CHỌN LỌC VI KHUẨN NỐT SẦN TRÊN CÂY ĐẬU XANH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA NÔNG HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CHỌN LỌC VI KHUẨN NỐT SẦN
TRÊN CÂY ĐẬU XANH

NGÀNH

: NÔNG HỌC

KHÓA

: 2008 – 2012

SINH VIÊN THỰC HIỆN : MAI NGỌC ĐIỀM

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07/2012


i

CHỌN LỌC VI KHUẨN NỐT SẦN
TRÊN CÂY ĐẬU XANH


Tác giả
MAI NGỌC ĐIỀM

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng kỹ sư ngành Nông học

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN:
PGS.TS. Lê Đình Đôn

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07/2012


ii

LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, em xin chân thành cảm ơn
Công ơn sinh thành, dưỡng dục của ba mẹ, sự động viên khích lệ của người
thân trong gia đình trong suốt thời gian qua.
Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Quý thầy cô khoa Nông Học đã tận tình dạy bảo em những kiến thức quý báu
trong suốt quá trình học tập.
PGS.TS. Lê Đình Đôn, người đã tận tình hướng dẫn em hoàn thành khóa luận
tốt nghiệp này.
Các bạn sinh viên lớp DH08NH, DH08BV, DH08SH và em Nguyễn Thị Dược
đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tp.Hồ Chí Minh, 9 tháng 7 năm 2012
Sinh viên thực hiện

Mai Ngọc Điềm


iii

TÓM TẮT
MAI NGỌC ĐIỀM, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Tháng
8/2012. Chọn lọc vi khuẩn nốt sần trên cây đậu xanh.
Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN
Trong canh tác, việc sử dụng các chế phẩm sinh học sẽ góp phần quan trọng
trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững. Đề tài đã thực
hiện thành công việc cải tiến bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi
khuẩn cố định đạm trên đậu xanh đồng thời tiến hành chọn lọc các chủng vi khuẩn đã
phân lập dựa trên mô hình đã cải tiến.
Nội dung nghiên cứu gồm 3 phần chính là: thứ nhất, phân lập ra các chủng vi
khuẩn cố định đạm trên cây họ đậu: đậu xanh, đậu đen, đâu phụng. Thứ hai, cải tiến
bioassay phục vụ cho việc chủng các chủng vi khuẩn đã phân lập lên cây đậu xanh.
Thứ ba, tiến hành chủng các chủng vi khuẩn phân lập được trên giống đậu xanh APN –
208.
Việc phân lập dựa vào sự phát triển của khuẩn lạc trên môi trường yeast
mannitol agar (YMA) sau 24 giờ cấy. Sau đó tiếp tục cấy tăng sinh các chủng vi khuẩn
cho khuẩn lạc điển hình, sau 24 giờ ở 370C, tiến hành chủng các chủng vi khuẩn cần
phân lập lên giống đậu xanh APN 208 trong môi trường đất và tro trấu đã được hấp ở
1210C. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, với 13 nghiệm
thức (NT), trong đó có một NT đối chứng, 12 NT là các chủng vi khuẩn cần phân lập,
đó là các chủng vi khuẩn: X4, H1, H3, A3I, X5, X6, Đ7, A3II, Đ5.1, Đ6, ĐP4, P4.1.
Kết quả chọn được bốn chủng vi khuẩn thiết lập mối quan hệ cộng sinh với rễ cây đậu
xanh tạo ra nốt sần hữu hiệu, đó là các chủng vi khuẩn: X4, H1, H3, A3I.
Việc thứ hai là cải tiến bioassay bằng cách trồng đậu xanh trên giấy ăn thấm
nước và được phủ bên ngoài bằng tấm giấy bìa cứng. Những tập giấy này được dựng
đứng bằng cách cố định vào những dây kẽm. Sau đó tiến hành thí nghiệm với các mức
khoảng cách trồng giữa các hạt đậu xanh khác nhau. Nhằm chọn ra được một khoảng
cách trồng phù hợp mà cây phát triển bình thường cũng như để khảo sát sự phát triển
của cây trên hệ thống bioassay. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

iv

nhiên, 4 lần lặp lại, với 4 nghiệm thức (NT) tương ứng với các mức khoảng cách giữa
các hạt khi gieo là: NT 1: 2 cm, NT 2: 3 cm, NT 3: 4 cm, NT 4: 5 cm. Kết quả đã chọn
được mức khoảng cách phù hợp là 4 cm để phục vụ cho việc chủng invitro các chủng
vi khuẩn đã phân lập được trong quy mô phòng thí nghiệm trên hệ thống bioassay.
Việc thứ ba được tiến hành trên giống đậu xanh APN – 208, thí nghiệm bố trí
theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại, với 5 nghiệm thức tương ứng với các
chủng vi khuẩn gồm: NT1: X4; NT2: H1; NT3: H3; NT4: A3I; NT5: Đối chứng không
có vi khuẩn. Kết quả sau 16 ngày sau khi chủng vi khuẩn trên đậu xanh, cả bốn chủng
vi khuẩn: X4, H1, H3 và A3I đã tạo được mối quan hệ cộng sinh với rễ cây đậu xanh
trên hệ thống bioassay, tạo được nốt sần hữu hiệu. Ngày thứ bảy sau khi chủng vi
khuẩn thì nốt sần đã xuất hiện. Chủng vi khuẩn X4 là chủng vi khuẩn hoạt động mạnh
nhất trong bốn chủng vi khuẩn tạo được nốt sần trên rễ đậu xanh.


v

MỤC LỤC
Trang
Trang tựa........................................................................................................................ i
Lời cảm tạ ..................................................................................................................... ii
Tóm tắt ......................................................................................................................... iii
Mục lục ..........................................................................................................................v
Danh sách các bảng, danh sách các hình ................................................................... viii
Danh sách các phụ lục ................................................................................................. ix
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... ix
Chương 1 Giới thiệu ....................................................................................................1

1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................1
1.2 Mục đích của đề tài..................................................................................................2
1.3 Yêu cầu của đề tài....................................................................................................2
1.4 Giới hạn của đề tài ...................................................................................................2
Chương 2 Tổng quan tài liệu ......................................................................................3
2.1 Vai trò của đạm (N) đối với thực vật.......................................................................3
2.2 Giới thiệu về cây đậu xanh ......................................................................................3
2.2.1 Khóa phân loại ......................................................................................................3
2.2.2 Đặc điểm ...............................................................................................................4
2.3 Các nguồn cung cấp đạm trong đất và quá trình cố định đạm trên cây đậu xanh ...4
2.3.1 Các nguồn cung cấp đạm trong đất ......................................................................4
2.3.2 Quá trình cố định đạm trên cây đậu xanh .............................................................5
2.3.2.1 Khái niệm chung về quá trình cố định đạm.......................................................5
2.3.2.2 Cơ chế của quá trình cố định đạm .....................................................................6
2.4 Vi khuẩn nốt sần và sự hình thành nốt sần ..............................................................6
2.4.1 Lịch sử phát triển ..................................................................................................6
2.4.2 Đặc điểm ...............................................................................................................7
2.4.3 Phân loại ...............................................................................................................9
2.5 Quá trình hình thành nốt sần .................................................................................10
2.6 Vi khuẩn chi Rhizobium ........................................................................................11
2.6.1 Lịch sử phát triển ................................................................................................11


vi

2.6.2 Phân loại .............................................................................................................12
2.6.3 Đặc điểm .............................................................................................................12
2.7 Vi khuẩn chi Bradyrhizobium ...............................................................................13
Chương 3 Nội dung, phương tiện và phương pháp nghiên cứu ............................14
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .........................................................................14

3.1.1 Thời gian nghiên cứu ..........................................................................................14
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu...........................................................................................14
3.2 Vật liệu thí nghiệm ................................................................................................14
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu .........................................................................................14
3.2.2 Thiết bi, dụng cụ và hóa chất sử dụng ................................................................14
3.2.2.1 Thiết bị và dụng cụ ..........................................................................................14
3.2.2.2 Hóa chất ...........................................................................................................15
3.3 Nội dung nghiên cứu .............................................................................................15
3.4 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................15
3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn cố định đạm ............15
3.4.1.1 Mô tả thí nghiệm .............................................................................................15
3.4.1.2 Bố trí thí nghiệm ..............................................................................................16
3.4.1.3 Cách lấy chỉ tiêu và phương pháp theo dõi .....................................................16
3.4.1.4 Quy trình kỹ thuật ............................................................................................16
3.4.2 Thí nghiệm 2: Cải tiến hệ thống bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các
chủng vi khuẩn trên giống đậu xanh APN 208 ...........................................................17
3.4.2.1 Hệ thống dùng trong bioassay .........................................................................17
3.4.2.2 Mô tả thí nghiệm .............................................................................................18
3.4.2.3 Bố trí thí nghiệm ..............................................................................................18
3.4.2.4 Cách lấy chỉ tiêu và phương pháp theo dõi .....................................................19
3.4.2.5 Quy trình kỹ thuật ............................................................................................19
3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh, đánh giá và chọn lọc các chủng vi khuẩn cố định đạm
trên giống đậu xanh APN 208 .....................................................................................19
3.4.3.1 Bố trí nghiệm ...................................................................................................19
3.4.3.2 Cách lấy chỉ chỉ tiêu và phương pháp theo dõi ...............................................20
3.4.3.3 Quy trình kỹ thuật ............................................................................................20


vii

3.5 Xử lý số liệu ..........................................................................................................21
Chương 4 Kết quả và thảo luận ...............................................................................22
4.1 Kết quả...................................................................................................................22
4.1.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn cố định đạm ............22
4.1.2 Thí nghiệm 2: Cải tiến hệ thống bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các
chủng vi khuẩn trên giống đậu xanh APN 208 ...........................................................35
4.1.3 Thí nghiệm 3: So sánh, đánh giá và chọn lọc các chủng vi khuẩn cố định đạm
trên giống đậu xanh APN 208 .....................................................................................49
4.2 Thảo luận ...............................................................................................................50
Chương 5 Kết luận và đề nghị ..................................................................................53
5.1 Kết luận..................................................................................................................53
5.2 Đề nghị ..................................................................................................................53
Tài liệu tham khảo .......................................................................................................55
Phụ lục .........................................................................................................................58


viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG, DANH SÁCH CÁC HÌNH
Danh sách các bảng
Bảng 4.1: Số chủng vi khuẩn phân lập và nguồn gốc mẫu ...................................... 22
Bảng 4.2: Chiều cao cây đậu xanh qua các lần theo dõi .......................................... 25
Bảng 4.3: Chiều dài rễ đậu xanh qua các lần theo dõi ............................................. 27
Bảng 4.4: Quan hệ cộng sinh của 12 chủng vi khuẩn với rễ cây đậu xanh .............. 29
Bảng 4.5: Số nốt sần hữu hiệu qua các lần điều tra .................................................. 33
Bảng 4.6: Đường kính nốt sần hữu hiệu qua các lần điều tra................................... 34
Bảng 4.7: Chiều cao trụ hạ diệp qua các ngày theo dõi ........................................... 38
Bảng 4.8: Chiều dài rễ đậu xanh 9 ngày sau gieo .................................................... 39
Bảng 4.9: Chiều cao cây đậu xanh qua các lần điều tra ........................................... 40
Bảng 4.10: Chiều dài rễ đậu xanh qua các lần điều tra ............................................ 41

Bảng 4.11: Nốt sần hữu hiệu qua các lần điều tra .................................................... 46
Bảng 4.12: Đường kính nốt sần hữu hiệu ................................................................. 49
Danh sách các hình
Hình 3.1: Hệ thống trồng đậu xanh .......................................................................... 18
Hình 4.1: Hình dạng, màu sắc của một số khuẩn lạc sau khi cấy 24 giờ ................. 23
Hình 4.2: Chiều cao cây đậu xanh qua các ngày theo dõi ........................................ 24
Hình 4.3: Chiều dài rễ đậu xanh tại 14 ngày sau gieo .............................................. 28
Hình 4.4: Nốt sần hữu hiệu tại 7 ngày sau gieo........................................................ 30
Hình 4.5: Nốt sần hữu hiệu tại 14 ngày sau gieo...................................................... 31
Hình 4.6: Nốt sần hữu hiệu tại 21 ngày sau gieo...................................................... 32
Hình 4.7: Quá trình gieo hạt giống ........................................................................... 35
Hình 4.8: Sự phát triển của cây đậu xanh vào thời điểm 4 ngày sau gieo ............... 36
Hình 4.9: Sự phát triển rễ đậu xanh của nghiệm thức 3 qua các lần điều tra ........... 37
Hình 4.10: Nốt sần hữu hiệu lúc chưa nhuộm .......................................................... 43
Hình 4.11: Nốt sần hữu hiệu tại 9 ngày sau gieo (đã nhuộm) .................................. 44
Hình 4.12: Nốt sần hữu hiệu tại 11 ngày sau gieo (đã nhuộm) ................................ 45


ix

Hình 4.13: Đường kính nốt sần hữu hiệu nhìn dưới kính hiển vi (vật kính 10) thời điểm
12 ngày sau gieo ....................................................................................................... 47
Hình 4.14: Đường kính nốt sần qua các ngày theo dõi ............................................ 48

DANH SÁCH CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1 Mẫu phân lập ............................................................................................ 58
Phụ lục 2 Môi trường phân lập ................................................................................. 58
Phụ lục 3 Dung dịch nhuộm rễ ................................................................................. 59
Phụ lục 4 Phương pháp nhuộm rễ ............................................................................ 59

Phụ lục 5 Số liệu qua các lần điều tra khi phân lập các chủng vi khuẩn ........ 60
Phụ lục 6 Số liệu qua các lần điều tra khi cải tiến mô hình bioassay ....................... 79
Phụ lục 7 Số liệu qua các lần điều tra khi chủng vi khuẩn trong thí nghiệm 3 ........ 83

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CV: Coefficient of Variation (Hệ số biến động)
NSG: Ngày sau gieo
NT: Nghiệm thức
N: nitơ


1

Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Khi canh tác con người luôn tìm mọi cách nhằm để đưa năng suất cây trồng lên
cao nhất bằng nhiều biện pháp khác nhau như cải tiến giống, nâng cao các kỹ thuật
thâm canh, sử dụng phân bón, … Trong những biện pháp đó, con người đã lạm dụng
quá mức vào phân bón hóa học, đặc biệt là phân đạm để tăng năng suất.
Vì thế, vấn đề đặt ra là cần phải nghiên cứu sản xuất ra một chế phẩm vi sinh
dùng để hỗ trợ cho việc sử dụng phân đạm hóa học. Ngoài tác dụng nâng cao năng
suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản xuất, việc sử dụng
phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền
nông nghiệp bền vững.
Chúng ta đã biết những cây họ đậu có một khả năng đặc biệt là sản xuất ra nitơ
cho chính bản thân nó thông qua mối quan hệ cộng sinh với một số vi sinh vật đất hay
còn gọi là vi khuẩn nốt sần. Vi khuẩn này xâm nhập vào tế bào rễ thực vật và bắt đầu
hàng loạt các thay đổi phát triển phức tạp dẫn đến sự tạo thành nốt sần. Các vi khuẩn
này được cây nuôi sống và cố định hay là biến đổi khí nitơ tự do trong bầu khí quyển

thành hợp chất nitơ mà cây có thể sử dụng giúp cho cây sinh trưởng và phát triển.
Tuy nhiên, với số lượng vi khuẩn cố định đạm trong đất còn hạn chế chưa đáp
ứng đủ đối với nhu cầu của cây. Vì vậy, việc phân lập ra những dòng vi khuẩn cố định
đạm là cần thiết và phục vụ cho sự phát triển của nền nông nghiệp nước nhà ngày càng
giàu mạnh.
Mặt khác, các chủng vi khuẩn khác nhau thì có khả năng cố định đạm khác
nhau và chuyên biệt đối với từng giống đậu khác nhau. Vì vậy, để tuyển chọn ra được


2

các chủng vi khuẩn thích hợp thì công việc bước đầu không kém phần quan trọng là
phải cải tiến thành công bioassay (thí nghiệm sinh học) phục vụ cho việc chủng invitro
các chủng vi khuẩn đó trên cây đậu.
Trong các loại cây họ đậu, đậu xanh là cây trồng khá phổ biến, được trồng rộng
rãi ở nước ta. Đậu xanh đóng một vai trò quan trọng trong đời sống vừa là thức ăn trực
tiếp của con người và động vật, cũng như một số chức năng chữa bệnh hữu hiệu mà nó
mang lại.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã đăng ký thực hiện đề tài: “Chọn lọc vi
khuẩn nốt sần trên cây đậu xanh”.
1.2 Mục đích của đề tài
Sử dụng mô hình bioassay (thí nghiệm sinh học) phục vụ cho việc chủng invitro
các chủng vi khuẩn cố định đạm trên đậu xanh và tiến hành chọn lọc các chủng vi
khuẩn nốt sần đã phân lập dựa vào mô hình đã thiết lập, sản xuất chế phẩm từ các
dòng vi khuẩn đã chọn lọc được.
1.3 Yêu cầu của đề tài
-

Phân lập, tạo dòng thuần và nhân sinh khối các chủng vi khuẩn cố định đạm từ nốt

sần của rễ cây đậu xanh, đậu đen, đậu phụng.
- Cải tiến bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi khuẩn trên đậu xanh.
- Đánh giá và chọn lọc các chủng vi khuẩn đã phân lập trên giống đậu xanh APN –
208 nhờ vào mô hình bioassay.
1.4 Giới hạn của đề tài:
Đề tài đã được thực hiện từ ngày 13/02 đến ngày 13/06 với việc phân lập, đánh giá
các chủng vi khuẩn nốt sần trên cây họ đậu, cải tiến hệ thống bioassay và chọn lọc các
chủng vi khuẩn thích hợp trên giống đậu xanh APN 208 trong phòng thí nghiệm.


3

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vai trò của đạm (N) đối với thực vật
Đạm có vai trò rất quan trọng đối với cây trồng, nhu cầu N của hầu hết các loại
cây trồng là rất cao. Trong sản xuất, phân N thường là yếu tố dinh dưỡng giới hạn
năng suất. Cây trồng hấp thụ N để hình thành các Amino acids, amides, amines, các
cấu trúc khung, các hợp chất trung gian như Proteins, chlorophyll, nucleic acids,
proteins/enzymes điều hòa các phản ứng sinh hóa, đây là những chất quan trọng bật
nhất trong việc xây dựng và điều tiết sự phát triển của thực vật. (Lê Văn Hưng,
Nguyễn Xuân Thành, Phạm Văn Toản, 2003).
Đạm là thành phần tổng hợp cấu trúc diệp lục tố. Nó cũng là thành phần của
DNA, RNA.
2.2 Giới thiệu về cây đậu xanh
2.2.1 Khóa phân loại
Bộ: Fabales
Họ: Fabaceae
Phân họ: Faboideae
Tông: Phaseoleae

Phân tông: Phaseolinae
Chi: Vigna
Tên khoa học: Vigna radiata (L.)
Tên đồng nghĩa: Phaseolus aureus Roxb.


4

2.2.2Đặc điểm
Đậu xanh hay đỗ xanh có kích thước hạt nhỏ (đường kính khoảng 2–2,5 mm).
Ở Việt Nam đậu xanh là loại đậu thường được sử dụng để làm xôi, làm các loại bánh
khọt, bánh đậu xanh, bánh ngọt, hoặc được ủ cho lên mầm để làm thức ăn (giá đỗ).
Đậu xanh thuộc loại cây thân thảo mọc đứng. Lá mọc kép ba chia, có lông hai
mặt. Hoa màu vàng lục mọc ở kẽ lá. Quả hình trụ thẳng, mảnh nhưng số lượng nhiều,
có lông, trong chứa hạt hình tròn hơi thuôn, kích thước nhỏ, màu xanh, ruột màu vàng,
có mầm ở giữa, ( />Một đặc trưng nổi bật của cây đậu xanh: chúng là các loại cây chủ cho nhiều
loài vi khuẩn trên rễ của chúng. Các loài vi khuẩn này được biết đến như là vi khuẩn
nốt rễ, có khả năng lấy khí nitơ (N2) trong không khí và chuyển hóa nó thành các dạng
chất mà cây có thể hấp thụ được (NO3- hay NH3). Hoạt động này được gọi là cố định
đạm. Cây đậu với vai trò là cây chủ, còn vi khuẩn nốt rễ với vai trò là nhà cung cấp
nitrat có ích, tạo ra mối quan hệ cộng sinh.
2.3 Các nguồn cung cấp đạm trong đất và quá trình cố định đạm trên cây đậu
xanh
2.3.1 Các nguồn cung cấp đạm trong đất
- Quá trình khoáng hóa các chất hữu cơ: qua quá trình này các nguyên tố dinh
dưỡng nằm trong cấu trúc sinh hóa của các chất hữu cơ bị phân giải và chuyển sang
dạng hữu dụng mà cây trồng có thể hấp thụ được, thực hiện do hầu hết các vi sinh vật
đất như vi khuẩn, nấm dị dưỡng.
-

Cố định N sinh học. Gồm cố định sinh học do vi sinh vật cộng sinh và không

cộng sinh.
- Cố định N trong khí quyển: Sấm sét và cố định công nghiệp.
- Phân hóa học, phân hữu cơ, chất thải rắn sinh học.


5

2.3.2 Quá trình cố định đạm trên cây đậu xanh
2.3.2.1 Khái niệm chung về quá trình cố định đạm
Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không chỉ đối với cây trồng, mà ngay
cả đối với vi sinh vật. Nguồn dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, chỉ tính riêng trong
không khí nitơ chiếm khoảng 78,16 % thể tích. Người ta ước tính trong bầu không khí
bao trùm lên một héc ta đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn nitơ, lượng nitơ này có thể
cung cấp cho cây trồng hàng chục triệu năm nếu như cây trồng đồng hóa được chúng.
Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất chứa khoảng 10 – 25.109 tấn nitơ.
Trong các vật trầm tích chứa khoảng 4.105 tỷ tấn nitơ. Nhưng tất cả các nguồn nitơ
trên cây trồng không tự đồng hóa được mà phải nhờ vi sinh vật. Thông qua hoạt động
sống của các loài vi sinh vật, nitơ nằm trong các dạng khác nhau được chuyển hóa
thành dạng dễ tiêu cho cây trồng.
Trong đó, cố định đạm là tiến trình chuyển hóa nitrogen trong khí quyển thành
đạm amôn mà cây có thể hấp thụ dưới tác dụng của nhóm vi sinh vật có hoạt tính
Nitrogenaza. Trên cây họ đậu cũng như trên đậu xanh quá trình này được thực hiện
nhờ vi khuẩn thuộc chi Rhizobium hoặc chi Bradyrhizobium, chúng sống trong nốt sần
rễ cây họ đậu, có khả năng hút và chuyển hóa nitơ tự nhiên trong không khí thành N
cung cấp cho cây, sau khi cây chết và bị phân giải, sẽ cung cấp và làm gia tăng lượng
N trong đất.
Sự cố định N sinh học có thể xảy ra nhờ các vi khuẩn sống tự do thuộc các chi
như: Azotobacter, Beijerinckia, Clostridium, vi khuẩn lam sống tự do, vi khuẩn lam

cộng sinh trên bèo hoa dâu…nhưng chưa có ý nghĩa trong nông nghiệp. Trong khi đó
vi khuẩn nốt sần trong cây họ Đậu có thể cố định được từ 55 – 144 kg N/ha/vụ.
(Đường Hồng Dật, Nguyễn Lân Dũng, 1979).


6

2.3.2.2 Cơ chế của quá trình cố định đạm
Trong một thời gian dài, cơ chế của quá trình cố định đạm là một bí ẩn đầy hấp
dẫn trong tự nhiên. Trong khi con người phải sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất
cao, rất tốn kém (400 ÷ 5000C, 200 ÷ 1000 atm với những chất xúc tác rất đắt tiền) để
phá vở mối liên kết 3 của phân tử nitơ để có phân đạm hóa học, bằng cách tổng hợp từ:
NH3 + CO2

xúc tác

CO(NH2)2

Trong khi vi sinh vật với sự giúp đỡ của hoạt tính Nitrogenaza lại phá vở mối
liên kết ba của phân tử nitơ một cách dễ dàng ngay trong điều kiện rất bình thường về
nhiệt độ và áp suất.
Phản ứng khử N2 dưới sự xúc tác của Nitrogenaza có thể biểu thị vắn tắt như
sau:
Nitrogenaza
N2 + 6e + 12ATP + H2O

2NH4+ + 12ADP + 12Pi + 4H+

Nitrogenaza được cấu tạo bởi hai phần:
• Fc – protein có trọng lượng phân tử khoảng 6.104.

• Mo – Fc – protein có trọng lượng phân tử khoảng 2,2.105.
2.4 Vi khuẩn nốt sần và sự hình thành nốt sần
2.4.1 Lịch sử phát triển
Năm 1866 hai nhà khoa học Đức là Henrighen và Vinphac (H. Hellriegel và
H.Wilfarth) lần đầu tiên dùng thực nghiệm để chứng minh được rằng cây đậu khác các
thực vật khác ở chỗ là có khả năng sử dụng nitơ trong không khí.
Hai năm sau (1888) nhà khoa học Hà Lan Bâyêrinh (M. W.Beijerinck) đã phân
lập được loại vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ Đậu (đậu
Hòa lan, đậu cove, đậu tằm, đậu lotus…). Ông đặt tên cho loại vi khuẩn này là


7

Bacillus radicicola. Năm 1889, Frank đề nghị xếp vi khuẩn này vào một chi riêng là
chi Rhizobium (B. Frank, 1889)
2.4.2 Đặc điểm
Căn cứ vào tài liệu hiện có thì vi khuẩn nốt sần là loại vi khuẩn gram âm, khi
còn non có tế bào hình que, kích thước vào khoảng 0,5 - 1,2 x 2,0 - 3,5 𝜇𝜇m, bắt màu

đồng đều và có khả năng di động nhờ tiên mao. Vi khuẩn có nốt sần có loại đơn mao,
có loại chu mao và cũng có loại tiên mao mọc thành chùm ở gần đầu.

Khi già vi khuẩn nốt sần trở nên bất động. Lúc đó tế bào trở nên bắt màu từng
đoạn khi nhuộm bằng thuốc nhuộm aniline (có thể do xuất hiện các thể ẩn nhập giàu
lipít). Có lúc vi khuẩn nốt sần tạo thành những dạng hình cầu di động hoặc không di
động. Có tài liệu cho biết trong đất vi khuẩn nốt sần thường có dạng hình cầu, cũng có
khi chúng tạo thành những quả thể lọc. Khi gặp điều kiện bình thường những quả thể
lọc này lại có thể phát triển thành các tế bào bình thường.
Trên môi trường nhân tạo cũng như trong nốt sần người ta thường gặp những tế
bào gọi là thể giả khuẩn (bacteroides). So với các tế bào hình que bình thường thì thể

giả khuẩn có kích thước lớn hơn, thường phân nhánh (tạo thành các hình giống như
chữ X, V, Y, …) chứa nhiều glycogen, volutin và lipoprotein hơn. (Nguyễn Đức
Lượng, 2006). Trên môi trường đặc vi khuẩn nốt sần thường có khuẩn lạc trơn bóng,
nhầy lồi, màu trắng trong hoặc trắng đục. Chất nhầy do vi khuẩn nốt sần sinh ra thuộc
một loại polisaccarit cấu tạo bởi hexozơ, pentozơ và axit uronic. (Phan Thị Huyền,
2006)
Vi khuẩn nốt sần có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau (đường
đơn, đường kép, axit hữu cơ, rượu bậc thấp, dextrin, glycogen, …). Khoảng 30%
lượng đường do vi khuẩn nốt sần đồng hóa được dùng để tạo chất nhầy của chúng. Vi
khuẩn nốt sần có thể phát triển được trên môi trường rất nghèo nitơ. Tuy nhiên cho đến
nay vẫn chưa có ai xác định được là chúng có khả năng cố định nitơ khi phát triển trên
các môi trường dinh dưỡng (phát triển bên ngoài nốt sần). Còn có ý kiến cho rằng khả
năng cố định nitơ chưa chắc đã thuộc về vi khuẩn nốt sần mà có thể là thuộc về cây họ
đậu. Vi khuẩn nốt sần chỉ có tác dụng kích thích cho việc thực hiện quá trình này.


8

Vi khuẩn nốt sần có thể đồng hóa tốt nhiều loại axit amin, một số nòi có thể
đồng hóa được pepton. Khả năng sử dụng các protein phân tử lớn nói chung là rất ít.
Ngược lại, vi khuẩn nốt sần có thể sử dụng dễ dàng các muối amon, nitrat và các gốc
kiềm purin, pirimidin. Chúng còn có thể sử dụng được ure hoặc biure.
Việc nuôi cấy vi khuẩn nốt sần trên môi trường với nồng độ các hợp chất nitơ
cao có thể làm mất khả năng xâm nhiễm cũng như khả năng tạo thành nốt sần trên cây
bộ đậu. Chính vì vậy cho nên người ta thường sử dụng các loại môi trường chứa nước
chiết thực vật để nuôi cấy vi khuẩn nốt sần. Nhu cầu vitamin thay đổi đối với tùy từng
nòi vi khuẩn nốt sần. Nói chung nhiều loại vi khuẩn nốt sần có khả năng tự tổng hợp
khá nhiều loại vitamin (B1, B2, B12, …). Nhiều vi khuẩn nốt sần còn có khả năng tổng
hợp các chất sinh trường thực vật (như gibberellins, axit 𝛽𝛽-indonaxetic, …).

Để nuôi cấy vi khuẩn nốt sần, người ta thường sử dụng các môi trường chứa

đường kính hoặc mannitol, một số muối khoáng và một ít cao nấm men (các môi
trường Harrison, 1915; Fred và Waksman, 1928; Matchette, 1933; Bond, 1910;
Hendrickson, 1942; Van Schreven, 1953; Burton, 196). Để nhân giống vi khuẩn nốt
sần trong điều kiện các hợp tác xã nông nghiệp cũng có thể sử dụng cả những môi
trường rất đơn giản chứa đường kính hoặc đường đen với tỷ lệ 1% trong nước chiết
của loại đậu tương ứng (50 g/lít).
Vi khuẩn nốt sần thuộc loại hiếu khí. Tuy nhiên chúng vẫn có thể phát triển
được ngay cả trong trường hợp chỉ có một áp lực oxi rất thấp, khoảng 0,01 atm. Đa số
các loài vi khuẩn nốt sần thích hợp phát triển ở pH = 6,5 - 7,5. Sự sinh trưởng của
chúng bị cản trở khi pH hạ thấp đến 4,5 - 5,0 hoặc nâng lên đến 8,0. Nhiệt độ thích
hợp đối với nhiều loại vi khuẩn nốt sần là 24 - 260C. Ở nhiệt độ 370C sự phát triển của
chúng bị cản trở rõ rệt.
Mỗi loài vi khuẩn nốt sần chỉ xâm nhiễm được trên một nhóm cây nhất định
trong bộ đậu. Ví dụ các nghiên cứu ở Việt Nam cho biết vi khuẩn nốt sần Điền thanh
hoa vàng (S. cannnabana) có thể tạo được nốt sần trên Điền thanh hạt tròn (S.
paludosa) và ngược lại, trong khi đó không có khả năng tạo nốt sần trên rất nhiều loại
đậu khác (đậu tương, đậu đen, đậu xanh, đậu đũa, lạc).


9

Cũng có trường hợp vi khuẩn nốt sần xâm nhập được vào những loại đậu không
đặc biệt đối với chúng, khi đó chúng chỉ có thể tạo ra rất ít nốt sần và cố định nitơ rất
yếu. Một đặc tính quan trọng của vi khuẩn nốt sần là tính hữu hiệu của chúng tức là
hoạt tính đồng hóa N2 khi cộng sinh với cây bộ đậu. Sự tồn tại trong thiên nhiên các
nòi vi khuẩn hữu hiệu và vô hiệu đã được phát hiện từ năm 1904 và từ đó đến nay đã
có rất nhiều nghiên cứu được đề cập tới.
Vi khuẩn nốt sần hữu hiệu thường tạo nên những nốt sần lớn và tập trung trên

rễ cái của cây họ đậu. Còn vi khuẩn vô hiệu thì thường tạo nên những nốt sần nhỏ
phân tán trên khắp bộ rễ. Nhiều nghiên cứu cho biết nốt sần tạo nên bởi các vi khuẩn
hữu hiệu thường có màu hồng. Sắc tố hồng thuộc loại hemin. Người ta đã tách được
sắc tố hồng ở dạng tinh khiết từ nốt sần của cây đậu tương và gọi là leghemoglobin.
Sắc tố này thường tồn tại trong không bào của tế bào thực vật chứ không phải tồn tại
trong tế bào vi khuẩn. Ở nhiều loại đậu, trong mỗi gam nốt sần có chứa tới 1,09 3,25mg leghemoglobin. Ở các cây họ đậu một năm khi đã kết thúc quá trình cố định
nitơ, người ta nhận thấy màu hồng của nốt sần chuyển thành màu lục. Rất nhiều
nghiên cứu cho phép khẳng định được rằng leghemoglobin đóng vai trò xúc tác trong
quá trình cố định nitơ phân tử.
2.4.3 Phân loại
Khi theo dõi sự phát triển của vi khuẩn nốt sần trên các môi trường dinh dưỡng
nhân tạo người ta thường chia chúng ra thành hai nhóm:
- Nhóm mọc nhanh, phản ứng axit màu vàng trên môi trường Bromthymol Blue,
có thời gian thế hệ nhỏ hơn 4 giờ, có khuẩn lạc 2 - 4 mm đường kính xuất hiện sau 3 5 ngày (vi khuẩn nốt sần cỏ ba lá, đậu Côve, mục túc…) Nhóm này thuộc chi
Rhizobium.
- Nhóm mọc chậm, phản ứng axit màu xanh trên môi trường Bromthymol Blue,
có thời gian thế hệ lớn hơn 8 giờ, khuẩn lạc không quá 1 mm sau 5 - 7 ngày (vi khuẩn
nốt sần đậu tương lạc, đậu đũa, đậu xanh…). Nhóm này thuộc chi Bradyrhizobium
(Somasegaran và Hoben, 1985).


10

2.5 Quá trình hình thành nốt sần
Vi khuẩn nốt sần thường xâm nhập vào rễ cây bộ đậu thông qua các lông hút,
đôi khi thông qua vết thương ở vỏ rễ. Một loại cây thuộc bộ đậu thường tiết ra chung
quanh rễ của mình những chất có tác dụng kích thích sự phát triển của các vi khuẩn
nốt sần thuộc loại tương ướng với nhóm cây đó. Chẳng hạn khi trộn vi khuẩn nốt sần
cỏ ba lá với vi khuẩn nốt sần mục túc rồi đưa vào bộ rễ của cỏ ba lá, sau ba tuần lễ
người ta lấy đất để kiểm tra và nhận thấy số lượng vi khuẩn nốt sần cỏ ba lá tăng lên

hàng triệu lần trong khi đó vi khuẩn nốt sần cỏ mục túc hầu như không phát triển.
Người ta nhận thấy muốn xâm nhập tốt vào thực vật thì vi khuẩn nốt sần cần
đạt tới mật độ 104 tế bào/g đất. Theo O.N. Allen (1966) thì đối với loại hạt đậu nhỏ
trên mỗi hạt cần nhiễm 500 - 1000 tế bào vi khuẩn nốt sần, còn đối với các loại hạt đậu
lớn thì cần nhiễm khoảng 70.000 tế bào vi khuẩn nốt sần. Khi đó cây đậu sẽ tạo thành
khá nhiều nốt sần và hoạt động cố định nitơ sẽ được tăng lên nhiều.
Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn nốt sần, rễ cây họ đậu sẽ tiết ra enzyme
poligalacturonaza, enzyme này sẽ làm phân hủy thành lông hút và giúp cho vi khuẩn
nốt sần có điều kiện xâm nhập vào rễ. Trong lông hút vi khuẩn nốt sần sẽ hình thành
một cái gọi là dây xâm nhập. Đó là một khối chất nhầy dạng sợi, bên trong chứa đầy
các vi khuẩn hình que ở trạng thái phát triển nhanh chóng. Dây xâm nhập đi dần vào
bên trong rễ với tốc độ khoảng 5-8 µm/s. Sự vận động của dây xâm nhập được thực
hiện dưới áp lực sinh ra do sự phát triển của các vi khuẩn bên trong dây.
Một số dây xâm nhập sẽ tiếp tục phát triển và lọt được vào đến lớp nhu mô. Ở
đây vi khuẩn nốt sần sẽ kích thích các tế bào thực vật bị chúng xâm nhiễm cũng như
các tế bào lân cận. Kết quả làm cho chúng phân chia nhanh chóng thành rất nhiều tế
bào mới. Vi khuẩn sẽ thoát ra khỏi dây xâm nhập và đi vào trong tế bào chất. Ở đó
chúng sẽ lớn lên và phân cắt thành nhiều tế bào mới. Chúng sẽ chuyển sang trạng thái
thể giả khuẩn. Thể giả khuẩn không có khả năng phân cắt nhưng có khả năng tăng kích
thước đến một mức độ nhất định. Trong các nốt sần vô hiệu người ta không thấy các
thể giả khuẩn mà chỉ thấy toàn vi khuẩn hình que. Người ta còn nhận thấy khi màu
hồng của nốt sần hữu hiệu chuyển sang màu lục thì cũng là lúc thể giả khuẩn bị dung


11

giải. Những điều đó cho phép người ta tin rằng việc tạo thành thể giả khuẩn có liên
quan mật thiết đối với quá trình cố định nitơ.
Khi hình thành thể giả khuẩn thì ti thể và lạp thể của tế bào sẽ bị dồn sát vào
thành tế bào và phân bố dọc theo thành. Khi đó trong tế bào sẽ bắt đầu xuất hiện

leghemoglobin và số lượng riboxom cũng đồng thời tăng lên khá nhiều. Ở những nốt
sần trưởng thành, người ta có thể thấy rõ ba vùng sau đây:
a) Vỏ nốt sần: Gồm vài lớp tế bào không bị vi khuẩn xâm nhiễm. Những tế bào
này thường có kích thước nhỏ hơn tế bào vỏ rễ. Sau khi hình thành vỏ nốt sần phần vỏ
rễ sẽ bị nát đi, một ít còn lại sẽ dính vào bên ngoài phần vỏ của nốt sần.
b) Vùng phân cắt mạnh mẽ: Vùng này gồm những tế bào không bị xâm nhiễm,
nằm bên dưới lớp vỏ nốt sần. Từ các tế bào của vùng này về sau sẽ phân hóa và tạo
thành các tế bào vỏ nốt sần, các tế bào chứa vi khuẩn và các tế bào mạch dẫn.
c) Vùng mô bị xâm nhiễm: Trong vùng này các tế bào chứa vi khuẩn nằm xen lẫn
với các tế bào không chứa vi khuẩn. Thể tích của mỗi tế bào chứa vi khuẩn có thể lớn
đến gấp 8 lần so với tế bào không chứa vi khuẩn.
d) Hệ thống mạch dẫn của nốt sần: Khi nốt sần bắt đầu phát triển, một số tế bào
nằm giữa phần vỏ nốt sần và phần mô bị xâm nhiễm sẽ phân hóa và phân cắt thành các
tế bào mạch dẫn của nốt sần. Về sau các mạch dẫn này sẽ liên kết với hệ thống mạch
dẫn của rễ cây. Số bó mạch trong mỗi nốt sần tùy loại cây mà thay đổi trong khoảng 112.
2.6 Vi khuẩn chi Rhizobium
2.6.1 Lịch sử phát triển
Beijerinck ở Holland lần đầu tiên đã phân lập và nuôi cấy một vi sinh vật từ nốt
sần của những cây họ Đậu (năm 1888) và ông ta đã đặt tên cho nó là Bacillus
radicicol. Hiện nay, nó được đặt dưới chi Rhizobium trong khóa phân loại của Bergey
(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology).


12

Loài đầu tiên của chi Rhizobium là R. leguminosarum, đã được nhận diện vào
1889, và tất cả những loài tìm thấy sau này ban đầu đều đưa vào trong chi Rhizobium.
Tuy nhiên, với các phương pháp phân tích hiện đại đã xem xét lại sự phân loại này và
hiện nay đã xếp vào trong nhiều chi khác nhau. Tất cả các nghiên cứu đều thực hiện
trên những cây họ đậu như cỏ ba lá, cỏ đinh lăng, những cây đậu.

2.6.2 Phân loại
Khóa phân loại
Giới:

Bacteria

Ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Alphaproteobacteria

Bộ:

Rhizobiales

Họ:

Rhizobiaceae

Chi:

Rhizobium (Frank 1889)

Một số loài hiện nay: Rhizobium arachis; Rhizobium daejeonense; Rhizobium
etli; Rhizobium galegae; Rhizobium gallicum; Rhizobium giardinii; Rhizobium
hainanense;

Rhizobium

huautlense;

Rhizobium

indigoferae;

Rhizobium

leguminosarum; Rhizobium loessense; Rhizobium lupini; Rhizobium mongolense;
Rhizobium phaseoli; Rhizobium sullae; Rhizobium tropici; Rhizobium undicola;
Rhizobium yangligense; Rhizobium sp.
2.6.3 Đặc điểm
Chi Rhizobium gồm những loài vi khuẩn Gram âm, hô hấp hiếu khí, ưa pH
trung tính hay kiềm không sinh bào tử, chuyển động nhờ nhung mao và tiêm mao, kích
thước 0,5 – 0,9 x 1,2 – 3 µm. Chúng là những vi sinh vật sống trong đất, có khả năng
cộng sinh với cây họ đậu để cố định nitơ của khí quyển thành những hợp chất nitơ mà
cây trồng có thể sử dụng được. Chúng phát triển tốt trên môi trường có chứa đường
pentose như là một nguồn carbon để tăng trưởng, thủy phân được hydrogen peroxide
(H2O2), sinh khí H2S trong điều kiện kỵ khí, không thủy phân được urea, có khả năng


13

oxy hóa đường glucose thành axít pyvuric nhưng không chuyển hóa thành axít hữu cơ
mà thành hợp chất acetone, có khả năng phân giải gelatine.
2.7 Vi khuẩn chi Bradyrhizobium
Phân loại:
Vị trí phân loại

Giới:

Bacteria

Ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Alphaproteobacteria

Bộ:

Rhizobiales

Họ:

Bradyrhizobiaceae

Chi:

Bradyrhizobium (Jordan 1982)

Một số loài trong chi Bradyrhizobium : Bradyrhizobium betae; Bradyrhizobrium
canariense; Bradyrhizobium elkanii; Bradyrhizobium genosp.; Bradyrhizobium
japonicum; Bradyrhizobium liaonigense; Bradyrhizobium lupini; Bradyrhizobium
yuanmingense; Bradyrhizobium pachyrhizi.

14

Chương 3
NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài đã được thực hiện từ ngày 13/02/2012 đến ngày 13/06/2012 nhằm chọn
lọc vi khuẩn nốt sần trên cây đậu xanh.
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu
Việc nghiên cứu đã được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và
Môi trường thuộc Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu thí nghiệm
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Vi khuẩn cố định đạm được phân lập trên rễ cây đậu xanh.
- Giống đậu xanh: APN 208.
3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng
3.2.2.1 Thiết bị và dụng cụ
- Tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp, đĩa petri, pipet, micropipet.
- Máy nước cất, máy lắc, máy trộn vortex, máy ly tâm, cân, kính hiển vi.
- Ống nghiệm, đèn cồn, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại ống đong.
- Que cấy thẳng, que cấy vòng, que cấy trang.


15

3.2.2.2 Hoá chất
- Manitol, K2HPO4, Mg.SO4.H2O, NaCl, cao nấm men, nước cất, Agar.
- Dinh dưỡng cho lan dạng bột màu tím.

- Dung dịch nhuộm rễ: chuẩn bị 0,35 g axit Fuchsin với 25 ml axit acetic và 75 ml
nước cất, hòa vào nhau, được dung dịch Fuchsin. Glycerol được làm chua bằng axit
HCl: chuẩn bị 2 ml HCl hòa vào 300 ml nước cất, sau đó cho 700 ml glycerol vào,
được dung dịch glycerol đã được làm chua bằng axit HCl.
- Nước tẩy Javen.
3.3 Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn cố định đạm.
- Sử dụng bioassay (Thí nghiệm sinh học) phục vụ cho việc chủng invitro các
chủng vi khuẩn trên cây đậu xanh.
- So sánh, đánh giá và chọn lọc các chủng vi khuẩn cố định đạm trên giống đậu
xanh APN 208.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn cố định đạm
3.4.1.1 Mô tả thí nghiệm:
Từ những mẫu nốt sần được lấy trên cây họ đậu ngoài đồng, tiến hành phân lập
bằng cách cấy trang trên môi trường YMA, sau đó chọn những khuẩn lạc có hình dạng
điển hình cấy tăng sinh và chủng trên giống đậu xanh APN 208, chủng vi khuẩn nào
thiết lập mối quan hệ cộng sinh với rễ cây đậu xanh tạo được nốt sần hữu hiệu thì kết
luận chủng vi khuẩn đó là chủng vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với rễ cây đậu xanh
và tiến hành tăng sinh khối chủng invitro các chủng vi khuẩn vừa phân lập được trên
đậu xanh. Thí nghiệm đơn yếu tố, đó là các chủng vi khuẩn cần phân lập. Thí nghiệm
được đặt trong nhà để tránh nước mưa làm ảnh hưởng đến kết quả của thí nghiệm.