NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA 3 GIỐNG CÚC (Chrysanthemum sp.) IN VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TRƯỞNG CỦA 3 GIỐNG CÚC
(Chrysanthemum sp.) IN VITRO

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ TƯỞNG
Ngành: NÔNG HỌC
Niên Khóa: 2008 – 2012

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07/2012


NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH
TRƯỞNG CỦA 3 GIỐNG HOA CÚC
(Chrysanthemum sp.) IN VITRO

Tác giả
Nguyễn Thị Tưởng

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành Nông học

Giáo viên hướng dẫn
ThS. Hồ Tấn Quốc

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07/2012
i


LỜI CẢM ƠN
Để có thể đi hết quãng đường 4 năm đại học và hoàn thành khóa luận này, đó
không chỉ là sự cố gắng của bản thân tôi mà còn có sự dạy dỗ tận tình của thầy cô, sự
giúp đỡ của bạn bè và công ơn nuôi dưỡng của cha mẹ, sự động viên anh chị em trong
gia đình.
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến ThS. Hồ Tấn
Quốc, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và bảo ban em trong suốt thời gian
thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Cảm ơn chị Nguyễn Hoàng Bảo Ngân và các chị ở phòng nuôi cấy mô đã giúp
đỡ em rất nhiều từ lúc còn bỡ ngỡ bước chân vào phòng thí nghiệm cho đến hôm nay.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn ban lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu Giống cây trồng
tỉnh Gia Lai đã tạo điều kiện tốt nhất để giúp đỡ cho tôi thực hiện đề tài này.
Xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Bộ môn Di truyền - Giống cây trồng, các
thầy cô khoa Nông học và trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh đã truyền đạt,
bổ sung kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập, tích lũy tri thức tại trường và
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Cảm ơn tới các bạn phòng 214 KTX đã luôn động viên, giúp đỡ và chia sẻ với tôi
những lúc khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài.
Và lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất con xin gởi đến ba mẹ, các anh chị trong
gia đình: “Cảm ơn mọi người vì đã luôn đồng hành và ủng hộ con để con có thể hoàn
thành tốt khóa luận cũng như đạt được ước mơ của mình”.
Xin chân thành cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07/2012
Sinh viên
Nguyễn Thị Tưởng

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường nuôi cấy mô
đến khả năng sinh trưởng của 3 giống hoa cúc (Chrysanthemum sp.) in vitro”
được tiến hành từ tháng 02 đến tháng 06 năm 2012, tại phòng nuôi cấy mô, Trung tâm
Nghiên cứu giống cây trồng – xã An Phú - Tp. Pleiku – tỉnh Gia Lai. Các thí nghiệm 2
yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, nhằm xác định
nồng độ Hypocloride calcium khử trùng mẫu thích hợp, xác định liều lượng BA thích
hợp cho khả năng nhân nhanh chồi và nồng độ NAA thích hợp cho sự tạo rễ của 3
giống hoa cúc in vitro.
Kết quả đạt được như sau:
- Dung dịch khử trùng thích hợp cho mẫu cấy nụ hoa và thân giống hoa cúc đại
đóa vàng và cúc thọ đỏ là dung dịch Hypocloride calcium 15%, cho giống vàng hòe là
dung dịch Hypocloride Ca18lcium 20%.
- Môi trường MS + 2 mg/l BA là môi trường nhất thích hợp nhất cho nhân chồi
3 giống cúc in vitro thí nghiệm.
- Môi trường MS + 1,5 mg/l NAA cho tỷ lệ cây ra rễ cao, số rễ nhiều, rễ phân
nhánh mạnh co nhiều lông hút, thích hợp nhất cho việc ra cây ngoài vườn ươm đối với
2 giống cúc đại đóa vàng và vàng hòe. Môi trường MS + 0,5 mg/l thích hợp cho ra rễ
giống cúc thọ đỏ.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa..........................................................................................................................i
Lời cảm ơn..................................................................................................................... ii

Tóm tắt. ........................................................................................................................ iii
Mục lục ........................................................................................................................ iv
Danh sách các từ viết tắt.............................................................................................. vii
Danh sách các bảng .................................................................................................... viii
Danh sách các hình ....................................................................................................... ix
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................2
1.3 Yêu cầu .....................................................................................................................2
1.4 Giới hạn đề tài ..........................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái niệm nuôi cấy mô, cơ sở khoa học và ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật ....3
2.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................................4
2.2.1 Lịch sử phát triển trên thế giới ..............................................................................4
2.2.2 Lịch sử phát triển ở Việt Nam ...............................................................................6
2.3 Các phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật...............................................................7
2.3.1 Nuôi cấy bằng đỉnh sinh trưởng ............................................................................7
2.3.2 Nuôi cấy bằng chồi bất định..................................................................................7
2.3.3 Nuôi cấy protoplast................................................................................................8
2.3.4 Nuôi cấy bằng chồi nách .......................................................................................8
2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro.........................................................8
2.4.1 Mẫu cấy .................................................................................................................8
2.4.2 Môi trường nuôi cấy ..............................................................................................9
2.4.3 Điều kiện nuôi cấy.................................................................................................9
2.4.3.1 Ánh sáng .............................................................................................................9
2.4.3.2 Nhiệt độ ..............................................................................................................9
iv


2.5 Những tồn tại thường gặp trong nhân giống in vitro................................................9

2.5.1 Tính bất định về mặt di truyền ..............................................................................9
2.5.2 Sự nhiễm mẫu ......................................................................................................10
2.5.3 Sự hóa nâu ...........................................................................................................10
2.5.4 Hiện tượng thủy tinh thể......................................................................................10
2.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô....................................11
2.6.1 Các Auxin ............................................................................................................11
2.6.2 Cytokinin .............................................................................................................12
2.7 Tình hình sản xuất hoa kiểng ở Việt Nam và trên thế giới ....................................13
2.7.1 Sản xuất hoa kiểng trên thế giới ..........................................................................13
2.7.2 Sản xuất và tiêu thụ hoa cây cảnh ở Việt Nam và khu vực Đông Nam Á ..........13
2.8 Giới thiệu về cây hoa cúc .......................................................................................14
2.8.1 Vị trí phân loại.....................................................................................................14
2.8.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cúc ..............................................................14
2.8.2.1 Rễ......................................................................................................................14
2.8.2.2 Thân ..................................................................................................................15
2.8.2.3 Lá ......................................................................................................................15
2.8.2.4 Hoa và quả ........................................................................................................15
2.8.3 Một số phương pháp nhân giống cây hoa cúc .....................................................16
2.8.3.1 Giâm cành.........................................................................................................16
2.8.3.2 Tách giá mầm ...................................................................................................16
2.8.3.3 Nuôi cấy tế bào .................................................................................................16
2.8.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây hoa cúc .........................................................16
2.8.4.1 Thế giới.............................................................................................................16
2.8.4.2 Việt Nam...........................................................................................................17
2.9 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô cây hoa cúc........................................18
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm...........................................................................20
3.2 Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................20
3.2.1 Giống ...................................................................................................................20
3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ.....................................................................................20

v


3.2.2.1 Phòng pha chế môi trường................................................................................20
3.2.2.2 Phòng cấy .........................................................................................................20
3.2.2.3 Phòng nuôi cây .................................................................................................21
3.2.3 Môi trường nuôi cấy ............................................................................................21
3.3 Điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm ...........................................................22
3.4 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................22
3.4.1 Thí nghiệm 1........................................................................................................22
3.4.2 Thí nghiệm 2........................................................................................................23
3.4.3 Thí nghiệm 3........................................................................................................24
3.5 Phương pháp tính toán xử lý số liệu.......................................................................25
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Xác định nồng độ Hypocloride calcium khử trùng thích hợp cho khả năng
vào mẫu hoa và thân của 3 giống cúc.....................................................................26
4.2 Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh chồi của 3 giống cúc in vitro ........28
4.3 Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của 3 giống cúc in vitro ..........35
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận...................................................................................................................44
5.2 Đề nghị ...................................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................45
PHỤ LỤC .... ................................................................................................................47

vi


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt

Viết đầy đủ (nghĩa)

ANOVA

Analysis of Variance

BA

Benzyl adenine

BAP

6- Benzyl aminopurin

C

Nồng độ

Ctv

Cộng tác viên

CV

Coefficient of Variance (Hệ số biến động)

2,4D

2,4 – Dichlorophenoxyacetic acid

Đ/C

Đối chứng

ĐV

Đóa vàng

HC

Hypocloride Calcium

HSN

Hệ số nhân

IAA

3 – Indolylacetic acid

IBA

3 – Indolebutyric acid

LLL

Lần lặp lại

MS

Murashige and Skoog, 1962

MT

Môi trường

MTN

Môi trường nền

NAA

1 – Naphthalene acetic acid

NSC

Ngày sau cấy

NT

Nghiệm thức

TĐ

Thọ đỏ

VH

Vàng hòe

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ Hypocloride Calcium đến tỷ lệ mẫu chết,
nhiễm, sống (%) của 3 giống cúc ở 10NSC.................................................26
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của BA đến thời gian hình thành chồi 3 giống cúc invitro........39
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA đến tỷ lệ đâm chồi 3 giống cúc invitro.........................30
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của BA đến chiều cao chồi 3 giống cúc invitro ở 40 NSC........31
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân chồi của 3 giống cúc invitro ................33
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của NAA đến thời gian hình thành rễ 3 giống cúc invitro ........36
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của NAA đến số rễ 3 giống cúc invitro .....................................37
Bảng 4.8 Ảnh hưởng của NAA đến tỷ lệ ra rễ 3 giống cúc invitro .............................38
Bảng 4.9 Ảnh hưởng của NAA đến chiều cao cây 3 giống cúc invitro ở 30 NSC......40
Bảng 4.10 Ảnh hưởng của NAA đến chiều dài rễ 3 giống cúc invitro ở 30 NSC .......41
Bảng 4.11 Ảnh hưởng của NAA đến hình thái rễ 3 giống cúc invitro ở 30 NSC .......42

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 3.1 Dạng hoa 3 giống cúc thí nghiệm .................................................................20
Hình 4.1 Ảnh hưởng nồng độ BA đến sự hình thành chồi 3 giống cúc
in vitro ở 40 NSC..................... ....................................................................35
Hình 4.2 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của 3 giống cúc
in vitro ở 30 NSC ................... ....................................................................43
4.2 Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh chồi của 3 giống cúc in vitro
4.3 Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của 3 giống cúc in vitro

28 ..................................... vi
35........................................ vi

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................................................. vi
5.1 Kết luận

44............................................................................................................................................. vi

5.2 Đề nghị

44............................................................................................................................................. vi

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ Hypocloride Calcium đến tỷ lệ mẫu chết,................................................. viii
nhiễm, sống (%) của 3 giống cúc ở 10NSC

26 ............................................................................................ viii

Chương 1 ........................................................................................................................1
MỞ ĐẦU.........................................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................................................... 2
1.3 Yêu cầu ........................................................................................................................................................ 2

1.4 Giới hạn đề tài..........................................................................................................2
Chương 2 ........................................................................................................................3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................................3
2.1 Khái niệm nuôi cấy mô, cơ sở khoa học và ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật ..................................... 3
2.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................................................................................... 4

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), có thể khái quát lịch sử nuôi
cấy mô như sau: ...............................................................................................................4
2.2.1 Lịch sử phát triển trên thế giới ......................................................................................................... 4

Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwa đưa ra thuyết tế bào và
nêu rõ rằng mọi cơ thể sinh vật dù phức tạp đến đâu cũng đều được tạo nên bởi sự kết
hợp của rất nhiều đơn vị rất nhỏ, là các tế bào. Các tế bào đã phân hóa đều mang thông
tin di truyền hệt như trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, đây là những

ix


đơn vị độc lập, có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể từ những thông tin di truyền mà nó
đã mang............................................................................................................................4
Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên thực hiện việc nuôi cấy tế bào thực vật và ông
nhận thấy có sự ảnh hưởng của các khoáng chất và điều kiện môi trường, ông cho rằng
người ta có khả năng tạo thành các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng nhưng ông
đã gặp thất bại khi cố gắng nuôi cấy các tế bào đã chuyển hóa được tách từ một số cây
một lá mầm như Erythronium, Ornithogalum, Tradescantia. Ngày nay, người ta đã biết
lý do thất bại trên là do ông nuôi cấy các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh (cây một
lá mầm là đối tượng khó nuôi cấy in vitro). ....................................................................4
Năm 1934, White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua trong môi trường chứa muối
khoáng, glucose và dịch chiết nấm men trong một thời gian dài. Sau đó một thòi gian,
ông sử dụng hỗn hợp ba loại vitamin thuộc nhóm B: B1 (thiamine), B6 (pyridoxine) và
acid nicotinic để thay thế cho dịch chiết nấm men và ông cho là hoàn toàn phù hợp. Từ
đó, việc nuôi đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau. .4
Cũng trong khoảng thời gian này, sau khi Went và Thimann phát hiện ra chất điều hòa
sinh trưởng thực vật đầu tiên: acid β – indolacetic (IAA) và thu nhận được chất này thì
Gautheret ở Pháp đã tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy tượng tầng của một số loài cây
thân gỗ. Ông xác định rằng IAA và nhóm vitamin nói trên (do White đề nghị) có khả

năng kích thích mô sẹo tăng trưởng. ...............................................................................4
Năm 1939, Nobécourt và Gautheret đã thành công trong việc duy trì sinh trưởng của
mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường có agar (môi trường đặc) trong thời
gian vô hạn bằng cách cấy chuyền đều đặn sáu tuần một lần. ........................................5
Năm 1941, Overbeek chứng minh tác dụng sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy
phôi ở cây họ cà (Datura). ...............................................................................................5
Năm 1948, Steward xác định tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trên mô
sẹo cà rốt. Trong thời gian này, người ta đã nghiên cứu và tổng hợp thành công nhiều
chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhân tạo thuộc nhóm auxin như A- naphthylacetic
acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D). Nhiều nhà nghiên cứu nhận
thấy khi phối hợp 2,4-D và NAA cùng với nước dừa sẽ giúp cho sự tạo mô sẹo, cảm
ứng được sự phân chia tế bào ở nhiều đối tượng mà trước đó rất khó nuôi cấy. ............5

x


Năm 1954, Skoog ở Mỹ tình cờ nhận thấy nếu bổ sung thêm một ít chế phẩm đã để lâu
của acid deoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các
mô thân cây thuốc lá thì các mảnh mô này được kích thích tăng trưởng rõ rệt. .............5
Năm 1955, chất này được xác định là chất 6-furfury laminopurine và được Skoog đặt
tên la kinetin do tác dụng kích thích sự phân bào. Sau này người ta chứng minh được
rằng trong tự nhiên sự phân chia tế bào ở thực vật nguyên vẹn cũng do các chất hóa
học tương tự như kinetin điều khiển và xếp chung các chất này vào nhóm có tên gọi là
cytokinin. Chất cytokinin lần đầu tiên được trích ra từ thực vật bậc cao là zeatin (trích
từ mầm ngô).....................................................................................................................5
Việc phát hiện ra vai trò của IAA, NAA, 2,4-D và Kinetin cùng với các vitamin và
nước dừa có ý nghĩa rất quan trọng trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật có thành phần
hóa học được xác định rõ ràng và ổn định làm cơ sở cho các bước phát triển tiếp theo
của lãnh vực khoa học này . ............................................................................................5
Năm 1957, Skoog và Miller ghi nhận được sự hình thành cơ quan từ mô sẹo thuốc lá

chịu sự ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy. Sự tạo rễ từ mô
sẹo sẽ xảy ra khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, còn sự tạo chồi tăng khi tỷ lệ này tăng.
.........................................................................................................................................5
Năm 1954 đến năm 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào sống độc lập
không dính các tế bào khác đã được phát triển. Muir, Hilderbrandt và Riker đã tách
thành công các tế bào của mô sẹo thành huyền phù các tế bào đơn bằng cách lắc trên
máy lắc.............................................................................................................................6
Năm 1960, Bergman cho rằng ông có thể thu được một huyền phù tế bào hầu như chỉ
gồm các tế bào đơn mà không có các tế bào không kết cụm bằng phương pháp lọc đơn
giản. Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường đặc trong các hộp petri có thể tiếp tục
sống, phân chia và tái tạo lại mô sẹo. Cùng vói kỹ thuật gieo tế bào của Bergman,
nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ một tế bào,
chứng minh được tính toàn năng của tế bào thực vật......................................................6
Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật trong các bình lên men dùng trong công nghiệp vi
sinh vật và khả năng tái tạo lại cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn đã mở ra những triển
vọng mới trong việc tạo các dòng tế bào siêu sản xuất một sản phẩm thứ cấp nào đó
phục vụ cho đời sống con người......................................................................................6
xi


Cooking công bố có thể dùng enzyme cellulase để phân hủy vách cellulose của tế bào
thực vật và kết quả là thu các vách tế bào không có vách mà chỉ có màng nguyên sinh
chất bao quanh, được gọi là tế bào trần. Tuy nhiên, người ta chỉ thực sự chú ý đến triển
vọng của tế bào trần vào đầu những năm 1970, khi các tác giả Nhật Nagata và Takebe
thành công trong việc kích thích các tế bào trần tách ra từ mô thuốc lá tái tạo lại thành
cellulose. ..........................................................................................................................6
Chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ 4 của nuôi cấy mô thực vật. Đây là
giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống,
nhân giống sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học vào nghiên cứu lý luận di
truyền thực vật bậc cao....................................................................................................6

2.2.2 Lịch sử phát triển ở Việt Nam........................................................................................................... 6
2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................................................................................... 7
2.3.1 Nuôi cấy bằng đỉnh sinh trưởng........................................................................................................ 7
2.3.2 Nuôi cấy chồi bất định ....................................................................................................................... 7
2.3.3 Nuôi cấy protoplast ............................................................................................................................ 8
2.3.4 Nuôi cấy bằng chồi nách .................................................................................................................... 8
2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro.......................................................................................... 8
Theo Dương Công Kiên (2002), trong nhân giống in vitro các yếu tố ảnh hưởng bao gồm: ............................ 8
2.4.1 Mẫu cấy............................................................................................................................................... 8
2.4.2 Môi trường nuôi cấy........................................................................................................................... 9
2.4.3 Điều kiện nuôi cấy .............................................................................................................................. 9
2.4.3.1 Ánh sáng ..................................................................................................................................... 9
2.4.3.2 Nhiệt độ ....................................................................................................................................... 9
2.5 Những tồn tại thường gặp trong nhân giống in vitro ................................................................................ 9
2.5.1 Tính bất định về mặt di truyền ......................................................................................................... 9
2.5.2 Sự nhiễm mẫu.................................................................................................................................. 10
2.5.3 Sự hóa nâu ....................................................................................................................................... 10
2.5.4 Hiện tượng thủy tinh thể................................................................................................................. 10
2.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô .................................................................... 11
2.6.1 Các Auxin.......................................................................................................................................... 11
2.6.2 Cytokinin........................................................................................................................................... 12
2.7 Tình hình sản xuất hoa kiểng ở Việt Nam và trên thế giới ..................................................................... 13
2.7.1 Sản xuất hoa kiểng trên thế giới...................................................................................................... 13
2.7.2 Sản xuất và tiêu thụ hoa cây cảnh ở Việt Nam và khu vực Đông Nam Á ................................... 13
2.8 Giới thiệu về cây hoa cúc .......................................................................................................................... 14
Theo Nguyễn Xuân Linh và Nguyễn Thị Kim Lý (2005), cây hoa cúc có một số đặc điểm như sau: ............... 14
2.8.1 Vị trí phân loại.................................................................................................................................. 14
2.8.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cúc .......................................................................................... 14
2.8.2.1 Rễ............................................................................................................................................... 14
2.8.2.2 Thân .......................................................................................................................................... 15

2.8.2.3 Lá............................................................................................................................................... 15
2.8.2.4 Hoa và quả ................................................................................................................................ 15
2.8.3 Một số phương pháp nhân giống hoa cúc....................................................................................... 16
2.8.3.1 Giâm cành................................................................................................................................. 16
2.8.3.2 Tách mầm giá ........................................................................................................................... 16
2.8.3.3 Nuôi cấy tế bào ......................................................................................................................... 16

xii


2.8.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa cúc .......................................................................................... 16
2.8.4.1 Thế giới ..................................................................................................................................... 16
2.8.4.2 Việt Nam ................................................................................................................................... 17
2.9 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô hoa cúc ......................................................................... 18

Chương 3 ......................................................................................................................20
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM....................................................20
3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm ............................................................................................................. 20
3.2 Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................................................... 20
3.2.1 Giống ................................................................................................................................................. 20

Thu thập từ những cây hoa cúc khỏe và không bị sâu bệnh tại Tp. Pleiku – tỉnh Gia Lai
để vào mẫu.....................................................................................................................20
Sử dụng 3 giống hoa cúc in vitro để nhân nhanh chồi và tạo rễ. ..................................20

...........20
Đóa vàng (ĐV)

Thọ đỏ (TĐ)

Vàng hòe (VH).................................................20

(Nguồn: Nguyễn Hoàng Bảo Ngân, 2012 – TT NCGCT tỉnh Gia Lai) .........................20
3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ ................................................................................................................ 20
3.2.2.1 Phòng pha chế môi trường ...................................................................................................... 20

Đây là phòng chuẩn bị môi trường nuôi cấy và dụng cụ cấy. Gồm: máy đo pH, tủ lạnh,
tủ sấy, cân điện tử, bếp ga, nồi nấu và các loại cốc thủy tinh .......................................20
3.2.2.2 Phòng cấy.................................................................................................................................. 20

Gồm các thiết bị: đèn cồn, tủ cấy vô trùng, cồn 90%, cồn 70%, dụng cụ cấy (dao, panh
kẹp, kéo…), bông gòn. ..................................................................................................20
3.2.2.3 Phòng nuôi cây ......................................................................................................................... 21

Gồm các thiết bị: các kệ để bịch thí nghiệm, đèn chiếu sáng, máy điều hòa, nhiệt kế, xe
đẩy di chuyển bịch đến kệ nuôi cây...............................................................................21
3.2.3 Môi trường nuôi cấy......................................................................................................................... 21

Môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) gồm các thành phần sau:...........21
Thành phần

Dạng sử dụng

Khoáng đa lượng
KNO3

NH4 NO3

Nồng độ (mg/l)...................................................21
1650 ........................................................................21

1900.............................................................................................................21

CaCl2.2H2O

440 ......................................................................................................21
xiii


MgSO4.7H2O
KH2PO4

370 ..................................................................................................21
170...........................................................................................................21

Khoáng vi lượng
ZnSO4.H2O
H3BO3
KI

MnSO4.H2O 23,3.......................................................................21

8,6 .......................................................................................................21
6,2 ..............................................................................................................21

0,83 ...................................................................................................................21

Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O

0,25 .............................................................................................21
0,025 ...............................................................................................21

CoCl2.6H2O

0,025 ...................................................................................................21

Sắt EDTA

Na2EDTA

FeSO4.7H2O
Vitamin

37,3 ................................................................................21

27,8 .................................................................................................21
Thiamine – HCl (B1) 0,1......................................................................21

Nicotinic Acid (B5)
Pyridoxine – HCl (B6)
Glycine
Myo – Inositol

0,5 ............................................................................................21
0,5.........................................................................................21

2 .............................................................................................................21
100 ..................................................................................................21

*Môi trường được hấp khử trùng bằng Autoclave ở áp suất 1atm, nhiệt độ 121oC trong
30 phút. ..........................................................................................................................21
*Điều chỉnh pH của môi trường nuôi cấy trước khi hấp ở 5,7 – 5,8.............................22
3.3 Điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm............................................................................................. 22

- Cường độ ánh sáng: 2500 – 3000 lux .........................................................................22
- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 26 ± 2 oC ............................................................................22
- Ẩm độ phòng nuôi cấy: 60 – 80 %..............................................................................22
- Thời gian chiếu sáng: 8 giờ/ngày ................................................................................22
3.4 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................................................... 22

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ BA ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh chồi
của 3 giống hoa cúc .......................................................................................................23
Mẫu cấy: là mẫu thân của 3 giống hoa cúc in vitro......................................................24
Phương pháp và chỉ tiêu theo dõi...............................................................................24
Theo dõi khả năng hình thành chồi mới của các nghiệm thức sau khi cấy, 10 ngày theo
dõi 1 lần .........................................................................................................................24
xiv


+ Thời gian hình thành chồi (ngày): được tính từ khi cấy đến khi có trên 50 % số mẫu
bật chồi ..........................................................................................................................24
+ Tỷ lệ hình thành chồi (%) = (số mẫu tạo chồi/tổng số mẫu cấy) x 100 .....................24
+ Chiều cao chồi (đo lần cuối): đo từ gốc đến đỉnh đọt của chồi cao nhất ...................24
+ Hệ số nhân chồi = tổng số chồi hình thành/tổng số mẫu ban đầu..............................24
3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của 3
giống hoa cúc in vitro ....................................................................................................24
Bố trí thí nghiệm ..........................................................................................................24
Môi trường nuôi cấy: MS + 30 g/l đường + 8 g/l agar + 0,3 g/l than hoạt tính + bổ
sung nồng độ NAA khác nhau theo từng nghiệm thức. ................................................25

Mẫu cấy: là mẫu ngọn của 3 giống hoa cúc in vitro ....................................................25
Phương pháp và chỉ tiêu theo dõi...............................................................................25
Theo dõi khả năng tạo rễ của các nghiệm thức sau khi cấy, 10 ngày theo dõi 1 lần ....25
3.5. Xử lý số liệu .............................................................................................................................................. 25

Chương 4 ......................................................................................................................26
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................................26
4.1 Xác định nồng độ Hypocloride calcium khử trùng thích hợp cho khả năng vào mẫu hoa và thân 3
giống cúc.......................................................................................................................................................... 26
4.2 Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh chồi của 3 giống cúc in vitro ....................................... 28

Chương 5 ......................................................................................................................44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................44
5.1 Kết luận...................................................................................................................................................... 44

PHỤ LỤC .....................................................................................................................47

xv


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Mỗi dịp lễ, tết là bao loài hoa đua nhau khoe sắc rực rỡ. Trong đó không thể
thiếu sự góp mặt của hoa cúc. Cúc là loài hoa được ưa chuộng và trồng khắp nơi trên
thế giới nhờ đặc tính sắc hoa tươi thắm, lâu tàn. Ngày nay, hoa cúc không những đa
dạng về chủng loại, màu sắc mà còn đa dạng về hình thái, kích thước. Hoa cúc hiện
nay có hơn 54 giống, phổ biến và được ưa chuộng như cúc đại đóa, kim cương,
pingpong vàng, farm tím, farm hồng, cúc nút, pha lê, tia muỗng...

Nhu cầu về hoa cúc vì thế mà càng tăng cao, song hầu hết các giống cúc đều
được nhân giống bằng cách truyền thống là để lại cây mẹ từ vụ này sang vụ khác. Điều
này dẫn đến giống hoa ngày càng bị thoái hóa khiến năng suất và phẩm chất hoa càng
giảm sút.
Với sự phát triển ngày càng lớn mạnh của công nghệ tế bào và hàng loạt các
nghiên cứu về phương pháp nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đã mang lại
hướng đi mới cho công tác nhân giống cây trồng. Điều đặc biệt mà phương pháp nhân
giống này mang lại là hệ số nhân giống cao từ một bộ phận hoặc bất kì cơ quan nào
của hoa cúc có thể cho ra hàng trăm cây sau các lần cấy chuyền. Các cây được tạo ra
tương đối đồng nhất và sạch bệnh. Điều này đã mang lại hướng đi mới có cho công tác
nhân giống hoa cúc.
Một trong những yếu tố quan trọng quyết định tới sự thành công của nuôi cấy
mô là yếu tố môi trường nuôi cấy. Đối với từng loại giống khác nhau thì môi trường
nuôi cấy cũng có sự khác nhau. Vấn đề đặt ra là phải tìm ra được môi trường thích hợp
nhất cho từng loại giống, loại cây dựa trên môi trường cơ bản MS.
Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường nuôi cấy
mô đến khả năng sinh trưởng của 3 giống hoa cúc (Chrysanthemum sp.) in vitro”
được thực hiện.

1


1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Xác định nồng độ Hypocloride Calcium khử trùng thích hợp cho khả năng đưa
mẫu vào trong bịch cấy của 3 giống cúc.
Xác định nồng độ BA thích hợp cho quá trình nhân chồi của 3 giống cúc in vitro
trong bịch cấy.
Xác định được nồng độ NAA thích hợp cho quá trình ra rễ của 3 giống cúc in
vitro trong bịch cấy.
1.3 Yêu cầu

Đưa được mẫu của 3 giống cúc vào trong bịch cấy
Tạo được chồi và rễ cho 3 giống cúc trong bịch cấy.
Theo dõi tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu sống bật chồi.
Theo dõi khả năng tái sinh chồi và sự sinh trưởng, phát triển của chồi qua các chỉ
tiêu là thời gian hình thành chồi, tỷ lệ đâm chồi, chiều cao chồi và hệ số nhân chồi.
Theo dõi khả năng tạo rễ qua các chỉ tiêu thời gian hình thành rễ, tỷ lệ ra rễ, số
rễ, chiều cao cây và chiều dài rễ.
1.4 Giới hạn đề tài
Đề tài chỉ thực hiện trong thời gian từ tháng 2 đến tháng 6 nên không thể thực
hiện các thí nghiệm nhiều lần để có kết quả chính xác hơn.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái niệm nuôi cấy mô, cơ sở khoa học và ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật
Khái niệm nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (gọi tắt là nuôi cấy mô) là thuật ngữ chung cho tất
cả các loại nuôi cấy các nguyên liệu (tế bào, mô, phôi) thực vật trên môi trường dinh
dưỡng nhân tạo trong ống nghiệm để tạo ra cây hoàn chỉnh.
Nuôi cấy mô là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng
dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy cây sinh
sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Tạo ra hàng loạt cá thể
đồng đều, giữ nguyên tính trạng di trạng di truyền của cá thể mẹ.
Cơ sở khoa học
- Do tế bào có tính toàn năng: Haberlandt (1902) đã đề cập đến tính toàn năng
của tế bào. Ông cho rằng, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể đa bào nào đều có khả năng phát
triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm hiện đại: mỗi tế bào hoàn chỉnh đều

mang toàn bộ thông tin di truyền của cả cá thể đó là tính toàn năng của tế bào.
- Do sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào, tức là từ tế bào ban đầu có thể
tạo thành các tế bào chuyên hóa và chuyên biệt. Các tế bào chuyên biệt ở các bộ phận
thực vật lại có khả năng như một tế bào ban đầu. Quá trình đó được gọi là sự phân hóa
và phản phân hóa của tế bào.
Ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Ứng dụng nhân giống trong ống nghiệm bằng kĩ thuật nuôi cấy tế bào, mô và cơ
quan thực vật tạo ra một lượng cây con lớn trong thời gian ngắn với kiểu di truyền của
cây mẹ ban đầu được giữ nguyên.
Với kỹ thuật này sẽ tạo được cây con sạch bệnh và kháng bệnh: ví dụ như kỹ
thuật chọn dòng tế bào biến dị soma trong nuôi cấy in vitro để tạo ra giống mới chống
chịu bệnh virus, vi khuẩn…hay chịu được điều kiện canh tác khắc nghiệt như ngập
mặn, hạn hán…

3


Sản xuất cây đơn bội để phục tráng giống cây đã bị thoái hóa sau thời gian canh
tác dài.
Lai xa để tạo ra những giống cây trồng mới (trích dẫn theo Nguyễn Thị Thu Hiền,
2011).
2.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), có thể khái quát lịch sử
nuôi cấy mô như sau:
2.2.1 Lịch sử phát triển trên thế giới
Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwa đưa ra thuyết tế bào
và nêu rõ rằng mọi cơ thể sinh vật dù phức tạp đến đâu cũng đều được tạo nên bởi sự
kết hợp của rất nhiều đơn vị rất nhỏ, là các tế bào. Các tế bào đã phân hóa đều mang
thông tin di truyền hệt như trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, đây là
những đơn vị độc lập, có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể từ những thông tin di truyền

mà nó đã mang.
Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên thực hiện việc nuôi cấy tế bào thực vật
và ông nhận thấy có sự ảnh hưởng của các khoáng chất và điều kiện môi trường, ông
cho rằng người ta có khả năng tạo thành các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng
nhưng ông đã gặp thất bại khi cố gắng nuôi cấy các tế bào đã chuyển hóa được tách từ
một số cây một lá mầm như Erythronium, Ornithogalum, Tradescantia. Ngày nay,
người ta đã biết lý do thất bại trên là do ông nuôi cấy các tế bào đã mất hết khả năng
tái sinh (cây một lá mầm là đối tượng khó nuôi cấy in vitro).
Năm 1934, White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua trong môi trường chứa
muối khoáng, glucose và dịch chiết nấm men trong một thời gian dài. Sau đó một thòi
gian, ông sử dụng hỗn hợp ba loại vitamin thuộc nhóm B: B1 (thiamine), B6
(pyridoxine) và acid nicotinic để thay thế cho dịch chiết nấm men và ông cho là hoàn
toàn phù hợp. Từ đó, việc nuôi đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều
cây khác nhau.
Cũng trong khoảng thời gian này, sau khi Went và Thimann phát hiện ra chất
điều hòa sinh trưởng thực vật đầu tiên: acid β – indolacetic (IAA) và thu nhận được
chất này thì Gautheret ở Pháp đã tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy tượng tầng của một

4


số loài cây thân gỗ. Ông xác định rằng IAA và nhóm vitamin nói trên (do White đề
nghị) có khả năng kích thích mô sẹo tăng trưởng.
Năm 1939, Nobécourt và Gautheret đã thành công trong việc duy trì sinh trưởng
của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường có agar (môi trường đặc) trong thời
gian vô hạn bằng cách cấy chuyền đều đặn sáu tuần một lần.
Năm 1941, Overbeek chứng minh tác dụng sinh trưởng của nước dừa trong nuôi
cấy phôi ở cây họ cà (Datura).
Năm 1948, Steward xác định tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trên
mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này, người ta đã nghiên cứu và tổng hợp thành công

nhiều chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhân tạo thuộc nhóm auxin như Anaphthylacetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D). Nhiều nhà
nghiên cứu nhận thấy khi phối hợp 2,4-D và NAA cùng với nước dừa sẽ giúp cho sự
tạo mô sẹo, cảm ứng được sự phân chia tế bào ở nhiều đối tượng mà trước đó rất khó
nuôi cấy.
Năm 1954, Skoog ở Mỹ tình cờ nhận thấy nếu bổ sung thêm một ít chế phẩm đã
để lâu của acid deoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi
cấy các mô thân cây thuốc lá thì các mảnh mô này được kích thích tăng trưởng rõ rệt.
Năm 1955, chất này được xác định là chất 6-furfury laminopurine và được Skoog
đặt tên la kinetin do tác dụng kích thích sự phân bào. Sau này người ta chứng minh
được rằng trong tự nhiên sự phân chia tế bào ở thực vật nguyên vẹn cũng do các chất
hóa học tương tự như kinetin điều khiển và xếp chung các chất này vào nhóm có tên
gọi là cytokinin. Chất cytokinin lần đầu tiên được trích ra từ thực vật bậc cao là zeatin
(trích từ mầm ngô).
Việc phát hiện ra vai trò của IAA, NAA, 2,4-D và Kinetin cùng với các vitamin
và nước dừa có ý nghĩa rất quan trọng trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật có thành
phần hóa học được xác định rõ ràng và ổn định làm cơ sở cho các bước phát triển tiếp
theo của lãnh vực khoa học này .
Năm 1957, Skoog và Miller ghi nhận được sự hình thành cơ quan từ mô sẹo
thuốc lá chịu sự ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy. Sự tạo rễ
từ mô sẹo sẽ xảy ra khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, còn sự tạo chồi tăng khi tỷ lệ này
tăng.
5


Năm 1954 đến năm 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào sống
độc lập không dính các tế bào khác đã được phát triển. Muir, Hilderbrandt và Riker đã
tách thành công các tế bào của mô sẹo thành huyền phù các tế bào đơn bằng cách lắc
trên máy lắc.
Năm 1960, Bergman cho rằng ông có thể thu được một huyền phù tế bào hầu như
chỉ gồm các tế bào đơn mà không có các tế bào không kết cụm bằng phương pháp lọc

đơn giản. Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường đặc trong các hộp petri có thể
tiếp tục sống, phân chia và tái tạo lại mô sẹo. Cùng vói kỹ thuật gieo tế bào của
Bergman, nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ một tế
bào, chứng minh được tính toàn năng của tế bào thực vật.
Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật trong các bình lên men dùng trong công
nghiệp vi sinh vật và khả năng tái tạo lại cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn đã mở ra những
triển vọng mới trong việc tạo các dòng tế bào siêu sản xuất một sản phẩm thứ cấp nào
đó phục vụ cho đời sống con người.
Cooking công bố có thể dùng enzyme cellulase để phân hủy vách cellulose của tế
bào thực vật và kết quả là thu các vách tế bào không có vách mà chỉ có màng nguyên
sinh chất bao quanh, được gọi là tế bào trần. Tuy nhiên, người ta chỉ thực sự chú ý đến
triển vọng của tế bào trần vào đầu những năm 1970, khi các tác giả Nhật Nagata và
Takebe thành công trong việc kích thích các tế bào trần tách ra từ mô thuốc lá tái tạo
lại thành cellulose.
1980 - 1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật
đã được công bố.
Chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ 4 của nuôi cấy mô thực vật. Đây
là giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống,
nhân giống sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học vào nghiên cứu lý luận di
truyền thực vật bậc cao.
2.2.2 Lịch sử phát triển ở Việt Nam
Việt Nam bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật từ năm 1975. Phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh học, Viện Khoa học Việt
Nam (nay là Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Nhận thấy được triển vọng to
lớn của ngành khoa học này trong việc chọn giống và nhân giống nên các cơ sở thuộc
6


trung tâm nghiên cứu Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia Hà Nội, Thành Phố
Hồ Chí Minh, một số đơn vị nghiên cứu thuộc Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông

Thôn, Bộ Lâm Nghiệp, Bộ Y Tế, Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân đã xây dựng các phòng
nuôi cấy mô thực vật, từng bước xây dựng tiềm lực khoa học cho ngành này.
Viện Khoa học Việt Nam ở Hà Nội đã thí nghiệm nhân giống vô tính in vitro các
cây khoai tây, cà, lúa, thuốc lá từ năm 1974-1975. Cho đến nay, ở đây cũng đã nhân
nhiều giống cây trồng như mía, ngô, dứa sợi, lúa, thuốc lá, …có khả năng chống chịu
để phục vụ cho việc trồng trọt ở địa bàn miền Bắc. Ở Đại học Nông nghiệp I, viện Di
truyền Nông nghiệp Trung ương, cũng bằng nhân giống vô tính và kĩ thuật dung hợp
protoplast tạo ra nhiều giống cây trồng phục vụ cho sản xuất nông nghiệp.
Ở Việt Nam, còn có trung tâm Thực nghiệm Sinh học tại thành phố Hồ Chí Minh
(1979-1980) cũng đã nhân giống vô tính in vitro giống khoai tây để phục vụ cho các
hợp tác xã sản xuất ở thành phố Đà Lạt.
Theo Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở
Việt Nam đã đạt được một số thành tựu như sau:
Nhân giống vô tính cây khoai tây (Solanum tuberosum L.), cây cỏ ngọt (họ
Compositae), chuối (Musa spp.), cây Kiwi (Actinidia chinensis Planch), cây bắt ruồi
(Nepenthes madagascariens), dứa Cayen và Queen Long An, cây mía đường
(Saccharum offcinarum), cây Vani (Vanilla sp.).
2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3.1 Nuôi cấy bằng đỉnh sinh trưởng
Một trong những phương thức để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào và
mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). Sự
thành công trong việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phụ thuộc vào mẫu cấy sử dụng và
việc áp dụng kích thích tố riêng biệt. Thông thường kích thước mẫu cấy là 0,5 – 2 mm,
phù hợp cho nhân giống. Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo
một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh.
2.3.2 Nuôi cấy chồi bất định
Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián
tiếp từ mô callus, mà mô callus này được hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật.
Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô nằm ở trong biểu
7

bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số tế bào này trỏ thành mô phân sinh và
các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển. Các thể phân sinh này rõ ràng có nguồn gốc
từ các tế bào đơn. Sự phát triển các chồi bất định gián tiếp đầu tiên qua giai đoạn hình
thành callus cơ sở từ các chồi được tách trong nuôi cấy. Các chồi sau đó phát triển từ
ngoại vi mô callus và không có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn của mẫu vật.
Sự hình thành chồi bất định có thể cho kết quả cao về tốc độ nhân giống nhưng
làm tăng tỉ lệ cây biến dạng. Khi sử dụng phương pháp này cần phải được đánh giá
cẩn thận về tính biến dị của cây trồng.
2.3.3 Nuôi cấy protoplast
Nuôi cấy protoplast được phát triển nhờ công trình của Cooking (1960). Ông là
người đầu tiên dùng enzym để thủy phân thành tế bào và tách được protoplast từ tế bào
rễ cà chua. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thẻ tái sinh thành tế bào
mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Protoplast không có thành tế bào nên đây là đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu
biến đổi di truyền ở thực vật. Sử dụng phương pháp dung hợp hai protoplast có thể tạo
ra các cây lai soma. Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để
chuyển các bào quan và chuyển gene.
2.3.4 Nuôi cấy bằng chồi nách
Chồi nách là chồi mọc từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh trưởng
phụ thuộc có khả năng mọc thành chồi giống nhu thân chính. Sự xuất hiện của chồi
nách sớm hay muộn, số lượng chồi nách nhiều hay ít của phần lớn cây trồng trong
nhân giống in vitro phụ thuộc vào sự cung cấp cytokinin. Sự xuất hiện chồi nách sớm
dẫn đến sự phát triển chồi bậc 2, bậc 3, … trong sinh cụm chồi. Các cụm chồi này phát
triển phân chia thành những cụm chồi nhỏ hay các cụm chồi được tách ra để hình
thành cụm chồi giống như cụm chồi mẹ.
2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
Theo Dương Công Kiên (2002), trong nhân giống in vitro các yếu tố ảnh hưởng
bao gồm:

2.4.1 Mẫu cấy
Theo Murashige (1974), thì hầu hết những cơ quan thực vật đều có thể dùng nuôi
cấy mô. Song phải chọn lựa đâu là mẫu cấy hiệu quả nhất. Mẫu thường sử dụng là các
8


mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng
một cây. Chồi hoa non hay cụm hoa non cũng thường có khả năng tái sinh rất tốt.
Mẫu cấy thích hợp cho nuôi cấy in vitro phải có tỉ lệ lớn mô phân sinh hiện diện
hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn thể.
2.4.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường phổ biến là MS, thích hợp cho phần lớn các loại cây trồng. Lựa chọn
môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là rất cần thiết. Thành phần môi
trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Môi
trường còn thay đổi tùy thuộc sự phân hóa của mô cấy, tùy theo trường hợp duy trì mô
ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh.
Các môi trường đều được thành lập từ một số thành phần chính: Khoáng đa
lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng, ngoài ra các tác
giả còn thêm một số chất hữu cơ như nước dừa, dịch chiết nấm men.
2.4.3 Điều kiện nuôi cấy
2.4.3.1 Ánh sáng
Ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng tạo hình cây in vitro. Trong
giai đoạn một và hai của quá trình nhân giống in vitro, việc nuôi cấy tốt nhất là ở 1000
lux. Khi cường độ ánh sáng tăng lên 3000 - 10.000 lux rất thuận lợi cho giai đoạn
chuẩn bị cây in vitro trước khi đem trồng.
2.4.3.2 Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng rõ đến sự tạo hình của cây nuôi cấy. Mỗi loại cây trồng có
nhiệt độ tối ưu cho sự tạo hình, hầu hết thích hợp ở nhiệt độ 22 – 25 0C khi nuôi cấy.
2.5 Những tồn tại thường gặp trong nhân giống in vitro
Theo Dương Công Kiên (2002), trong nhân giống in vitro thường gặp những vấn

đề sau:
2.5.1 Tính bất định về mặt di truyền
Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính đã được sử dụng nhằm mục đích tạo ra quần
thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn, nhưng phương pháp này cũng tạo ra biến dị
soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn. Những biến dị này được nghiên cứu
và vận dụng vào cải thiện đời sống cây trồng (Evans và Sharp, 1986; Larkin, 1987).
Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen và Karp, 1985; Fish
9