TH VI SINH UNG DUNG

Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã môn học: BIO332

BÀI BÁO CÁO
THỰC HÀNH VI SINH ỨNG DỤNG
TS. Nguyễn Thị Hai
1. NGUYỄN THỊ BÍCH PHƯƠNG

16HSH02

1615101006

2. DƯƠNG THỊ NHƯ SƯƠNG

15DSH03

1511100333

3. NGUYỄN ĐẶNG ĐAN THÙY

15DSH03

1511100297

4. TRẦN THUY HOÀNG HÂN

15DSH03

1511100337

5. ĐINH CẨM TIÊN

15DSH01

1511100030

6. LƯU NGỌC ĐAN THANH

13DSH02

1311100657


BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA
I/LÝ THUYẾT
Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ tạo
thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không
sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn
và nấm khuẩn ty. Tuy vậy, những vi sinh vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều.
Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các
amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đổng hóa. Các sản
phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH3 và H2S.
Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện
hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và
Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Trong đó,
vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống
Clostridium tham gia quá trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình
amôn hóa được thực hiện bới các loài vi khuẩn và trực khuẩn kỵ khí tùy nghi.
II/THỰC HÀNH
Việc phát hiện và xác định số lượng các vi sinh vật amôn hóa được thực hiện bằng cách cấy các
mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịt-peptone.

Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng Pasteur nhằm
tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện thuộc giống Bacillus – giống
đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa.
Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính khác nhau của
khuẩn lạc các vi khuẩn khác nhau này.
1/ Môi trường - hóa chất
* Môi trường canh thịt- peptone:
- Cao thịt: 1,25g
- Peptone: 2,5g
- Nước:
250ml
- Môi trường canh thịt - peptone được phân vào ống nghiệm khoảng 10 ml, khử trùng ở 1atm, 15
phút.
- Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetate chì được cho vào đĩa peptri, hấp tiệt trùng ở 1 atm, 15
phút.
- Môi trường thạch cao thịt peptone: trộn vào môi trường lỏng 2% thạch, sau khi hấp tiệt trùng được
đổ vào các đĩa peptri, giữ ở 300C.

- Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng.
- Giấy lọc loại thấm acetate chì
2


- Giấy quỳ
- Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm bào tử,Thuốc thử
Nessler
2/ Dụng cụ
- Các dụng cụ pha chế môi trường
- Các dụng cụ cấy, khử trùng
- Kinh hiển vi

3/ Tiến hành thí nghiệm
 Chuẩn bị môi trường:
- Môi trường canh thịt-peptone được phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm, khử trùng ở 1 atm,
15 min.
- Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử trùng.
- Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các đĩa petri, giữ ở 30 OC
 Chuẩn bị mẫu:
- Rửa sạch ruột cá, cắt lấy mặt trong ruột. Cân lấy 10g ruột cá + 90ml nước muối sinh lý, lắc đều.
* Ủ vi sinh vật trên môi trường lỏng:
 Lấy 1ml dịch pha loãng nồng độ 10-1 cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịtpeptone đã khử trùng ở trên
 Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetate chì gài vào giữa nút bông và ống
nghiệm
 Ủ ở nhiệt độ 28-30OC trong 3 ngày đêm.
* Ủ vi sinh vật trên môi trường thạch:
 Lấy 0,1ml dịch pha loãng nồng độ 10-1 cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử trùng
ở trên.
 Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch cho khô.
 Ủ ở nhiệt độ 28-300C trong 3 ngày đêm.
4/Quan sát và ghi nhận kết quả
* Đối với môi trường lỏng, quan sát:
Sự đục môi trường
Sự tạo bông, kết cạn
Nổi váng trên bề mặt
Phản ứng sinh hóa:
Màu kết tủa với thuốc thử Nessler: Nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng, thêm một que cấy
đầy đất vườn ủ trong peptone broth. Quan sát màu kết tủa:
o Màu vàng nhạt – ít ammoniac
o Vàng sậm – nhiều ammoniac
3

o Nâu – rất nhiều ammoniac
o Sự sinh NH3 làm giấy quỳ hóa xanh
o Sự sinh H2S làm giấy lọc thấm acetate chì hóa đen.
Quan sát hiện tượng

Độ pha loãng
Đục môi trường

10-1
Có

Tạo bông

Không

Tạo cặn

Có

Sinh NH3

Có làm giấy Quỳ hóa xanh
(pH=7)

Sinh H2S

H2S sinh ra tác dụng với
chì làm đen giấy lọc thấm
acetate chì, tạo kết tủa đen.

 Thử với thuốc thử Nessler:

4


Dung dịch chuyển sang màu nâu, chứng tỏ có nhiều NH4+ sinh ra, có vi sinh vật phân giải protein
thành NH4+.
 Môi trường thạch
- Trên môi trường thạch, ghi nhận:

Trước và sau khi ủ, môi trường không có gì thay đổi do mẫu pha loãng lại ruột cá rửa sạch nên
có lẽ không có vi vi khuẩn phân giải protein, hoặc có thể do que trang còn quá nóng làm chết
vi khuẩn.
 Chọn một khuẩn lạc Bacillus subtilis thuần (mẫu đối chứng dương) làm tiêu bản và soi kính
hiển vi
Nhuộm gram:
 Làm vết bôi, cố định vết bôi.
 Nhuộm crystalviolet/ 30 giây.
 Rửa nước.
 Nhuộm lugol 1 phút, sau đó rửa nước.
 Tẩy cồn 960/ 30 giây.
 Rửa nước.
 Nhuộm fucshin 30 giây, rửa nước, để khô, đậy lamel, quan sát dưới kính hiển vi.
5


Tế bào Bacillus subtilis dưới kính hiển vi tế bào hình que, bắt màu tím (thuộc gram dương).

BÀI TẬP

Câu 1: Vi khuẩn amôn hóa thực hiện những chuyển hóa nào trong môi trường tự nhiên?

6


Phân hủy xã bã động thực vật, phân chường, rác thải hữu cơ sinh hoạt, nước thải chứa nhiều tinh bột,
ure...
Câu 2: Môi trường tăng sinh chọn lọc là gì?
Môi trường tăng sinh chọn lọc là môi trường lỏng,dùng để tăng số lượng vi sinh vật cần quan tâm và
ức chế những vi sinh vật không mong muốn do có chất ức chế đặc hiệu.
Câu 3: Vì sao sử dụng môi trường cao thịt – pepton để tăng sinh vi khuẩn amôn hóa? Yếu tố
chọn lọc trong môi trường này là gì?
Sử dụng cao thịt peptone để tăng sinh vi khuẩn amôn hóa vì vi khuẩn amôn hóa phân giải các hợp
chất chứa protein,ure,acid amin....thành NH4+.Do trong môi trường trên có cao thịt làm từ chiết thịt
cô đặc(cung cấp đạm hữu cơ,muối khoáng,đường,vitamin) và peptone là dạng thủy phân protein
(chứa đạm hữu cơ,vitamin và đường) đáp ứng đủ nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn amôn.
Yếu tố chọn lọc của môi trường trên là cao thịt-peptone.
Câu 4: Cho biết vì sao để phát hiện vi khuẩn amôn hóa người ta lại thử giấy quỳ, giấy lọc tẩm
acetate chì, dùng thuốc thử Nessler? Thử nghiệm nào có giá trị khẳng định vi khuẩn amôn hóa
là dương tính trong mẫu?
Vì khi thực hiện quá trình amôn hóa sản sinh ra NH3,H2S và NH4+.NH3 có tính chất kiềm làm giấy
quỳ hóa xanh,H2S phản ứng với acetate chì làm hóa đen giấy lọc, Nessler phản ứng với NH 4+ thành
kết tủa nâu.
Thí nghiệm với thuốc thử Nessler khẳng định vi khuẩn amôn hóa dương tính trong mẫu.
Câu 5: Nêu vai trò của vi khuẩn amôn hóa trong môi trường.
Vai trò của vi khuẩn amôn hóa là chuyển hóa các nguồn chất hữu cơ chứa nitơ trong tự nhiên thành
NH4+
Câu 6: Ứng dụng của vi khuẩn amôn hóa là gì?
Ứng dụng của vi khuẩn amôn hóa là: Làm phân bón và xử lý môi trường.

BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA
I/ Lý thuyết:
7


Nitrat hóa là quá trình oxi hóa NH3 thành HNO3, cung cấp năng lượng cho vi sinh vật hoạt động. Quá
trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO 2. Hầu hết các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng
vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có khả năng thực hiện quá trình này.
Nitrat hóa qua 2 giai đoạn:
Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa NH3 thành nitrit bởi một số đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrit
hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, ...Tất cả chúng đều giống nhau về mặt
sinh lý, sinh hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào.
Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục. Trên
môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc một số điều kiện. Hai
pha chủ yếu là pha di động- tế bào có 1 hay chùm tiên mao và pha tập đoàn khuẩn keo-các tế bào
không di động.
Giai đoạn 2 của quá trình nitrat hóa oxi hóa nitrit thành nitrat bởi một số vi khuẩn: Nitrobacter
winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis.
Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que tròn, hình hạt đậu,
hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động. Khi điều kiện không thuận lợi chúng có thể hình
thành những tập đoàn khuẩn keo. Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ, thỉnh
thoảng có dạng hình cầu, không di động, và có đặ trưng là hình thành những tập đoàn khuẩn
keo.Nitrococcus mobilis thì có dạng hình tròn, có tiên mao.
Vi khuẩn nitrat hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt chẽ đối với việc
oxi hóa cơ chất-NH3 và nitrit
Việc phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn nitrat hóađược thực hiện bằng cách cấy dịch huyền
phù cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô cơ Winogradski. Nguồn C duy nhất trong môi trường
này là CO2 có trong không khí và trong thành phần của CaCO 3. Nguyên liệu năng lượng và nguồn N
cho các vi khuẩn gây ra giai đoạn đầu của quá trình nitrat hóa là NH 3 và muối amon, còn đối với vi
khuẩn gây ra giai đoạn hai là nitrit.

Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là việc thông khí đầy đủ vào môi
trường nuôi cấy. Số lượng vi khuẩn nitrat hóa được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
II/ Thực hành:
1/Nguồn phân lập:
Đất vườn (độ sâu <30cm)
2/Môi trường- hóa chất:
Thành phần môi trường
Winogradski 1 (môi trường phân lập)
(NH4)2SO4

0,5 g/l
8


K2HPO4

0,25 g/l

MgSO4.7H2O

0,125 g/l

FeSO4.7 H2O

0,1 g/l

NaCl

0,5 g/l

Nước

250ml

Winogradski 2 (môi trường tăng sinh)
NaNO2

0,25 g

MgSO4.7H2O

0,125 g/l

FeSO4.7 H2O
NaCl
K2HPO4
Nước

0,001 g/l
0,001 g/l
0,25 g/l
250ml

Chỉnh về pH 7,3.
Chia vào các bình thủy tinh 100 ml, cho vào mỗi bình một ít CaCO3. Hấp khử trùng ở 1atm,15 phút.
3/Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường: Môi trường đã hấp khử trùng được phân vào các chai thủy tinh 100ml.
Pha loãng mẫu đất: cân 10g đất + 90ml nước muối sinh lý (10-1).
Hút 1ml mẫu cấy vào chai có chứa môi trường W1, W2 đã khử trùng ở trên, đậy kín
Lắc 200 vòng/phút 7-14 ngày.

III/ Quan sát - kết quả:

9


Cả 2 môi trường đều bị đục.
Định tính NO2- trong W1: Dùng pipette pasteur hút mẫu thí nghiệm trong chai W1 và mẫu nước cất
nhỏ lên lam kính, thêm vào mỗi mẫu 1 giọt Griess A và 1 giọt Griess B thì thấy dung dịch chuyển
sang hồng nhạt. chứng tỏ có vi sinh vật phân giải amoni thành nitrit (do Griess A là hỗn hợp acid
sunfanilic/ acid acetic 10% nên phản ứng với ion nitrit tạo thành muối điazo, Griess B là hỗn hợp αnaphtylamin/acid acetic 10% nên tác dụng với muối điazo tạo hợp chất có màu hồng)

10


Định tính NO3- trong W2: Dùng pipette pasteur hút mẫu thí nghiệm trong chai chứa môi trường W2
và mẫu nước cất nhỏ lên lam kính, Loại bỏ nitrite dư trong mẫu bằng cách cho một lượng dư acid
sulfamic (thử với thuốc thử Griess A và Griess B không còn màu hồng). Sau đó thêm 1 giọt
dephenylamine/H2SO4 vào. Có Màu xanh dương nhạt xuất hiện, phản ứng dương tính. Chứng tỏ có vi
sinh vật phân giải nitrit thành nitrate trong mẫu.

11


IV/Trả lời câu hỏi:
Câu 1:
Phân biệt AOB và NOB
Giống nhau về mặt sinh lý sinh hóa,hình thái và cấu trúc tế bào
Khác :
AOB: là vi khuẩn chuyển hóa amoni thanh nitrit.

Không sinh nội bào tử
Tế bào nhỏ hình bầu dục
Có 2 pha:di động và keo
NOB: là vi khuẩn chuyển nitrit thành nitrate.
Trực khuẩn thẳng,mảnh,thỉnh thoảng có hình cầu
Không di động.Điều kiện pH luôn giữ 7,3
Câu 2: Đặc điểm trao đổi chất của AOB và NOB
Vi khuẩn AOB: hô hấp hiếu khí bắt buộc, dinh dưỡng hóa năng vô cơ tự dưỡng.nguồn năng
lương NH4+,nguồn C là CO3Vi khuẩn NOB: hô hấp hiếu khí,tự dưỡng, một số là hóa năng vô cơ nhưng dị dưỡng hay hỗn
hợp.Nguồn năng lượng là NO2-, nguồn C là CO3Câu 3:
12


W1
Nguồn C: CaCO3
Nguồn N: (NH4)2SO4
W2
NaNO2
Na2CO3
Yếu tố chọn lọc là nguồn C, N.
Câu 4:
Cơ chế phản ứng của Griess A và Griess B: do Griess A là hỗn hợp acid sunfanilic/acid acetic 10%
nên phản ứng với ion nitrit tạo thành muối điazo, Griess B là hỗn hợp α- naphtylamin/acid acetic 10%
nên tác dụng với muối điazo tạo hợp chất có màu hồng
Câu 5:
Xử lý mẫu tăng sinh W2 trong môi trường acid sulfamic trước khi dùng chỉ thị
diphenylamine/H2SO4 vì:diphenylamine là phản ứng định nitrate nên cho acid sulfamic để loại bỏ
lượng nitrit có trong mẫu.
Câu 6:
Vai trò của vi khuẩn nitrate hóa trong môi trường tự nhiên: oxi hóa các hợp chất amôn chuyển thành

nitrate cung cấp năng lượng cho vi sinh vật hoạt động.
Câu 7: Ứng dụng vi khuẩn nitrate hóa trong lĩnh vực xử lý nước thải,xử lý môi trường, phân bón.

BÀI 3. VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA
I/LÝ THUYẾT
Phản nitrat hóa là quá trình vi sinh vật thực hiện việc khử nitrat thành nitrogen phân tử, đồng
thời oxi hóa các chất hữu cơ như đường, rượu, axit hữu co thành CO 2 và H2O với chất nhận điện tử
13


cuối cùng là NO3. Năng lượng sinh ra khi oxi hóa cơ chất được vi sinh vật sử dụng trong quá trình
hoạt động sống của mình.
Quá trình phản nitrat hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nhưng đặc biệt mạnh
trong điều kiện kỵ khí.
Các vi sinh vật thực hiện quá trình này phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn chúng thuộc
loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kỵ khí tùy nghi gồm một số giống Pseudomonas, Achromobacter,
Micrococcus …
II/THỰC HÀNH
Việc phát hiện vi khuẩn phản nitrat hóa và xác định số lượng của chúng được thực hiện bằng
phương pháp cấy mẫu lên môi trường chứa hợp chất C ở dạng oxi hóa, có nitrat và các hợp chất khác
cần cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Khi đó, đáng chú ý là một số vi khuẩn nitrat sử dụng nitrat
như nguồn năng lượng chủ yếu hoặc duy nhất, tức dùng chúng làm chất nhận electron nhưng không
dùng làm nguồn N trong trao đổi kiến tạo, vì không thể khử NH3 thành NH4 +. Vì vậy, trong môi
trường nuôi cấy vi khuẩn phản nitrat hóa, người ta cho thêm peptone, asparagin hoặc muối amon và
hạn chế lưu khí trong quá trình nuôi cấy.
Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
1/Môi trường- hóa chất
* Môi trường Giltay:
Dung dịch A
Asparagine:

KNO3:
1g
Nước:

Dung dịch B

1g

Citrit acid:
KH2PO4:
0.25 l
MgSO4.7H2O:
CaCl2..6 H2O:
FeCl2. 4H2O:
Nước :
Bổ sung dd KOH 10% vào dung dịch A chỉnh về PH=7.

5g
1g
1g
0,2g
vết
0,25l

Hòa 0,25l dung dịch A và 0,25l dung dịch B, sau đó thêm nước máy đến 1L dung dịch môi trường
Giltay hoàn tất.
1/Tiến hành thí nghiệm
Mẫu: pha mẫu đất 10g + 90ml nước muối sinh lý, để lắng.
Chuẩn bị môi trường: môi trường Giltay với thành phần như trên được phân vào các ống nghiệm,
hấp khử trùng 1 atm

- Xác định vi sinh vật trên môi trường lỏng:
14




Pha loãng mẫu 10-1



Lấy 1ml mẫu cấy sâu vào đáy ống nghiệm có chứa môi trường đã khử trùng



Ủ ở 28-30OC trong 7 ngày

- Làm 1 ống nghiệm đối chứng
1. Quan sát và ghi nhận kết quả
- Dấu hiệu chủ yếu nhất cho sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là sự sinh khí, làm đục và giảm pH
của môi trường

Trước và sau khi hấp khử trùng
 Phản ứng định tính khả năng phản nitrate :
Thêm 1 Griess A và 1 giột Griess B vào mẫu nuôi cấy trong môi trường Giltay . Các trường hợp sau
có thể xảy ra :
 Nếu màu hồng , kết luận có phản ứng khử từ nitrate thành nitrite . Nếu có khí tạo thành kết
luận dương tính phản nitrate . Ngược lại không có khí tạo thành thì chưa chăc đã có vi khuẩn
phản nitrate, càn tăng sinh lại để thòi gian lâu hơn rồi kết luận.
 Nếu không màu, thêm viên Zn( kẽm nguyên tố) sau thời gian ngắn nếu màu hồng xuất hiện ,
tương đương với nitrate chưa bị khử bở vi sinh vật hiện mới bị khử bởi Zn ( Zn là chất xúc tát

hóa học cho phản ứng khử nitrate thành nitrite ), kết luận âm tính ( thường không thu được khí
trong ống Durham). Ngược lại nếu cho Zn vào mà vẫn không màu , khi ấy cùng với dấu hiệu
khí sinh ra trong ống Durham kết luận dương tính phản nitrate.
- Quan sát các ống nghiệm ở các độ pha loãng và ghi nhận vào bảng:
Độ pha loãng

10-1
15


Đục
trường
Sinh khí

môi Có
Có. Có vi
khuẩn phát
triển chuyển
NO3- thành
NO, N2O, N2
Đẩy mực
nước trong
Durham tụt
xuống

pH

môi pH=7

trường

Định
NO2-

tính Có,

làm

dung

dịch

chuyển sang
hồng nhạt (ít
NO2-), chứng
tỏ

có

vi

khuẩn
chuyển
NO3-

hóa
thành

NO2-

Vừa nhỏ dung dich Griess A và dung dịch Griess B vào dung dịch đã chuyển sang màu hồng
nhat. Kết quả dương tính.
16


BÀI TẬP
Câu 1: Thế nào là vi khuẩn phản nitrate?
Vi khuẩn phản nitrate là những vi sinh vật có thể thực hiện việc khử nitrate thành nitơ phân tử qua
nitrit,khí nitrit oxide,khí nitrous oxide và cuối cùng là nitơ đồng thời oxi hóa các chất hữu cơ và giải
phóng năng lượng.
Câu 2: Nêu đặc điểm trao đổi chất của vi khuẩn phản nitrate?
Qúa trình phản nitrate hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kị khí, nhưng đặc biệt mạnh
trong điều kiện kị khí.
Câu 3: Chỉ ra nguồn năng lượng và nguồn C, nguồn N trong môi truòng Giltay. Đâu là yếu tố
chọn lọc trong những môi trường này?
Nguồn C: asparagine
Nguồn N: KNO3
Yếu tố chọn lọc của môi trường là KNO3,KOH 10% chỉnh pH=7
Câu 4: Điều kiện nào cần tuân thủ để tăng sinh vi khuẩn phản nitrate?
Điều kiện cần tuân thủ thủ để tăng sinh vi khuẩn phản nitrate là bổ sung KOH 10% và chỉnh về pH
7.0, peptone, asparagine hoặc muối amôn và hạn chế khí lưu trong quá trình nuôi cấy.
Câu 5: Dấu hiệu tăng sinh thành công vi khuẩn phản nitrate:
Có khí trong ống durham
Câu 6: Những sai lầm dễ mắc phải khi tăng sinh vi khuẩn phản nitrate là: không cân băng pH về
7, quên bổ sung peptone,asparagine hoặc muối amôn,quên quấn paraffin.

17


BÀI 4. VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NITƠ

I/ Lý thuyết:
Cố định N là khả năng đồng hóa N phân tử của một số vi sinh vật và dùng làm nguồn kiến tạo tế
bào. Các vi sinh vật cố định N sống tự do, có nhiều trong đất, nước gồm một số loài thuộc giống
Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aerobacter, vi khuẩn quan năng, vi khuẩn sinh
metan, vi khuẩn khử sulfat, nấm, tảo lam… Ngoài ra khả năng cố định N còn có ở các vi khuẩn nốt
sần sống cộng sinh trong rễ các cây họ đậu. Chúng có ý nghĩa quan trong trong việc chuyển N vô cơ
thành N hữu cơ, đặc biệt là vai trò của vi khuẩn nốt sần, các loài trong
giống Clostridiumvà Azotobacter.
Các loài Azotobacter thuộc loài vi sinh vật cố định nitrogen hoạt động nhất. Một số loài được
nghiên cứu hơn cả là Az. Chroococum-đặc trưng trên đất đồng cỏ, Az. Agilisvà Az. Vinelandii trong ao
hồ. Các loài này khác nhau về đặc điểm sinh trưởng trên môi trường đặc, kích thước, hình thái tế bào
và một số đặc điểm sinh lý khác. Az. Chroococum tạo những khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc lan, lúc đầu
không màu, sau chuyển thành màu nâu tối hoặc đen nhưng không lan màu sang môi trường. Az.
Agilis và Az. Vinelandii thì có khuẩn lạc trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng lục hoặc lam
lục, và có sự khuếch tán vào môi trường. Khi còn non, tế bào Azotobacter hình que đầu tròn đứng
riêng lẽ hoặc xếp thành từng đôi chồng chất, tế bào chất nhuộm màu đồng đều, có khả năng di động
nhờ chu mao. Chiều dài tế bào thay đổi 2-3 đếm 4-6 μm, trong đó lớn nhất là tế bào của Az. Agilis.
Dần dần, các tế bào hình que chuyển thành hình cầu hoặc hình bầu dục với đường kính 4 μm, hình
dạng không cố định. Khi đó tiên mao rụng đi và tế bào trở nên bất động, bọc bao nhầy, tế bào chất
xuất hiện dạng hạt với nhiều chất dinh dưỡng mỡ, glycogen… Ở tế bào Az. Chroococcum và Az.
Vinelandiicác tế bào tròn có thể phủ lớp vỏ nhầy và chuyển thành kén. Hình dạng tế bào và chu kỳ
biến đổi của Azotobacter phụ thuộc tuổi của giống và điều kiện phát triển.
Tất cả các loài Azotobacter đều sống dị dưỡng, dùng nhiều nguồn cacbon khác nhau, monosacharit,
disacharit, polysacharit (dextrin, tinh bột), nhiều rượu và acid hữu cơ, các hợp chất thơm…Nguồn
18


nitrogen có thể là Nitrogen phân tử, cũng có thể là muối amon, nitrate, nitrit, aminoaxit. Tùy thuộc
nồng độ các hợp chất có nitrogen này trong môi trường mà quá trình cố định nitrogen phân tử sẽ bị ức
chế nhiều hay ít. Đồng thời Azotobacter có nhu cầu lớn đối với P và Ca. Azotobacter nhận được năng

lượng từ quá trình oxi hóa các hợp chất hữu cơ thành CO2 và H2O.
Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát triển được ở pH lớn hơn 6, vì vậy hầu như không gặp chúng ở
đất chua. Đối với đất chua, đặc trưng là loài Az. Indicum có thể phát triển trong môi trường với pH 3.
Azotobacter cần độ ẩm cao hơn so với nhiều vi khuẩn khác nên cũng ít gặp chúng ở các vùng đất khô
hạn.
Việc phát hiện Azotobacter được thực hiện trên môi trường chọn lọc Thompson-Sherman không
chứa nitrogen hợp chất, trong điều kiện hiếu khí và độ ẩm cao.
II/ Thực hành:
1/Nguồn phân lập:
Đất vườn (lấy mẫu pha loãng chung của bài 2)
Mẫu đối chứng dương Azotobacter sp.
2/ Môi trường- hóa chất:
Thành phần môi trường Thompson-Sherman (N2-free glucose) tăng sinh
K2HPO4: 0,25g
MgSO4 : 0,05g
FeSO4:0,05g
CaCl2: 0,025g
Na2MoO4:0,00025g
Glucose:2,5g
Nước cất không đạm: 250ml
Thành phần môi trường Thompson-Sherman (N2-free glucose) phân lập
K2HPO4: 0,25g
MgSO4 : 0,05g
CaCl2:0,025g
Na2MoO4:0,00025g
Glucose:2,5g
Nước không đạm: 250ml
Agar: 2% thể tích môi trường
Chuẩn bị môi trường Thompson-Sherman với thành phần như trên, hấp khử trùng ở 121 OC trong 15
phút 1 atm.

3/Tiến hành thí nghiệm:
Giai đoạn tăng sinh: hút 1ml dịch mẫu đất mà nhóm 2 đã pha sẵng cho vào erlen có 50ml môi
trường Thompson-Sherman tăng sinh đã hấp khử trùng với thành phần như trên. Ủ 4-7 ngày 30 OC.
Giai đoạn phân lập: Cấy 0,1 ml mẫu đất (dùng chung mẫu đất bài 2 của nhóm 2 pha) vào môi
trường Thompson-Sherman phân lập đã phân vào đĩa petri và hấp khử trùng. Ủ 3-5 ngày, 30 OC.
19


III/ Quan sát - kết quả:
Giai đoạn sau tăng sinh:

các bình mẫu sau tăng sinh làm môi trường đục rõ rệt
Kiểm tra hình dạng, kích thước tế bào vi khuẩn có trong sinh khối đã tăng sinh dưới kính hiển vi
quang học:
Nhuộm gram:
 Làm vết bôi, cố định vết bôi.
 Nhuộm crystalviolet/ 30 giây.
 Rửa nước.
 Nhuộm lugol 1 phút, sau đó rửa nước.
 Tẩy cồn 960/ 30 giây.
 Rửa nước.
 Nhuộm fucshin 30 giây, rửa nước, để khô, đậy lamel, quan sát dưới kính hiển vi.

20


Tế bào Azotobacter dưới kính hiển vi tế bào tròn, bắt màu hồng.
Giai đoạn phân lập:
Không mọc khuẩn lạc nào cả: lý do có thể do thao tác que trang sau khử trùng còn nóng mà trang làm
chết vi sinh vật.

Kết quả sau phân lâp không khuẩn lạc nào mọc
IV/ Trả lời câu hỏi:
Câu 1:
21


Vi khuẩn cố định đạm là vi khuẩn có thể biến đổi nitơ khí trời thành nguồn dinh dưỡng có thể sử dụng
được cho cây.
Câu 2:
Nguồn năng lượng và nguồn carbon: không có ni tơ và nguồn carbon là glucose.
Yếu tố chọn lọc là môi trường không chứa đạm.
Câu 3:
Điều kiện cần và đủ để tăng sinh/ phân lập vi khuẩn cố định đạm: môi trường vô đạm, pH mẫu ≥6,
bổ sung khoáng vi lượng ( Fe,Mo.Ca..)gia nhiệt mẫu, lắc mẫu.
Câu 4:
Môi trường tăng sinh có thêm FeSO4 là yếu tố giúp tăng sinh vi khuẩn do trong quá trình cố định
nitơ vi khuẩn tiết ra enzyme nitrogenase cần cofacter là Mo và Fe.
Câu 5:
Vai trò của vi khuẩn cố định đạm trong tự nhiên là vi sinh vật sử dụng nguồn nitơ trong không khí
chuyển đổi thành nguồn nito dưới dạng NH4+/ NH3 giúp cho cây hấp thụ dễ dàng.
Câu 6:
Vai trò của vi khuẩn cố định đạm: làm phân bón vi sinh, chế phẩm sinh học, butanol, etanol, xử lý
nước thải.

22


BÀI 5:VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE
I/ Lý thuyết:

Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật. Việc tổng hợp cellulose có quy
mô phức tạp hơn hẳn việc tổng hợp những hợp chất khác. Do đó, vi sinh vật phân giải cellulose có vai
trò đặc biệt quan trọng trong chu trình tuần hoàn Cacbon.
Sự phân giải tiến hành trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, môi trường kiểm hoặc acid, độ ẩm thấp
hoặc cao và ở các nhiệt độ khác nhau. Tất cả vi sinh vật tham gia vô cơ hóa cellulose đều thuộc loại
dị dưỡng hóa năng hữu cơ, có enzyme cellulosase xúc tác việc phân giải cellulose thành cellobioase
và glucose. Vi sinh vật dùng các hợp chất sinh ra này làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng.
Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào quá trình này gồm niêm khuẩn, một số đại
diện của các vi khuẩn không sinh bào tử và sinh bào tử, xạ khuẩn, nấm...Trong đó, quan trọng nhất là
niêm khuẩn.
Niêm khuẩn có tế bào hình que nhỏ bé (03-0,4 x 0,7-10μm) hơi uốn cong, thường có đầu nhọn,
thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các vi khuẩn khác. Trên cơ chất đặc niêm khuẩn có
chuyển động trượt, do sự tiết chất nhầy không đồng đều trên bề mặt tế bào. Vài loài niêm khuẩn có
tiên mao, có chu kỳ phát triển phức tạp. Đầu tiên, các tế bào hình que từ từ dầy lên, biến thành những
tế bào dạng nghỉ, hình cầu hoặc bầu dục, kích thước khác nhau.
Niêm khuẩn phân giải cellulose chủ yếu gồm các giống Cytophaga, Sporocytophaga,
Sorangium sống trong đất ít acid, trung tính và ít kiềm. Các loài thuộc giống Cytophagacó tế bào đầu
nhọn, không sinh vi kén. Các loài trong giống Sporocytophaga có hình thái tương tự
như Cytophaganhưng khác ở chỗ có khả năng sinh vi kén. Các loài thuộc giống Sorangium là những
trực khuẩn đầu nhọn, có khả năng hình thành kén.
Trên bề mặt vật liệu có cellulose, niêm khuẩn phát triển trong dạng thể nhầy, không có hình dạng
xác định, lan rộng, không màu hoặc có màu vàng, da cam, đỏ tương ứng với chỗ cellulose bị phân
giải nhiều hay ít.
Ngoài niêm khuẩn, trong đất còn có các loài phân giải cellulose thuộc giống Cellvibrio, tế bào
uống cong, di động nhờ 1 tiên mao, không sinh nội bào tử, khuẩn lạc không màu hoặc có màu vàng

23


lục. Chúng chỉ dùng cellulose khi cạn kiệt các nguồn cacbon khác và khả năng phân giải không mạnh

mẽ bằng niêm khuẩn.
Trong đất chua, vai trò phân giải do các nấm thuộc giống Chaelomium, Trichoderma, Fusarium,
Aspergillus...
II/ Thực hành:
1/Nguồn phân lập:
Đất vườn
Đối chứng dương Trichoderma spp
2/ Môi trường và hóa chất:
Môi trường CMC
(NH4)2SO4 1g
K2HPO4 0,5g
MgSO4 0,25g
KCl2 0,25g
CMC 2,5g
Peptone 0,1g
Agar 7,5g
Định lượng bằng nước cất đến 500ml. Hấp khử trùng ở 121OC trong 15 phút 1 atm.
3/Tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị các đĩa petri đã hấp khử trùng ở 121OC trong 15 phút 1 atm. Đổ môi trường CMC đã hấp
khử trùng.
Pha loãng mẫu đất: 10g đất + 90ml nước cất, lắc đều, lọc để lấy dịch huyền phù.
Mẫu: Cấy 0,1 ml dịch huyền phù từ độ pha loãng 10-1 vào đĩa petri có chứa môi trường CMC, trang
đều, khô. Nuôi cấy 28-30OC trong 5 - 7 ngày .

24


Đối chúng dương: Dùng que cấy vòng lấy sinh khối Trichoderma spp cấy điểm vào tâm đĩa petri
chứa môi trường CMC.
Nuôi cấy 28-30OC trong 5 - 7 ngày .

25