TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ VI KHUẨN CỘNG SINH PHÂN LẬP TẠI VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o

Phạm Ngọc Tuyên

PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA TUYẾN
TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ VI KHUẨN
CỘNG SINH PHÂN LẬP TẠI VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


Hà Nội - 2010


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o

PHẠM NGỌC TUYÊN

PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA TUYẾN
TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ VI KHUẨN
CỘNG SINH PHÂN LẬP TẠI VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHAN KẾ LONG

Hà Nội - 2010


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, sự cảm ơn sâu sắc tới .TS. Phan Kế
Long - chủ nhiệm dự án “Tiếp cận gen trong khai thác sản phẩm trao đổi
chất thứ cấp của Xenorhabdus và Photorhabdus”, người đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận
văn tốt nghiệp.
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo và các cán bộ
trong Bộ môn Di truyền học - Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên - Đại học Quốc Gia, Hà Nội đã có những nhận xét, những chỉ dẫn quý
báu cũng như cung cấp những tài liệu cần thiết giúp tôi hoàn thành nghiên
cứu này.
Trong thời gian học tập, thực hiện đề tài nghiên cứu luận văn tôi đã
nhận được sự tạo điều kiện, sự giúp đỡ nhiệt tình của các lãnh đạo, các đồng
nghiệp trong Phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, phòng Tuyến
Trùng học - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Tôi xin chân thành cảm ơn
sự giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, các
đồng nghiệp khác trong và ngoài Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã
luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn!
Học viên

Phạm Ngọc Tuyên

i

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

i

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC HÌNH

v

DANH MỤC BẢNG

vi

MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN
TRÙNG, VI KHUẨN CỘNG SINH VÀ MỐI QUAN HỆ CỦA CHÚNG 3
1.1.1. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 3
1.1.2. Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng
5
1.1.3. Mối quan hệ giữa EPN và vi khuẩn cộng sinh 8

1.2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VỀ TUYẾN TRÙNG VÀ VI KHUẨN
CỘNG SINH
9
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18
1.2.3. Ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại trong việc nghiên cứu về tuyến
trùng và vi khuẩn cộng sinh. 21
1.3. KHÁI QUÁT ĐIỀU KIỆN ĐỊA LÝ TỰ NHIÊN VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ
22
1.3.1.
1.3.2.

Vị trí địa lý 22
Khí hậu
23

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

25

2.2. VẬT LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT25
2.2.1. Vật liệu
25
2.2.2. Trang thiết bị 27
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu tuyến trùng28
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn 34
2.3.3. Phân tích dữ liệu
37

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA VÀ THU THẬP MẪU 38

ii

38

25


3.2. KẾT QUẢ PHÂN LOẠI DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
3.2.1. Đặc điểm hình thái của tuyến trùng
39
3.2.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn 43
3.3. SẢN PHẨM PCR CỦA CÁC MẪU VỚI MỒI ĐẶC HIỆU
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN
3.4.1.
3.4.2.
3.4.3.

Đối chiếu trình tự của tuyến trùng 45
Đối chiếu trình tự của vi khuẩn 56
Quan hệ di truyền 73

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI 81
4.1. KẾT LUẬN 81
4.2. KIẾN NGHỊ 81
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt

82

Tài liệu nước ngoài

83

PHỤ LỤC

82

91

iii

45

43

39


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
EPN
VKCS
IJs
BTB
TTC
TBE
EtBr
EDTA

TAF
WLB

:
:
:
:
:
:
:
:
:
:

Entomopathogenic nematodes
Vi khuẩn cộng sinh
Ấu trùng cảm nhiễm (Infective juveniles)
Bromothymon Blue
Triphenyltetrazolium Chloride
Tris/Borate/EDTA
Ethidium Bromide
Ethylenediaminetetraacetic axit
Triethanolamine formalin
Worm Lysis Buffer

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Vòng đời của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng..................................5

Hình 2. Mối quan hệ họ hàng của các loài Steinernema phân lập ở Việt Nam (Phan
Ke Long, 2004)........................................................................................................20
Hình 3. Bản đồ hành chính Vườn Quốc Gia Ba Vì..................................................23
Hình 4. Màu sắc của ấu trùng bướm sáp lớn do tuyến trùng gây chết.....................39
Hình 5. Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn...............................................43
Hình 6. Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose với cặp mồi đặc hiệu của tuyến
trùng........................................................................................................................ 44
Hình 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose đối với cặp mồi đặc hiệu của vi
khuẩn....................................................................................................................... 44
Hình 8. Đối chiếu trình tự nucleotit đoạn gen ITS của tuyến trùng Steinernema
sp.B1 với các loài trong nhóm. ..............................................................................50
Hình 9. Đối chiếu trình tự nucleotit đoạn gen ITS của tuyến trùng Heterorhabditis
sp.D9 với các loài trong nhóm................................................................................55
Hình 10. Đối chiếu trình tự nucleotit gen 16S-rARN của VKCS Xenorhabdus sp.B1
với các loài trong nhóm...........................................................................................63
Hình 11. Đối chiếu trình tự nucleotit gen 16S-rARN của VKCS Photorhabdus
sp.D9 với các loài trong nhóm................................................................................72
Hình 12. Cây phát sinh chủng loại ME của tuyến trùng Steinernema......................74
Hình 13. Cây phát sinh chủng loại MP của tuyến trùng Steinernema......................74
Hình 14. Cây phát sinh chủng loại ME của nhóm Heterorhabditis.........................76
Hình 15. Cây phát sinh chủng loại MP của nhóm Heterorhabditis..........................76
Hình 16. Cây phát sinh chủng loại ME của nhóm Xenorhabdus.............................78
Hình 17. Cây phát sinh chủng loại MP của nhóm Xenorhabdus..............................78
Hình 18. Cây phát sinh chủng loại ME của nhóm Photorhabdus............................80
Hình 19. Cây phát sinh chủng loại MP của nhóm Photorhabdus............................80

v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh tương ứng.............................................6
Bảng 2. Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR....................................................30
Bảng 3. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR.............................................................31
Bảng 4. Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự ADN...............................33
Bảng 5. Chu trình nhiệt của phản ứng xác định trình tự ADN.................................33
Bảng 6. Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR....................................................36
Bảng 7. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR.............................................................36
Bảng 8. Thành phần loài tuyến trùng thu được tại VQG Ba Vì...............................38
Bảng 9. Số đo các chỉ tiêu của ấu trùng cảm nhiễm BVB1.....................................40
Bảng 10. Số đo ấu trùng cảm nhiễm BVD9.............................................................41
Bảng 11. Thống kê sự biến đổi nucleotit trong nhóm Steinernema.........................73
Bảng 12. Ma trận khoảng cách di truyền của nhóm Steinernema theo mô hình
Jukes-Cantor............................................................................................................73
Bảng 13. Sự biến đổi các nucleotit của nhóm Heterorhabditis................................75
Bảng 14. Ma trận khoảng cách di truyền của nhóm Heterorhabditis theo mô hình
Jukes-Cantor............................................................................................................75
Bảng 15. Sự biến đổi nucleotit của nhóm Xenorhabdus..........................................77
Bảng 16. Ma trận khoảng cách di truyền của nhóm Xenorhabdus theo mô hình của
Jukes-Cantor............................................................................................................77
Bảng 17. Sự biến đổi nucleotit của nhóm Photorhabdus.........................................79
Bảng 18. Ma trận khoảng cách di truyền của nhóm Photorhabdus theo mô hình
Jukes-Cantor............................................................................................................79

vi


MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có sự đa dạng
phong phú về các loài thực vật, bên cạnh đó nước ta còn có sự đa dạng rất lớn
về các loài côn trùng. Hàng năm, các côn trùng gây hại làm giảm đến 40-50%

sản lượng của sản xuất nông nghiệp (Phạm Văn Lực et al, 1999).
Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân đã sử dụng rất nhiều
loại thuốc trừ sâu khác nhau. Tuy nhiên, các loài côn trùng đã trở nên ngày
càng kháng thuốc trừ sâu, và họ đã phải tăng nồng độ thuốc trừ sâu thậm chí
trong một số trường hợp phải sử dụng cả loại thuốc có độ độc hại rất cao.
Điều này đã dẫn đến một nồng độ ngày càng tăng của các hóa chất độc hại
trong chuỗi thức ăn tự nhiên. Xu hướng chung trên thế giới và của Việt Nam
hiện nay là sử dụng các sản phẩm sinh học để diệt sâu hại mà một trong
những sản phẩm hữu ích nhất là thuốc sinh học tuyến trùng phòng trừ sâu hại.
Thuốc này có nhiều đặc điểm như: có khả năng ký sinh gây chết cho nhiều
loại sâu hại khác nhau; an toàn cho người, động vật, thực vật và môi trường;
sâu hại không có khả năng kháng thuốc…(Vũ Tứ Mỹ et al., 2004).
Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematodes
– EPN) thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis hiện đang rất được
quan tâm trên thế giới do khả năng phòng trừ sinh học sâu hại của chúng. Cơ
chế gây bệnh là nhờ các vi khuẩn cộng sinh (VKCS) (Xenorhabdus ở
Steinernema và Photorhabdus ở Heterorhabditis). Sau khi thâm nhập vào vật
chủ, các vi khuẩn này sản sinh rất nhanh và tạo ra độc tố giết chết vật chủ,
thêm vào đó các vi khuẩn này cũng tiết ra một số chất chống lại các tác nhân
cạnh tranh khác trong môi trường như vi khuẩn, nấm (Akhurst and Dunphy,
1993). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, các hoạt chất sinh ra trong quá
trình trao đổi chất của các chủng/loài vi khuẩn này có khả năng kháng sinh,
kháng nấm, ngăn chặn sự tăng sinh của tế bào ung thư chính vì vậy các
chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus/Photorhabdus là nguồn hợp chất tự nhiên

1


quan trọng để nghiên cứu các loại thuốc mới cho con người (Chen et al.,
1994).

Do mỗi chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus/Photorhabdus tạo ra các
hoạt chất khác nhau chính vì vậy việc tìm ra các chủng/loài mới của loại vi
khuẩn này là rất cần thiết. Tuy nhiên để có các chủng/loài vi khuẩn này cần
phải phân lập các chủng/loài EPN tương ứng trước. Từ năm 1997 đến nay,
khoảng hơn 60 chủng EPN đã được phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau
ở Việt Nam. Đây là nguồn VKCS rất quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà
còn đối với thế giới. Kết quả nghiên cứu bước đầu đã chứng minh một số
chủng/loài Xenorhabdus ở Việt Nam tạo ra một số chất có khả năng kháng
sinh kháng khuẩn và một số hoạt chất mới. Với mục đích tìm kiếm thêm các
chủng EPN mới, chúng tôi đã tiến hành phân lập EPN tại vườn Quốc gia Ba
Vì, Hà Nội và đã thu được 1 chủng Steinernema và 1 chủng Heterorhabditis.
Để xác định các loài EPN trên cùng với VKCS này, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Phân tích mối quan hệ di truyền của tuyến trùng ký sinh gây
bệnh côn trùng và vi khuẩn cộng sinh phân lập tại Vườn Quốc Gia Ba
Vì”
Với các mục đích sau:
- Xác định loài tuyến trùng EPN trên cơ sở phân tích hình thái và phân
tích thông tin di truyền vùng gen ITS-rADN và mối quan hệ di truyền của
chúng
- Xác định loài vi khuẩn cộng sinh trên cơ sở phân tích đoạn gen 16SrARN và mối quan hệ di truyền của chúng.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.

KHÁI QUÁT CHUNG VỀ TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH
CÔN TRÙNG, VI KHUẨN CỘNG SINH VÀ MỐI QUAN HỆ CỦA
CHÚNG

1.1.

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematode EPN) là những loài giun tròn có ích ký sinh ở những loài côn trùng, làm suy
yếu hoặc giết chết những côn trùng vật chủ này, nhưng lại rất an toàn đối với
người, động vật và thực vật.
Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng thuộc 2 giống Steinernema và
Heterorhabditis, thuộc 2 họ khác nhau: giống Steinernema thuộc họ
Steinernematidae và Heterorhabditis thuộc họ Heterorhabditidae của ngành
giun tròn. Dưới đây là vị trí của chúng trong hệ thống phân loại (De Ley and
Blaxter, 2002):
Ngành: Nematoda
Lớp: Chromadorea
Bộ: Rhabditida
Phân Bộ: Tylenchina
Dưới Bộ: Panagrolaimomorpha
Tổng họ: Strongyloidoidea
Họ: Steinernematidae
Giống: Steinernema
Phân Bộ: Rhabditina
Dưới bộ: Rhabditomorpha
Tổng Họ: Strongyloidea
Họ: Heterorhabditidae
Giống: Heterorhabditis

3


Cơ chế gây bệnh của EPN là nhờ vào VKCS mà ấu trùng của chúng

mang theo trong ruột (Akhurst, 1983; Poinar, 1990). Trong vòng đời phát
triển của EPN trải qua các giai đoạn ấu trùng, con trưởng thành đực và cái.
Một chu kỳ xâm nhập vào côn trùng vật chủ và phát triển của tuyến trùng
EPN trong xác chết côn trùng vật chủ bắt đầu từ pha ấu trùng cảm nhiễm (IJs)
(tồn tại ở trong đất) đến pha ký sinh phát triển bên trong cơ thể côn trùng vật
chủ và sau khi kết thúc pha ký sinh chúng lại quay trở về pha IJs bên ngoài
côn trùng vật chủ. Khi tìm được vật chủ thích hợp, IJs xâm nhập vào cơ thể
côn trùng qua các lỗ tự nhiên như miệng, hậu môn hoặc lỗ thở hoặc một số
dạng IJs được trang bị mấu kitin dạng sừng có thể đục thủng thành cơ thể côn
trùng tại nơi xung yếu là ranh giới giữa các đốt cơ thể để xâm nhập. Sau khi
vào cơ thể vật chủ IJs nhanh chóng xâm nhập vào xoang máu. Tại đây vi
khuẩn cộng sinh sẽ được giải phóng ra khỏi cơ thể tuyến trùng qua miệng
(Heterorhabditis spp.) hoặc hậu môn (Steinernema spp.) để vào xoang máu
của côn trùng. Nhờ môi trường thích hợp là huyết tương vật chủ vi khuẩn
cộng sinh nhân nhanh số lượng và tạo ra độc tố gây chết vật chủ trong vòng
48h. Màu sắc của côn trùng vật chủ cũng là điểm đặc trưng khác biết giữa 2
giống tuyến trùng: đối với các loài Heterorhabditis spp. thì khi côn trùng vật chủ
chết sẽ có màu đỏ gạch, da xác chết khô và dai, còn đối với các loài Steinernema
spp. khi côn trùng chết sẽ có màu nâu, xác chết côn trùng không có mùi thối
(Nguyễn Ngọc Châu, 2008). Các tuyến trùng sau đó sẽ trải qua các thế hệ khác
nhau, và cuối cùng khi nguồn thức ăn đã hết, thế hệ cuối cùng trong sẽ chui ra
khỏi xác và phát tán ra môi trường bên ngoài và trở thành IJs để tiếp tục một
chu kỳ phát triển mới với một côn trùng vật chủ mới.

4


Hình 1. Vòng đời của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng
1.2.

Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh

gây bệnh côn trùng

Xenorhabdus cộng sinh với Steinernema và Photorhabdus cộng sinh
với Heterorhabditis thuộc họ Enterobacteriaceae. Đa số các loài thuộc 2 giống
vi khuẩn này gây bệnh cho côn trùng khi xâm nhập vào máu. Ngoài ra còn có
các chủng vi khuẩn không phải cộng sinh như P. asymbiotica được xác định
là gây bệnh cho người (Farmer et al., 1989) và một nhóm khác chưa xác định
đến loài gây nhiễm bệnh cần liệu pháp điều trị kháng sinh (Peel et al., 1999).
Các nghiên cứu trong 20 năm qua từ giun tròn cho thấy Xenorhabdus cộng
sinh ở ruột của ấu trùng cảm nhiễm của Steinernema và Photorhabdus ở
Heterorhabditis (Forst et al., 1997). Mỗi loài tuyến trùng thường chỉ cộng
sinh với một loài vi khuẩn mặc dù một loài vi khuẩn có thể cộng sinh với vài
loài tuyến trùng. Hiện nay các nhà khoa học đã phân lập và mô tả được 18
loài vi khuẩn Xenorhabdus và 8 loài Photorhabdus. Bảng 1 dưới đây trình bày
các tuyến trùng và các vi khuẩn cộng sinh tương ứng:

5


Bảng 1. Tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh tương ứng
ST
T

Vi Khuẩn cộng sinh

Tuyến trùng

Nguồn

1

Xenorhabdus nematophila

Steinernema
carpocapsae

Akhurst và Boemare,
1990

2

X. bovienii

S. affine, S. feltiae, S.
intermedium, S.
kraussei, S. weiseri

Akhurst, 1983; Akhurst
and Boemare (1993),
Tailliez et al., 2006.

3

X. poinarii

S. glaseri, S. cubanum

Akhurst, 1983; Akhurst

and Boemare (1993)

4

X. beddingii

S. longicaudum

Akhurst and Boemare
(1993)

5

X. japonica

S. kushidai

Nishimura et al., 1994

6

X. budapestensis

S. bicornutum, S.
ceratophorum

Lengyel et al., 2005 ;
Tailliez et al., 2006.

7

X. ehlersii

S. serratum

Lengyel et al., 2005.

8

X. innexi

S. scapterisci

9
10

X. szentirmaii
X. indica

S. rarum
S. abbasi

Lengyel et al., 2005
Tailliez et al., 2006

11

X. kozodoii

12

X. doucetiae

S. apulia,
S. arenarium
S. diaprepesi

Fischer-Le Saux et
al., 1998
Tailliez et al., 2006

13

X. griffiniae

S. hermaphroditum

14

X. hominickii

15

X. romanii

S. kari, S.
monticolum
S. puertiricense

Fischer-Le Saux et

al., 1998, Tailliez et
al., 2006
Tailliez et al., 2006

16

X. cabanillasii

S. riobravis

Tailliez et al., 2006

17

X. koppenhoeferi

S. scarabaei

Tailliez et al., 2006

18

X. stockiae

S. siamkayai

Tailliez et al., 2006

19

Photorhabdus temperata Heterorhabdis
subsp. cinerea
downesi

6

Tailliez et al., 2006

Tailliez et al., 2006

Tímea
Tamás
(2008)

Tóth và
Lakatos


20

P. temperata

H. zealandica, H.
bacteriophora NC1, H.
megidis

Fisscher-Le Saux et al.,
1999,
Marion
Fisscher

et
al.,
(1999)

21

P. temperata subsp. temperata H. megidis (các chủng

Marion Fisscher et
al., (1999)

22

P. luminescens subsp. kayaii

H. bacteriophora (vùng
đồng cỏ, Thổ Nhĩ Kỳ)

Marion Fisscher et
al., (1999)

23

P. luminescens subsp.
thracensis

H. bacteriophora (rừng
cây hướng dương, rừng
thông, Thổ Nhĩ Kỳ)

Marion Fisscher et
al., (1999)

24

Photorhabdus luminescens
subsp. luminescens

Heterorhabditis
bacteriophora

Marion Fisscher et
al., (1999).

25

P. luminescens subsp.
akhurstii

H. indica

Fisscher-Le Saux et al.,
1999.

26

P. luminescens subsp.
laumondii

H. bacteriophora HP88

Marion Fisscher et
al., (1999)

Các loài thuộc giống Xenorhabdus không sinh bào tử, hình que kích
thước 0.3-2 x 2-10 µm, gram âm, kị khí không bắt buộc có cả kiểu hô hấp và
lên men. Chúng sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu là 28 0C; một số chủng phát triển
ở 400C. Lên men đường glucose sinh axit (không sinh khí) và một số đường
khác ít lên men. Phản ứng catalase âm tính và không khử nitrate thành nitrite.
Sự chuyển pha xuất hiện ở các mức độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy
(Boemare and Akhurst, 1988). Pha I sản sinh nguyên sinh chất trong giai đoạn
nuôi cấy (Boemare et al., 1983), di động bằng lông rung và có thể tập trung
lại trong môi trường thạch 0.6-1.2% (Givaudan et al., 1995). Pha II không bắt
màu (Akhurst, 1980), sản sinh kháng sinh (Akhurst, 1982), protein và một
số đặc tính khác của pha. Một số chủng di động ở pha II, nhưng thường pha I
mới di động. Đa số các chủng có deoxyribonuclease và protease dương tính.
Giống Photorhabdus hình que, kích thước (0.5-2 x 1-10 µm), Gram
âm, không sinh bào tử, và di động bằng lông rung. Kị khí không bắt buộc, có

7


cả hô hấp và lên men. Nhiệt độ tối ưu là 28 0C; một số chủng phát triển ở 37380C. Tất cả các chủng đều có phản ứng catalase dương tính, nhưng không
khử nitrate. Âm tính với nhiều đặc điểm của họ Enterobacteriaceae. Thủy
phân gelatin, hầu hết các chủng gây tan huyết cừu và ngựa, một số sản sinh
gây tan huyết hình khuyên trên môi trường máu cừu ở 25 0C. Lên men
Glucose sinh axit, nhưng không sinh khí. Cũng lên men đường Fructose, Dmannose, maltose, ribose, và N-acetylglucosamine sinh axit. Lên men
glycerol yếu.
1.3.

Mối quan hệ giữa EPN và vi khuẩn cộng sinh

Mối quan hệ giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh là hiện tượng cộng
sinh mà cả 2 phía cùng có lợi.
Tuyến trùng mang vi khuẩn trong ruột mình, bảo vệ vi khuẩn khi ở
ngoài côn trùng vật chủ; khi ở ngoài môi trường, vi khuẩn không tồn tại ở
dạng tự do. Tuyến trùng còn đóng vai trò quan trọng là vector vận chuyển vi
khuẩn vào xoang máu của côn trùng vật chủ, bảo vệ vi khuẩn trong xoang
máu côn trùng vật chủ bằng cách chúng tiết ra một số chất có tác dụng làm
trung hoà và làm mất tác dụng của kháng thể do côn trùng tiết ra để chống lại
vi khuẩn. Nhờ vậy mà vi khuẩn cộng sinh có thể sinh sôi nhanh chóng trong
ruột côn trùng (Boemare and Akhurst, 2006).
Vi khuẩn cộng sinh sản sinh độc tố giúp giết chết côn trùng vật chủ,
chuyển biến xác côn trùng vật chủ thành hỗn hợp chất chất dinh dưỡng cho
tuyến trùng phát triển (Akhust và Dunphy, 1993). Độc tố do vi khuẩn cộng
sinh tiết ra làm côn trùng chết một cách nhanh chóng. Thời gian giết chết côn
trùng vật chủ khác nhau tuỳ tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn cộng sinh và cũng
phụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ.
Vi khuẩn còn cung cấp nguồn thức ăn cho côn trùng. Khi mới bắt đầu
xâm nhập vào cơ thể côn trùng, tuyến trùng sử dụng vi khuẩn cộng sinh vừa
giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trong xoang máu côn trùng như nguồn

8


dinh dưỡng của chúng, nhờ đó các ấu trùng xâm nhiễm tuổi 3 nhanh chóng
phát triển sang tuổi 4 và đạt đến trưởng thành. Từ thế hệ thứ 2, tuyến trùng
chuyển sang dinh dưỡng bằng mô côn trùng đã được vi khuẩn hoạt hoá. Vi
khuẩn cộng sinh hoạt hoá xác chết côn trùng nhờ việc tiết ra các enzyme. Các
enzyme do vi khuẩn tiết ra có tác dụng hoạt hoá mô cơ thể côn trùng thành

nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng. Nhờ đó từ thế hệ thứ 2, tuyến trùng
sử dụng chính xác chết của côn trùng để làm nguồn dinh dưỡng để tiếp tục
phát triển, sinh sôi nảy nở ở các thế hệ tiếp theo (Boemare and Akhurst,
2006).
Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn đã sản sinh ra các chất trao đổi thứ
cấp mang hoạt tính kháng khuẩn, ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào
xác chết côn trùng, bảo vệ nguồn thức ăn nguyên vẹn giành cho tuyến trùng.
2.

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VỀ TUYẾN TRÙNG VÀ VI KHUẨN
CỘNG SINH
2.1.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

a. Tuyến trùng
Trên thế giới, đã từ lâu có rất nhiều các nhà khoa học, các công trình
nghiên cứu về EPN, vi khuẩn cộng sinh và các sản phẩm trao đổi chất của
chúng. Từ năm 1923 đến nay, các nhà khoa học đã điều tra, phân lập, mô tả
khoảng 63 loài Steinernema và 19 loài Heterorhabditis từ khắp các quốc gia
trên thế giới. Phân loại tuyến trùng bằng các phương pháp chuẩn như hình
thái và hình thái lượng khá đúng đắn (Hominick et al., 1997), một số đặc
điểm hình thái có ích cho việc phân loại loài và sắp xếp chúng vào trong các
nhóm khác nhau như chiều dài và đặc điểm đường bên của ấu trùng cảm
nhiễm (Mraceck and Bednarek, 1991; Hominick et al, 1997), và các đặc điểm
hình thái của gai giao cấu và tuyến sinh dục (Nguyen and Smart, 1997). Tuy
nhiên nhiều loài có nhiều đặc điểm giống nhau về mặt hình thái, vì vậy nếu
chỉ mô tả về mặt hình thái là chưa đủ độ tin cậy. Hominick et al., (1996) đã đề

9

xuất kỹ thuật phân tử dựa trên các đặc điểm phân tử của các loài giúp cho việc
phân loại đến loài và nhóm loài chính xác hơn. Phương pháp này sử dụng kỹ
thuật PCR để nhân vùng gen ITS-rADN của tuyến trùng rồi sau đó giải trình
tự và so sánh trình tự giữa các loài với nhau. Cho đến nay, phương pháp này
được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu về các loài tuyến trùng mới.
Jennifer và Harry (1988) đã nghiên cứu tỉ mỉ các loài tuyến trùng thuộc 2
giống Steinernema và Heterorhabditis. Các tác giả đã mô tả những đặc điểm
sinh học, sinh thái học chung của các loài tuyến trùng thuộc 2 giống
Steinernema và Heterorhabditis. Các phương pháp nghiên cứu tuyến trùng và
phân lập vi khuẩn từ 2 giống này cũng được trình bày trong bài báo này.
Patricia Stock et al., (2000) đã so sánh và phân tích tính đa dạng hình
thái của các cá thể đực và ấu trùng cảm nhiễm tuổi 3 của chủng tuyến trùng
Steinernema kraussei (Steiner, 1923) phân lập từ Canada, US. Nghiên cứu
này cho thấy rằng có sự sai khác về mặt hình thái giữa các vùng địa lý, nhưng
không thay đổi trong một vùng.
Năm 2000, Sudershan Ganguly và L. K. Singh đã phân lập một loài
tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng mới, Steinernema thermophilum từ
vùng nông thôn ở New Delhi, Ấn Độ. Loài này đã được mô tả và so sánh về
mặt hình thái với một số loài trong giống Steinernema. Một số đặc điểm sinh
học của loài mới này: chiều dài cơ thể của ấu trùng cảm nhiễm trong khoảng
480 - 620μm, gần tương đồng với loài S. carpocapsae. Khả năng giết vật chủ
từ 24 - 36h, vòng đời từ 2 - 3 thế hệ trong 5 - 6 ngày ở 30 - 35 0C. Cá thể đực
và cái trưởng thành thế hệ một được hình thành trong 24 - 48h sau khi vật chủ
chết, cá thể trưởng thành thế hệ 2 được hình thành sau 72 - 96h.
Hussaini et al., (2001) sử dụng phương pháp RFLP khuếch đại PCR
vùng trình tự ITS-rDNA với 17 enzym giới hạn của 3 loài tuyến trùng
Steinernema. Kết quả sau đó được phân tích và cho thấy 1 loài Steinernema

10


tami được tìm thấy ở rừng Việt Nam, 1 loài S. abbasi ở nam nước hồi giáo
của Oman và 1 loài chưa được mô tả Steinernema sp. SSL2 từ Sri Lanka.
Năm 2001, Steinernma pakistanense được Shahina et al., mô tả là loài
mới. Loài này được tìm thấy trong các mẫu từ các vùng khác nhau của
Pakistan. Đặc điểm để phân biệt loài này với các loài Steinernema khác là 2
cấu trúc giống như sừng nhô ra trên vùng miệng của các cá thể ấu trùng cảm
nhiễm tuổi 3. Những kiểm tra về hình thái và DNA tách rời loài này từ 2 loài
có hình thái tương đồng S. bicornutum và S. certophorum. Các đặc điểm sinh
học cũng được mô tả kĩ lưỡng bao gồm chiều dài cơ thể trung bình (683 μm),
8 đường bên, chiều dài thực quản, vị trí lỗ bài tiết và gai giao cấu. Thêm vào
đó, phân tích RFLP của vùng ITS-rDNA cũng cho thấy sự khác biệt với các
loài Steinernema khác.
Những nghiên cứu về tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh với chúng giai
đoạn trước năm 1998 đã được Boemare N. tổng hợp vào năm 2002. Tác giả
đã trình bày đầy đủ các đặc điểm hình thái, sinh học của các loại tuyến trùng
của 2 giống Steinernema và Heterorhabditis đã được phân loại từ trước năm
1998 cũng như các đặc điểm sinh học và hoạt tính của các vi khuẩn cộng sinh
với 2 chủng tuyến trùng nói trên.
Sekcuk Hazir (2003) nghiên cứu những đặc điểm về kích thước hình
thái để công bố một loài mới thuộc giống Steinernema, Steinernema
anatoliense với các đặc điểm riêng biệt so với các loài khác: chiều dài cơ thể
của ấu trùng cảm nhiễm tuổi 3 (507 - 580μm) với 6-8 đường bên theo chiều
dọc cơ thể, hình thái đuôi của con đực thế hệ 1 với mucro biểu bì, hình dáng
của gai giao cấu và dây dẫn và sự sắp xếp của các nhú sinh dục. Các tác giả
cũng đã tiến hành lai chéo và phân tích RFLP vùng trình tự ITS-rDNA của
loài này cũng cho thấy sự khác biệt với 50 loài Steinernema khác.
Cũng trong năm này, Christopher Cutler và Patricia Stock đã sử dụng

các đặc điểm về hình thái, dữ liệu trình tự gen 28S rDNA và phân tích RFLP

11


để công bố loài Steinernema mới ở Trung Quốc. Steinernema websteri có các
đặc điểm hình thái: chiều dài cơ thể con đực trưởng thành thế hệ 1 trung bình
1712μm, con cái thế hệ 1 trung bình 5542 μm, ấu trùng cảm nhiễm có chiều
dài 584 μm. Christopher Cutler phân tích RFLP cho thấy rằng loài mới này
cùng với loài S. carpocapsae có kết quả phân tích đa hình cắt giới hạn bằng
enzym tương tự nhau. Trong cây phát sinh chủng loại, loài mới S. websteri có
mối quan hệ gần với nhánh gồm 4 loài S. abbasi, S. riobrave, S.
ceratophorum và S. bicornutum.
Năm 2004 là năm đánh dấu sự phát hiện của nhiều loài tuyến trùng
mới. Ở Mexico, Khuong B. Nguyen et al., (2004) đã tìm thấy một loài tuyến
trùng mới trong giống Heterorhabditis ở phía bắc của bang Tamaulipas. Dữ
liệu hình thái và phân tử chỉ ra rằng tuyến trùng này là loài mới. Loài mới
được mô tả là Heterorhabditis mexicana và là taxon lớn hơn H. indica.
Heterorhabditis mexicana có hình thái giống với H. bacteriophora, H.
brevicaudis và H. indica và có thể phân biệt với những loài này bằng các đặc
điểm của con đực và con cái. Các mẫu của H. mexicana có tới 70% con cái có
8 nhú, trong khi tất cả các loài khác là 9. Tỉ lệ của ống dẫn tinh so với chiều
dài gai giao cấu cao hơn so với H. bacteriophoora, H. brevicaudis, H. indica
và chiều dài tương đối của gai giao cấu so với chiều rộng cơ thể tại anus (SW)
lại ngắn hơn so với tất cả các loài. Trong vùng ITS của rDNA, H. mexicana
tiến hóa 13 trạng thái đặc điểm nucleotide giống nhau, khác biệt hẳn so với H.
indica ở 113 vị trí khớp.
Steinermena jollieti được mô tả loài mới bởi Spiridonow et al., Mẫu
này được phân lập từ một mẫu dất thu được trong rừng ở Mỹ vào năm 1999.
Hình thái học và trình tự phân tử của ITS-rDNA chỉ ra rằng loài mới phân bố

rộng. Một đặc điểm đặc trưng của S. jollieti ấu trùng cảm nhiễm chỉ có 6
đường bên ở giữa cơ thể, và những cá thể cái thế hệ thứ 2 có một mucro trên
mấu đuôi. Trình tự ITS rDNA của S. jollieti thuộc một nhánh cùng với nhóm

12


S. krausei, S. feltiae, S. weiseri và S. oregonense, trình tự này cũng cho thấy
mức độ sai khác cao hơn so với các loài Steinernema.
Năm 2004, Spiridonov et al sau khi phân tích mối quan hệ phát sinh
chủng loại vùng gen ITS1-5.8S-ITS2 của rADN của các loài tuyến trùng
Steinernema đã phân chúng ra thành 5 nhóm có mối liên hệ về hình thái ấu
trùng cảm nhiễm:
Nhóm ‘carpocapsae-scapterisci-tami’: chiều dài IJs nhỏ hơn 600μm, có
13 loài.
Nhóm ‘affine-intermedium’ : chiều dài cơ thể IJs từ 600-700μm, nhóm
này có 3 loài.
Nhóm ‘feltiae-kraussei-oregonense’ : chiều dài cơ thể IJs từ 7001000μm, nhóm này có 21 loài.
Nhóm ‘arenarium-glaseri-karii-longicaudum’ : chiều dài cơ thể IJs lớn
hơn 1000μm, nhóm này có 11 loài.
Nhóm ‘bicornutum-ceratophorum-riobrave’ : có cấu trúc mấu đôi ở
vùng môi IJs, nhóm này có 7 loài.
Patricia Stock et al., (2004) đã quan sát các đặc điểm hình thái và
nghiên cứu các bằng chứng về phân tử (các nghiên cứu lai chéo) để chỉ ra
những khác biệt của S. hermaphroditum từ những Steinernema spp. khác.
Loài mới này được mô tả bởi sự có mặt lưỡng tính trong cá thể trưởng thành
thế hệ 1. Những đặc điểm hình thái chính bao gồm: một đuôi hình ngón với 1
mucro và một túi nhận tinh dạng tuyến chứa tinh dịch trong cá thể lưỡng tính
thế hệ 1. Các bằng chứng phân tử từ những phân tích RFLP về ITS rDNA,
trình tự 28S rDNA, và xây dựng lại cây phát sinh chủng loại. Loài mới này có

quan hệ gần gũi với loài S. carabaei.
Mutsuhiro Yoshida (2004) đã nghiên cứu và mô tả 1 loài EPN mới,
Steinernema litorale đã được phân lập từ các mẫu đất cát ở Nhật bản. Loài
mới này được mô tả theo những đặc điểm về hình thái: ấu trùng cảm nhiễm

13


tuổi 3 có chiều dài cơ thể trung bình 909 ± 42,1μm, chiều dài đuôi trung bình
83 ± 4,5 μm. Loài này khác biệt hẳn so với các loài giống nhau về hình thái
(S. feltiae, S. thanhi, S. karii, S. scarabaei, S. kraussei, S. oregonense, S. loci
và S. diaprepesi) bằng các phân tích RFLP. Những nghiên cứu về hình thái và
phân tử cũng cho thấy loài mới này rất giống với S. feltiae, nhưng các kiểm
tra lai chéo đã cho thấy rằng đó là loài mới.
Dựa trên các dữ liệu về hình thái và phân tử, Khuong b. Nguyen, 2004
đã đưa ra một loài mới phân lập từ Yirgalem, Ethiopia Steinernema
yirgalemense. Loài mới này thuộc nhóm bicornutum là nhóm tuyến trùng có
các cấu trúc giống sừng trong vùng môi của ấu trùng cảm nhiễm. Cá thể ấu
trùng cảm nhiễm có chiều dài cơ thể khoảng 635 μm, chiều dài đuôi 62 μm.
Bằng việc mô tả chiều dài trình tự ITS (960bp), ITS1 (270bp) ITS2 (284bp)
chứng tỏ loài mới Steinernema yirgalemense có quan hệ họ hàng với S.
abbasi.
L. Qiu et al., (2005) đã nghiên cứu và mô tả một loài EPN mới là
Steinernema akhursti được thu thập từ các mẫu đất tại tỉnh Yunan, Trung
Quốc. Dữ liệu về hình thái cũng như phân tử đều chỉ ra rằng S. akhursti thuộc
về nhóm loài S. feltiae. Những đặc điểm về hình thái khác biệt của
Steinernema akhursti như: chiều dài gai 90 ± 4,6 μm, đầu mút của gai có một
kẽ hở ở mặt bụng. Các đặc điểm hình thái của ấu trùng cảm nhiễm được mô
tả: chiều dài cơ thể 812 ± 19 μm, đuôi dài và mảnh có phần thắt lại trong suốt
với chiều dài 73 ± 2,9 μm, đây là đặc điểm để xác định loài mới. Việc xác

định trình tự của chuỗi 28S rDNA cũng chứng minh S. akhursti là loài mới,
kết quả kiểm tra lai chéo cho thấy loài này gần gũi với S. feltiae và S.
oregonense.
Khương B. Nguyễn (2006) đã nghiên cứu một loài EPN mới,
Steinernema khoisanae được mô tả từ Nam Mỹ. Loài mới có các đặc điểm
hình thái về ấu trùng cảm nhiễm với chiều dài cơ thể 1076 μm, chiều rộng cơ

14


thể 33 μm, chiều dài từ đầu đến lỗ bài tiết 94 μm, đuôi dài 84 μm. Số đường
bên của loài mới là 2, 7, 8, 6, 4 và 2. Cá thể đực trưởng thành thế hệ 1 có thể
phân loại bởi vulva không thò ra và đuôi có mucron lồi lên. Steinernema
khoisanae được mô tả về mặt di truyền bởi các trình tự của các vị trí đệm và
các vùng D2/D3 của 28S rDNA. Cây phát sinh phả hệ cho thấy S. khoisanae
và các thành viên khác của nhóm S. glaseri thuộc một nhánh.
b. Vi khuẩn cộng sinh
Song song với việc nghiên cứu về tuyến trùng, các nhà khoa học còn
nghiên cứu về các loài vi khuẩn cộng sinh với các tuyến trùng. Phương pháp
PCR khuyếch đại gen 16S-rARN của vi khuẩn là phương pháp nhanh nhất và
phổ biến nhất hiện nay trong phân loại vi khuẩn (Brunel et al, 1997). Bằng
phương pháp này các nhà khoa học đã phân loại đến loài 18 chủng vi khuẩn
Xenorhabdus và 8 chủng Photorhabdus.
Năm 1997, Emília Szállás et al. đã phân tích trình tự của gen 16S rRNA
của 40 chủng vi khuẩn cộng sinh được phân lập từ tuyến trùng
Heterorhabditis spp. và 7 vi khuẩn cộng sinh của tuyến trùng Steinernema
spp. được phân lập từ những vùng địa lý khác nhau, và trình tự của một vài
chủng tham khảo trong họ Enterobacteriaceae. Kết quả giải trình tự cho thấy
chiều dài gen của chủng Xenorhabdus khoảng 1339 nucleotide, còn của các
chủng vi khuẩn còn lại nằm trong khoảng 1428 đến 1452 nucleotide. Phân

tích phát sinh chủng loại cho thấy các loài thuộc chủng Xenorhabdus,
Photorhabdus và các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae phân ra
thành 3 nhánh khác nhau, trong đó Photorhabdus được phân chia thành 5
nhánh phụ.
Marion Fischer et al., (1998) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của
117 chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng
Xenorhabdus và Photorhabdus bằng sự phân tích RFLP của sản phẩm PCR
gen 16S rRNA (rDNAs). Tác giả đã xác định được 30 kiểu gen 16S riêng biệt

15


và nhóm chúng vào các giống Xenorhabdus và Photorhabdus. Cả 2 giống đều
đa dạng về kiểu gen và có liên quan tới sự phân bố của tuyến trùng vật chủ.
Marion Fisscher et al., (1999) đã dựa trên những đặc tính về hình thái,
sinh lý, hóa sinh để sắp xếp một số chủng vi khuẩn Photorhabdus vào 3
nhóm: nhóm I (nhiệt độ sinh trưởng tối đa từ 35-39C) gồm những vi khuẩn
cộng sinh với tuyến trùng Heterorhabditis bacteriophora và Heterorhabditis
indica. Nhóm II (nhiệt độ sinh trưởng tối đa 33-35 0C) gồm những chủng vi
khuẩn cộng sinh với H. megidis, H. zealandica. Nhóm III (nhiệt độ sinh
trưởng tối đa là những vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh ở người.
Dựa trên phân tích cây phát sinh chủng loại xây dựng từ trình tự gen 16S
rRNA các tác giả đã đề xuất phân 2 loài mới: P. luminescens subsp.
luminescens, P. luminescens subsp. akhurstii, P. luminescens subsp.
laumondii, tách ra từ chủng Photorhabdus luminescens, và 2 loài P.
temperata, P. temperata subsp., temperata tách ra từ chủng Photorhabdus
temperata.
Isabelle Babic et al., (2000) đã nghiên cứu mối quan hệ giữa vi khuẩn
cộng sinh với tuyến trùng

Heterorhabditis indica với vi khuẩn

Ochrrobactrum spp. Các vi khuẩn cộng sinh tự nhiên Photorhabdus
luminescens subsp. akhurstii được phân lập từ tuyến trùng ký sinh gây bệnh
côn trùng Heterorhabditis indica. 14 vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng được
chọn lọc từ 3 đảo Caribbean khác nhau, được mô tả bằng những kiểm tra kiểu
hình thường, phân tích trình tự và đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn của
PCR gen 16S rRNA (16S rDNAs). Các phân lập được nhóm vào 3 kiểu
genome, mỗi nhóm tương ứng với một đảo Caribbean. Các đặc điểm kiểu
hình và phân tích 16S rDNA chỉ ra rằng vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus có
quan hệ gần gũi với Ochrobactrum anthropi.
Liu et al., 2001 đã so sánh trình tự của 2 chủng vi khuẩn cộng sinh với
tuyến trùng Heterorhabditis marelatus và Steinernema oregonense thu được

16