PHÁT HIỆN VIRÚT GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT RTPCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÁT HIỆN VI-RÚT GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG
BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : PHẠM THANH TÙNG
Niên khóa

: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÁT HIỆN VI-RÚT GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG
BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. LÊ THỊ THU HÀ

PHẠM THANH TÙNG

KS. VÕ KHÁNH HƢNG

Tháng 07/2012


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Các thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trƣờng Đại học Nông Lâm đã chăm
lo và tạo điều kiện cho những sinh viên chúng tôi đƣợc học tập và nghiên cứu.
Tất cả các thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm đã truyền dạy cho tôi những kiến
thức vô cùng quý giá trong lĩnh vực công nghệ sinh học.
Lãnh đạo Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam và lãnh đạo
Phòng Công Nghệ Sinh học đã cho phép tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện
đề tài tại cơ sở của Viện và Phòng.
ThS. Lê Thị Thu Hà và KS. Võ Khánh Hƣng, những ngƣời đã tận tình chỉ dạy
và hƣớng dẫn tôi thực hiện đề tài này.
Anh Nguyễn Xuân Nam, chị Nguyễn Thị Bích Hiền, những ngƣời đã giúp đỡ
tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng là cha mẹ tôi, những ngƣời đã sinh thành và nuôi dƣỡng tôi, luôn
chăm lo, chia sẽ, động viên tôi và là ngƣời đã dẫn dắt tôi đến lĩnh vực công nghệ sinh
học này.
TP. Hồ Chí Minh, năm 2012.
Phạm Thanh Tùng

i


TÓM TẮT
Bệnh lở mồm long móng là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên gia súc.
Bệnh lây lan nhanh vì vậy đòi hỏi phải có một phƣơng pháp chẩn đoán nhanh chóng
và hiệu quả để phát hiện sớm nhằm giảm thiệt hại do bệnh gây ra. Kỹ thuật RT-PCR
có thể đáp ứng những yêu cầu này cho phép phát hiện nhanh chóng và hiệu quả sự
hiện diện của vi-rút gây bệnh.
Xây dựng quy trình phản ứng RT-PCR phát hiện vi-rút gây bệnh lở mồm long
móng sử dụng cặp mồi 3DF/3DR. Cặp mồi 3DF/3DR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự
gen 3D quy định một protein không cấu trúc của vi-rút lở mồm long móng, cặp mồi
khuếch đại đoạn gen có kích thƣớc 204 bp. Phản ứng RT-PCR với cặp mồi 3DF/3DR
phát hiện vi-rút lở mồm long móng sử dụng bộ kit one-step RT-PCR (AccessQuick™
RT-PCR System (Promega)) với chu trình nhiệt: ủ 450C trong 45 phút, 920C trong 2
phút, tiếp theo là 35 chu kỳ (940C trong 30 giây, 520C trong 1 phút, 680C trong 1
phút), cuối cùng là 680C trong 7 phút. Phản ứng RT-PCR đƣợc tiến hàng trên 3 mẫu
dƣơng chủng O, A, Asia1 của vi-rút lở mồm long móng và 24 mẫu thực địa đƣợc thu
thập tại tỉnh Lâm Đồng.
Kết quả mẫu dƣơng chủng O, Asia1 của vi-rút lở mồm long móng cho sản
phẩm PCR có kích thƣớc 204 bp. Kết quả giải trình tự và BLAST của sản phẩm PCR
thuộc hai chủng O, Asia1 cho thấy chính là gen 3D của vi-rút lở mồm long móng. Kết
quả PCR trên 24 mẫu thực địa không cho ra sản phẩm PCR. Cần xem xét việc ứng
dụng quy trình phản ứng RT-PCR phát hiện vi-rút lở mồm long móng đã xây dựng
trên vào thực địa.

ii

SUMMARY
Foot and mouth disease is a dangerous contagious disease in cattle. The disease
spreads rapidly so a rapid effective and diagnostic methods is required for the early
detection to reduce damage caused by the disease. RT-PCR technique can meet these
requirements for rapid detection the virus.
RT-PCR reactions to detect the virus that causes foot and mouth with
3DF/3DR primers was developed. The 3DF/3DR primers were designed based on the
sequence encoding 3D structure a protein of the foot and mouth virus, primer pairs
amplified fragments with the size of 204 bp. RT-PCR reaction was performed using
the kit one-step RT-PCR (RT-PCR AccessQuick ™ System (Promega)) with thermal
cycles: 450C for 45 minutes incubation , 920C for 2 min, followed by 35 cycles (940C
for 30 sec, 520C for 1 min, 680C for 1 min), and finally extention at 680C for 7
minutes. RT-PCR reaction was carried on three positive samples of type O, A, Asia1
of foot and mouth disease virus and 24 field samples collected in Lam Dong province.
Result positive samples type O, Asia1 of foot and mouth virus for PCR showed
bands with the size of 204 bp on agarose gel. The results of the sequencing and
BLAST PCR products from two strains of O, Asia1 proved that thay were 3D gene of
foot and mouth disease virus. Amplification of 24 field samples resulted no PCR
products. Amplication of RT-PCR technique to detect foot and mouth virus should be
put in consideration.
Keyword: foot and mouth disease, RT-PCR, FMDV, 3D

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
TÓM TẮT ...................................................................................................................... ii
SUMMARY ..................................................................................................................iii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iv

Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2 Yêu cầu..................................................................................................................... 2
1.3 Nội dung ................................................................................................................... 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 3
2.1. Bệnh lở mồm long móng......................................................................................... 3
2.1.1 Biểu hiện lâm sàng của bệnh lở mồm long móng ................................................. 3
2.1.2 Đƣờng xâm nhập của bệnh lở mồm long móng .................................................... 5
2.1.3 Cơ chế sinh bệnh lở mồm long móng ................................................................... 5
2.1.4 Tình hình dịch bệnh lở mồm long móng trên thế giới và Việt Nam..................... 6
2.1.5 Một số nghiên cứu về bệnh lở mồm long móng ................................................... 8
2.2. Vi-rút gây bệnh lở mồm long móng ........................................................................ 9
2.2.1 Hình thái học vi-rút gây bệnh lở mồm long móng ................................................ 9
2.2.2 Phân bố của chủng vi-rút lở mồm long móng ..................................................... 11
2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ........................................ 11
2.3.1 Chẩn đoán lâm sàng ............................................................................................ 11
2.3.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm ............................................................................. 12
2.3.2.1. Chẩn đoán huyết thanh học ............................................................................. 12
2.3.2.1.1 Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) ................................................................. 12

iv


2.3.2.1.2 Phản ứng trung hòa vi-rút ............................................................................. 13
2.3.2.1.3 Phản ứng ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ........................... 13
2.3.2.3 Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR ................................................................... 14
2.4. Kỹ thuật RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chains reaction) ................. 15
2.4.1 Nguyên tắc của kỹ thuật RT-PCR ....................................................................... 15
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 17
3.1. Thời gian và địa điểm............................................................................................ 17

3.2. Vật liệu .................................................................................................................. 17
3.2.1 Bệnh phẩm .......................................................................................................... 17
3.2.2 Hóa chất, vật liệu và thiết bị tiến hành phản ứng RT-PCR................................. 17
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................... 18
3.3.1 Phƣơng pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm .............................. 18
3.3.2 Thiết kế mồi cho phản ứng RT-PCR phát hiện vi-rút lở mồm long móng ......... 19
3.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR để phát hiện vi-rút lở mồm long móng ......................... 20
3.3.3.1 Ly trích RNA vi-rút từ mẫu bệnh phẩm ........................................................... 20
3.3.3.2 Phản ứng RT-PCRphát hiện vi-rút trong mẫu bệnh phẩm ............................... 21
3.3.3.3 kiểm tra sản phẩm PCR .................................................................................... 21
3.3.4 Giải trình tự ......................................................................................................... 22
Chƣơng 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ........................................................................... 23
4.1 Thiết kế primer cho phản ứng RT-PCR phát hiện vi-rút gây bệnh lở mồm long
móng ............................................................................................................................. 23
4.2 Đánh giá khả năng phát hiện vi-rút lở mồm long móng bằng kỹ thuật RT-PCR
của cặp primer 3DF và 3DR ........................................................................................ 25
4.3 Kết quả giải trình tự ............................................................................................... 27
4.4 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi 3DF và 3DR để phát hiện vi-rút gây
bệnh lở mồm long móng trên mẫu thực địa ................................................................. 29
v


Chƣơng 5 KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ................................................................................ 33
5.1 Kết luận .................................................................................................................. 33
5.2 Đề nghị ................................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................ 34

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BHK-21

: Baby Hamster Kidney 21

cDNA

: complementary DNA

dATP

: Deoxyriboadenosine triphosphate

dCTP

: Deoxyribocytidine triphosphate

dGTP

: Deoxyriboguanosine triphosphate

DNA

: Deoxyribonucleic acid

dNTP

: Deoxyribonucleotide triphosphate

dTTP

: Deoxyribothymidine triphosphate

dUTP

: Deoxyribouridine Triphosphate

ELISA

: Enzyme-linked immunosorbent assay

FAO

: Food and Agriciltural Organization

KHBT

: Kết hợp Bổ Thể

LMLM

: lở mồm long móng

NCBI

: National Center for Biotechnology Information

OIE

: World Organisation for Animal Health

PCR

: Polymerase chain reaction

RNA

: Ribonucleic acid

RT-PCR

: Reverse transcription polymerase chain reaction

TBE

: Tris/Borate/EDTA

TCID50

: 50% Tissue Culture Infectious Dose

WRL

: World Reference Labolatory

vii


DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách mẫu thực địa và ký hiệu. ............................................................ 18
Bảng 3.2 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase. .............................................................. 21
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR............................................................... 21
Bảng 4.1 Trình tự primer (3DR, 3DR) ........................................................................ 23
Bảng 4.2 Kết quả PCR trên mẫu thực địa.................................................................... 31

viii


DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Một số biểu hiện lâm sàn của gia súc bị bệnh LMLM. .................................. 4
Hình 2.2 Cấu trúc hình thái vi-rút LMLM. ................................................................... 9
Hình 2.3 Sơ đồ bộ gen vi-rút LMLM. ......................................................................... 10
Hình 2.4 Các quốc gia có dịch LMLM đã đƣợc báo cáo cho OIE những năm 1990 –
2002 . ............................................................................................................................ 11
Hình 3.1 Bản đồ khu vực lấy mẫu ............................................................................... 18
Hình 4.1 Vị trí primer 3DF trên đoạn gen 3D. ............................................................ 23
Hình 4.2 Vị trí Primer 3DR trên đoạn gen 3D. ........................................................... 24
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid vi-rút chủng O, A, Asia với primer
(3DF, 3DR). ................................................................................................................. 26
Hình 4.4a Kết quả Blast mẫu dƣơng chủng O. ........................................................... 27
Hình 4.4b Kết quả Blast của mẫu chủng O với 1 trình tự gen đã biết ........................ 27
Hình 4.5a Kết quả Blast mẫu dƣơng chủng Asia1. ..................................................... 28
Hình 4.5b Kết quả Blast của mẫu chủng Asia1 với 1 trình tự gen đã biết .................. 29
Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên 12 mẫu thực địa với cặp mồi (3DF
và 3DR). ...................................................................................................................... 30
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên 12 mẫu thực địa với cặp mồi (3DF
và 3DR)( tt). ................................................................................................................ 30

ix


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển của đất nƣớc trong những năm qua, ngành chăn nuôi
nƣớc ta đã có những bƣớc phát triển nhanh chóng, đạt đƣợc nhiều thành tựu, ngành
chăn nuôi chiếm khoảng 1/4 tỉ trọng trong sản suất nông nghiệp. Tổng đàn gia súc của
Việt Nam đạt khoảng 36 triệu con, trong đó gần 3 triệu con trâu, gần 7 triệu con bò,
hơn 26 triệu con heo. Về sản lƣợng thịt, sữa: đạt khoảng 2.5 triệu tấn thịt heo, 200
nghìn tấn thịt bò và hơn 200 nghìn tấn sữa (Báo cáo bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn, 2007). Cùng với sự phát triển của chăn nuôi là sự bùng phát của các dịch
bệnh, dịch bệnh ngày càng nguy hiểm và phức tạp, đã ảnh hƣởng trực tiếp đến năng
suất và sản lƣợng ngành chăn nuôi của Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới. Trong số các
bệnh có thể kể tới các bệnh nhƣ: bệnh tụ huyết trùng trâu bò, bệnh dịch tả heo, bệnh
lở mồm long móng, bệnh heo tai xanh. Trong đó bệnh lở mồm long móng (LMLM).
Tuy không làm chết gia súc trừ gia súc nhỏ, nhƣng bệnh LMLM lại gây những thiệt
hại gián tiếp to lớn ảnh hƣởng đến năng suất, chất lƣợng, phân phối, lƣu thông và suất
khẩu sản phẩm của ngành chăn nuôi (Sổ tay phòng chống dịch bệnh, 2002).
Bệnh LMLM là bệnh truyền nhiễm trên gia súc có khả năng lây nhiễm nhanh.
Nên khi dịch bệnh xảy ra có thể trở thành đại dịch gây thiệt hại lớn đối với ngành
chăn nuôi của Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới. Việc dịch bệnh lây lan sẽ gây khó
khăn trong việc phòng chống dịch và cản trở việc buôn bán động vật và các sản phẩm
từ động vật làm ảnh hƣởng nghiêm trọng đến kinh tế xã hội của vùng dịch đó. Vì vậy,
tổ chức thú y thế giới (OIE; World Organisation for Animal Health) xếp bệnh này
đứng đầu bảng trong danh mục các bệnh nguy hiểm trên vật nuôi. Bệnh LMLM là
bệnh truyền nhiễm của động vật guốc chẵn nhƣ: trâu, bò, heo, dê, hƣơu, nai… Sự
nguy hiểm của bệnh là khả năng lây lan rất nhanh, rất mạnh. Sự lây lan không chỉ do

tiếp xúc giữa động vật khỏe và động vật mắc bệnh mà còn qua nhiều đƣờng kể cả qua
không khí. Vì vậy bệnh thƣờng bùng phát thành đại dịch gây thiệt hại về chăn nuôi,
ảnh hƣởng lâu dài đến năng suất vật nuôi và kinh tế xã hội của nhiều nƣớc thuộc
nhiều châu lục trên thế giới (Knowles và Sanuel, 2003).
1


Ở Việt Nam dịch LMLM xảy ra chủ yếu trên trâu, bò , heo với các chủng O, A,
Asia1 (Knowles và ctv, 2005). vì vậy cần chọn một phƣơng pháp đặc hiệu và nhạy có
thể phát hiện nhanh và sớm vi-rút LMLM thuộc cả 3 chủng O, A, Asia1 tồn tại trong
cơ thể vật nuôi nhằm phát hiện sớm các cá thể vật nuôi nhiễm bệnh để hỗ trợ công tác
phòng và trị bệnh do vi-rút LMLM gây ra. Một trong những phƣơng pháp thƣờng
đƣợc sử dụng là kỹ thuật RT-PCR, đây là phƣơng pháp chẩn đoán phát hiện sự có mặt
bộ gene của vi-rút. Vì thế thực hiện đề tài phát hiện vi-rút gây bệnh LMLM bằng kỹ
thuật RT-PCR.
1.2 Yêu cầu
Xây dựng đƣợc quy trình chẩn đoán bệnh lở mồm long móng bằng kỹ thuật
RT-PCR trên các chủng O, A và Asia1.
1.3 Nội dung
Thu thập mẫu bệnh phẩm tại một số huyện thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng.
Thiết kế primer cho phản ứng RT-PCR phát hiện vi-rút LMLM
Đánh giá cho phản ứng RT-PCR để phát hiện vi-rút gây bệnh LMLM trên mẫu
thực địa với primer đƣợc thiết kế.
Ứng dụng phản ứng RT-PCR đƣợc phát triển để phát hiện vi-rút gây bệnh
LMLM trên các mẫu thực địa thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Bệnh lở mồm long móng
Lở mồm long móng là một bệnh dịch lây lan rất nhanh trên diện rộng nên
đƣợc xếp vào nhóm bệnh thứ nhất trong danh mục kiểm dịch quốc tế. Mặc dù bệnh
có tỷ lệ gây chết chỉ cao trên heo con, bê, nghé còn trên các gia súc lớn và trƣởng
thành nếu đƣợc điều trị tốt thú có thể phục hồi sau 1 – 2 tuần, song thiệt hại về kinh
tế rất lớn, do tính lây lan quá mạnh (Bùi Quang Anh và Hoàng Văn Nam, 2000).
Hiện nay những nƣớc đã khống chế đƣợc bệnh rất ngại nhập khẩu gia súc, hoặc các
sản phẩm động vật từ các nƣớc chƣa khống chế đƣợc bệnh LMLM, đây chính là
mối nguy hại cho đầu ra của ngành chăn nuôi, cũng nhƣ sự phát triển của nó. Vì thế
việc chẩn đoán sớm bệnh này là rất cần thiết trong thực tiễn (Sổ tay dịch bệnh động
vật, 2002).
2.1.1 Biểu hiện lâm sàng của bệnh lở mồm long móng
Ở trâu bò và heo hoặc các loài vật khác, bệnh có chung đặc điểm là sốt đột
ngột 2 – 3 ngày, viêm dạng mụn nƣớc rồi lở loét ở miệng, vú, vùng móng chân,
nƣớc bọt chảy nhiều nhƣ bọt bia. Niêm mạc miệng, môi, lợi, chân răng đỏ ửng,
khô, nóng. Mụn nƣớc bắt đầu mọc ở bên trong má, mép, chân răng, môi, lợi, và bề
mặt lƣỡi. Kích thƣớc của mụn nƣớc bằng hạt gạo, hạt ngô hoặc to hơn, mụn nƣớc
phồng lên, có màng bọc mỏng, bên trong chứa nƣớc trong, sau đục dần. Sau 1 – 2
ngày, mụn nƣớc bị vỡ, lớp niêm mạc tróc ra để lộ mặt dƣới đỏ, chạm nhẹ vào dễ
chảy máu mụn nƣớc thƣờng không có mủ. Do viêm vùng miệng, con vật khó chịu,
luôn lúc lắc đầu, nhai tóp tép, nƣớc bọt sùi ra đầy mõm miệng (Sổ tay dịch bệnh
động vật, 2002).
Do có viêm mụn nƣớc ở vùng vành móng, kẽ móng chân làm con vật khó
chịu, tỏ ra đau đớn, bồn chồn, luôn nhấc chân lên. Dễ thấy nhất là hiện tƣợng què,
không đi cày kéo đƣợc trong khoảng 1 – 2 tuần. Có trƣờng hợp móng chân bị long
hẳn ra, phổ biến nhất là ở heo. Triệu chứng què ở cả đàn trâu bò gây ảnh hƣởng xấu
đối với vùng dựa vào sức kéo của chúng, làm lỡ thời vụ gieo trồng, có nơi xảy ra
dịch bệnh, năng lúa bị giảm 20% (Nguyễn Tiến Dũng, 2000).
3

Hình 2.1 Một số biểu hiện lâm sàn của gia súc bị bệnh LMLM. A: lở loét ở
miệng trên bò; B:mụn nước ở chân heo; C: long móng ở heo; D: mụn nước ở vú
(bò) (vietbao.vn)

Ở con cái đang nuôi con, triệu chứng và bệnh tích ở bầu vú, núm vú cũng
tƣơng tự nhƣ ở miệng và chân làm con vật giảm tiết sữa, sữa bị giảm phẩm chất.
Con mẹ thƣờng không cho con bú vì đau, làm con non thiếu sữa. Hơn nữa chính
con non cũng bị viêm lở mồm nhƣ mẹ nên không bú đƣợc. Hậu quả có tới 50 –
80% gia súc non bị chết. Súc vật cái mang thai nhiễm vi-rút LMLM sẽ sẩy thai.
Biến chứng: Viêm cơ tim ở súc vật non và viêm ruột (bê non, heo < 2 tháng). Từ
miệng tới thực quản, dạ dày, ruột đều có mụn loét với từng mảng suất huyết hoặc tụ
máu. Bộ máy hô hấp cũng bị viêm. Ở trâu bò hay gặp hiện tƣợng mặt ngoài cơ tim
có những vệt hoại tử màu trắng xen kẽ trông giống nhƣ da hổ nên gọi là “tim vằn
hổ” (Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1978).
Bệnh lở mồm long móng ở ngƣời: lây nhiễm bệnh LMLM ở ngƣời khá hiếm
và nhẹ. Đôi khi gặp ở ngƣời hay tiếp xúc với gia súc có bệnh hoặc với vi-rút trong
phòng thí nghiệm nhƣ ngƣời chăn nuôi, chăm sóc gia súc, cán bộ thú y, công nhân
lò mổ, nhân viên phòng thí nghiệm. Đôi khi do uống sữa nhiễm mầm bệnh không
4


tiệt trùng kỹ, hoặc qua vết trầy xƣớc trên da. Biểu hiện là có mụn nƣớc nổi trên da
ở tay, chân và lƣỡi, lợi, có cảm giác ngứa ngáy và hơi nóng rát. Mụn nƣớc có thể tự
vỡ ra hoặc xẹp đi sau vài ngày, không để lại vết sẹo hay di chứng, có thể sốt nhẹ,
mệt mỏi (www.anova.com.vn/contents/article.asp?id=265&detail=16&ucat=42).
2.1.2 Đƣờng xâm nhập của bệnh lở mồm long móng
Đƣờng xâm nhập chính là tiêu hoá, vi-rút có thể vào cơ thể qua niêm mạc
miệng, và niêm mạc ống tiêu hoá. Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi

vi-rút xâm nhập vào cơ thể. Đƣờng sinh dục và hô hấp đƣợc coi là đƣờng xâm nhập
phụ (Sổ tay dịch bệnh đông vật, 2002).
Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau:
- Lây trực tiếp qua nƣớc bọt hoặc các chất bài tiết do nhốt chung hoặc chăn
thả chung gia súc bệnh với gia súc khoẻ mạnh.
- Lây gián tiếp qua thức ăn, nƣớc uống, các dụng cụ chăn nuôi, chân tay,
giầy dép của ngƣời chăn nuôi, ngƣời tham gia điều trị bệnh hoặc lây lan do việc
bán chạy các gia súc mắc bệnh, mổ lậu gia súc mắc bệnh, không xử lý đúng mức
thịt gia súc mắc bệnh hoặc vận chuyển gia súc mắc bệnh.
- Vi-rút có thể theo gió phát tán ra không khí trong cự ly 10 km.
2.1.3 Cơ chế sinh bệnh lở mồm long móng
Thời gian ủ bệnh LMLM: sau khi vius LMLM nhiễm vào động vật mẫn cảm
qua đƣờng hô hấp trên hoặc phổi, vi-rút LMLM tuần hoàn qua máu đến các tổ chức
biểu mô và nhân lên rất nhanh theo cấp số nhân. Thời gian từ khi vi-rút xâm nhập
vào cơ thể động vật mẫn cảm cho đến khi gây các bệnh tích lâm sàng là các mụn
nƣớc ở móng chân mồm thƣờng là khoảng 2 – 14 ngày tùy thuộc vào độc lực của
chủng vi-rút. Vì vậy cần chọn phƣơng pháp thích hợp để chẩn đoán và phát hiện
sớm vi-rút LMLM trên trâu, bò, heo (Garland và Donaldson, 1990).
Đầu tiên vi-rút xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc miệng, niêm mạc ống
tiêu hoá, qua thức ăn, nƣớc uống… hoặc các vết trầy ở bên ngoài cơ thể. Vi-rút sẽ
nhân lên tại các vị trí xâm nhập ở lớp thƣợng bì của miệng, niêm mạc ống tiêu hoá,
da, tạo nên mụn nƣớc sơ cấp, thƣờng các mụn nƣớc này ít và ở giai đoạn đó thú vẫn
sinh hoạt bình thƣờng, do đó dễ dàng bị bỏ qua không phát hiện đƣợc. Sau 1 – 2
5


ngày vi-rút từ mụn nƣớc sơ phát xâm nhập vào máu và phủ tạng, tạo nên triệu
chứng sốt cao. Tuy nhiên, máu và phủ tạng không phải là nơi thích hợp cho sự phát
triển, do đó vi-rút quay ngƣợc trở về các vị trí trên cơ thể có vùng thƣợng bì non
nhƣ môi, nƣớu răng, lƣỡi, gờ móng, đầu vú để phát triển, tạo các mụn nƣớc thứ

cấp. Đặc điểm mụn nƣớc chỉ mọc ở phần thƣợng bì, không ăn sâu vào lớp trung bì
và hạ bì, do đó sau khi mụn nƣớc vỡ sẽ rất mau lành lại, và ít gây nhiễm trùng
thành mụn mủ nếu đƣợc chăm sóc tốt.
Mụn mọc ở miệng, lƣỡi gây cảm giác đau nhức làm thú không nuốt đƣợc,
nƣớc bọt bị kích thích chảy ra đầy ở miệng. Heo con, bê, nghé bỏ bú do đó sẽ chết
sau vài ngày mắc bệnh. Mụn nƣớc ở móng chân thƣờng bị nhiễm trùng do thú đi
đứng trong phân, đất, vi trùng phụ nhiễm sẽ tấn công sâu vào các lớp bên dƣới gây
hƣ hại nặng tổ chức da ở gờ móng, làm móng dễ bị bong tróc. Vi-rút có thể tạo các
mụn nƣớc ở khí quản, phế quản hoặc tấn công vào cơ tim kéo theo sự phụ nhiễm
của vi khuẩn Staphylococcus, tạo nên các thể viêm cơ tim, thoái hoá cơ tim làm gia
súc chết ngộp (Nguyễn Tiến Dũng, 2000).
2.1.4 Tình hình dịch bệnh lở mồm long móng trên thế giới và Việt Nam
Từ thế kỷ XVII, XVIII bệnh LMLM đã bắt đầu suất hiện ở châu Âu và sau
đó bệnh đƣợc phát hiện trên toàn thế giới. Năm 1987, Loeffler và Frosch mới phân
lập đƣợc vi-rút gây bệnh (Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1978). Tình hình dịch bệnh LMLM
trong những năm 60 xảy ra rất trầm trọng, trung bình mỗi năm có khoảng 4.000 ổ
dịch. Đến những năm 70, bệnh có xu hƣớng giảm ở các nƣớc châu Âu, nhƣng ở các
nƣớc châu Phi và châu Á vẫn tăng.
Vào những năm 1980, dịch LMLM xảy ra ở nhiều nƣớc trên toàn thế giới.
châu Âu có 804 ổ dịch tại 12 nƣớc do các chủng O, A, và C gây ra. Tại châu Á đã
có quốc gia đƣợc thông báo có dịch LMLM do chủng Asia1 gây ra. Các nƣớc châu
Phi có dịch LMLM do chủng C và SAT1, SAT2, SAT3 gây ra.
Tháng 3/1997 dịch tái phát tại Đài Loan, tiêu diệt khoảng 4 triệu heo gây
thiệt hại gần 2 tỉ USD. Năm 2000, bệnh LMLM tiếp tục xảy ra trên dê bởi chủng
tƣơng tự chủng O năm 1999; dịch xảy ra trên bò ở các nƣớc Nhật Bản, Hàn Quốc,
Mông Cổ, Liên Bang Nga (Hoàng Văn Nam, Văn Đăng Kỳ, 2000). Năm 2001 dịch
bùng phát lại gây thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế nƣớc Anh, đến tháng 7/2001 có
6

20 nƣớc ở châu Phi, châu Mỹ, châu Á cũng xảy ra bệnh do vi-rút LMLM chủng O,
chủ yếu trên heo (Knowles và ctv, 2005). Năm 2004 có 48 nƣớc thông báo có dịch
LMLM, chủng O là chủ yếu, riêng chủng A, SAT1 và SAT2 có sự biến đổi gen.
Riêng các nƣớc Đông Nam Á và vùng Viễn Đông, trừ Indonesia không có dịch
LMLM, chủng A đƣợc tìm thấy ở Malaysia, Thái Lan, Việt Nam. Năm 2005,
FAO/WRL đã nhận đƣợc 266 mẫu bệnh từ 21 nƣớc thuộc châu Âu, châu Á, châu
Phi, kết quả chủng O vẫn chiếm tỉ lệ cao (OIE/FAO, 2005). Trƣớc tình hình dịch
bệnh xảy ra nghiêm trọng , nhiều viện nghiên cứu ở các nƣớc, Anh, Hòa Kỳ, Đức,
Pháp, Brazil, Thái Lan ra đời. Năm 1958, Pirbright của Anh trở thành phòng thí
nghiệm tiêu chuẩn thế giới về LMLM. Nhờ vào sự phát triển của khoa học công
nghệ hiện đại, việc chẩn đoán và phát hiện bệnh nhanh chóng cũng nhƣ việc sản
suất các loại vắc xin chất lƣợng cao cùng các biện pháp phòng chống dịch hiệu quả,
nhiều quốc gia đã thanh toán thành công dịch LMLM (59 quốc gia đƣợc công nhận
là quốc gia an toàn dịch bệnh LMLM (OIE, 2005).
Ở Việt Nam: vi-rút LMLM đƣợc phát hiện lầm đầu tiên năm 1898 tại Nha
Trang sau đó dịch đã xảy ra liên tiếp vào các năm 1937, 1940, 1948 tại các tỉnh
miền Trung và Nam bộ. Theo tổ chức quốc tế bệnh truyền nhiễm, bệnh LMLM có
xu hƣớng định vị tại Việt Nam và Campuchia. Bệnh cũng xảy ra và gây nhiều thiệt
hại trên trâu, bò, heo ở các tỉnh miền Bắc, Bắc Trung bộ (1952 – 1953) và các tỉnh
đồng bằng sông Cửu Long (1995). Theo số liệu nghiên cứu trƣớc đây cho thấy dịch
LMLM xảy ra liên tục trên trâu bò suốt từ năm 1975 – 2005, gây thiệt hại nặng nề
nhất vào các năm 1993, 1995, 1999 và 2000. Vi-rút chủng O lƣu hành nhiều năm
cùng với chủng A (2005) trên trâu bò và chủng Asia1 đƣợc tìm thấy ở heo (2005)
(Thái Thị Thủy Phƣợng, 2008).
Trong năm 2008, tổng số 153 ổ dịch LMLM xuất hiện ở 128 xã thuộc 47
huyện trong cả nƣớc, trong đó xảy ra trên 1775 trâu, 886 bò, 67 heo. Trong 2 tháng
đầu năm 2009, có tổng số 38 ổ dịch LMLM xảy ra ở 36 xã của 11 huyện thuộc 5
tỉnh, tổng số ảnh hƣởng dến 106 trâu, 394 bò. Trong các ổ dịch trên, chủng O và A
là nguyên nhân chính gây bệnh (Hoàng và ctv, 2009). Năm 2010, số trâu bò bị mắc
bệnh LMLM là 12.826 con so với năm 2009 tăng 5.595 con. Tuy nhiên số bị chết,

xử lý là 225 con, giảm 183 con so với năm ngoái: số heo bị chết, xử lý là 818 con,
7


tăng 389 con (Báo cáo Bộ NN và PT Nông thôn, 2010). Báo cáo 6 tháng đầu năm
2011, dịch LMLM đã xảy ra hơn 30 tỉnh thành với tổng số gia súc là 140.897 con,
trong đó trâu bị nhiễm nhiều nhất 78.277con, tiếp đến là heo 42.897, bò 17.373 con
và dê 1.624 con. Tổng số gia súc bị tiêu hủy trên cả nƣớc là 38.744 con (Báo cáo
Bộ NN và PT Nông thôn, 2011).
2.1.5 Một số nghiên cứu về bệnh lở mồm long móng
Vi-rút gây bệnh LMLM thuộc họ Picornavirus (giống Aphthovirus, họ
Picornaviridae), tồn tại với 7 kiểu huyết thanh miễn dịch khác nhau: O, A , C,
Asia1, SAT1, SAT2, SAT3 (South Afican Territories), với rất nhiều kiểu huyết
thanh phụ khác nhau phản ánh biến đổi di truyền ở các mức độ (Carrillo và ctv,
2005). Ba chủng A, O, C phổ biến trên thế giới, chủng Asia1 đƣợc tìm thấy ở
Pakistan, chủng này thƣờng gây bệnh ở châu Á. Các chủng SAT1, SAT2, SAT3
tìm thấy ở Nam Phi, chủng này thƣờng gây bệnh cho gia súc ở các nƣớc châu Phi.
Trong số đó, chủng A có kháng nguyên đa dạng nhất và vì thế việc tạo vắc xin là
khó khăn hơn cả (Kiching, 2005). Vi-rút gây bệnh LMLM biến đổi liện tục nên gây
đe dọa lớn đến ngành chăn nuôi trên toàn thế giới (Mohapatra và ctv, 2009b).
Theo Lê Văn Phan và ctv (2010) đã tiến hành phân tích trình tự một số đoạn
gen mã hóa vi-rút LMLM chủng A trên các mẫu thu từ vùng dich thuộc các tỉnh
Bắc Cạn, Phú Thọ, Quảng Bình Và Thừa Thiên Huế trong năm 2009. Kết quả phân
tích trình tự nucleotid và acid amin vùng gen mã hóa protein capsid VP1 cho thấy 6
chủng vi-rút LMLM phân lập tại Việt Nam Thuộc kiểu gen IX trong tổng số 10
kiểu gen chính tồn tại trên thế giới, với mức tƣơng đồng acid amin 98,1 – 100%.
Các chủng vi-rút LMLM trên có quan hệ gần gũi với chủng A thuộc các nƣớc châu
Á lân cận nhƣ Lào, Thái Lan và Malaysia, với mức tƣơng đồng acid amin 88,3 –
95,5%. Phan và ctv (2010a, b) phân tích trình tự một số gen mã hóa vi-rút LMLM
chủng A, O và Asia1 cho thấy cả 3 chủng trên có mặt ở các vùng dịch từ nhiều tỉnh

thành khác nhau. Dịch LMLM đã có mặt ở hầu hết các quốc gia châu Á, châu Phi
và Nam Mỹ. Hiệu quả việc kiểm soát dịch LMLM phụ thuộc rất nhiều vào việc
chẩn đoán sớm động vật nhiễm dựa trên phƣơng pháp chẩn đoán đặc hiệu và nhạy
(Hoffmann và ctv, 2009).

8


2.2. Vi-rút gây bệnh lở mồm long móng
2.2.1 Hình thái học vi-rút gây bệnh lở mồm long móng

Hình 2.2 Cấu trúc hình thái vi-rút LMLM (Grubman, 2004)
Là vi-rút nhỏ nhất trong các hạt vi-rút qua lọc, thuộc họ picornaviridae, chi
aphthovirus, có kích thƣớc từ 20nm – 30nm, hình đa diện có 30 mặt đều, qua đƣợc
các máy lọc bekefeld, chamberland và qua mang lọc seitz. Hạt vi-rút chứa 30% là
acid nucleic, đó là 1 đoạn RNA chuỗi đơn. Vỏ capsid có 60 đơn vị gọi là capsome,
mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4) trong đó VP1 đóng vai trò
quan trọng nhất trong viêc gây bệnh, đồng thời là loại kháng nguyên chính tạo ra
kháng thể bảo hộ chống lại bệnh LMLM (Nguyễn Tiến Dũng, 2000).
Cấu trúc gen: bộ gen vi-rút có chiều dài khoảng 8.500 base, bao gồm phần
giải mã đầu 5’ và đầu 3’, phần giải mã protein cấu trúc (1ABCD) và phần giải mã
protein không cấu trúc (2ABC và 3ABCD) (Clavijo và ctv, 2004). Trong số 7
chủng LMLM, chủng A là chủng có tính biến đổi kháng nguyên lớn nhất.

9


Hình 2.3 Sơ đồ bộ gen vi-rút LMLM (Grubman, 2004)
Dựa vào phân tích cây sinh dòng trên cơ sở trình tự gen VP1, chủng A đƣợc
chia thành 10 kiểu gen chính (I – X) (Kitching, 2005). Tƣơng tự chủng O đƣợc chia

làm 10 kiểu gen, ký hiệu Europe-South America (Euro-SA), MiddleEast-South
Asia (ME-SA), Cathay (CHY), West Africa (WA), East Africa 1 (EA-1), East
Africa 2 (EA-2), East Africa 3 (EA-3), Indonesia – 1 (ISA-1), và Indonesia – 2
(ISA – 2) (Knowles và ctv, 2005). Chủng Asia1 đƣợc chia làm 6 chủng (I – VI)
(Valarcher và ctv, 2009). Ở khu vực Đông Nam Á, những năm gần đây vi-rút
LMLM gây ra những trận đại dịch ở Campuchia, Lào, Myanma, Philippin, Thái
Lan và Việt Nam đƣợc xác định là do sự suất hiện đồng thời các chủng O, A, và
Asia1 (Knowles và ctv, 2005). Chính sự đa dạng này mà khả năng lây lan nhanh,
mạnh nên rất khó khăn trong việc phòng chống bệnh (Kitching, 2005). Dịch
LMLM vẫn tiếp tục tồn tại và phát triển, điều đó đặt ra mối đe dọa nghiêm trọng
cho ngành chăn nuôi trên toàn thế giới (Mohapatra và ctv, 2009). Vi-rút LMLM
không có vỏ bọc ngoài do vậy chúng có sức đề kháng với các dung môi hƣu cơ
(cồn, ete…) nhƣng lại mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol…

10


2.2.2 Phân bố của chủng vi-rút lở mồm long móng
Các chủng huyết thanh có sự phân bố khác nhau trên thế giới. Chủng huyết
thanh O, A đƣợc nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới. Trái lại các chủng
huyết thanh SAT1, SAT2, SAT3 đƣợc giới hạn ở một số nƣớc thuộc châu Phi.
Chủng huyết thanh Asia1 đƣợc tìm thấy ở nhiều nƣớc thuộc châu Á. Riêng chủng
huyết thanh C chỉ còn tồn tại một vài nƣớc nhƣ Philippines (OIE/FAO, 2005). Theo
tài liệu của Cục Thú y, dòng vi-rút gây bệnh lở mồm long móng trên gia súc ở Việt
Nam thuộc chủng O, gần đây có suất vi-rút chủng A ở miền Trung và vi-rút chủng
Asia1 ở các tỉnh miền núi phía bắc.

Hình 2.4 Các quốc gia có dịch LMLM đã đƣợc báo cáo

cho OIE giữa năm 1990 và 2002 (Grubman, 2004)

2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh lở mồm long móng
2.3.1 Chẩn đoán lâm sàng
Việt chẩn đoán lâm sàng bệnh LMLM có thể đƣợc thực hiện trong trƣờng
hợp bệnh xảy ra tại khu vực đã đƣợc xác định là có dịch LMLM. Các triệu chứng
chính của bệnh là sự suất hiện các mụn nƣớc trong khoang miệng (lƣỡi, lợi), quanh
mũi, vành tiếp giáp da với móng chân, kẽ chân và các đầu vú (đối với bò sữa). Kèm
theo các triệu chứng trên là hiện tƣợng con vật bị què do bị đau chân gây khó khăn
11


trong di chuyển. Các mụn nƣớc này tiến triển tạo thành các vết loét có thể có vi
trùng thứ phát. Tuy nhiên việc chẩn đoán lâm sàng thƣờng dễ nhầm với các bệnh
khác nhƣ: viêm miệng mụn nƣớc, bệnh mụn nƣớc ở heo, bệnh ngoại ban mụn nƣớc
heo, bệnh dịch tả trâu bò, bệnh tiêu chảy siêu trùng ở bò… Mặt khác cần phải chú ý
rằng không phải tất cả số gia súc mắc bệnh đều có biểu hiện lâm sàng rõ rệt. Do
vậy cần kết hợp với số liệu dịch tể để chẩn đoán (Tô Long Thành, 2004).
2.3.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Tại các nơi chƣa bao giờ xảy ra dịch LMLM, các triệu chứng lâm sàng chỉ
có tính chất định hƣớng trong chẩn đoán và nhất thiết phải dùng biện pháp chẩn
đoán trong phòng thí nghiệm để khẳng định bệnh. Biện pháp chẩn đoán phòng thí
nghiệm thƣờng dùng là phƣơng pháp huyết thanh học. Trƣớc đây, ta thƣờng dùng
phản ứng kết hợp bổ thể phát hiện huyết thanh cho cả 7 chủng khẳng định là
LMLM. Hiện nay ta có thể dùng các phƣơng pháp khác nhƣ ELISA.
2.3.2.1. Chẩn đoán huyết thanh học
2.3.2.1.1 Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT)
Phản ứng KHBT đƣợc thực hiện nhờ hai hệ thống: hệ thống dung khuẩn và
hệ thống dung huyết với sự tham gia của bổ thể.
Huyết thanh miễn dịch của từng chủng trên chuột lang: bằng phƣơng pháp
gây tối miễn dịch, tiêm vắc xin LMLM của các chủng khác nhau vào trong da dƣới

bàn chân chuột lang hai lần, mỗi lần cách nhau một tháng, sau đó lấy máu, chắt
huyết thanh có chứa kháng thể.
Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc dùng bệnh phẩm
cấy vào môi trƣờng tế bào tổ chức lấy từ tuyến yên của bò hoặc của heo, tế bào
thận bê hoặc cừu non hoặc các dòng tế bào có độ nhạy tƣơng đƣơng, khi tế bào
nuôi suất hiện các biến đổi tế bào thì lấy dịch làm phản ứng KHBT.
Phản ứng KHBT cũng đã đƣợc hoàn thiện rất kỹ và khi sử dụng thành thục
sẽ là một phƣơng tiện hữu hiệu để chẩn đoán phân biệt giữa vi-rút LMLM và các
vi-rút gây viêm mụn nƣớc khác.

12


2.3.2.1.2 Phản ứng trung hòa vi-rút
Vi-rút LMLM có khả năng kích thích cơ thể sinh kháng thể đặc hiệu, sự kết
hợp giữa vi-rút với kháng thể đó làm cho vi-rút không còn khả năng gây bệnh đƣợc
nữa. Phản ứng trung hòa rất có giá trị trong các trƣờng hợp bệnh diễn ra ở thể nhẹ,
không có điều kiện lấy mẫu bệnh phẩm là mụn nƣớc, mà phải lấy máu tìm kháng
thể. Phản ứng trung hòa vi-rút thƣờng đƣợc thực hiện trên môi trƣờng tế bào tổ
chức thận heo hoặc thận cừu, hoặc tế bào mẫn cảm BHK-21 đƣợc nuôi trong các
đĩa nhựa lỗ nhỏ. Kháng thể nghi là huyết thanh vi-rút đƣợc xử lí ở nhiệt độ 56oC
trong 30 phút.
Để xác định chủng gây bệnh trên thực địa cần có 7 chủngs vi-rút LMLM đã
biết đƣợc nuôi trong phòng thí nghiệm. Ủ 100 TCID50 (50% Tissue Culture
Infectious Dose) của vi-rút trong thể tích tƣơng đƣơng với huyết thanh nghi nhiễm
vi-rút ở 370C trong 20 – 60 phút. Sau đó dùng hỗn dịch cấy vào các dãy lỗ nhựa đã
nuôi cấy tế bào để đánh giá khả năng trung hòa huyết thanh. Sau khi đã xác định
đƣợc chủng vi-rút gây bệnh, tiếp tục pha loãng huyết thanh nghi và làm phản ứng
tƣơng tự để xác định hiệu giá kháng thể có khả năng trung hòa vi-rút. Phản ứng
trung hòa vi-rút vừa có khả năng định tính vừa có khả năng định lƣợng nhƣng có

nhƣợc điểm là có thể có hiện tƣợng dƣơng tính giả.
2.3.2.1.3 Phản ứng ELISA (Enzyme- linked immunosorbent assay)
Dùng kháng thể hoặc kháng nguyên đã biết gắn vào đĩa nhựa 96 lỗ. sau đó ủ
đĩa với kháng nguyên từ bệnh phẩm (biểu mô) hoặc kháng thể từ con vật nghi bị
bệnh LMLM.
Phản ứng ELISA trực tiếp dùng để phát hiện kháng nguyên. Dùng kháng thế
đặc hiệu cho chủng vi-rút đã đƣợc gắn với enzym để phát hiện kháng nguyên. Sau
khi cơ chất vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzym tạo ra màu. Và khi so màu trong
quang phổ kế sẽ định lƣợng đƣợc mức độ phản ứng.
Phản ứng ELISA gián tiếp dùng để phát hiện kháng thể. Dùng kháng thể thứ
2 đã đƣợc gắn với enzym để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh của bệnh
phẩm. Đánh giá con vật mắc vi-rút LMLM dựa vào kháng nguyên đã đƣợc gắn vào
đĩa cho kết quả phản ứng ELISA dƣơng tính (Nguyễn ngọc hải, 2007).
13


2.3.2.2 Chẩn đoán vi-rút học
Huyền dịch bệnh phẩm nghi có chứa vi-rút LMLM phải đƣợc ly tâm trƣớc
khi cấy cho tế bào nuôi hoặc tiêm cho động vật thí nghiệm. Các tế bào nhạy cảm
với vi-rút LMLM bao gồm: tế bào sơ cấp tuyến giáp trạng bò, tế bào sơ cấp thận
cừu, bê hoặc heo, các tế bào dòng nhƣ tế bào thận chuột Hamster non (BHK-21).
Có thể tiêm huyền dịch bệnh phẩm nghi có vi-rút LMLM vào nội bì lƣỡi bò, bò này
không nằm trong phạm vi ổ dịch, chƣa tiêm vắc xin LMLM. Nếu có vi-rút LMLM
thì sau khi tiêm 24 – 48 giờ thấy xuất hiện các mụn nƣớc ở chổ tiêm, dần mụn vở
thành vết loét. Hoặc dùng chuột lang (từ 2 – 7 ngày tuổi) để lây bệnh bằng cách
khía da bàn chân rồi bôi bệnh phẩm lên. Nếu bệnh phẩm có vi-rút LMLM thì sau
24 – 48 giờ, các chổ khía da nổi mụn nhỏ, màu đỏ, có thủy thủng, chuột có thể
nhiễm trùng toàn thân và chết (Nguyễn Nhƣ Thành, 1974).
2.3.2.3 Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR
Kỹ thuật PCR là một phƣơng pháp tạo dòng in vitro, cho phép khuếch đại

một đoạn DNA đặc hiệu từ một đoạn gen tƣơng đối dài, mà không cần đến việc
tách và nhân dòng. RT-PCR là kỹ thuật cho phép nhân dòng vật chất di truyền của
vi-rút có bộ gen là RNA (Ribonucleic acid). Phản ứng gồm 2 giai đoạn: thứ nhất
RNA sẽ đƣợc phiên mã ngƣợc tạo cDNA dƣới tác dụng của enzyme phiên mã
ngƣợc RT (Reverse Transcriptase). Sau đó tiến hành chạy PCR nhƣ bình thƣờng.
Mồi trong phản ứng RT-PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự đoạn cDNA (Kitching,
2000).
Phƣơng pháp khuếch đại gen phiên mã ngƣợc (RT-PCR; reverse
transcriptase-polymerase chain reaction) là phƣơng pháp tin cậy nhanh và nhạy hơn
cả để phát hiện vi-rút LMLM với số lƣợng mẫu lớn (Hoffmann và ctv, 2009). Độ
nhạy và độ đặc hiệu của phƣơng pháp chẩn đoán là yếu tố quan trọng liên quan đến
nhiều yếu tố nhƣ mồi đặc hiệu, điều kiện và thành phần phản ứng RT-PCR, chất
lƣợng mẫu.
Ở Việt Nam dịch LMLM xảy ra chủ yếu trên trâu, bò, heo với các chủng O,
A, Asia1. Triệu chứng bệnh diễn ra khá rõ nét và diển biến rất nhanh, vì vậy cần
chọn một phƣơng pháp có thể phát hiện nhanh và sớm vi-rút LMLM tồn tại trong
cơ thể vật nuôi. Một trong những phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng là kỹ thuật
14