Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể của loài dầu nước (dipterocarpus alatusroxb ex g don) ở rừng nhiệt đới đông nam bộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG
NGHỆ VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----o0o----

NGUYỄN MINH ĐỨC

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CỦA LOÀI DẦU NƯỚC (DIPTEROCARPUS
ALATUS ROXB. EX G.DON) Ở RỪNG NHIỆT ĐỚI ĐÔNG NAM BỘ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 01. 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS.
Nguyễn Thị Phương Trang

Hà Nội – 2014


MỤC LỤC
Trang
Trang

bìa

phụ

..........................................................................................

lục....................................................................................................................

Lời

Mục
cảm

ơn.............................................................................................................. i Danh mục các từ viết
tắt,

ký

hiệu..........................................................................

..............................................................................................

ii

iii

...............................................................................................

Danh
Danh
iv

mục
mục
MỞ

.............................................................................................................. 1
NỘI DUNG........................................................................................................... 4
Chương 1. Tổng quan tài liệu................................................................................ 4
1.1Tổng quan về họ Dầu ....................................................................................... 4
1.2 Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) ........................................................... 4
1.3 Một số khái niệm về quần thể thực vật và phân cắt nơi sống ......................... 5
1.3.1 Quần thể thực vật ................................................................................... 5
1.3.2 Nơi sống và phân cắt .............................................................................. 6
1.3.3 Quần thể nhỏ và cô lập........................................................................... 7
1.3.4 Bảo tồn và quản lý tài nguyên di truyền thực vật .................................. 7
1.4 Một số kỹ thuật trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa
phân tử ............................................................................................................. 9
1.5 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae)........ 13
1.6 Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số loài cây họ Dầu
(Dipterocarpaceae) trên cơ sở vùng gen matK ............................................. 14
Chương 2. Đối tượng, địa điểm và phương pháp nghiên cứu............................. 17

các

bảng

các

hình
ĐẦU

2.1 Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 17
2.2 Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 18
2.2.1 Địa điểm nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể của 10 quần thể Dầu nước
(Dipterocapus alatus).......................................................................................... 18
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài họ Dầu .... 20
2.3 Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 22
2.3.1 Khảo sát thực địa.................................................................................. 22
2.3.2 Phương pháp thu mẫu .......................................................................... 22
2.3.2 Phân tch trong phòng thí nghiệm ........................................................ 22
2.4 Phân tích số liệu ............................................................................................ 28
2.4.1 Đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước.................................... 28
2.4.2 Mối quan hệ di truyền của một số loài cây họ Dầu ............................. 28
Chương 3. Kết quả và thảo luận.......................................................................... 30
3.1 Nơi sống, cấu trúc phân tầng rừng, hiện trạng quần thể Dầu nước ngoài tự
nhiên .................................................................................................................... 30
3.1.1 Nơi sống và cấu trúc phân tầng rừng ................................................... 30
3.1.2 Cấu trúc tuổi quần thể của loài Dầu nước............................................ 45
3.1.3 Hiện trạng quần thể Dầu nước ngoài tự nhiên, một số nguyên nhân làm suy giảm
kích thước quần thể ....................................................................... 46
3.2 Đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước ............................................. 48
3.2.1 Kết quả tách chiết DNA, PCR và điện di sản phẩm ............................ 48
3.2.2 Kết quả phân tích đa dạng di truyền quần thể...................................... 51
3.3 Đặc điểm vùng gen matK và mối quan hệ di truyền của 11 loài Dầu ở Việt
Nam ..................................................................................................................... 58
Danh sách các trình tự đã được công bố lên Ngân hàng gen thế giới


(Genbank):........................................................................................................... 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 65
Kết luận ............................................................................................................... 65
Kiến nghị ............................................................................................................. 66
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, do áp lực tăng dân số và tốc độ phát triển kinh tế diễn ra
nhanh, thảm thực vật rừng tự nhiên, nơi chứa đựng đa dạng sinh học cao ở nước ta bị phân
cắt và suy giảm mạnh. Các mảnh rừng còn sót lại hiện nay là hậu quả của quá trình phân cắt
và thường bị giới hạn về kích thước. Những quần thể thực vật rừng thường dễ bị tổn thương
và ít có khả năng thích nghi khi môi trường sống bị thay đổi, đặc biệt khi chịu áp lực của biến
đổi khí hậu.
Các cây họ Dầu là những loài cây rừng chiếm ưu thế, đóng vai trò quan trọng trong
cân bằng sinh thái và kinh tế. Hiện có hơn 45 loài được biết đến từ 6 chi ở Việt Nam, chủ yếu
là bản địa và đặc hữu. Do có giá trị thương mại cao và do nhu cầu sử dụng gỗ tại các địa
phương mà các cây họ Dầu đang bị khai thác một cách mạnh mẽ. Hơn nữa, trong nhiều năm,
áp lực tăng trưởng kinh tế đã dẫn đến sự suy giảm lớn trong khu vực rừng và tăng mức độ
phân mảnh tại những khu rừng còn sót lại. Những xu hướng thay đổi này dẫn đến những
ảnh hưởng trực tiếp mang tính bất lợi đến môi trường sống và đe dọa nghiêm trọng sự
tồn tại của các cây họ Dầu. Hiện nay, 33 loài cây họ Dầu đang bị đe dọa ở mức độ toàn cầu.
Loài cây Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb. ex G.Don) đã và đang được sử dụng rộng rãi
cho lĩnh vực làm đồ nội thất và xây dựng. Bên cạnh đó, chúng còn được sử dụng như một
nguồn cho tnh dầu có giá trị và được sử dụng phổ biến trong thương mại. Loài Dầu này phân
bố trong các khu rừng nhiệt đới vùng đất thấp. Ở Việt Nam, do sự giảm của môi trường sống
và khai thác quá mức, loài cây này đã được liệt kê là bị đe dọa.
Cho đến nay, vẫn thiếu các thông tin quan trọng về đa dạng di truyền ở cấp độ
quần thể và loài, đặc biệt là những tác động có hại từ hoạt động của con người đến loài Dầu
nước (Dipterocarpus alatus). Nghiên cứu này sẽ góp phần giải quyết các vấn đề có liên quan

và cung cấp thêm thông tin cho ngành kiểm lâm để nhấn mạnh sự cần thiết của việc bảo tồn
và sử dụng các loài của các cộng đồng địa phương. Để nâng cao sự hiểu biết về sinh học
bảo tồn, luận văn tiến


hành xác định các thông số di truyền học quần thể và sự phát triển của loài, cũng như quá
trình chia cắt nơi sống có liên quan đến các hoạt động của con người.
Mục tiêu nghiên cứu
- Mục tiêu chung:
Đóng góp cho công tác bảo tồn và phục hồi hữu hiệu các loài quý hiếm đang bị đe
doạ ở Việt Nam. Giúp các nhà quản lý hiểu biết sâu hơn về mức độ tến hoá, quan hệ di
truyền giữa các loài cây họ Dầu. Các yếu tố tác động của con người làm xói mòn cấu trúc
di truyền quần thể và loài. Mục têu này cũng sẽ giúp cộng đồng các nhà khoa học hiểu biết
rõ hơn về quá trình tuyệt chủng cũng như mức độ tiến hoá loài không chỉ cho các loài cây họ
Dầu mà còn có thể áp dụng cho các loài cây khác có lịch sử sống tương tự và nâng cao đời
sống cộng đồng địa phương.
- Mục tiêu cụ thể:
Xác định được mức độ đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước
(Dipterocarpus alatus) có phân bố tại Việt Nam.
Xác định được các nguyên nhân làm mất tính đa dạng di truyền quần thể,
đưa ra các giải pháp phục hồi và sử dụng bền vững loài Dầu nước.
Xác định mối quan hệ di truyền của một số loài trong họ Dầu phân bố ở
Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
Khảo sát, điều tra hiện trạng về phân bố, cấu trúc quần thể của loài Dầu nước phân
bố tại 4 tỉnh miền Đông Nam Bộ Việt Nam gồm: Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa –
Vũng Tàu, 1 tỉnh Nam Trung Bộ: Phú Yên và 1 tỉnh Tây Nguyên: Đắk Lắk.
Xác định các thông số di truyền và phân tích ảnh hưởng của các biến động môi trường
sống có liên quan đến tác động của con người đến các quần thể của loài Dầu nước ở 6 tỉnh
miền Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên Việt Nam bằng phương pháp SSR (Simple

Sequence Repeats).


Xác định mối quan hệ di truyền của các loài thuộc họ Dầu ở Việt Nam
trên cơ sở phân tích trình tự gen matK.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn:
Luận văn không những cho phép các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về mức độ
suy giảm đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài của loài Dầu nước (Dipterocarpus
alatus) mà còn áp dụng cho các loài Dầu khác đang bị đe doạ và xác định được vị trí phân
loại trên cơ sở phân tích trình tự vùng gen matK cho một số loài Dầu ở Việt Nam.
Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhật thông tn về giá trị
bảo tồn và nâng cao sự hiểu biết của người dân sống gần rừng về sự tuyệt chủng loài cần
bảo vệ.
Kết quả của luận văn đóng góp cho công tác bảo tồn và quản lý hữu hiệu nguồn gen
của các loài thực vật quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng, nâng cao hiểu biết rõ hơn về
phương thức sinh sản và mức độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể Dầu, thu thập
thông tin về ảnh hưởng của người dân địa phương đến tính đa dạng di truyền của loài.


CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về họ Dầu
Họ

Dầu còn

được

gọi

là Họ

Hai

cánh có

danh

pháp

khoa

học là

Dipterocarpaceae gồm có 17 chi và khoảng 580-680 loài cây thân gỗ chủ yếu phân bố ở các
rừng mưa nhiệt đới vùng đất thấp với quả hai cánh. Tên gọi khoa học của họ xuất phát từ
chi điển hình là Dipterocarpus, có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (di = hai, pteron = cánh và
karpos = quả, nghĩa là quả có hai cánh). Các chi lớn nhất là Shorea (196-360 loài), Hopea
(105 loài), Dipterocarpus (70 loài) và Vatca (60-65 loài). Nhiều loài chiếm ưu thế trong các
cánh rừng nhiệt đới núi thấp (dưới 500m so với mặt nước biển), thông thường có thể cây
cao tới 40–
70m, đôi khi trên 80m (Dryobalanops, Hopea và Shorea). Chúng phân bố rộng khắp vùng
nhiệt đới, từ miền bắc Nam Mỹ tới Châu Phi, Seychelles, Ấn Độ, Đông Dương và
Malaysia, với sự đa dạng và phổ biến nhất ở miền tây Malaysia. Theo Nguyễn Hoàng Nghĩa
(2005) [4], Việt Nam có 42 loài cây Dầu thuộc 6 chi: Anisoptera (1 loài), Dipterocarpus (12
loài), Hopea (11 loài), Parashorea (2 loài), Shorea (8 loài) và Vatica (8 loài). Phần lớn
những loài này được tìm thấy trong rừng nhiệt đới thường xanh và rừng khộp hỗn giao ở
độ cao khoảng
500m. Các cây họ Dầu đóng vai trò quan trọng về sinh thái và kinh tế trong hệ sinh thái rừng
núi thấp. Gỗ thường được sử dụng để đóng tàu, thuyền. Nhựa cây được sử dụng cho việc
sơn và làm đồ mỹ nghệ.

1.2 Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus)
Cây Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb. ex G.Don) phân bố trong rừng nhiệt
đới ẩm núi thấp ở Việt Nam, Lào, Campuchia và Thái Lan. Ở Việt Nam, loài này phân bố rộng
từ Nam Trung Bộ đến Đông Nam Bộ và Phú Quốc. Dầu nước là cây gỗ lớn, chiều cao thông
thường 30-35m, nhưng có khi đạt tới
40-45m, đường kính ngang ngực đạt tới 250cm. Dầu nước thường chiếm tầng cao, ưu thế
của rừng. Thân tròn đều, dáng thẳng đẹp. Gỗ màu nâu đỏ nhạt, thớ thô, bền. Cây trước
tuổi trưởng thành có tán lá hình chóp nhưng khi trưởng


thành, cây có tán lá hình lọng. Vỏ cây mỏng có màu xám trắng và nhẵn. Lá đơn mọc cách, lá
hình bầu dục hoặc trái xoan, dài 10-20cm, rộng 5-15cm; đầu hơi nhọn; gốc lá hình nêm hay
hình tròn. Phiến lá có màu xanh thẫm ở mặt trên, màu xanh nhạt và có lớp lông mịn phủ
ở mặt dưới, gân bên 11-18 đôi. Lá kèm có lông màu vàng xám nhạt. Quả gần hình cầu, có 5
cạnh nổi rõ, đường kính 11,5cm. Quả có 5 cánh đài nhẵn; hai cánh to, cánh dài từ 10-14cm, rộng 1,5-2cm, xếp song
song, có màu đỏ tươi khi quả non và chuyển thành màu vàng khi quả chín già; 3 cánh nhỏ có
kích thước 1,2-1,4cm. Mỗi quả có 1 hạt. Mùa quả chín là tháng 3-4 hàng năm, thường tập
trung vào cuối tháng 3 và đầu tháng 4.
1.3 Một số khái niệm về quần thể thực vật và phân cắt nơi sống
1.3.1 Quần thể thực vật
Quần thể được định nghĩa là tập hợp một nhóm cá thể của một loài trong một nơi
sống cụ thể và như vậy, chúng độc lập với các quần thể khác nhau về quan hệ sinh sản. Về
mặt di truyền, quần thể liên quan ở mức độ cá thể, chúng được truyền từ thế hệ này sang
thế hệ khác, và cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như kích thước quần thể, sức sinh sản, khả
năng sống sót, phương thức sinh sản, trao đổi và đột biến di truyền. Kích thước quần thể là
kết quả của sự tương tác phức tạp liên quan đến các điều kiện môi trường sống và các đặc
tính quần thể của loài. Kích thước quần thể đóng vai trò quan trọng liên quan đến phương
thức sinh sản, di truyền và tiến hoá. Nguồn gốc tiến hoá thường liên quan đến cá thể lai (thế
hệ tiếp theo) trong quần thể và loài. Thụ phấn chéo từ cá thể của dòng này với cá thể của
dòng khác có thể sản sinh những cá thể lai đa dạng. Cấu trúc di truyền của những cá thể này

có nhiều cơ hội đóng góp vào tính đa dạng trong quần thể và duy trì khả năng thích nghi cao
trong hoàn cảnh môi trường sống. Tác động của con người đến môi trường sống thường dẫn
đến sự phá vỡ cấu trúc quần thể và thiết lập những quần thể nhỏ, cô lập và cuối cùng làm
suy giảm khả năng thích nghi của quần thể với môi trường sống của chúng. Ở những thế hệ
được sản sinh bằng thụ phấn cận noãn sẽ dẫn đến 3 hậu quả nghiêm trọng: sự


khác nhau về di truyền giữa các quần thể bị thu hẹp, mất tnh đa dạng di truyền
và tăng tần số gen đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ.
1.3.2 Nơi sống và phân cắt
Nơi sống của mỗi loài được thiết lập trong quá trình hình thành loài. Phân cắt xảy ra
khi nơi sống bị chia nhỏ và cô lập với nhau bằng ma trận các cảnh quan khác nhau không
giống ban đầu và không phù hợp cho sự tồn tại của loài. Như vậy, phân cắt tạo nên sự phá
vỡ nơi sống. Tác nhân gây ra phân cắt bao gồm: mở rộng đất nông nghiệp, khai thác không
hợp lý tài nguyên sinh vật, xây dựng khu dân cư, các công trình phát triển kinh tế và khai thác
khoáng sản. Phân cắt đe dọa đến tính thống nhất sinh thái của một vùng rộng lớn đã được
hình thành trong lịch sử phát triển loài và là một trong những nguyên nhân gây ra sự tuyệt
chủng (Schonewald-Cox et al., 1983) [49]. Suy giảm diện tch nơi sống sẽ ảnh hưởng đến kích
thước quần thể và sự phân mảnh nơi sống còn sót lại sẽ ảnh hưởng đến sự phát tán loài. Hậu
quả của quá trình phân cắt thường làm suy giảm chức năng hệ sinh thái và cuối cùng mất nơi
sống. Các quần thể nhỏ và bị cô lập trong các mảnh nơi sống còn sót lại dễ bị tổn thương
và ít có khả năng thích nghi khi điều kiện môi trường sống của chúng bị thay đổi (Keller
và Waller,
2002) [29]. Tất nhiên, hậu quả sẽ dẫn đến mất tính đa dạng di truyền ở cả hai mức độ
quần thể và loài và cuối cùng nhiều loài bị đe doạ tuyệt chủng.
Các mảnh rừng tự nhiên còn sót lại hiện nay là hậu quả của sự phân cắt và thường bị
giới hạn về kích thước và suy giảm về chất lượng. Các mảnh rừng này có thể chứa đựng
những quần thể nhỏ và bị cô lập bởi khoảng cách lớn. Đây là bước đầu tiên của quá trình suy
giảm nơi sống, dẫn đến mất chức năng của hệ sinh thái và cuối cùng là mất nơi sống. Quần
thể nhỏ và cô lập thường dễ bị tổn thương và ít có khả năng thích nghi khi môi trường sống

bị thay đổi do cấu trúc hữu hiệu được thiết lập trong quá trình hình thành loài và quần thể bị
phá vỡ. Phân cắt nơi sống có ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sinh sản của loài và
được gây ra bởi những biến đổi bất lợi của môi trường, kích thước và cấu trúc di truyền quần
thể.


1.3.3 Quần thể nhỏ và cô lập
Kích thước quần thể là kết quả của mối quan hệ phức tạp các nhân tố khác nhau bao
gồm lịch sử hình thành quần thể, điều kiện môi trường sống và đặc điểm sinh thái của mỗi
loài. Kích thước quần thể phản ánh quá trình thụ phấn, cấu trúc di truyền và mức độ tến
hoá của loài, được ghi nhận lần đầu tiên bởi Wright vào năm 1931 và 1938. Phần lớn các
loài đang bị đe doạ đều nhỏ về số cá thể trong mỗi quần thể và số quần thể, đều tồn tại
trong những mảnh rừng nhỏ và cô lập (Ashton, 1987) [7]. Một trong những hậu quả của
quần thể nhỏ và cô lập là xuất hiện mối quan hệ cận noãn giữa các cá thể trong quần thể
(Lande,
1999) [33]. Ảnh hưởng này có thể làm mất tính đa dạng di truyền nếu tần số và cường độ
quan hệ cận noãn cao. Cuối cùng là giảm khả năng thích nghi của quần thể trong điều
kiện môi trường biến đổi và khả năng nhạy cảm đối với dịch bệnh (Hamilton, 1982) [22].
Barrett và Kohn (1991) [9] đã chỉ ra rằng với kích thước quần thể nhỏ (<100 cá thể), tần số
alen có thể khác nhau đáng kể giữa các thế hệ với nhau. Kết quả của quá trình này sẽ làm
mất alen và tnh đa hình tại mỗi lô cút liên quan đến áp lực môi trường. Byer và Meagher
(1992) [12] cũng chỉ ra rằng quần thể quá nhỏ (<50 cá thể) không có khả năng duy trì các
alen chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường.
1.3.4 Bảo tồn và quản lý tài nguyên di truyền thực vật
Công việc bảo tồn nguồn gen thực vật là duy trì tiềm năng tiến hoá và tnh chống chịu
của loài trong điều kiện môi trường sống bất lợi. Do vậy, đánh giá số lượng cá thể và các
tham số đa dạng di truyền quần thể và loài được ghi nhận như là chìa khoá dẫn đến thành
công trong lĩnh vực quản lý bền vững các loài đang bị đe doạ (Falk và Holsinger, 1991) [18].
Tiềm năng tiến hoá và khả năng phục hồi của mỗi loài phụ thuộc vào tính đa dạng di
truyền ở cả mức độ quần thể và loài của loài đó. Tư liệu về sinh thái và di truyền quần thể

sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý xây dựng chiến lược bảo tồn và quản lý
các loài bị đe doạ một cách bền vững và hiệu quả. Phần lớn công việc bảo tồn loài đều
hướng trực tiếp vào duy trì nơi sống, cụ thể là quan tâm đến kích thước và


tốc độ phát triển quần thể và loài. Tuy nhiên, để bảo tồn hữu hiệu bất kỳ loài nào các nhà
quản lý cần phải đưa ra chiến lược duy trì tính đa dạng di truyền ở cả hai mức độ quần thể và
loài. Kích thước quần thể đủ lớn sẽ phòng tránh tốt hơn quá trình xói mòn di truyền và duy
trì lâu bền sự sống của loài trong môi trường sống của chúng. Suy giảm tnh đa dạng di
truyền thông qua các áp lực về biến đổi bất lợi của môi trường liên quan đến cấu trúc quần
thể và thụ phấn cận noãn trong quần thể nhỏ và biệt lập là những yếu tố chính gây nên
tổn thương khả năng tồn tại lâu dài của quần thể và loài.
Hai hình thức bảo tồn loài đang bị đe doạ là bảo tồn nguyên vị và bảo tồn chuyển vị.
Đây là cơ sở khoa học phục vụ công tác bảo tồn tnh đa dạng di truyền quần thể và
loài. Mối quan hệ này sẽ cung cấp thông tn về các đặc điểm sinh thái loài và quần thể. Nó
sẽ khắc phục về số lượng cá thể trong mỗi quần thể nhỏ và củng cố các giải pháp quản lý và
bảo tồn nguyên vị và chuyển vị.

Hạt

Dự trữ hạt
Một phần
Mầm

Hạt

Cả cây
Cây
Quần thể tại chỗ

Cây ở vườn
Thu thập hạt ở vườn

Hình 1.1. Sơ đồ bảo tồn chuyển vị (theo Brown và Briggs, 1991) [11]
Quá trình thiết lập hoạt động bảo tồn chuyển vị được trình bày ở Hình 1.1. Quần thể của các
loài đang bị đe dọa là đối tượng cho công tác bảo tồn nguyên vị và cung cấp nguyên liệu như
hạt và các phần khác của cây cho công tác bảo tồn chuyển vị. Bảo tồn chuyển vị đóng vai trò
duy nhất để lấp vào khoảng trống và nâng cao tính đa dạng di truyền quần thể và cung cấp
nguồn giống cho những nơi đang bị phá hoại (Millar và Libby, 1991) [43]. Duy trì nơi sống
của loài là bảo vệ tính thống nhất vật liệu di truyền và thống nhất mối quan hệ về tến hoá.


Mối quan hệ tương tác giữa các cá thể, quần thể và loài với nhau và với điều kiện môi
trường sống để duy trì quá trình tiến hoá của loài. Millar và Libby (1991) [43] đã xác định
đơn vị quản lý nguồn tài nguyên di truyền là đơn vị diện tch rừng được thiết kế cho các
đối tượng quản lý tài nguyên này ở mức tối thiểu. Mục đích là điều khiển thành phần di
truyền cho mỗi loài trong mỗi đơn vị quản lý để duy trì, phục hồi tài nguyên di truyền tự
nhiên. Các tác giả đã lưu ý rằng đa dạng di truyền trong những đơn vị quản lý bị ảnh hưởng
bởi những điều kiện bên ngoài thông qua “ô nhiễm vật liệu di truyền” và áp lực chọn
lọc tự nhiên bị thay đổi do các hoạt động của con người. Tác động tiềm năng từ “ô nhiễm”
này phụ thuộc vào mức độ khác nhau của tần số alen và tính thích nghi môi trường trong
mỗi đơn vị quản lý. Rõ ràng, bảo tồn nguyên vị và bảo tồn chuyển vị là rất cần thiết để bảo vệ
và duy trì số lượng các loài, cũng như phục hồi nơi sống của chúng.
1.4 Một số kỹ thuật trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử
Việc đánh giá ảnh hưởng của sự phân cắt nơi sống, điều tra tnh đa dạng di truyền
và sinh thái ở cả hai mức độ quần thể và loài quý hiếm trong tự nhiên có vai trò quan trọng
góp phần đưa ra chiến lược và các giải pháp bảo tồn một cách hữu hiệu. Nhiều nghiên cứu
đã đề cập đến mức độ suy giảm tính đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể thực vật
liên quan đến quá trình phân cắt nơi sống (Bahulikar et al., 2004; Cascante et al., 2002; Godt
et al., 1996; Keller và Waller, 2002; Templeton et al., 1990) [8, 13, 20, 29, 54]. Các tác giả đã

chỉ ra rằng suy giảm tnh đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lượng cá thể thấp trong
quần thể tại thời gian nơi sống bị phân cắt. Hệ số thụ phấn cao giữa các cá thể có quan hệ
cận noãn cũng là yếu tố làm suy giảm tnh đa dạng di truyền. Phân cắt nơi sống có thể
hạn chế mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền
khác nhau giữa chúng.
Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự phát triển mạnh mẽ,
tạo ra công cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sự sống ở cấp độ phân tử, các kỹ thuật
sinh học phân tử cũng nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng
sinh học, tạo ra lĩnh vực khoa học mới như tiến


hóa phân tử, di truyền bảo tồn. Để nghiên cứu đa dạng di truyền quẩn thể và loài thực vật,
ngoài kỹ thuật isozyme, còn có kỹ thuật DNA với các phương pháp như RAPD, SSR, ISSR,
AFLP, RFLP, vv.
Kỹ thuật isozyme
Kỹ thuật Isozyme là kỹ thuật nghiên cứu sự đa hình enzyme. Phương pháp này
được Hunter và Market đưa ra từ năm 1957, được Harris hoàn thiện vào năm 1966 và bắt
đầu được sử dụng phổ biến từ thập niên 70 đến nay. Di truyền quần thể cần thiết phải
nghiên cứu nguyên nhân và hậu quả của sự biến đổi di truyền trong/giữa các quần thể. Kỹ
thuật isozyme được sử dụng như dấu phân tử cho mục tiêu này. Mặc dù hiện nay đã có
nhiều kỹ thuật DNA phát triển nhưng kỹ thuật isozyme vẫn được sử dụng vì cách thức thực
hiện tương đối nhanh, chi phí thấp, thích hợp cho các nghiên cứu xác định mức độ biến đổi
di truyền ở cấp độ thấp. Ngoài ra việc kết hợp kỹ thuật isozyme với các kỹ thuật nghiên cứu
đa hình DNA cho phép phân tch, so sánh những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều
kiện khác nhau của môi trường (Thanh, 2005) [5].
Kỹ thuật RAPD
RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA – đa hình các đoạn DNA
được khuếch đại ngẫu nhiên) do Williams phát minh năm 1990 (Williams et al.,
1990) [61], Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991 (Welsh et al., 1991) [60]. Phương pháp
này sử dụng cùng một số mồi ngẫu nhiên (mồi ngẫu nhiên là các đoạn oligo nucleotide gồm

khoảng 8 đến 20 Nucleotide) để thực hiện phản ứng PCR nhằm nhân các đoạn DNA đặc
trưng của các mẫu nghiên cứu. Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn,
sản phẩm PCR thu được gồm các đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc.
Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR sẽ nhân được các đoạn
khác biệt nhau (Dung et al., 2005; Thanh, 2005) [1, 5].
Kỹ thuật RFLP
RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài các
đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn). Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của


các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt được bằng
điện di đồ, các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân tay” đặc trưng cho từng phân tử DNA.
Bản đồ di truyền kết quả RFLP có tnh chính xác cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu
sự khác biệt trong cấu trúc bộ gene của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự
khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu, xác định nguồn gốc hoặc mức độ tến hóa giữa
của các loài sinh vật (Dương, 2002; Thanh, 2005) [2, 5].
Kỹ thuật này được dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến nay. Kỹ thuật RFLP được
sử dụng để kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo qui luật Mendel, hoặc
ứng dụng trong chọn giống động vật, chọn giống thực vật hoặc so sánh sự khác nhau giữa
các cá thể, các loài sinh vật... Kỹ thuật RFLP được thực hiện trên nguyên lý cắt enzyme giới
hạn. DNA của mẫu nghiên cứu sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được cắt với cùng
một số loại enzyme giới hạn. Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắt đặc hiệu DNA ở
những vị trí xác định, do đó các bộ gene có cấu trúc khác nhau sẽ cho ra số lượng và kích
thước các đoạn cắt DNA khác nhau, những bộ gene giống nhau thì sẽ cho ra số lượng, kích
thước các đoạn cắt giống nhau, kích thước và số lượng các đoạn cắt này sẽ quan sát được
trên điện di đồ.
Kỹ thuật AFLP
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), được hiểu là sự đa dạng
của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng, sử dụng những phân đoạn DNA này làm
khuôn cho phản ứng khuếch đại (PCR). Kỹ thuật này được Vos và cộng sự phát triển vào

năm 1995 và ngay lập tức trở thành một công cụ hữu ích để nhận biết nhiều lô cút trong
sự đa hình DNA mà không cần biết trước thông tn về trình tự DNA của chúng. Phương pháp
này có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần
thể với nhau (Watson và Barker, 2004) [59].
Kỹ thuật SSR


Microsatellite hoặc SSR (Simple Sequence Repeat) là những trình tự nucleotide
đặc biệt lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn oligonucleotde ngắn, đơn giản, còn gọi là vi vệ
tinh. Phương pháp truy tm các phân đoạn DNA đơn giản lặp lại được gọi là phương pháp vi
vệ tinh (microsatellite) do Litt và Luty phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử năm
1989 (Litt and Luty, 1989) [39]. Genome sinh vật nhân thật có nhiều đoạn DNA lặp lại, các
đoạn dài ngắn khác nhau tùy theo từng loài. Các chuỗi lặp lại này thường từ 1–6
nucleotide. Bản chất đa hình của SSR là nó có thể được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng
số của genome nhờ sử dụng hai mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu vùng lặp lại. Giá trị
của SSR là do nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ khắp genome và có
bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Cho đến nay kỹ thuật này đang được
ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật và thực vật.
Kỹ thuật ISSR
Kỹ thuật ISSR (internal simple sequence repeat) là kỹ thuật phân tch dựa trên việc
nhân bản đoạn DNA nằm giữa 2 vùng lặp đơn giản. Với ISSR, mồi là những đoạn lặp đơn
giản. Nguyên lý của phương pháp này là khuếch đại những đoạn trình tự nằm giữa 2 đầu lặp
đơn giản. Bộ gen của sinh vật bậc cao có nhiều đoạn DNA lặp lại, các đoạn lặp thường có
kích thước ngắn (vài nucleotide), số lần lặp lại là đặc trưng cho mỗi loài, mỗi giống. Ví dụ, ở
lúa có khoảng gần 1000 lần lặp lại trật tự AC/TG, khoảng trên 300 lần lặp lại trật tự
GATA/CTAT. Nhiều loài cây một lá mầm như ngô, lúa… lặp lại đoạn CGG/GCC.
Phân tích ISSR sử dụng mồi bổ trợ với các vùng microsatellite nên còn gọi là MPPCR có thể kế thừa mở rộng từ các phân tích microsatellites khác để tăng khả năng lặp lại
và giảm tnh đa hình so với RAPD. Các chỉ thị RAPD, ISSR được dùng nhiều trong lập bản
đồ, phân tích di truyền, chọn giống ở thực vật (Tam et al., 2009) [52].
1.5 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae)

Việc bảo tồn và quản lý của một loài đòi hỏi thông tn về đặc điểm sinh thái và đa
dạng di truyền trong và giữa các quần thể của loài đó. Và để có được những thông tin cần
thiết trên, cần có sự hiểu biết rõ ràng hơn về các quá trình di truyền và các kỹ thuật sinh học
hiện đại. Vì vậy, chỉ thị (marker) DNA đã được sử dụng để xác định mức độ khác biệt di
truyền giữa các quần thể. Chỉ thị microsatellite (lặp lại trình tự đơn giản, SSR) là hữu ích,
được sử dụng để phân tch hiệu quả sự trao đổi di truyền thông qua hạt phấn và sự phát tán
hạt trong quần thể. Vì vậy, các chỉ thị marker SSR với tính đa hình cao đã được áp dụng trong
các nghiên cứu về trao đổi di truyền, cấu trúc di truyền, và mối quan hệ sinh sản trong
các quần thể (Iwata et al., 2000; Pandey và Geburek, 2009; Takeuchi et al., 2004; Ujino et al.,
1998) [26, 45, 51, 58].
Tiềm năng tến hóa của loài phụ thuộc vào mức độ khác nhau di truyền của nó.
Hiểu biết về đa dạng di truyền sẽ cung cấp những thông tin hữu ích để xây dựng chiến lược
bảo tồn và sử dụng loài một cách bền vững. Đối với loài thực vật, thụ phấn chéo duy trì tiềm
năng lớn cho quá trình trao đổi di truyền, sẽ duy trì mức độ cao của đa dạng di truyền trong
quần thể và loài (Hamrick, 1983; Hamrick và Godt, 1989) [23, 24]. Các thông số về mức độ đa
dạng di truyền cao cũng đã tm thấy ở một số loài cây họ Dầu như Shorea lumutensis
(Boshier,
2011; Lee et al., 2004) [10, 36], S. leprosula (Keiya et al., 2001; Lee et al.,
2000; Rimbawanto và Isoda, 2001) [28, 35, 47]. Mức độ khác nhau di truyền giữa các
quần thể trong một số loài cây họ Dầu là thấp, cũng đã được báo cáo như Dryobalanops
aromatica (Gst=0,067, Lim et al., 2002) [38], Shorea leprosula (Gst=0,117, Lee et al., 2000)
[35] và Shorea lumutensis (Gst=0,048, Lee et al., 2004) [36]. Sự trao đổi di truyền thông qua
hạt phấn nhờ côn trùng và phát tán hạt nhờ gió và dòng nước đóng vai trò quan trọng cho
các loài cây họ Dầu (Appanah and Chan, 1981; Dayanandan et al., 1990) [6, 15].
1.6 Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số loài cây họ Dầu
(Dipterocarpaceae) trên cơ sở vùng gen matK
Sử dụng một vùng gen chuẩn được coi là một công cụ hiệu quả xác định
loài và phân loài, cũng như xác định mối quan hệ di truyền giữa các taxon với

nhau. So với gen ty thể (cytochrome c oxidase I), hiệu quả để xác định cho nhiều
nhóm động vật, tỷ lệ khác nhau của gen này là rất thấp trong thực vật. Hơn nữa, do cây
lai và tính đa bội ở thực vật, việc xác định vùng gen chuẩn mã là khó khăn hơn ở động vật.
Do đó, Kress et al. (2005) [31] đã đề xuất vùng gen trnH-psbA và sau đó Kress và Erickson
(2007) [32] đề xuất để kết hợp hai gen trnH-psbA và rbcL. Lahaye et al. (2008) [34] so sánh
tám vùng gen bao gồm trnH-psbA, matK, ycf5, rbcL, rpoB, ndhJ, accD và rpoC1 và xác định
gen matK như vùng gen chuẩn cho thực vật có hoa và cho thấy gen matK có thể hữu ích
trong việc xác định loài. Tuy nhiên, việc áp dụng chúng bị cản trở do các vấn đề như mức độ
khác nhau giữa các loài thấp. Nhóm nghiên cứu về thực vật (2009) [14], dựa trên đánh giá về
mức độ khác nhau giữa các loài trong bảy vùng DNA (atpF-atpH, matK, rbcL, rpoB, rpoC1,
psbK-psbL và trnH-psbA) đề nghị kết hợp 2 locus của carboxylase ribulose-1,5-bisphosphate
(rbcL) và maturase (matK) dùng để xác định loài và phân loài. Sự kết hợp 2 locus này sẽ xác
định loài và đóng góp vào sự phát hiện loài mới.
Họ Dầu Dipterocarpaceae bao gồm 17 chi và khoảng 680 loài và được chia thành
ba phân họ; Dipterocarpoideae chứa 13 chi và khoảng 600 loài trong rừng nhiệt đới núi thấp
ở châu Á, Pakaraimoideae với một loài duy nhất ở vùng cao nguyên Guaianan, Nam Mỹ và
Monotoideae với 3 chi và 30 loài ở Châu Phi và Nam Mỹ. Việt Nam bao gồm khoảng 42 loài
và 6 chi (Nguyễn Hoàng Nghĩa,
2005) [4]. Hầu hết các loài này phân bố chủ yếu ở rừng nhiệt đới thường xanh và rừng
hỗn giao lá ở Tây Nguyên và Đông Nam Bộ. Các cây họ Dầu đóng một vai trò quan trọng
trong hệ sinh thái và kinh tế của các khu rừng núi ở độ cao dưới 500m tại Việt Nam. Gỗ được
sử dụng với mục đích xây dựng, đóng tàu thuyền. Nhựa được sử dụng như một nguồn sơn,
đánh véc ni và sơn mài. Như một hệ quả của sự khai thác và phá rừng, môi trường sống
tự nhiên của nhiều loài cây Dầu bị suy thoái nghiêm trọng hoặc bị phá hủy. Để thiết lập các
biện pháp bảo tồn và tái trồng rừng có hiệu quả thì việc xác định chính xác loài và mối
quan hệ giữa chúng có ý nghĩa quan trọng. Trong đó, việc xác định tên loài không phải là
công việc dễ dàng tại Việt Nam. Phương pháp truyền thống để xác

định loài sử dụng các têu chí về hình thái như chiều cao của cây, hình dạng và kích thước lá,
các đặc điểm của hoa và quả. Tuy nhiên, phần lớn đặc điểm này thay đổi theo độ tuổi của
cây và đôi khi với môi trường sống. Do vậy, một kỹ thuật xác định chính xác hơn dựa vào
phân tích DNA để hỗ trợ cho phương pháp phân loại truyền thống là điều vô cùng cần thiết.
Phân tch mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) dựa
trên trình tự nucleotide của một số vùng gen lục lạp đã được nghiên cứu bởi Yuwaamornpitak et al. (2006) [64] và Kajita et al. (1998) [27]. Nghiên cứu này sử dụng gen lục lạp
matK để xác định chín loài thuộc chi Dipterocarpus, một loài Vatica và một loài Hopea,
nhằm cung cấp thêm thông tin để nhấn mạnh giá trị của các loài bảo tồn và tiến hóa loài Dầu
ở Việt Nam.


CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus)

Hinh 2.1. Cây, la va qua loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) tai
VQG Cat Tiên, Đông Nai
Tên khác: Dầu con rái, Dầu con rái trắng, Dầu rái. Tên khoa
học: Dipterocarpus alatus Roxb. ex G.Don Tên đồng nghĩa:
D. genopterus Turcz
D. incanus Roxb. ex Kurz
D. philipinensis Foxw. Chi :
Dầu (Dipterocarpus)
- Tổng số 268 cá thể loài Dầu nước thu tại 10 điểm nghiên cứu thuộc 6 tỉnh gồm
Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Đắk Lắk và Phú Yên.


- 10 đại diện của các loài khác thuộc họ Dầu được tm thấy trong các khu vực như: Dầu song

nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre), Dầu lông (Dipterocarpus intricatus Dyer), Dầu mít
(Dipterocarpus costatus Gaertn.), Dầu baud (Dipterocarpus baudii Korth), Dầu trà beng
(Dipterocarpus

obtusifolius Teysm), Chò nâu (Dipterocarpus retusus Bl.), Dầu đồng

(Dipterocarpus tuberculatus Roxb.), Dầu cát (Dipterocarpus caudatus af. condorensis
Ashton), So chai (Hopea recopei Pierre), Táu trắng (Vatica odorata (Griff) Sym. spp. odorata).
2.2 Địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Địa điểm nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể của 10 quần thể Dầu
nước (Dipterocarpus alatus)
Để phân tích đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước, luận văn đã tến hành thu
mẫu lá hoặc vỏ cây tươi của mỗi cá thể tại các quần thể nghiên cứu với các thông tin về địa
điểm thu thập (hình 2.2a), số lượng mẫu được trình bày ở Bảng 2.1.


Hình 2.2a. Bản đồ địa điểm nghiên cứu đa dạng di truyền 10 quần thể Dầu nước
Bảng 2.1. Địa điểm và số mẫu thu thập cho phân tch SSR
STT

Quần thể

Ký
Số
hiệu mẫu

Địa điểm

Độ
cao

Vĩ độ
Bắc

Kinh độ
Đông

1

Mã Đà

MD

32

Vĩnh Cửu, Đồng Nai

129 m

11o12’

107o09’

2

Đảo Tiên

DT

23

Cát Tiên, Đồng Nai

120 m

11o44’

107o27’

3

Tân Phú

TP

31

Định Quán, Đồng
Nai

80 m

4

Núi Tượng

NT

27

Cát Tiên, Đồng Nai

130 m

11o25’

107o17’

5

Bù Gia Mập

BG

33

Bù Gia Mập, Bình
Phước

467 m

12º13’

107º10’

6

Côn Đảo

CD

29

đảo Côn Đảo

315 m

8o40’

106o39’

7

Bình Châu Phước Bửu

BC

19

Xuyên Mộc, Bà Rịa
- Vũng Tàu

100 m

10o 28’

107o 35’

8

Lò Gò - Xa Mát

LG

20

Tân Biên, Tây Ninh

100 m

11o21’

106o02’

9

Yok Đôn

YD

30

Đắk Lắk

230 m

12o49’

107o34’

11o 05’

107o 24’


10

Krông Trai

KT

24

Sơn Hòa, Phú Yên

158 m

13o03’

108o51’

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài họ Dầu
Để xác định vị trí phân loại loài Dầu nước, nghiên cứu đã tiến hành thu mẫu lá hoặc
vỏ cây tươi 10 loài họ dầu khác (bảng 2.2). Vị trí thu mẫu được thể hiện ở hình 2.2b.

Hình 2.2b. Bản đồ địa điểm thu mẫu 11 loài cây họ Dầu dùng trong xác định vị trí
phân loại
Để xác định vị trí phân loại loài Dầu nước với một số loài họ Dầu khác, nghiên cứu
đã tiến hành thu thập mẫu lá hoặc vỏ cây tươi cho mỗi loài nghiên cứu kèm theo thông
tin về địa điểm thu mẫu được trình bày ở Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Danh sách các loài Dầu dùng xác định vị trí phân loại
STT

Tên khoa học

Tên Việt Nam

Địa điểm thu mẫu


1

Dipterocarpus dyeri Pierre

Dầu song nàng

Tân Cửu, Vĩnh Cửu, Đồng Nai,

2

Dipterocarpus alatus Roxb.
ex G.Don

Dầu nước

Cát Tiên, Đồng Nai,

3

Dipterocarpus intricatus

Dyer

Dầu lông

Tân Cửu, Vĩnh Cửu, Đồng Nai,

4

Dipterocarpus costatus
Gaertn.

Dầu mít

Tân Biên, Tây Ninh,

5

Dipterocarpus baudii Korth

Dầu baud

Cát Tiên , Đồng Nai,

6

Dipterocarpus obtusifolius
Teysm

Dầu trà beng

Yok Đôn, Đắk Lắk,

7

Dipterocarpus retusus Bl.

Chò nâu

Hy Cường, Lâm Thao, Phú Thọ,

8

Dipterocarpus tuberculatus
Roxb.

Dầu đồng

Yok Đôn, Đắk Lắk,

9

Dipterocarpus caudatus af.
condorensis Ashton

Dầu cát

Bình châu, Xuyên Mộc, Bà Rịa Vũng Tàu,

10

Hopea recopei Pierre

So chai

Tân Cửu, Vĩnh Cửu, Đông Nai,

11

Vatca odorata (Griff) Sym.
spp. odorata

Táu trắng

Cát Tiên, Đồng Nai,

2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Khảo sát thực địa
Kích thước quần thể của loài Dầu nước là rất nhỏ, do đó các thông số hình thái cá thể
trong mỗi quần thể nghiên cứu được quan sát và xác định trực tiếp tại hiện trường, bao gồm
chiều cao và đường kính ngang ngực. Khoảng cách giữa các cá thể trong quần thể nghiên cứu
cũng được xác định trực tiếp.


Nơi sống của mỗi quần thể cũng được mô tả bao gồm kiểu thảm thực vật, cấu trúc
phân tầng của thảm thực vật. Loài thực vật đặc trưng cho mỗi kiểu thảm thực vật. Đặc điểm
nơi sống và số mẫu thu thập cho phân tích đa dạng di truyền quần thể cũng được đề cập.
Để xác định chính xác tên khoa học ở mỗi nơi nghiên cứu, mẫu têu bản được thu
thập và được lưu giữ tại Phòng Sinh học, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam.
Ngoài ra, tại thực địa người dân địa phương cũng được phỏng vấn về nghề
nghiệp, thu nhập và nhận thức bảo tồn loài quý hiếm đang bị đe dọa tại những khu vực

nghiên cứu. Vị trí nghiên cứu được xác định trên cơ sở bản đồ địa hình tỉ lệ 1:50.000 và
định vị khu vực nghiên cứu bằng máy định vị GPS.
2.3.2. Phương pháp thu mẫu
Tổng số 268 mẫu lá hoặc vỏ cây tươi của 10 quần thể loài Dầu nước và 10 mẫu lá
hoặc vỏ cây tươi của 10 loài dầu khác được thu, đánh số và bảo quản trong silica gel ngoài
thực địa. Sau đó được chuyển về phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, các
mẫu được bảo quản trong tủ lạnh -300C cho đến khi mẫu được lấy ra để phân tích DNA. Mẫu
tiêu bản cũng được thu thập tại thực địa và được bảo quản trong phòng thí nghiệm
2.3.3 Phân tích trong phòng thí nghiệm
2.3.3.1 Tách chiết DNA tổng số
Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Doyle và Doyle (1987) [16], có cải
tiến theo phòng thí nghiệm bao gồm các bước sau:
Bước 1: Cân 0,3g mẫu lá (hoặc vỏ cây). Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ vô
trùng, nghiền thành bột mịn, chuyển ngay bột mịn vào ống eppendorf 2ml.
Bước 2: Bổ sung 800 l đệm rửa (Tris-HCl 100mM, EDTA 5mM, NaH2PO4
0,5%) vào ống eppendorf chứa mẫu, vortex tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm
12000 v/p trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi (lặp lại bước này 2 lần).