XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL TIME RTPCR SỬ DỤNG MẪU DÒ TAQMAN ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI RÚT GÂY RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP CHỦNG TRUNG QUỐC TRÊN HEO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL TIME RT-PCR SỬ DỤNG
MẪU DÒ TAQMAN ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG
VI RÚT GÂY RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP
CHỦNG TRUNG QUỐC TRÊN HEO

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa:

2008 – 2012

Sinh viên thực hiện:

PHAN CHÂU HUY

Tháng 7/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL TIME RT-PCR SỬ DỤNG
MẪU DÒ TAQMAN ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG
VI RÚT GÂY RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP
CHỦNG TRUNG QUỐC TRÊN HEO

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN

PHAN CHÂU HUY

KS. VÕ KHÁNH HƯNG

Tháng 7/2012


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến ba mẹ và các em, những người
đã luôn yêu thương, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện cho con học tập. Gia
đình mình luôn ở bên con và là chỗ dựa vững chắc nhất của con.
Em xin cảm ơn các Thầy Cô của trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
Minh và Bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những
kiến thức khoa học, kiến thức chuyên ngành, cũng như những kinh nghiệm quý báu
trong những năm học tại trường tạo cho em nguồn động lực nghiên cứu khoa học.
Lòng biết ơn chân thành sâu sắc xin được gửi đến PGS.TS. Trần Thị Dân và KS.
Võ Khánh Hưng, người đã dành hết nhiệt tâm và trách nhiệm để hướng dẫn, chỉ dạy
em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.

Em xin chân thành cảm ơn đến tập thể cán bộ và quý Thầy - Cô Viện công
nghệ sinh học và môi trường, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo
điều kiện và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập.
Xin gửi lời cảm ơn đến:
Anh Nguyễn Phan Thành, anh Huỳnh Đăng Sang đã tận tình giúp đỡ và chỉ
dẫn em trong suốt thời gian em thực hiện đề tài.
Anh Hải, anh Hùng, chị Dung, chị Oanh; phòng xét nghiệm chuẩn đoán Chi
Cục Thú Y tỉnh Bình Dương; và chị Toan; Khoa Chăn Nuôi Thú Y, đại học Nông Lâm
Tp. Hồ Chí Minh; đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em có thể thực hiện đề tài.
Các bạn và các em cùng nhóm nghiên cứu đã động viên, chia sẻ và cùng mình
vượt qua những khó khăn khi làm việc chung.
Các bạn lớp DH08SH, Đại học chính quy khóa 2008-2012 đã quan tâm và
động viên mình trong thời gian học tập và thực hiện đề tài.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2012
Phan Châu Huy

i


TÓM TẮT
Trong những năm gần đây, sự bùng phát của bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp
(PRRS) ở hầu hết các vùng của Việt Nam, gây thiệt hại lớn về kinh tế, đã được chứng
minh liên quan đến dòng PRRSV Bắc Mỹ gây sốt cao chủng Trung Quốc, gọi tắt là
H-PRRSV (highly fever PRRSV). Do vậy, việc xây dựng quy trình định tính và định
lượng PRRSV dòng Trung Quốc là cần thiết cho công tác phòng chống bệnh do vi rút
PRRS gây ra. Real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman là phương pháp có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao trong định tính và định lượng các tác nhân gây bệnh bởi vi
rút. Vì những yêu cầu trên, đề tài “Xây dựng quy trình real time RT-PCR sử dụng
mẫu dò Taqman để phát hiện và định lượng vi rút gây rối loạn sinh sản và hô hấp

chủng Trung Quốc trên heo” đã được thực hiện.
Phản ứng real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman dựa trên đường chuẩn
DNA plasmid pGEM T-Easy gắn vùng gen NSP2 đã được xây dựng. Kết quả đường
chuẩn cho phản ứng real time RT-PCR sử dụng plasmid DNA đã gắn vùng gen NSP2
của PRRSV và chuyển vào tế bào chủ E. coli DH5α.
Cặp mồi TQ1s, TQ1as và mẫu dò Taqman sử dụng trong quy trình real time RTPCR cho phép định chủng và định lượng H-PRRSV. Độ nhạy trong quy trình real
time RT-PCR là 102 bản sao/µl. Tính đặc hiệu của phản ứng được khẳng định với
PRRSV chủng Châu Âu, PRRSV chủng Bắc Mỹ, PCV2 (porcine circovirus 2), lở
mồm long móng (FMD - foot and mouth disease).
Phân tích đường chuẩn H-PRRSV với nồng độ từ 108 đến 100 bản sao/µl đã
chứng minh độ lặp lại cao với hệ số tương quan R2 = 0,998, hiệu quả của phản ứng
real time RT-PCR (E%) đạt 102,6%, độ nghiêng bằng -3,261 và hệ số biến động (CV)
trong khoảng 0,10667 - 2,79905%.

ii


SUMMARY
Outbreaks of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) in most of
regions of Vietnam, causing huge economic losses, in recent years, was demonstrated
in relation to the highly fever Chinese-type of North American PRRSV (called HPRRSV). Therefore, establishing the procedure for detecting and quantifying HPRRSV is necessary. Real time RT-PCR using Taqman probe is the sensitive and
specific method to detect and quantify the viral pathogen. For all these reasons, the
thesis: “Establishment of real time RT-PCR protocol using Taqman Probe to detect
and quantify reproductive and respiratory syndrome virus of Chinese type” was
performed.
The real time RT-PCR using Taqman Probe assay was performed based on the
standard curve of DNA pGEM T-Easy vector harboring NSP2gene region. The
standard curve for the Taqman Probe real time RT-PCR assay was linked the NSP2
gene fragment of H-PRRSV and cloned in E. coli DH5α.
A pair of primers TQ1s, TQ1as and Taqman probe used in the real time RT-PCR

assay could quantify and distinguish the genotypes of H-PRRSV. The sensibility of the
assay was 102 copies/µl. The speciality of the assay was confirmed by using PRRSV
EU type, PRRSV NA type, PCV2 (porcine circovirus 2) and FMD virus (foot and
mouth disease).
Analysis with 108–100 copy/µl of H-PRRSV standard demonstrated high
reproducibility with correlation coefficient R2 = 0,998, high efficiency of real time RTPCR – E (102,6%), slope value -3,261 and coefficient of variation (CV) of 0,10667 2,79905%.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
TÓM TẮT ...................................................................................................................ii
SUMMARY .............................................................................................................. iii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iv
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1
1.2. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................. 2
1.3. Nội dung của đề tài ............................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo ......................................................... 3
2.2. Vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo.......................................... 4
2.2.1. Cơ chế sinh bệnh ................................................................................................ 4
2.2.2. Cấu trúc vi rút PRRS .......................................................................................... 5
2.2.2.1 Tổ chức bộ gen của vi rút PRRS....................................................................... 5
2.2.2.2 Protein không cấu trúc NSP2............................................................................ 6
2.2.3. Các chủng PRRSV và sự phân bố của chúng ...................................................... 9

2.2.3. Sự khác biệt về trình tự giữa 2 dòng PRRSV Châu Âu và Bắc Mỹ ................... 10
2.2.4. Biến chủng PRRSV Trung Quốc gây sốt cao ................................................... 11
2.3. Kỹ thuật real time RT-PCR chẩn đoán PRRSV ................................................... 13
2.3.1. Kỹ thuật real time PCR .................................................................................... 13
2.3.2. Các chất phát huỳnh quang sử dụng trong real time PCR ................................. 14
2.3.2.1 SYBR Green .................................................................................................. 14
2.3.2.2 Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) ................................................................. 14
2.3.3. Nguyên lý hoạt động real time sử dụng mẫu dò Taqman .................................. 15
2.3.3.1 Cơ chế khuếch đại của real time PCR sử dụng mẫu dò Taqman ..................... 15
2.3.3.2 Phân tích dữ liệu real time PCR ..................................................................... 15
2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về PRRSV............................................. 18
2.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới............................................................................. 18
2.4.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................................... 19
iv


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 20
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu ........................................................ 20
3.2. Vật liệu và hóa chất............................................................................................ 20
3.2.1. Vật liệu ............................................................................................................ 20
3.2.2. Hóa chất ........................................................................................................... 20
3.3. Phương pháp tiến hành........................................................................................ 21
3.3.1. Thu nhận mẫu .................................................................................................. 21
3.3.2. Ly trích RNA ................................................................................................... 21
3.3.2.1 Ly trích RNA từ vacxin .................................................................................. 21
3.3.2.2 Ly trích RNA từ phổi...................................................................................... 22
3.3.3. Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng real time RT-PCR Taqman ................... 22
3.3.3.1 Phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng gen NSP2 .............................................. 23
3.3.3.2 Kiểm tra plasmid bằng điện di, PCR và giải trình tự ....................................... 25
3.3.4. Phản ứng real time RT-PCR Taqman định chủng và định lượng H-PRRSV ..... 26

3.3.4.1 Khả năng khuếch đại của đoạn mồi TQ1s và TQ1as và mẫu dò Taqman ........ 26
3.3.4.2 Phản ứng real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman ................................... 27
3.3.5. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ lặp lại của phản ứng real time ................. 27
3.3.5.1 Độ nhạy của phản ứng real time RT-PCR Taqman ......................................... 27
3.3.5.3 Độ đặc hiệu của phản ứng real time RT-PCR Taqman ................................... 28
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 29
4.1. Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng real time RT-PCR Taqman ...................... 29
4.1.1. Phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng gen NSP2 ................................................ 29
4.1.2. Kiểm tra plasmid đã chèn đoạn gen NSP2 bằng điện di .................................... 31
4.1.3. Kiểm tra plasmid bằng phản ứng PCR.............................................................. 31
4.1.4. Kiểm tra đoạn gen đích chèn vào plasmid bằng giải trình tự............................. 32
4.2.2. Phản ứng real time RT-PCR mẫu dò Taqman ................................................... 34
4.2.2.1 Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp real time PCR ............................. 34
4.2.2.2 Giới hạn phát hiện và độ lặp lại của phương pháp real time PCR ................... 35
4.2.3. Tính đặc hiệu của phản ứng real time RT-PCR ................................................ 37
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 39
5.1. Kết luận .............................................................................................................. 39
5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 40
PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
aa

Amino acid

bp

Base pair

cDNA

Complementary deoxyribonucleotide acid

Ct

Threshold cycle

ctv

Cộng tác viên

CV

Coefficient of variation

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

EAV

Equine arteritis virus

EU

European

FMD

Foot and mouth disease

GP

Glycoprotein

H-PRRSV

Highly fever PRRSV

LMLM

Lở mồm long móng

NA

North American

NSP

Nonstructural protein

nt

Nucleotide

OD

Optical density

ORF

Open reading frame

PCV2

Porcine circovirus virus type 2

PRRS

Porcine reproductive and respiratory syndrome

PRRSV

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

RNA

Ribonucleic acid

RT-PCR

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

SD

Standard deviation

sgmRNAs

Subgenomic mRNAs

SHFV

Simian hemorrhagic fever virus

TBE

Tris borate EDTA

UTR

Untranlated region

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Sản phẩm dịch mã của các ORFs ....................................................................6
Bảng 2.2 Tỉ lệ tương đồng về trình tự gen của các chủng PRRSV .................................9
Bảng 2.3 Các cặp reporter và quencher thường được sử dụng...................................... 15
Bảng 3.1 Trình tự mồi khuếch đại đoạn NSP2 ............................................................. 23
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn NSP2 ................................ 24
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR ......................................................... 25
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR ........................................................................... 25
Bảng 3.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ............................................................... 26
Bảng 3.6 Cặp mồi và probe cho phản ứng real time PCR ............................................ 26

Bảng 3.7 Thành phần phản ứng của kit OneStep RT-PCR (QIAGEN)......................... 27
Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng của kit OneStep RT-PCR (QIAGEN) ................... 27
Bảng 4.1 Giá trị chu kỳ ngưỡng của các mức pha loãng từ 100 đến 108 bản sao ........... 35
Bảng 4.2 Hệ số biến động giá trị Ct ............................................................................. 37

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Đại thực bào trước và sau khi nhiễm PRRSV ................................................... 4
Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen vi rút PRRS ........................................................................................ 5

Hình 2.3 Biểu đồ giả định protein NSP2 của PRRSV ...................................................... 7
Hình 2.4 Xây dựng các chủng VR-2332 có NSP2 đột biến .............................................. 8
Hình 2.5 Cây phân bố di truyền của một số chủng PRRSV dòng Châu Âu và Bắc Mỹ .. 10
Hình 2.6 Trình tự gene vùng NSP2 của PRRSV tại Việt Nam ...................................... 13
Hình 2.7 Cấu tạo của mẫu dò Taqman ........................................................................... 14
Hình 2.8 Cơ chế phát quang của Taqman trong phản ứng real time PCR .................................. 16

Hình 2.9 Biểu đồ khuếch đại dựa trên hiệu số của tín hiệu nền huỳnh quang ................. 17
Hình 2.10 Đường chuẩn cho phản ứng định lượng ........................................................ 17
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tạo DNA tái tổ hợp dùng trong xây dựng đường chuẩn .......... 23
Hình 3.2 Trình tự gen NSP2 .......................................................................................... 24
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR vùng NSP2 với mồi F-NSP2 và R-NSP2 .. 29
Hình 4.2 Kết quả blast vùng giải trình tự trên NCBI...................................................... 30
Hình 4.3 Kết quả kiểm tra plasmid DNA bằng PCR ...................................................... 31
Hình 4.4 Kết quả kiểm tra plasmid DNA bằng PCR ...................................................... 32
Hình 4.5 Kết quả giải trình tự xuôi (A) và ngược (B) của DNA plasmid ....................... 32
Hình 4.6 Kết quả blast vùng giải trình tự trên NCBI...................................................... 33
Hình 4.7 Phản ứng RT-PCR với cặp mồi TQ1s và TQ1as trên các nồng độ khác nhau của

đường chuẩn cũng như mẫu dương tính H-PRRSV........................................................................ 34
Hình 4.8 Biểu đồ khuếch đại các mức pha loãng từ 100 đến 108 bản sao ........................ 35
Hình 4.9 Biểu đồ đường chuẩn của các mẫu pha loãng từ 100 đến 108 bản sao ............... 36
Hình 4.10 Biểu đồ độ lặp lại của các mẫu chuẩn ........................................................... 36
Hình 4.11 Biểu đồ kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng real time RT-PCR sử dụng cặp mồi
TQ1s và TQ1as và mẫu dò Taqman................................................................................................. 38

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Trên thế giới, ngành chăn nuôi heo chiếm một vai trò quan trọng trong nền kinh

tế toàn cầu nói chung và ngành nông nghiệp nói riêng. Hàng năm, 37,7% số lượng thịt
được cung cấp trên thế giới là thịt heo (Tổ chức Nông lương thế giới–FAO, 2009),
chăn nuôi heo chiếm 58% GDP nông nghiệp hàng năm (FAO, 2011). Riêng ở Việt
Nam, chăn nuôi chiếm hơn 21% giá trị sản xuất nông nghiệp, trong đó chăn nuôi heo
chiếm 60% giá trị sản xuất toàn ngành (Cục Chăn nuôi, 2008).
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (porcine reproductive and
respiratory syndrome-PRRS) hay còn gọi là “bệnh heo tai xanh” gây nhiều tổn thất
nghiêm trọng cho các nhà chăn nuôi vì bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi của heo, nhưng tập
trung chủ yếu ở heo nái mang thai và heo con theo mẹ và gây tổn thất lớn cho người
chăn nuôi hàng trăm triệu đô la (FAO, 2011). Bệnh này lần đầu tiên báo cáo ở Mỹ vào
năm 1987 và đặt tên là bệnh tai xanh hoặc "bệnh lợn bí ẩn" (Keffaber, 1989).
Trong năm 2009, PRRS đã bùng phát trở lại Việt Nam với không dưới 10 địa
phương trên cả 3 miền. Qua nghiên cứu giải mã gen các mẫu vi rút gây dịch PRRS tại
Việt Nam cho thấy các chủng vi rút PRRS (PRRSV) tại Việt Nam thuộc nhóm

PRRSV dòng Bắc Mỹ chủng Trung Quốc gây sốt cao với độ tương đồng 99-99,7%
(Nguyễn Ngọc Hải và Võ Khánh Hưng, 2010a). Hiện tại, dòng PRRSV chủng Trung
Quốc gây sốt cao đã được phân tích và cho thấy có một đoạn gene khoảng 87 bps đã bị
xóa tại khu vực của gen NSP2 của vùng ORF1 của các chủng này so với các chủng
bình thường (Tian và ctv, 2007). Vùng trình tự mã hóa NSP2 được xem như một yếu
tố đặc trưng để phân biệt chủng vi rút PRRS từ Trung Quốc.
Để phát hiện PRRSV, các phương pháp huyết thanh học, nuôi cấy tế bào, cũng
như các biện pháp sinh học phân tử cùng với các biện pháp kỹ thuật xét nghiệm nhanh,
hiện đại và độ chính xác cao như PCR, RT-RCR, nested-PCR, LAMP…được sử dụng
phổ biến. Gần đây kỹ thuật real time RT-PCR đang trở thành kỹ thuật được ứng dụng
rộng rãi trong việc định lượng vi rút có vật chất di truyền RNA. Phương pháp real time
RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao
(Kreuzer và ctv, 2000), cho phép định chủng và định lượng vi rút PRRS nhiễm trên
heo ở mức độ thấp giúp xác định chính xác dòng PRRSV Bắc Mỹ chủng Trung Quốc,
hỗ trợ việc sử dụng vacxin hiệu quả và công tác phòng chống bệnh. Vì những lý do
1


trên, đề tài: “Xây dựng quy trình real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman phát hiện
và định lượng vi rút gây rối loạn sinh sản và hô hấp chủng Trung Quốc trên heo” đã
được thực hiện.
1.2.

Yêu cầu của đề tài
Xây dựng quy trình real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman để phát hiện và

định lượng vi rút PRRS chủng Trung Quốc trên heo nhằm phục vụ công tác nghiên
cứu và phòng chống dịch bệnh.
1.3.

Nội dung của đề tài
Xây dựng đường chuẩn định lượng cho phương pháp real time RT-PCR sử dụng

mẫu dò Taqman trong định tính và định lượng H-PRRSV.
Xác định độ nhạy, tính đặc hiệu của quy trình định chủng và định lượng HPRRSV bằng phương pháp real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) là bệnh gây sảy thai ở heo nái và

rối loạn đường hô hấp trên heo sơ sinh và heo choai (Christianson và ctv, 1992). Bệnh
được phát hiện lần đầu tại Bắc Mỹ và Canada năm 1987. Sau đó, các nước vùng châu
Âu cũng xuất hiện bệnh như ở Đức năm 1990, Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh năm
1991 và 1992 ở Pháp và châu Á vào những năm 1990. Ban đầu, bệnh có nhiều tên
khác nhau nhưng đến năm 1992, tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) công nhận tên chính
thức của bệnh là PRRS (porcine reproductive and respiratory syndrome). Năm 2006,
đại dịch PRRS đã xảy ra ở Trung Quốc làm hàng triệu heo bị mắc bệnh. Trong trận
dịch này đã phát hiện sự biến chủng của vi rút thành chủng độc lực cao, có khả năng
lây lan và gây chết rất nhanh trên heo. Cho đến nay, hội chứng PRRS đã xảy ra hầu hết
các nước có nền chăn nuôi heo công nghiệp phát triển trên thế giới. Gần đây các ổ dịch
xảy ra tại Thụy Điển, Nam Phi, Nga, Trung Quốc, và Việt Nam với độc lực cao, diễn
biến ngày càng phức tạp (FAO, 2007).
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn heo nhập từ Mỹ
(10/51 con có huyết thanh dương tính). Các nghiên cứu về bệnh trên những trại heo
giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh rất

khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%. Ở các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có
huyết thanh dương tính rất cao, như ở Anh là 60-75%, Mỹ là 36% (Phòng Dịch Tễ–
Cục Thú Y, 2007). Ngày 12/3/2007, đợt dịch đầu tiên bùng nổ tại Hải Dương, chỉ
trong vòng 1 tháng, bệnh đã lây lan sang 6 tỉnh lân cận như Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc
Giang, Thái Bình, Hải Phòng và Quảng Ninh. Từ đó đến nay dịch vẫn tiếp tục xảy ra ở
một số địa phương trong cả nước (Trần Thị Bích Liên và ctv, 2008).
Theo đánh giá không chính thức, hiện nay hội chứng PRRS có thể đã chuyển
sang dạng mãn tính tại hầu hết các trại có bệnh (Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2008). Kết
quả giải trình tự và gây bệnh thực nghiệm trên heo cho thấy chủng PRRSV tại Việt
Nam hiện nay có mức độ tương đồng cao về di truyền so với PRRSV chủng độc lực
cao của Trung Quốc (Tô Long Thành và ctv, 2008).
3


2.2.

Vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo
Vi rút PRRS thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirades.

Arterivirus gần giống với vi rút viêm khớp ngựa (EAV: equine arteritis virus), lactic
dehydrogenase virus (LDV) của chuột và vi rút gây sốt xuất huyết trên khỉ (SHFV:
simian hemorrhagic fever virus) (Dea và ctv, 2000). Vi rút PRRS có cấu trúc RNA sợi
đơn, có vỏ bọc, kích thước khoảng 50-70 nm,chứa nucleocapsid có cấu trúc đối xứng
20 mặt, đường kính 35 nm, chịu được nhiệt độ thấp (tồn tại khoảng 4 tháng ở nhiệt độ
-700C). Ba đặc tính quan trọng đáng lưu ý của giống Arterivirus nói chung và PRRSV
nói riêng là gây nhiễm trùng dai dẳng mà không thể hiện triệu chứng, nhân lên trong
các đại thực bào và có khả năng biến đổi gen rất lớn (Meulenberg và ctv, 1993).
2.2.1. Cơ chế sinh bệnh
Vi rút PRRS rất thích hợp với đại thực bào đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở
vùng phổi. Chúng xâm nhập vào tế bào bằng con đường nhập nội bào (endocytosis)

qua trung gian thụ thể. PRRSV có thể nhân lên trong đại thực bào sau đó phá hủy và
giết chết đại thực bào tới 40%. Đại thực bào bị giết chết sẽ làm giảm chức năng của hệ
thống bảo vệ cơ thể từ đó làm tăng nguy cơ nhiễm các bệnh kế phát. Điều này có thể
thấy rõ ở những đàn heo vỗ béo hoặc chuẩn bị giết thịt có sự tăng đột biến về tỷ lệ
viêm phổi kế phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong đường hô hấp (Nguyễn Văn
Thanh, 2007).

Hình 2.1 Đại thực bào trước và sau khi nhiễm PRRSV
a) Đại thực bào bình thường, b) Đại thực bào bị phá hủy bởi PRRSV.
().

4


2.2.2. Cấu trúc vi rút PRRS
2.2.2.1 Tổ chức bộ gen của vi rút PRRS
Bộ gen vi rút dài khoảng 1,5kb, gồm chín khung đọc mở (ORFs-open reading
frames) gồm ORF1a, ORF1b, ORF2a, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7,
nằm hai đầu hai vùng không dịch mã (untranslate region-UTR) 5’UTR và 3’UTR tại vị
trí 59 và 39 (Meulenberg JJ và ctv, 1993), có cấu trúc mũ methyl tại đầu 5’ và đuôi
poly (A) tại đuôi 3’, mã hóa cho 20 protein đã định sẵn. Vùng ORF1a và ORF1b dài
1,2kb, chiếm gần 75% bộ gen, mã hóa cho 12 protein không cấu trúc (NSP- nonstructural
protein), từ NSP1 đến NSP12, bản chất là các enzyme polymerase giúp cho việc nhân
lên của vi rút, trong đó vùng gen mã hóa NSP2 có sự biến đổi di truyền chủ yếu trong
sự nhân bản vi rút (Roongtham Kedkovid, 2010). Vùng gene mã hóa NSP2, tương
đồng giữa chủng Châu Âu và Bắc Mỹ cổ điển, nhưng ở chủng PRRSV dòng Trung
Quốc độc lực cao thì xuất hiện hiện tượng mất đoạn gene dài khoảng 87bp so với các
chủng khác (Tian và ctv, 2007). ORF1a được dịch mã trực tiếp trong khi ORF1b được
dịch bởi một khung dịch chuyển ribosom. Vùng trùng lắp ORF1a/ORF1b chứa những
tín hiệu thúc đẩy khung dịch chuyển này (Snijder và ctv, 1998).

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen vi rút PRRS. ORF1a, ORF1b: Protein không cấu trúc, ORF2a,
ORF3, ORF4 (GP2, GP3, GP4): Protein màng, ORF5 (E): Protein vỏ ngoài, ORF6 (M):
Protein gian màng, ORF7 (N): Protein Capsid (www.porcilis-prrs.com).

ORFs 2-7 định vị ngược dòng từ 3'-UTR, mã hóa một loạt các protein cấu trúc
của vi rút như protein vỏ, glycoprotein vỏ (GP2a, GP2b, GP3, GP4, GP5), protein
màng (M) và protein vỏ nucleocapsid (N) một cách chuyên biệt (Xiaofang Hao và ctv,
5


2011) nhưng chỉ có ba khung ORFs có ý nghĩa quan trọng trong tổng hợp vi rút, đó là
ORF5, ORF6 và ORF7. Sản phẩm GP2a (mã hóa bởi ORF 2a), GP2b (ORF2b), GP3
(ORF 3), GP4 (ORF 4), và GP5 (ORF5) là những protein được glycosyl hóa. Trong
khi ORF6 mã hóa protein màng (M) thì nucleocapsid (N) được mã hóa tại vùng ORF7,
có vai trò gây đáp ứng kháng thể sớm nhất (Plana-Duran và ctv, 1997). Các protein có
nguồn gốc từ khung đọc mở ORFs 2-7 được dịch từ đầu 3’ của bộ subgenome mRNAs
(sgmRNAs). Các sgmRNAs bao gồm một trình tự đầu bắt nguồn từ đầu 5’ của bộ gen
vi rút và hợp nhất thành một vật thể theo cơ chế sao chép không liên tục (Phan Thị
Anh Văn. 2010).
Bảng 2.1 Sản phẩm dịch mã của các ORFs
Tên các ORFs

Sản phẩm dịch mã

ORF1

RNA replicase ORF1s và ORF1b

ORF2

Glycoprotein màng GP2a, GP2b

ORF3

Glycoprotein màng GP3

ORF4

Glycoprotein màng GP4

ORF5

Glycoprotein màng chính GP5

ORF6

Protein liên kết màng M

ORF7

Nucleocapsid protein N

Proteins không cấu trúc

Protein cấu trúc

2.2.2.2 Protein không cấu trúc NSP2
Sản phẩm của ORF1 được phát hiện trong tế bào nhiễm vi rút nhưng không được
tìm thấy trong cấu trúc virion, vì vậy chúng được xem là những protein không cấu

trúc. ORF1a và ORF1b mã hóa các protein replicase, các protein phân tách ra ít nhất
13 protein không cấu trúc liên quan đến việc nhân rộng và tái bản của vi rút (Den
Boon và ctv, 1996). Trong các protein không cấu trúc của PRRSV, NSP2 là sản phẩm
lớn nhất của protein replicase. NSP2 protease tương tự như nhóm protease giống
papain (papain-like protease) nhưng nó có đặc tính riêng biệt như hoạt tính protease
cystein tự phân cắt nên được xếp vào nhóm “ chymotrypsin-like cystein protease”
(Snijder và ctv, 1995). Protein NSP2 của PRRSV có cấu trúc tương tự như NSP2 của
EAV, gồm 3 vùng chính: vùng bảo tồn với đầu N-terminal cystein protease (PL2);
vùng không tương đồng và vùng siêu biến đổi (HV-hypervariable); vùng kỵ nước CterminusTM (TM) (Hình 2.3)
6


Hình 2.3 Biểu đồ giả định protein NSP2 của PRRSV. Vùng NSP1 đến NSP5 của PRRSV
và EAV trên lược đồ. Vị trí giao nhau được đánh dấu bởi hình tam giác và vị trí được chú
thích. Vùng hoạt động các enzyme là hộp màu đen, vùng không hoạt động PCP-1 trên EAV là
hộp màu xám. Vùng TM (aa từ 876 đến 898, 911 đến 930, 963 đến 979 và 989 đến 1009). Hai
vùng siêu biến đổi (HV) (Jun Han và ctv, 2007).

Vùng bảo tồn với đầu N-terminal cystein protease (PL2)
Vùng này có khoảng 100 aa, là vùng hoạt động trên chất nền giữa vùng giao nhau
của NSP2 và NSP3. Đây là vùng được dự đoán có tính bảo tồn cao (Bosch và ctv,
2004). Để kiểm tra tính quan trọng của miền PL2, Jun Han và ctv (2007) đã tiến hành
tạo một số đột biến mất nucleotide (nt) trên vùng PL2 trên NSP2 (Y47-S180). Kết quả,
việc mất lõi PL2 trên NSP2 đã gây chết cho vi rút.
Ngoài ra, vai trò của vùng đầu và cuối của PL2 cũng được xác định bằng cách tạo
một trong hai đột biến xóa vùng trên A13-V35[V7-NSP213-35] hoặc vùng dưới
S181-L323[V7-NSP2181-323], sau đó tạo dòng và nuôi cấy trên môi trường
MACR-144. Kết quả sự phiên mã cho thấy V7-NSP213-35 hoạt động bình thường
còn V7-NSP2181-323 chết. Điều này chứng tỏ aa 181-323 có ảnh hưởng đến hoạt
động của PL2 (Jun Han và ctv, 2007).

Vùng không tương đồng và vùng siêu biến đổi (HV-hypervariable)
Là vùng nằm giữa vùng PL2 và vùng TM, khoảng 150-850 aa, khác nhau rất cao
giữa các giống và đặc biệt là giữa các chủng PRRSV (Nellsen và ctv, 1999; Allende và
ctv, 1999). Theo ghi nhận của Jun Han và ctv (2007) vùng này không cần thiết cho
việc nhân lên của vi rút.
7


Vùng kỵ nước C-terminusTM (TM) và đuôi C
Vùng carboxyl của NSP2 thì có tính bảo tồn cao trên các chủng PRRSV và chứa
khoảng 3 đến 4 vùng hydrophotic TM (aa 876-898, 911-930, 963-979, 989-1009). Đặc
điểm này giống với EAV, vì vậy vùng kỵ nước C chịu trách nhiệm cho các mô đích
của các protein không cấu trúc trên màng tế bào để hoàn thành việc nhân rộng vi rút
(Van der Meer và ctv, 1998). Các đột biến xóa toàn bộ vùng W876-Q1009 hay vị trí
giao nhau 981G/G, vùng A880-A937[V7-NSP2880-937], vùng S1070-A1162[V7NSP21070-1162] đã gây chết cho vi rút (Jun Han và ctv, 2007).

Hình 2.4 Xây dựng các chủng VR-2332 có NSP2 đột biến. Đột biến đã xóa trong khung
NSP2 đã được hình thành để đạt được sản phẩm bằng PCR. Các nucleotide đã xóa được
hiển thị bằng đường nét đứt và các vị trí liên quan được chỉ định theo tên của từng đột biến.
Với mục đích biểu hiện gen ra ngoài, gen GFP đã được chèn vào vị trí mà các aa vùng 324434 của NSP2 đã bị xóa để tạo ra đột biến V7-NSP2324-434-GFP. Các miền enzyme giả
định và vùng TM và các vị trí giao nhau được hiển thị. Sức sống cho mỗi đột biến xây dựng
được hiển thị bên phải: +, sống; -, không sống (Jun Han và ctv, 2007).

8


Theo Pedersen và ctv (1999), protein NSP2 (cùng với NSP3) có liên quan đến sự
cảm ứng hình thành túi màng kép (Double-membrance vesicle). Hơn nữa, NSP2 mang
tính kháng nguyên cao (Oleksiewics và ctv, 2001). Gen NSP2 cho thấy sự đa dạng di
truyền cao nhất trong bộ gen vi rút, cũng như tính đa hình về kích thước rất đáng kể,

gồm sự xen vào 108 base và sự mất 3-333 base (Fang và ctv, 2004). Điển hình, theo
Tian và ctv (2007) những chủng PRRSV độc lực cao, có sự mất không liên tiếp 90
base được xem như là một chỉ thị phân tử (marker) cho di truyền dịch tễ. NSP2 sở hữu
2 đặc điểm quan trọng làm cho nó có tiềm năng cho việc xây dựng marker vi rút: một
là có thể chèn được một đoạn gen từ bên ngoài vào và việc có thể xóa bỏ trình tự trong
NSP2; hai là: có tính miễn dịch cao.
NSP2 của PRRSV mã hóa các protein chức năng, được đánh giá là có tính không
đồng nhất cao và biến đổi. Trình tự mã hóa NSP2 cũng khác nhau giữa 2 chủng
PRRSV EU và NA, tương đồng khoảng 40% trình tự aa (Nellsen và ctv, 1999). Hơn
nữa vùng NSP2 chính là nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về chiều dài giữa 2 type
PRRSV EU và NA (Tian và ctv, 2007).
2.2.3. Các chủng PRRSV và sự phân bố của chúng
Hiện nay đã xác định được hai kiểu gen vi rút chính: dòng châu Âu (vi rút
Lelystad hay type EU) và dòng Bắc Mỹ (VR–2332 hay type NA). Việc so sánh kiểu
gen đã cho thấy sự khác biệt di truyền giữa 2 nhóm này (có sự tương đồng 67% về giá
trị nucleotide). Type EU chiếm ưu thế tại châu Âu trong khi type NA được tìm thấy ở
châu Mỹ (cả miền Bắc và Nam) và châu Á (FAO, 2011). Tuy nhiên, bên trong mỗi
dòng lại có sự khác nhau về chuỗi trình tự nuceotide hay chuỗi hợp chất hữu cơ của
protein trong từng chủng vi rút. Sự khác nhau giữa các chủng được thể hiện trong
Bảng 2.2 và Hình 2.5.
Bảng 2.2 Tỉ lệ tương đồng về trình tự gen của các chủng PRRSV
Chủng
Nguồn gốc
Tỉ lệ
Dòng PRRSV
VR2332

Mỹ

100

Bắc Mỹ

Taiwan

Đài Loan

97

Bắc Mỹ

807/94

Canada

92

Bắc Mỹ

Olot

Tây Ban Nha

66

Châu Âu

110

Netherland

66

Châu Âu

().
9


Hình 2.5 Cây phân bố di truyền của một số chủng PRRSV dòng Châu Âu và
Bắc Mỹ. ().
Hình 2.5 mô tả phân bố giống, loài của chủng PRRSV theo số liệu bảng 2.1.
Trong đó có 2 kiểu gen Bắc Mỹ và Châu Âu. Sự khác nhau giữa các chủng phụ thuộc
vào sự khác nhau trong chuỗi trình tự nucleotide trong từng chủng vi rút.
Về mặt độc lực, PRRSV được phát hiện tồn tại dưới 2 dạng: Thứ nhất là dạng cổ
điển_đây là dạng có độc lực thấp, gây tỉ lệ chết thấp (1-5% tổng đàn). Thứ 2 là dạng
biến thể độc lực cao, là dạng có khả năng gây nhiễm và làm chết nhiều heo.
2.2.3. Sự khác biệt về trình tự giữa 2 dòng PRRSV Châu Âu và Bắc Mỹ
Nelson và ctv (1993), đã phát hiện sự khác nhau quan trọng giữa 2 chủng PRRSV
VR-2332 (dòng PRRSV Bắc Mỹ) và chủng Lelystad (dòng PRRSV Châu Âu) là sự
khác biệt trên trình tự đầu 5’ và một phần vùng ORF1a. Sự khác biệt cũng đã tìm thấy
trên một số gen cấu trúc. Sự so sánh giữa vi rút Lelystad với VR-2332 (Muratugh và
ctv, 1995) và giữa Lelystad với VR-2385, dòng Bắc Mỹ, (Morozov và ctv, 1995) đều
nhận được 63, 58 và 68% sự tương đồng tại các gen tương ứng ORFs 2, 3 và 4. Vùng
ORF5 có 88-97% tương đồng giữa các dòng PRRSV Bắc Mỹ nhưng chỉ có 51-59%
tương đồng với chủng Lelystad, dòng Châu Âu, (Andreyev và ctv, 1997). Gen ORF7
là vùng bảo tồn cao trên dòng Bắc Mỹ (95-100% tương đồng về trình tự axit amin)
nhưng khi đem so sánh với chủng Lelystad thì cũng chỉ có 57-59% tương đồng (Meng
và ctv, 1995; Muratugh và ctv, 1995). Vùng ORF6 là vùng bảo tồn nhất của dòng Bắc
Mỹ (100% tương đồng) và cũng là gen bảo tồn nhất giữa 2 dòng PRRSV Bắc Mỹ và

Châu Âu với sự tương đồng lên đến 71-80%. Sự khác biệt lớn nhất giữa 2 dòng vi rút
10


này được thể hiện ở vùng gen NSP2. Protein NSP2 của dòng Bắc Mỹ dài hơn 102 axit
amin, tương đồng chỉ 32% (Muratugh và ctv, 1995; Andreyev và ctv, 1997).
2.2.4. Biến chủng PRRSV Trung Quốc gây sốt cao
Thông thường, các dòng vi rút PRRS chủng Châu Âu và Bắc Mỹ gây chết với tỷ
lệ thấp. Nhưng vào tháng 7/2006, Trung Quốc đã bùng nổ đợt dịch PRRS và phát hiện
biến chủng vi rút Bắc Mỹ gây sốt cao (gọi tắt là H-PRRSV), tốc độ lây lan và khả năng
gây chết cho heo của chủng này nhanh hơn, chứng tỏ vi rút đã có sự biến đổi phức tạp.
Biến chủng vi rút này có thể gây chết đến 100% heo bệnh, kể cả heo trưởng thành.
Mầm bệnh này đã làm hàng triệu heo bị ốm, chết và phải tiêu hủy. Sự biến đổi của vi
rút được giải thích do áp lực chọn lọc và sự thay đổi tập quán chăn nuôi, sự liên kết
dịch tễ của một số lượng lớn động vật và điều kiện môi trường…tại Trung Quốc
(FAO, 2011).
Năm 2004, trong lúc so sánh hai chủng HB-1 và HB-2 với chủng Bắc Mỹ, Gao
và ctv phát hiện có 1 đột biến mất đoạn 12 aa ở vùng NSP2 thuộc dòng HB-2 và đã
khẳng định đây là một chủng PRRSV mới. Năm 2007, Tian và cộng sự cho biết
nguyên nhân gây ra các ổ dịch tai Trung Quốc năm 2006 vẫn là vi rút PRRS nhưng có
độc lực cao hơn rất nhiều. Sau khi phân tích di truyền các chủng PRRSV phân lập, cho
thấy rằng các chủng này đã bị mất 30 axit amin trong vùng NSP2.
Xiaofang Hao (2011) đã nghiên cứu vùng gen ORF7 và NSP2 của bảy trình tự
gen PRRSV phân lập được từ Trung Quốc và so sánh với 93 trình tự trên ngân hàng
gen trong đó có 91 trình tự đã phân lập từ Trung Quốc, 1 trình tự Bắc Mỹ VR-2332 và
một trình tự vi rút vacxin nhược độc RespPRRS MLV thì thấy có sự mất một số axit
amin trên protein NSP2 của 75/100 trình tự Trung Quốc này. Ngoài trình tự HB-2 bị
mất mười hai axit amin tại vị trí 470-481, 74 trình tự còn lại có bốn kiểu đột biến khác
nhau. 64 trình tự từ ngân hàng gen và 6 trình tự phân lập được (07N, 128, PC, TS,
XIN, và XB) bị mất ba mươi axit amin trong đó 1 ở vị trí 482 và 29 axit amin khác tại

vị trí 533-561 của NSP2. Trong khi trình tự CG và GDQY2 bị mất 36 và 29 amino axit
tại vị trí 471-506 và 533–561 thì trình tự YN9 bị mất lần lượt 25 và 29 axit amin tại vị
trí 478-502 và 533-561. Riêng trình tự Em2007 bị mất 1 axit amin vị trí 499-566.
Trình tự nucleotide (nt) của 98 trình tự PRRSV Trung Quốc trên tương đồng với nhau
tới 90,9-100% và 88,6-100% trình tự axit amin, tất cả đều thuộc dòng Bắc Mỹ. Những
dòng này có độ tương đồng tới 91,4-100% nt và 91,1-100% axit amin so với dòng VR11


2332 and vacxin RespPRRS MLV còn so với dòng châu Âu là 67,8-71,1% nucleotide và
62,5-65,8% axit amin.
Kết quả phân tích 5 gen (GP2, GP3, GP4, GP5 và NSP2) của 7 chủng PRRSV
phân lập từ Trung Quốc cho thấy cả 7 chủng này đều thuộc cùng phân nhóm di truyền
và có quan hệ với kiểu gen PRRSV Bắc Mỹ với mức tương đồng từ 80,8-92,9%. Tất
cả protein NSP2 của 7 chủng đều bị mất 29 axit amin (Chengmin Wang và ctv, 2010)
Hiện nay, dòng H-PRRSV đã lây sang vùng Đông Nam Á. Trong năm 2007, Việt
Nam và Philipin đều phát hiện sự có mặt của dòng vi rút này. Thái Lan tìm thấy dòng
vi rút độc lực cao năm 2008 nhưng tình hình dịch bệnh bùng phát chậm. Kết quả
nghiên cứu của Youjun Feng và ctv (2007) đã khẳng định dòng vi rút PRRS tại Việt
Nam và Trung Quốc tương đồng với nhau, đều là dòng độc lực cao và bị mất 30 axit
amin trong vùng NSP2. Tại Việt Nam, toàn bộ chuỗi gen M của chủng vi rút gây bệnh
“tai xanh” phân lập từ heo bệnh tại Quảng Nam (Việt Nam) năm 2007, ký hiệu
TXMT1 (Việt Nam), có độ dài 525 bp đã được thu nhận và giải trình tự. Thành phần
nucleotide, axit amin biểu hiện từ gen M của chủng TXMT1 được sử dụng để phân
tích và so sánh đồng nhất về nucleotide và tương đồng về axit amin giữa chủng này
với một số chủng của Trung Quốc phân lập trong các năm 2006-2008 và thế giới. Kết
quả cho thấy chủng TXMT1 chỉ có 2-3 vị trí nucleotide khác biệt so với các chủng
Trung Quốc, trong khi đó có đến 28 vị trí khác so với chủng VR-2332 (chủng Bắc Mỹ)
và rất nhiều so với các chủng châu Âu. Đặc tính gen M cho thấy, chủng TXMT1 của
Việt Nam có biến đổi di truyền cao, có thể có cùng nguồn gốc phát sinh cùng với các
chủng PRRSV của Trung Quốc, dẫn đến suy đoán, tác nhân gây PRRS cường độc cao

có tại Việt Nam rất có thể là do từ Trung Quốc vào (Feng và ctv, 2009). Kết quả giải
trình tự bộ gen vi rút PRRS phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của Việt Nam được so
sánh với Ngân hàng Gen khẳng định các chủng tại Việt Nam có mức tương đồng 77%
so với chủng VR-2332 và chủng MN184 (2 chủng PRRSV Bắc Mỹ) nhưng lại có mức
tương đồng từ 98-99,6% với các chủng vi rút PRRS Trung Quốc độc lực cao như
HUN4, JX0612, JXA1, HUB1, HUN, HEB1 (Trung tâm chuẩn đoán Thú Y Trung
Ương, 2008).
Qua nghiên cứu giải mã gen các mẫu vi rút gây dịch PRRS tại Việt Nam cho
thấy các chủng PRRSV tại Việt Nam thuộc nhóm PRRSV dòng Bắc Mỹ chủng Trung
Quốc độc lực cao với độ tương đồng 99-99,7%. Các protein NSP2 của các chủng đều
12


có sự biến thể (đều bị mất nucleotide từ vị trí 378 đến 464 (Hình 2.6)) (Nguyễn Ngọc
Hải và Võ Khánh Hưng. 2010a).

Hình 2.6 Trình tự gen vùng NSP2 của PRRSV tại Việt Nam. Vùng màu đỏ: trình tự bị
mất (Nguyễn Ngọc Hải và Võ Khánh Hưng, 2010)
2.3.

Kỹ thuật real time RT-PCR chẩn đoán PRRSV

2.3.1. Kỹ thuật real time PCR
Đối với kỹ thuật PCR, muốn xác định có sản phẩm khuếch đại mong muốn trong
phản ứng hay không thì người làm thí nghiệm cần phải phải tiếp tục một số giai đoạn
để đọc và phân tích mẫu sau khi hoàn tất quá trình khuếch đại. Trong giai đoạn này,
người làm thí nghiệm có thể thực hiện điện di trên gel agarose để xác định sản phẩm
khuếch đại có vạch đúng với kích thước hay không hoặc lai với các đoạn dò đặc hiệu
(trên màng, giếng hay phiến nhựa..) để xem có trình tự mong muốn hay không.
Real time PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại

ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng do đó người làm thí nghiệm không cần phải
tiến hành giai đoạn đọc và phân tích kết quả như PCR. Khả năng này được thực hiện
nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu sự gia tăng
lượng DNA tỉ lệ với sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang. Chất phát huỳnh quang bao
gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu
13


với mồi gọi là mẫu dò. Kết quả được thu nhận bởi thiết bị gọi là máy luân nhiệt gắn bộ
phận thu nhận huỳnh quang, cho phép kiểm soát tín hiệu huỳnh quang khi phản ứng
xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang thu nhận được phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại
trong mỗi chu kỳ.
2.3.2. Các chất phát huỳnh quang sử dụng trong real time PCR
2.3.2.1 SYBR Green
SYBR Green chỉ phóng thích một lượng nhỏ tín hiệu huỳnh quang khi nó ở dạng
tự do trong dung dịch nhưng khi có sự hiện diện của sản phẩm PCR thì SYBR Green
sẽ liên kết với mạch đôi DNA làm cho tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng lên ngàn lần. Khi
có sự hiện diện của các sản phẩm không đặc hiệu có thể làm tăng tín hiệu huỳnh quang
tổng và ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả định lượng. Hơn nữa, không thể sử
dụng thuốc nhuộm liên kết DNA cho phản ứng multiplex bởi không thể phân biệt
được tín hiệu huỳnh quang từ các sản phẩm khác nhau. Chính vì vậy thường phân tích
đường cong nóng chảy để nhận diện các sản phẩm phản ứng khác nhau trong phản ứng với
SYBR Green (Bio-Rad).
2.3.2.2 Mẫu dò phân hủy (Taqman probe)
Mẫu dò Taqman là những đoạn oligonucleotide sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ
sung đặc hiệu với DNA đích, dài khoảng 24 đến 30 base với đầu 5’gắn chất phát
huỳnh quang (reporter) và đầu 3’ gắn chất hấp thụ tương ứng (quencher) để hấp phụ
ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter.

Hình 2.7. Cấu tạo của mẫu dò Taqman ().

14


Bảng 2.3 Các cặp reporter và quencher thường được sử dụng
Bước sóng kích

Bước sóng huỳnh

thích (nm)

quang phát ra (nm)

FAM

495

520

TAMRA, DABCYL, BHQ1

TAMRA

557

583

BHQ2, DABCYL

TET

521

536

DABCYL, BHQ1

VIC

538

554

BHQ1

HEX

535

556

BHQ1, BHQ3, DABCYL

JOE

529

555

BHQ1

Cy5

647

667

BHQ2, BHQ3

Cy5.5

690

705

BHQ2

Rox

586

610

BHQ2, BHQ3, DABCYL

Reporter

Quencher

(Phạm Hùng Vân, 2009)
Việc chọn reporter phù hợp với quencher rất quan trọng, cần chính xác và hiệu

quả. Có nhiều loại chất phát huỳnh quang nhưng thường sử dụng cặp chất phát và hấp
thụ huỳnh quang fluorescein (FAM, chất phát màu xanh) và Black Hole Quencher 1.
Ưu điểm của mẫu dò Taqman là rất đặc hiệu, tỉ lệ huỳnh quang phát cao, có khả năng
thực hiện các phản ứng đa mồi (Bio-Rad).
2.3.3. Nguyên lý hoạt động real time sử dụng mẫu dò Taqman
2.3.3.1 Cơ chế khuếch đại của real time PCR sử dụng mẫu dò Taqman
Điểm khác biệt quan trọng nhất của real time PCR so với các kỹ thuật PCR khác
là sử dụng enzyme có hoạt tính 5’-3’ exonuclease. Nhờ đặc tính này mà enzyme có thể
cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang khi nó tiếp xúc trong quá trình kéo dài (Hình 2.8).
2.3.3.2 Phân tích dữ liệu real time PCR
Theo Phạm Hùng Vân (2009), khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại
đặc hiệu từ DNA đích, mẫu dò còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang phát ra từ
reporter bị quencher hấp thụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt cặp và kéo dài DNA của
phản ứng khuếch đại, mẫu dò liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’-3’ exonuclease
đặc hiệu cho DNA mạch đôi của enzyme Taq DNA Polymerase hay Tth DNA
polymerase sẽ cắt rời reporter ở đầu 5’ của mẫu dò ra xa quencher và phóng thích chất
phát huỳnh quang ra ngoài môi trường. Khi cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter

15