rửa dịch chiết bằng nước cất để loại bớt kiềm.
Dịch dichloromethane đã rửa nước cất, sau đó được loại bớt các chất không cần
thiết kèm theo bằng việc lắc tiếp tục với dung dịch HCl 2% (theo tỷ lệ: 1 lít dịch
dichloromethane/0,5 lít HCl 2 %/lần), ngừng lắc cho tới khi dịch chiết acid không còn
15