TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE ĐỂ ỨNG DỤNG XỬ LÝ VỎ CA CAO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE
ĐỂ ỨNG DỤNG XỬ LÝ VỎ CA CAO

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: PHẠM TRẦN VŨ THƢ
Niên khóa: 2008 – 2012

Tháng 07/2012

i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE
ĐỂ ỨNG DỤNG XỬ LÝ VỎ CA CAO

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

KS. TRẦN THỊ QUỲNH DIỆP

PHẠM TRẦN VŨ THƢ

ThS. VÕ THỊ THÚY HUỆ

Tháng 07/2012
ii


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm
Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả Quý Thầy Cô tận tình giảng dạy và truyền đạt
kiến thức cho tôi trong thời gian học tập tại trƣờng.
Thầy Lê Đình Đôn đã luôn lắng nghe, động viên chia sẻ và tạo mọi điều kiện
cho chúng tôi suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Viện Nghiên cứu Công
nghệ sinh học và Môi trƣờng.
Cô Trần Thị Quỳnh Diệp, Cô Võ Thị Thúy Huệ, Thầy Nguyễn Minh Quang, đã
chỉ dạy, chia sẻ, hỗ trợ cho tôi, giúp tôi vƣợt qua những khó khăn khi thực hiện đề tài.
Chị Nguyễn Trƣờng Ngọc Tú, chị Trƣơng Thị Ngọc Hân cùng các thành viên
làm việc tại Trại Thực Nghiệm Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trƣờng
Trƣờng Đại học Nông Lâm đã hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều.
Bạn Nguyễn Xuân Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Trâm, Mai Thị Hồng Diễm, Từ Thị
Anh, Võ Đức Tuấn, Đỗ Tô Hoa Mai, Nguyễn Công Phát, Quách Văn Thiệu và tất cả
các bạn lớp DH08SH luôn đồng hành cùng tôi khi thực hiện đề tài, trong học tập cũng
nhƣ trong cuộc sống.
Cuối cùng xin gởi lời cám ơn chân thành nhất đến bố mẹ, ngƣời đã sinh ra và
nuôi dạy con lớn lên, nâng con dậy khi vấp ngã và luôn ở bên con để con có đƣợc ngày
hôm nay.

Tp Hồ Chí Minh, 14/7/2012
PHẠM TRẦN VŨ THƢ

i


TÓM TẮT
Đến năm 2015, diện tích ca cao cả nƣớc sẽ đạt 53.580 ha, dẫn tới một lƣợng lớn
vỏ ca cao thải ra môi trƣờng mà chƣa có qui trình xử lý thích hợp. Việc tận dụng vỏ ca
cao nhƣ một nguồn nguyên liệu chính để chế biến thành phân hữu cơ sinh học, thức ăn
cho vật nuôi hoặc sản xuất ethanol sinh học sẽ góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế và
giảm ô nhiễm môi trƣờng. Tuy nhiên, có một vấn đề lớn là hàm lƣợng cellulose trong
vỏ ca cao khá cao, đòi hỏi phải có khâu xử lý ban đầu hiệu quả. Vì vậy, nhóm nghiên
cứu đã thực hiện đề tài phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng
phân hủy cellulose để ứng dụng xử lý vỏ ca cao.
Đề tài đã tiến hành phân lập các chủng xạ khuẩn từ mẫu khác nhau nhƣ đất, lá
mục, phân ủ, vỏ trấu, cà phê mục thu thập tại các địa phƣơng. Tiến hành định tính,
định lƣợng khả năng sinh hệ enzyme cellulase của các chủng này. Dựa vào kết quả
trên chọn ra một số chủng mạnh để tiếp tục khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến
khả năng tăng sinh và sinh tổng hợp enzyme cellulase. Từ đó tiến hành tăng sinh khối
để thử nghiệm xử lý vỏ ca cao quy mô nhỏ.
Kết quả đã phân lập đƣợc 25 chủng xạ khuẩn đều có khả năng phân giải cellulose
và sinh hệ enzyme cellulase khá mạnh. Trong đó 2 chủng 14IV và 23XIV là 2 chủng
có khả năng tăng sinh khối mạnh nhất lần lƣợt là 9,9 x 1010 CFU/ml, 8,3 x 1010
CFU/ml trong điều kiện nuôi cấy tối ƣu là môi trƣờng YS, pH 6, thời gian 108 giờ khi
lắc ở tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục tăng sinh khối 2 chủng này để
xử lý vỏ ca cao thì thấy trong quá trình ủ, độ ẩm và pH đều giảm đến ngƣỡng tối ƣu.
Nhiệt độ không tăng mạnh do kích thƣớc đống ủ quá nhỏ nhƣng hàm lƣợng cellulose
vẫn giảm có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng.

ii


SUMMARY
Vietnam’s area under cocoa cultivation in 2015 is estimated for 50.580 hectares.
It causes a large number of cocoa shells discharged into the environment without any
appropriate treatment system. Cocoa shells could be used for the production of
microorganism fertilizer, animal feed and bioethanol. This would enhance economic
efficiency and decrease environmental pollution. However, the key problem is the
cellulose content of cocoa shell is quite high, so an effective initial treatment of cocoa
shell is necessary. Therefore isolation and selection of some actinomycetes strains
which could decompose cellulose in cocoa shell was performed.
After isolating actinomycete strains from different samples such as soil, leaves,
compost, rice hulls collected from different provinces in Vietnam, their ability to
produce cellulase enzyme system was investigated. Some strong strains were selected
to test and culture medium and condition to increase biomass as well as cellulase
enzyme producing were determined for the selected strong strains. Based on the result,
we tested cocoa shell process on a small scale.
Twenty five isolated actinomycete strains were able to decompose cellulose and
generate strong cellulase enzyme system. Among those strains, strains 14IV and
23XIV are the ones have the highest capacity of enriching biomass. Their biomass are
9,9 x 1010 CFU/ml, 8,3 x 1010 CFU/ml, respectively, in the optimal culture conditions
are environment YS, pH 6, the time 108 hours, shaking at the speed of 150 cycles per
minute at room temperature. In the processing, we found that, the moisture and pH
factors were reduced to the optimal threshold. The temperature increased
insignigicantly because the heap size was small. However, the cellulose content was
significantly reduced compared with control treatment.

iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ......................................................................................................................iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................ix
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề: ................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của khóa luận ..............................................................................................2
1.3. Nội dung của khóa luận ............................................................................................2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
2.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn ...................................................................................3
2.1.1. Phân loại ................................................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của xạ khuẩn .............................................................4
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái..............................................................................................4
2.2.1.2. Đặc điểm cấu tạo của xạ khuẩn ..........................................................................5
2.1.2.3. Bào tử của xạ khuẩn ...........................................................................................5
2.1.3. Đặc điểm sinh thái .................................................................................................6
2.1.4. Enzyme cellulase của xạ khuẩn .............................................................................7
2.2. Cellulose và hệ enzyme cellulase .............................................................................8
2.2.1. Cellulose ................................................................................................................8
2.2.2. Enzyme cellulase ...................................................................................................8
2.2.2.1. Định nghĩa .........................................................................................................8
2.2.2.2. Cấu tạo chung của cellulase ...............................................................................8
2.2.2.3. Phân loại hệ thống hệ enzyme cellulase .............................................................9
2.2.2.4. Tính chất ...........................................................................................................10
2.2.2.5. Cơ chế tác động của enzyme cellulase .............................................................10

2.3. Giới thiệu về cây và vỏ ca cao ................................................................................11
2.3.1. Cây ca cao ............................................................................................................11
iv


2.3.2. Lợi ích của vỏ ca cao ...........................................................................................12
2.4. Một số công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam ..................................13
2.4.1. Một số công trình nghiên cứu trên thế giới .........................................................13
3.4.2. Một số công trình nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................14
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................16
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện .............................................................................16
3.2. Vật liệu nghiện cứu.................................................................................................16
3.2.1. Đối tƣợng thí nghiệm ..........................................................................................16
3.2.2. Hóa chất ...............................................................................................................17
3.2.3. Dụng cụ, thiết bị ..................................................................................................17
3.2.4. Môi trƣờng ...........................................................................................................17
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................17
3.3.1. Phƣơng pháp phân lập và tăng sinh các dòng xạ khuẩn từ tự nhiên ...................17
3.3.2. Phƣơng pháp quan sát hình dạng khuẩn ty bào tử bằng tiêu bản phòng ẩm .......18
3.3.3. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc ...........18
3.3.4. Phƣơng pháp định tính khả năng phân giải cellulose ..........................................19
3.3.5. Phƣơng pháp định lƣợng hoạt độ enzyme cellulase ............................................19
3.3.5.1. Dựng đƣờng chuẩn ...........................................................................................19
3.3.5.2. Định lƣợng hoạt độ enzyme cellulase trong mẫu .............................................20
3.3.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng sự tăng sinh và tổng hợp hệ enzyme cellulase. .21
3.3.6.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh tổng hợp cellulase ...................21
3.3.6.2. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy lên sự sinh tổng hợp cellulase ............................21
3.3.6.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của xạ khuẩn ....22
3.3.7. Thử nghiệm khả năng phân giải cellulose trong vỏ ca cao ở quy mô nhỏ ..........22
3.3.7.1 Xử lý và phân tích mẫu đầu vào ........................................................................22

3.3.7.2. Tiến hành ủ ở quy mô nhỏ ................................................................................22
3.3.7.3. Phƣơng pháp phân tích các chỉ tiêu mẫu ủ .......................................................23
3.3.8 Tính toán ...............................................................................................................24
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................25
4.1. Kết quả phân lập .....................................................................................................25
4.2. Mô tả đặc điểm hình thái các dòng phân lập ..........................................................25
4.3. Kết quả quan sát hình thái bằng phƣơng pháp phòng ẩm ......................................26
v


4.4. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cellulase của 25 chủng xạ khuẩn phân lập .....27
4.5. Kết quả khảo sát hoạt độ hệ enzyme cellulase .......................................................29
4.6. Kết quả khảo sát các điều kiện ảnh hƣởng đến khả năng nhân sinh khối ..............30
4.6.1. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh .......30
4.6.2. Xác định pH môi trƣờng thích hợp......................................................................31
4.6.2. Xác định môi trƣờng tăng sinh thích hợp ............................................................33
4.7. Thử nghiệm xử lý vỏ ca cao ở quy mô nhỏ ............................................................34
4.7.1. Đặc tính vỏ ca cao đầu vào ..................................................................................34
4.7.2. Theo dõi sự thay đổi nhiệt độ ..............................................................................34
4.7.3. Theo dõi sự thay đổi độ ẩm .................................................................................35
4.7.4. Theo dõi sự thay đổi pH ......................................................................................36
4.7.4. Theo dõi sự thay đổi hàm lƣợng cellulose ..........................................................36
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................37
5.1. Kết luận...................................................................................................................37
5.2 Kiến nghị .................................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................38
PHỤ LỤC ......................................................................................................................40

vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APGII

Angiosperm Phylogeny Group II

CMC

Carboxymethylcellulose

CFU/g

Colony forming units/gram

C/N

Carbon/nitrogen

DNA

Deoxyribo nucleic acid

DNS

3,5 – Acid dinotrosalisylic

DC

Nghiệm thức đối chứng

EDTA

Ethylendiamine tertraacetic axid

HEC

Hydroxyethyl cellulose

Hđez

Hoạt độ enzyme

KTKS

Khuẩn ty khí sinh

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

OD

Optical density

UI

International Unit

X

Nghiệm thức bổ sung hỗn hợp dịch tăng sinh

XK

Xạ khuẩn

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1

Khuẩn lạc xạ khuẩn ...................................................................................... 3

Hình 2.2

Mô hình phân tử cellulase đang thủy phân cellulose ................................. 11

Hình 4.1

Khuẩn lạc xạ khuẩn trên môi trƣờng Gause sau 10 ngày .......................... 26

Hình 4.2

Hình dạng khuẩn ty và cuống sinh bào tử xạ khuẩn .................................. 27

Hình 4.3

Vòng phân giải CMC của các chủng xạ khuẩn sau 6 ngày ....................... 29

Hình 4.4

Đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ xạ khuẩn theo thời gian ................. 30

Hình 4.5

Đồ thị thể hiện sự biến thiên hoạt độ enzyme cellulase theo thời gian ..... 31

Hình 4.6

Đồ thị biễu diễn sự biến thiên mật độ xạ khuẩn theo pH .......................... 32

Hình 4.7

Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hoạt độ enzyme cellulase theo pH ............. 32

Hình 4.8

Đồ thị biễu diễn sự thay đổi mật độ xạ khuẩn theo môi trƣờng ................ 33

Hình 4.9

Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nhiệt độ của đống ủ theo ngày ..................... 34

Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ ẩm của đống ủ theo 7 ngày...................... 35
Hình 4.11 Sự thay đổi pH của đống ủ theo 7 ngày ..................................................... 36
Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng cellulose của đống ủ ................... 36

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Lƣợng xạ khuẩn trong đất xác định theo chiều sâu đất ................................... 6
Bảng 2.2 Thành phần vỏ ca cao .................................................................................... 12
Bảng 3.1 Nơi lấy và tính chất mẫu phân lập ................................................................. 16
Bảng 3.2 Nồng độ glucose trong xây dựng đồ thị đƣờng chuẩn .................................. 20
Bảng 3.3 Các bƣớc tiến hành định lƣợng hoạt độ enzyme cellulase ............................ 21
Bảng 3.4 Nghiệm thức bố trí đống ủ ............................................................................. 22
Bảng 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc xạ khuẩn trên môi trƣờng Gause .................................. 25
Bảng 4.2 Đƣờng kính vòng phân giải CMC của 25 chủng xạ khuẩn ........................... 28
Bảng 4.3 Hoạt độ enzyme cellulase của 25 chủng phân lập ......................................... 29
Bảng 4.4 Đặc điểm của vỏ ca cao trƣớc khi ủ .............................................................. 34

ix


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học, khu vực miền Nam nƣớc ta, đặc biệt là
vùng Tây Nguyên, có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển cây ca cao. Đây là giống
cây có nhiều ƣu điểm: dễ trồng, chịu hạn tốt, chi phí đầu tƣ thấp và có năng suất cao.
Hiện nay giá cả và nhu cầu tiêu thụ ca cao trên thị trƣờng thế giới đang có xu hƣớng
tăng lên. Do đó, ca cao đƣợc đánh giá là giống cây có tiềm năng kinh tế và đƣợc chọn
là một trong những loại cây trồng chủ lực trong thời gian tới.
Dựa trên số liệu của Cục Trồng trọt thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn, diện tích ca cao cả nƣớc sẽ đạt 53.580 ha vào năm 2015, dẫn tới một lƣợng lớn
vỏ ca cao đƣợc thải ra môi trƣờng mà chƣa có qui trình xử lý thích hợp. Đây sẽ là một
vấn đề lớn cho môi trƣờng cũng nhƣ sự thiệt hại về kinh tế cho nguồn chất hữu cơ giàu

dinh dƣỡng này. Do đó, việc tận dụng vỏ trái ca cao nhƣ một nguồn nguyên liệu chính
để chế biến thành phân hữu cơ sinh học (dùng bón lại cho cây ca cao), thức ăn cho vật
nuôi (gia súc, gia cầm) hoặc sản xuất ethanol sinh học, sẽ góp phần nâng cao hiệu quả
kinh tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng, qua đó giúp cho việc trồng và chế biến ca cao
đƣợc phát triển một cách bền vững.
Tuy nhiên, có một vấn đề lớn là vỏ ca cao có hàm lƣợng cellulose khá cao, đòi
hỏi phải có khâu xử lý ban đầu hiệu quả. Để giải quyết vấn đề này, phƣơng pháp sử
dụng vi sinh vật để phân huỷ cellulose đang đƣợc coi là giải pháp hữu hiệu nhất. Ở
Việt Nam, trong công tác xử lý cellulose đã tồn tại và sử dụng phổ biến một số chủng
vi sinh vật, trong đó đóng góp một phần không nhỏ là các chủng xạ khuẩn.
Trong tự nhiên xạ khuẩn tham gia vào các quá trình phân giải các hợp chất hữu
cơ trong đất góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất nhờ nhiều hệ enzyme ngoại
bào phong phú nhƣ amylase, lignin peroxydase, xylanase, protease, đặc biệt là
cellulase. Đặc tính quan trọng này đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong chế biến và xử lý
rác hữu cơ. Trên cơ sở đó, đề tài “Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng
phân hủy cellulose để ứng dụng xử lý vỏ ca cao” đã đƣợc tiến hành.

1


1.2. Yêu cầu của khóa luận
Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase cao để nghiên
cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp và bƣớc đầu ứng dụng xử lý vỏ ca cao.
1.3. Nội dung của khóa luận
Phân lập các chủng xạ khuẩn từ mẫu khác nhau nhƣ đất, lá mục, phân ủ, vỏ trấu,
cà phê mục thu thập tại các địa phƣơng. Quan sát hình dạng khuẩn ty bào tử và tiến
hành định tính, định lƣợng khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng này. Dựa
vào kết quả này chọn ra một số chủng mạnh để tiếp tục khảo sát ảnh hƣởng của yếu tố
thời gian, pH và môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase.
Từ đó tiến hành tăng sinh khối ứng dụng thử nghiệm xử lý vỏ ca cao quy mô nhỏ.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn
2.1.1. Phân loại
Giới

Bacteria

Ngành

Actinobacteria

(Harz, 1877)
Hình 2.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn
(www.jic.ac.uk)

Gồm 35 họ, 110 chi và 1000 loài với 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500
loài thuộc các chi còn lại thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm (Nguyễn Lân Dũng, 2006).
Thông thƣờng ngƣời ta nhận dạng và định danh xạ khuẩn dựa vào hình thái. Tuy
nhiên, thông tin về trình tự 16S rDNA cho thấy đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ít liên
quan đến di truyền và tiến hóa giữa các chủng xạ khuẩn. Hai chủng đƣợc coi là hai loài
riêng biệt nếu chúng giống nhau dƣới 70% khi tiến hành lai DNA. Theo Keswani và
ctv (2001), nếu sự tƣơng đồng giữa hai trình tự rDNA 16S là 98,6% thì xác suất để
mức độ giống nhau trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tƣơng
đồng 98,6% của trình tự rDNA 16S đƣợc coi là ngƣỡng để phân biệt hai loài khác
nhau (Trích dẫn bởi Nguyễn Lân Dũng, 2006).
Sự tồn tại của xạ khuẩn đƣợc thừa nhận và biết đến hơn một trăm năm nay. Ban

đầu, xạ khuẩn đƣợc xem là một nhóm vi sinh vật với nhiều đặc điểm tƣơng đồng với
cả vi khuẩn (prokaryote) và nấm mốc (eukaryote). Tuy nhiên đến nay, xạ khuẩn đã
đƣợc chứng minh là vi khuẩn (Kalakutsky và Agre, 1977) do các đặc điểm:
Một số xạ khuẩn nhƣ các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống với
các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium.
Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc
chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào.
Đƣờng kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với ở vi khuẩn. Đồng thời sợi xạ
khuẩn thƣờng không chứa vách ngăn.
Xạ khuẩn là đích tấn công của các thực khuẩn thể giống nhƣ vi khuẩn, trong khi
đó, nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể.
3


Xạ khuẩn thƣờng nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn, nhƣng
lại thƣờng kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm nhƣ các polyen.
Xạ khuẩn không chứa chitin, chất có mặt ở nhiều nấm, không có ở vi khuẩn.
Đồng thời giống phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không chứa cellulose.
Tƣơng tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng acid của môi trƣờng,
đặc điểm này không có ở nấm.
Các đặc điểm về sợi và nang bào tử kín (sporangium) của chi Actinoplanes cho
thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp.
2.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của xạ khuẩn
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái
Khuẩn lạc của xạ khuẩn không trơn ƣớt nhƣ vi khuẩn hay nấm men mà thƣờng
có dạng khô, không trong suốt, xù xì, dạng lông tơ, dạng nhung, dạng màng dẻo với
các màu sắc khác nhau nhƣ: đỏ, da cam, vàng, trắng, xanh, có các nếp tỏa ra theo hình
phóng xạ và bám sâu vào thạch. Khuẩn lạc thƣờng có cấu tạo gồm 3 lớp: lớp vỏ ngoài
gồm các sợi khuẩn ty quấn chặt vào nhau, lớp trong tƣơng đối xốp và lớp giữa có dạng
tổ ong. Hệ sợi cơ chất có thể tiết vào môi trƣờng các loại sắc tố, thƣờng có màu xanh,

hồng, nâu, đen, có sắc tố tan trong nƣớc, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.
Khuẩn lạc thƣờng có đƣờng kính 0,5 - 2 mm, nhƣng cũng có khuẩn lạc có đƣờng kính
đạt đến 1 cm hoặc hơn.
Xạ khuẩn có hệ sợi rất phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (trừ
cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi xạ khuẩn có đƣờng kính thay đổi trong
khoảng 0,2 - 1 μm đến 2 - 3 μm. Kích thƣớc và khối lƣợng hệ sợi thƣờng không ổn
định và phụ thuộc vào tuổi sinh lý và điều kiện nuôi cấy. Các loài xạ khuẩn khác nhau
đểu có cùng một kiểu cấu tạo hệ sợi, có loài có hệ sợi dài, thẳng hay làn sóng hoặc rất
ít phân nhánh; có loài lại có hệ sợi ngắn, thƣờng phân nhánh, thẳng hoặc xoắn.
Trên môi trƣờng đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại. Một loại cắm
sâu vào môi trƣờng, có chức năng lấy chất dinh dƣỡng gọi là hệ sợi cơ chất (substrate
mycelium). Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (aerial mycelium)
làm nhiệm vụ sinh sản. Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ chất nhƣng cũng có những loại nhƣ
chi Sporichthya lại chỉ có khuẩn ty khí sinh (Trần Cẩm Vân, 2002).

4


2.2.1.2. Đặc điểm cấu tạo của xạ khuẩn
Theo Lê Xuân Phƣơng (2001), xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tƣơng tự các vi khuẩn
G+. Dƣới kính hiển vi có thế thấy rõ các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất,
nguyên sinh chất, chất nhân, các thể ẩn nhập. Thành tế bào có kết cấu dạng lƣới, dày
khoảng 10 - 20 nm, gồm có ba lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60 - 120 Å, lớp giữa dày
khoảng 50 Å, lớp trong dày khoảng 50 Å. Thành tế bào đƣợc cấu tạo từ các lớp
glucopeptide, gồm có các gốc N-axetylglucosamine liên kết với acid N-axetylmuramic
bằng liên kết 1,4 - β glucoside.
Khác với nấm, thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và chitin nhƣng chứa
nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua
màng tế bào. Trên thành tế bào xạ khuẩn còn có các lỗ cho phép các hợp chất có phân tử
lƣợng lớn di chuyển qua.

Thành tế bào xạ khuẩn có thể cho phép các chất kháng sinh, acid amin, enzyme và
nhiều hợp chất khác đi qua một cách dễ dàng, đồng thời các chất dinh dƣỡng từ môi
trƣờng bên ngoài cũng đƣợc thẩm thấu một cách có chọn lọc.
Dƣới lớp thành tế bào là màng sinh chất bao quanh tế bào chất, dày khoảng 50 nm
đƣợc cấu tạo từ hai thành phần chính là phospholipid và protein. Chúng có vai trò quan
trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn. Xét về bản
chất hóa học thì tế bào chất là nucleoprotein, có hàm lƣợng RNA khá cao, hàm lƣợng này
thay đổi trong quá trình phát triển của xạ khuẩn và phụ thuộc vào điều kiên nuôi cấy.
Nguyên sinh chất và nhân của tế bào xạ khuẩn khá giống với vi khuẩn. Trong
nguyên sinh chất có chứa mesosome và các thể ẩn nhập. Tuy nhiên, ở xạ khuẩn khác với
các prokaryote khác ở chỗ chúng có tỉ lệ G + C trong DNA rất cao (> 70%), trong khi đó
ở vi khuẩn tỉ lệ này chỉ khoảng 25 – 40%.
Do chất nhân chƣa có màng nhân bao bọc nên một trong những điểm đáng chú ý ở
xạ khuẩn là chúng không ổn định về mặt di truyền và thƣờng xuyên xảy ra sự sắp xếp lại
trong phân tử DNA. Điều này đã tạo nên tính đa dạng về hình thái và tính kháng thuốc.
2.1.2.3.Bào tử của xạ khuẩn
Xạ khuẩn sinh sản bằng bào tử, giữa khuẩn lạc thƣờng thấy có nhiều bào tử màng
mỏng gọi là bào tử trần (conidia hay conidiospores). Bào tử ở xạ khuẩn đƣợc sinh ra ở
đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành các vách ngăn (septa). Các chuỗi bào tử trần

5


có thể chỉ là 1 bào tử, 2 bào tử, có thể là chuỗi ngắn, chuỗi dài, cũng có thể các bào tử
trần nằm trên bó sợi, tƣơng tự bó sợi của nấm.
Bào tử đƣợc hình thành trên các nhánh phân hóa từ khuẩn ty khí sinh gọi là
cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau
nhƣ: thẳng, lƣợn sóng (Retus - Flexibilis), vòng hở có móc hoặc xoắn (spira). Các đặc
điểm hình thái này rất quan trọng khi tiến hành định tên xạ khuẩn. Kích thƣớc cuống
sinh bào tử khác nhau, thƣờng nằm trong khoảng từ 20 - 30 nm đến 100 – 200 nm. Trên

mỗi cuống thƣờng có khoảng từ 30 đến 100 bào tử, cũng có thể có một đến hai bào tử (chi
Saccharomonospora, chi Microbispora). Trong một số trƣờng hợp, do tác động cơ học,
hệ sợi của xạ khuẩn bị đứt thành từng đoạn ngắn giống nhƣ bào tử, nếu gặp điều kiện
thuận lợi cũng có thể phát triển thành cơ thể mới. Hình dạng, kích thƣớc của bào tử không
giống nhau tùy thuộc vào loài, từng cá thể trong loài, thậm chí trên cùng một cuống.
Bào tử xạ khuẩn đƣợc bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ
dày khoảng 300 – 400 Å gồm 3 lớp giúp bào tử tránh những ảnh hƣởng bất lợi của
ngoại cảnh nhƣ nhiệt độ, độ ẩm và pH. Hình dạng, kích thƣớc chuỗi bào tử và cấu
trúc màng thay đổi khi nuôi cấy trên những môi trƣờng có nguồn nitrogen khác
nhau.
2.1.3. Đặc điểm sinh thái
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, ngay cả ở những môi trƣờng mà vi
khuẩn và nấm mốc không phát triển đƣợc. Đa số xạ khuẩn đã đƣợc phân lập có nguồn
gốc từ đất. Theo Waksman thì trong 1 g đất có khoảng 29.000 – 2.400.000 mầm xạ
khuẩn, chiếm 9 – 45% tổng số vi sinh vật có trong đất.
Bảng 2.1 Lƣợng xạ khuẩn xác định theo chiều sâu đất
Chiều sâu đất (cm)

Xạ khuẩn (CFU/g)

3-8

2.080.000

20 - 25

245.000

35 - 40

49.000

65 – 75

5.000

135 - 145
(Lê Xuân Phương, 2001)

Trong mùn, rác, phân, chúng thƣờng hiện diện với mật độ cao, có thể lên đến trên
bốn triệu CFU/g. Streptomyces là loài phổ biến và chiếm ƣu thế, có thể đến mức 95%

6


các chủng phân lập. Xạ khuẩn cũng có thể đƣợc phân lập từ nƣớc ngọt nhƣng mật độ
hiện diện thấp. Các giống phổ biến là Actinoplanes, Micromonospora, Nocardia,
Rhodococcus, Streptomyces và Thermoactinomyces. Nhiều giống xạ khuẩn đã đƣợc
phân lập từ nƣớc biển và trầm tích biển. Những loài xạ khuẩn này chƣa đƣợc hiểu rõ
và chỉ có một vài báo cáo có liên quan đến xạ khuẩn phân lập từ rừng ngập mặn (Siva
Kumar, 2001). Ngoài ra chúng cũng hiện diện ở dạng cộng sinh trong hệ đƣờng ruột
các động vật trong đất, giữ vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa ở mối.
Phần lớn xạ khuẩn thuộc nhóm ôn hòa với nhiệt độ phát triển khoảng 25 - 30oC.
Một vài loài ƣa nhiệt có nhiệt độ phát triển tối ƣu ở 45 - 55oC hay ƣa lạnh phát triển ở
nhiệt độ thấp hơn. Xạ khuẩn đất thƣờng đƣợc xem là hiếu khí bắt buộc, một số loài là
vi hiếu khí (Actinomyces humiferus và Agromyces ramosus) hoặc kỵ khí (Oerskovia).
Xạ khuẩn phân lập từ đất thƣờng thuộc dạng pH trung tính với dãy phát triển dao động
từ pH 5,0 đến 9,0 và pH tối ƣu khoảng pH 7,0. Một số loài ƣa acid có thể phát triển ở
khoảng pH 3,5 đến pH 6,5. Hiện nay có ít báo cáo về xạ khuẩn ƣa kiềm. Streptomyces
caeruleus có thể phát triển đƣợc trong khoảng pH từ 6,5 đến pH 9,5. Độ ẩm thích hợp

là 40 - 55%. Nồng độ muối NaCl trong môi trƣờng thấp (1,5 - 1 g/l).
2.1.4. Enzyme cellulase của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có khả năng sử dụng một phổ rộng các hợp chất hữu cơ, bao gồm
những nguyên liệu sinh học phức tạp nhƣ cellulose và lignin (Kutzner, 1986). Xạ
khuẩn trong đất đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự
nhiên nhờ vào việc sản xuất các hệ enzyme nhƣ cellulase, amylase, lignin peroxydase,
xylanase, protease.
Những ứng dụng công nghệ sinh học của enzyme cellulase đã đƣợc biết đến từ
đầu những năm 1980 trong lĩnh vực thức ăn gia súc (Harchand và Singh, 1997). Khả
năng sản xuất enzyme cellulase của xạ khuẩn đã thu hút sự quan tâm nghiên cứu đáng
kể do những ứng dụng tiềm năng của nó trong việc tái phục hồi đƣờng có khả năng lên
men từ cellulose để có lợi cho sự phát triển của chúng (Jang và Chen, 2003) so với
những loài sản xuất cellulase kị khí nhƣ Paenibacilus curdlanolyticus (Parson, 2006).
Theo Krasilnikov (1949), các loài xạ khuẩn phân giải cellulose có thể xếp theo 4
loài có mức độ phân giải khác nhau. Trong cùng một loài hoạt tính phân giải cellulose
của các chủng khác nhau cũng rất khác nhau.

7


Những nghiên cứu trƣớc đây đã cho thấy tiềm năng của xạ khuẩn phân lập từ
phân hữu cơ trong việc phân hủy cellulose (Godden và Penninckx, 1984; Van Zyl,
1985) . Theo Stutzenberger và ctv (1971), trong các vi sinh vật phân giải cellulose
đƣợc phân lập từ phân rác ủ thì chiếm ƣu thế là loài xạ khuẩn ƣa nhiệt Thermonospora
curvata phát triển nhanh chóng ở nhiệt độ 50 - 60oC và tích lũy khá nhiều enzyme
cellulase trên môi trƣờng nuôi cấy chứa cellulose vi tinh thể (Avicel) và cao nấm men.
Golovina và cộng sự (1968) đã phân lập đƣợc chủng Actinomyces diastaticus 7 từ đất
rừng. Chúng phát triển tối ƣu trên ở 40oC và sản sinh các enzyme cellulase,
hemicellulase khi nuôi cấy trên môi trƣờng Enger (1965).
2.2. Cellulose và hệ enzyme cellulase

2.2.1. Cellulose
Cellulose là hợp chất cao phân tử đƣợc cấu tạo từ các liên kết các mắt xích β-DGlucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể
nằm trong khoảng 5000 - 14000. Cellulose có cấu tạo dạng sợi, có cấu trúc phân tử là
một polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharide gọi là cellobiose. Cellobiose
có cấu trúc từ 2 phân tử D-glucose. Cấu trúc bậc 2 và bậc 3 rất phức tạp thành cấu trúc
dạng lớp gắn với nhau bằng lực liên kết hydro. Lực liên kết hydro trùng hợp nhiều lần
nên rất bền vững (Lê Xuân Phƣơng, 2001).
Cellulose trong tự nhiên đƣợc sản xuất bởi thực vật, một số động vật, tảo, nấm,
flagellates và vi khuẩn nhƣ Gluconacetobacter xylinus, Agrobacterium tumefaciens và
Rhizobium spp. Cellulose chiếm tới 50% tổng số hydratcarbon trên trái đất, là thành
phần chủ yếu của vách tế bào thực vật, chiếm khoảng 20% (theo trọng lƣợng) của vách
tế bào sơ cấp, khoảng 50% vách tế bào thứ cấp. Trong tế bào thực vật, cellulose tồn tại
liên kết bền vững với các polysaccharide khác nhƣ hemicellulose, pectin và lignin.
2.2.2. Enzyme cellulase
2.2.2.1. Định nghĩa
Cellulase là một hệ bao gồm các enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa
cellulose thành sản phẩm hòa tan. Phức hệ enzyme cellulase là enzyme khá phức tạp.
2.2.2.2. Cấu tạo chung của cellulase
Trọng lƣợng của enzyme cellulase thay đổi từ 30 - 110 Kdal (Beguin và ctv,
1900). Cấu trúc không gian khoảng 280 - 600 aa nhƣng chiều dài cellulase thƣờng
khoảng 300 - 400 aa (Gillees và ctv, 1992) và trung tâm xúc tác khoảng 250 aa.
8


Cellulase là một loại homopolimer của β–D–glucose. Các góc β-D-glucose đƣợc nối
với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucan.
Hệ thống enzyme thủy phân cellulose bao gồm ít nhất 3 enzyme khác nhau:
endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase, EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4β-D

glucan-cellobiohydrolase,

EC.3.2.1.91)

và

β-glucosidase

(β-D-glucosid

glucohydrolase, EC.3.2.1.21). Các enzyme này có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt
động hỗ trợ nhau. Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết 1,4-β-D-glucoside trong
phân tử cellulose, sau đó endoglucanase tiếp tục thủy phân cellulose thành các phân tử
cellobiose và sau cùng β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose.
2.2.2.3. Phân loại hệ thống hệ enzyme cellulase
Theo Nguyễn Đức Lƣợng (2006), hệ thống các enzyme thủy phân cellulose gồm
có: endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, Exoglucanase ký hiệu EC 3.2.1.91 và βglucansidase có kí hiệu EC 3.2.1.21.
Endoglucanase EC 3.2.1.4
Tên thƣờng gọi: cellulase.
Tên hệ thống: 1,4-(1,3:1,4)-β-D-glucan-4-glucannohydrolase.
Đôi khi ngƣời ta cũng có thể gọi enzyme này bằng tên khác: endo-1,4-β-Dglucanase; β-1,4-glucanase; cellulase A.
Enzyme này thƣờng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và
các β-D-glucan của các loại ngũ cốc.
Exoglucanase- EC 3.2.1.91
Tên thƣờng gọi: cellulose 1,4-β-cellobiosidase.
Tên hệ thống: 1,4,β-D-glucan cellobiohydrolase
Các tên khác: exo-cellobiohydrolase, exoglucanase; cellulase C1; exo-β-1,4glucan cellobiohydrolase.
Enzyme này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid, giải phóng
cellobiose từ đầu không khử.
Exoglucanase là một enzyme chứa hai vùng xúc tác với một vùng gắn cellulose
qua một vùng liên kết đƣợc glycin hóa cao. Exoglucanase gồm có 2 chuỗi A và B. Cả

hai chuỗi đều có 434 aa nhƣng giữa chúng có sự khác nhau để phân biệt.
β-glucosidase-EC 3.2.1.21
Tên thƣờng gọi: β-D-glucosidase.
9


Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase.
Một số trƣờng hợp cũng thủy phân: β-D-galactosidase, β-D-fucoside, β-Dxyloside, α-L-arabinoside.
2.2.2.4. Tính chất
Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và các β-Dglucan của ngũ cốc. Ngƣời ta cho rằng đầu tiên exogluxanase tác động lên các đầu
chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là cellobiose, β-glucosidase thủy phân các
gốc β-D-glucose cuối cùng từ các đầu phân tử cellulose. Theo nghiên cứu, các
cellulase có pH tối ƣu, tính hòa tan và thành phần acid amin giống nhau. Độ bền và
tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. Nhiệt độ tối ƣu nằm trong khoảng 40 - 500C,
pH tối ƣu thƣờng ở giữa 4 - 5. Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm của nó nhƣ
glucose, cellobiose. Thủy ngân ức chế cellulase hoàn toàn, các ion khác nhƣ Mn 2+,
Ag+, Zn2+ chỉ ức chế nhẹ.
2.2.2.5. Cơ chế tác động của enzyme cellulase
Theo Sandgren (2005), quá trình thủy phân cellulase tự nhiên đƣợc thực hiện
dƣới sự tác động của 1 phức hệ cellulase, gồm các enzyme C1, Cx và β-glucosidase.
Enzyme C1 là enzyme không đặc hiệu. Dƣới tác dụng của enzyme này các
cellulose tự nhiên bị trƣơng lên và chuyển thành các chuỗi cellulose hoạt động có
mạch ngắn hơn chuẩn bị cho tác dụng của enzyme tiếp theo. Nhiều tác giả cho rằng
enzyme C1 không phải là một enzyme mà chỉ là một yếu tố của enzyme C 1. Có tác
dụng làm biến đổi cellulose, nhƣng khi tách riêng thì tác dụng này không còn nữa.
Enzyme Cx còn gọi là enzyme β-1,4-glucanase. Enzyme này thủy phân cellulose
thành cellobiose. Ngƣời ta thƣờng chia Cx thành 2 loại: Exo-β-1,4-glucanase có khả
năng xúc tác tách ra một cách liên tiếp các đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi
cellulose và Endo-β-1,4-glucanase có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucoside ở bất
cứ nơi nào bên trong chuỗi cellulose phân tử. Để xác định hoạt tính của enzyme Cx

ngƣời ta thƣờng sử dụng CMC hay HEC làm cơ chất.
Cellobiose tác dụng lên các disacaritxellobiose để tạo ra glucose.
Phức hệ cellulase nhiều cấu tử đã đƣợc tách ra từ nấm Myrothecium verrucaia.
Bằng phƣơng pháp điện di, ngƣời ta thấy phức hệ enzyme này gồm 6 cấu tử. Nhƣng
chỉ có 3 cấu tử có khả năng thủy phân đƣợc cellulose nguyên thủy và cellulose hòa tan.
Ở nấm Polyporus versicolor thì phức hệ cellulase có 4 cấu tử trong đó có β10


glucosidase. Các enzyme này khác nhau bởi cấu trúc phân tử, tính đặc trƣng và vận tốc
tác dụng trên cellulose.

Hình 2.2 Mô hình phân tử enzyme cellulase đang thủy
phân cellulose (www.ornl.gov)
2.3. Giới thiệu về cây và vỏ ca cao
2.3.1. Cây ca cao
Ca cao (Theobroma cacao), theo truyền thống đƣợc phân loại thuộc
Sterculiaceae còn theo phân loại của hệ thống APG II thì thuộc phân họ
Byttnerioideae của họ Malvaceae. Họ Sterculiaceae đƣợc chia ra làm nhiều loại, quan
trọng nhất là các loại Criollo, Forastero và Trinitario.
Ca cao Criollo xuất xứ ở vùng Trung mỹ, thống trị thị trƣờng cho đến giữa thế kỷ
thứ mƣời tám, nhƣng ngày nay còn rất ít Criollo tinh khiết trên thế giới. Hạt ca cao
Criolo đƣợc coi là hạt ca cao quý bởi hƣơng vị đặc biệt, độ mịn cao và ít đắng. Tuy
nhiên, cây thƣờng cho sản lƣợng kém và bị bệnh tật tấn công.
Ca cao Foraster chiếm đến 80% ca cao trên thế giới. Đƣợc trồng rộng rãi cả trong
canh tác, hoang dã và bán hoang dã. Cây ca cao này trƣớc đây sống ở vùng Nam mỹ
vùng hạ lƣu sông Amazon. Sản lƣợng tƣơng đối cao.
Ca cao Trinitario là giống tƣơng đối mới đƣợc cấy ghép bởi Criollo và Forastero,
nó có mùi thơm đặc biệt của Criollo và sản lƣợng cũng nhƣ sự mạnh mẽ của Forastero.
Trinitario bắt đầu đƣợc trồng ở Trinidad, lan sang Venezuela và Ecuador, Cameroon,
Samoa, Sri Lanka, Java và Papua New Guinea. Đây là giống mới nên ngày nay sản

lƣợng trên thị trƣờng thế giới còn ít.
Hiện nay ca cao đã trở thành một thực phẩm thông dụng và phổ biến trên khắp
Châu Âu và thế giới. Ở Việt Nam, cây ca cao theo chân ngƣời Pháp đến Nam Bộ vào
đầu thế kỷ 20. Hiện tại, cây đƣợc trồng rộng rãi ở nhiều nơi, vùng Tây Nguyên đƣợc
11


đánh giá là có điều kiện lý tƣởng nhất cho sự phát triển cây ca cao. Ở đây, theo nghiên
cứu thống kê thì cây ra hoa cho quả quanh năm, sản lƣợng bình quân đạt 3 kg hạt
khô/1 cây 5 năm tuổi. Tƣơng lai của cây ca cao ở Đồng bằng sông Cửu Long, Đông
Nam bộ, Tây Nguyên rất hứa hẹn, có thể trở thành một trong những giống cây chủ lực
trong phát triển kinh tế, nâng cao đời sống nông dân và mang lại giá trị xuất khẩu lớn.
2.3.2. Lợi ích của vỏ ca cao
Trái ca cao mọc từ thân và nhánh của ca cao, khi chƣa chín có màu xanh, khi
chín có mầu vàng, dáng bầu dục thuôn dài, có chiều dài khoảng 15 - 25 cm và đƣờng
kính khoảng từ 7 – 10 cm. Vỏ quả có chứa hạt ca cao, sau khi chín quả đƣợc tách hạt
và do đó loại bỏ một khối lƣợng vỏ tƣơng đối lớn (khoảng 50% khối lƣợng quả).
Trong vỏ quả này có chứa hàm lƣợng nƣớc, xơ thô cao và lƣợng đƣờng khá cao.
Bảng 2.2 Thành phần vỏ ca cao
Thành phần

Trung bình (% của trọng lƣợng khô)

Protein

6,25

Chất xơ

27,30

Tro

8,10

Na

0,01

K

3,20

Ca

0,44

P

0,09

(Wood và Lass, 2001)

Vỏ ca cao là một loại phân bón 100% chất hữu cơ tự nhiên, không gây hại cho
môi trƣờng và sức khỏe, giàu Kali, Mg. Khi làm chất phủ, nó có khả năng giữ độ ẩm
cao, ngăn chặn sự tăng trƣởng của cỏ dại và truyền chất dinh dƣỡng cho đất.
Do hàm lƣợng chất xơ, khoáng chất khá cao, việc nghiên cứu sử dụng vỏ ca cao
làm nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học có sự trợ giúp của vi sinh vật đang là một
trong những giải pháp đầy hứa hẹn cho việc tạo ra nhiên liệu thay thế cho nhiên liệu
hoá thạch đang dần cạn kiệt, giảm thiểu các tác động xấu đến môi trƣờng.

Ngoài ra, vỏ ca cao còn có thể đƣợc chế biến để làm thức ăn gia súc. Chế biến
phụ phẩm ca cao làm thức ăn đã đƣợc một số tác giả trên thế giới tiến hành. Theo
Wood và Lass (2001), vỏ quả ca cao khô có thể xay nhỏ trộn vào thức ăn cho bò, cừu,

12


dê với tỉ lệ 50%. Bột vỏ ca cao có thể thay thế bột ngô và trộn với tỉ lệ 35% trong khẩu
phần mà vẫn không thay đổi mức tăng khối lƣợng của lợn (Bo Gohl, 1981). Theo
Nghiên cứu của Wong và ctv (1986), nuôi bò Brahman với khẩu phần có 50% vỏ ca
cao cho tăng trọng 500 g/ngày cao hơn lô đối chứng cho ăn cỏ Voi đạt 260 g/con/ngày.
2.4. Một số công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam
2.4.1. Một số công trình nghiên cứu trên thế giới
Janete và ctv (1999) đã tiến hành phân lập xạ khuẩn sống nội ký sinh trong rễ và
lá ngô. Kết quả thu nhận đƣợc 53 chủng, 31 trong số đó từ lá và 22 từ rễ. Hiện diện
nhiều nhất là chi Microbispora, tiếp theo là chi Streptomyces và Streptosporangium.
43,4% xạ khuẩn đƣợc phân lập có hoạt tính kháng sinh kháng lại một hoặc nhiều vi
khuẩn và nấm men thử nghiệm. Nghiên cứu chứng minh rằng sự hiện diện của xạ
khuẩn trong mô rễ và thậm chí là lá cây đóng một vai trò quan trọng trong sự phát
triển và sức khỏe thực vật.
AMIRA và ctv (1989) phân lập xạ khuẩn Streptomyces chủng AT7 từ đất ở
IRAQI, nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa, định tính khả năng sản xuất enzyme
cellulase và tối ƣu hóa điều kiện môi trƣờng nuôi cấy. Kết quả chỉ ra rằng chủng này
có thể phát triển tốt trong môi trƣờng có CMC và sản xuất enzyme cellulase ở các
nhiệt độ khác nhau (28 - 48oC) với cả pH acid và kiềm.
Nermeen và ctv (2010) đã chọn ra chủng xạ khuẩn Streptomyces ruber có khả
năng sản xuất enzyme cellulase tốt nhất trong 6 chủng xạ khuẩn biển đƣợc phân lập.
Nghiên cứu chủng này cho thấy sự sản xuất enzyme đạt cao nhất ở pH 6 và 40°C sau 7
ngày kể từ ngày ủ (25,6 U/ml). Các nhà khoa học cũng nghiên cứu điều kiện nuôi cấy
tối ƣu ảnh hƣởng đến sự sản xuất enzyme cellulase. Kết quả cho thấy nồng độ cao của

KH2PO4 và nồng độ thấp của MgSO4 ảnh hƣởng đáng kể trong sản xuất enzyme. Rơm
rạ có thể đƣợc sử dụng nhƣ là một nguồn cellulose chi phí thấp. Hàm lƣợng khoảng 30
g rơm/l là nồng độ thích hợp để có thể sản xuất enzyme tối đa.
Nghiên cứu của Ziad và ctv (2008) xác định ảnh hƣởng của điều kiện tăng trƣởng
và thành phần môi trƣờng đến khả năng sản xuất enzyme cellulase của Streptomyces
sp. (chủng J2). Sau 4 ngày ủ ở 28oC, trên môi trƣờng agar, enzyme cellulase tạo thành
một vòng tròn 22 mm xung quanh khuẩn lạc. Hoạt tính enzyme thô cao nhất (432 U/l)
đo đƣợc sau 3 ngày ở pH 7 và 60°C trong môi trƣờng bổ sung glucose 0,5%, 0,2% tinh
bột, và NH4Cl 0,2%. Tuy nhiên, sản lƣợng và hoạt tính enzyme giảm mạnh ở 45°C và
13


pH acid. Sản lƣợng và hoạt tính enzyme cũng bị ức chế khi Streptomyces chủng (J2)
phát triển trong canh CMC bổ sung arabinose và dịch chiết nấm men nhƣ nguồn
carbon và nitrogen duy nhất.
Theo Francis Alemawor và ctv (2009), việc sử dụng vỏ ca cao nhƣ nguồn thức ăn
chăn nuôi chi phí thấp thƣờng bị giới hạn do mức độ polysaccharides không phải tinh
bột cao bao gồm pectin, cellulose và hemicellulose khó tiêu hóa trong chăn nuôi gia
cầm dạ dày đơn. Các nhà khoa học đã tiến hành xử lý bằng enzyme để kiểm tra hiệu
quả của những công thức kết hợp khác nhau của các enzyme ngoại sinh phân hủy xơ
vỏ ca cao. Kết quả là nồng độ phần trăm khối lƣợng 0,8; 0,6 và 0,8% tƣơng ứng với
Pentopan®MonoBG, Viscozyme®L và Pectinex®5XL là công thức thích hợp để bổ
sung vào thức ăn gia súc từ vỏ ca cao. Đây là công thức hiệu quả nhất trong việc tối đa
hóa lƣợng đƣờng đƣợc giải phóng từ loại thức ăn này. Khi bổ sung enzyme, lƣợng
đƣờng tăng 42 - 53% tƣơng ứng với sự giảm 7 - 14% chất xơ thô và polysaccharide
không phải tinh bột (P < 0,05). Kết quả này cho thấy, bổ sung phức hệ đa enzyme hoặc
hỗn hợp các enzyme ngoại sinh phân giải vỏ ca cao có thể tăng cƣờng khả năng tiêu
hóa và sử dụng thức ăn vỏ ca cao của gia cầm một cách hiệu quả.
3.4.2. Một số công trình nghiên cứu tại Việt Nam
Nguyễn Quỳnh Uyển và ctv (2010), tuyển chọn đƣợc chủng xạ khuẩn A-2026 từ

130 chủng xạ khuẩn lƣu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và
Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội là chủng có hoạt tính sinh tổng hợp
CMC-ase ngoại bào tốt nhất. Chủng xạ khuẩn này bƣớc đầu đƣợc quan sát hình thái
trên kính hiển vi quang học Olympus X41 và xác định một số tính chất của enzyme
nhƣ: pH 6 là pH thích hợp, bị ức chế bởi Ni2+ và EDTA và là một enzyme khá bền
nhiệt. Bƣớc đầu tinh sạch enzyme qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G-50 đã thu đƣợc
ba đỉnh có hoạt tính CMC-ase với độ sạch tƣơng ứng là 1,2; 2,9 và 5,1 lần.
Lƣơng Bảo Uyên và Phạm Thị Ánh Hồng (2008), sử dụng mạt dừa sau khi đƣợc
trồng nấm bào ngƣ (có tỉ lệ C/N là 49) xử lý tiếp bằng chủng xạ khuẩn đƣợc phân lập
từ mạt dừa đƣợc đổ đống lâu ngày. Mạt dừa sau khi trồng nấm đƣợc ủ với xạ khuẩn 60
ngày giảm hàm lƣợng lignin còn 34%, cellulose 7% và C/N là 19 thích hợp ứng dụng
sản xuất phân sinh hóa hữu cơ.
Trƣơng La và ctv (2010), sử dụng vỏ quả ca cao trong khẩu phần nuôi vỗ béo bò
tại Đắk Lắk. Nghiên cứu cho thấy tỉ lệ vỏ ca cao khác nhau 25%, 30% và 35% chƣa
14