TÌM HIỂU KỸ THUẬT NUÔI THÂM CANH CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878) TẠI CÔNG TY CỔ PHẦN THỦY SẢN KIÊN GIANG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA THỦY SẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TỔNG HỢP HỢP CHẤT CHITIN TỪ
SINH KHỐI NẤM SỢI

SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ CẨM
NGÀNH: CHẾ BIẾN THỦY SẢN
KHÓA: 2007 – 2011

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 07/ 2011


KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TỔNG HỢP HỢP CHẤT CHITIN TỪ SINH KHỐI
NẤM SỢI

Thực hiện bởi

Nguyễn Thị Cẩm

Luận văn được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng Kỹ Sư Chế Biến Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn: Th.s Nguyễn Thị Thanh Trúc
Th.s Trương Phước Thiên Hoàng

Thành Phố Hồ Chí Minh

Tháng 07/2011

i


CẢM TẠ
Con cảm ơn ba mẹ, các em cùng những người thân luôn tạo mọi điều kiện thuận
lợi và động viên con trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
- Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm khoa bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Ban chủ nhiệm khoa Thủy Sản cùng các
thầy cô khoa Thủy Sản đã tận tình dạy dỗ tôi.
- Ths Nguyễn Thị Thanh Trúc đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài tốt nghiệp tại trường.
- Ths Trương Phước Thiên Hoàng đã luôn bên cạnh, quan tâm, hướng dẫn tận tình
trong suốt tiến trình tiến hành đề tài.
- Các anh, chị cùng cán bộ nhân viên ở viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và
Công Nghệ Môi Trường trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận
tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này.
- Các bạn cùng lớp DH07CT luôn chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học
tập và thực hiện đề tài.
- Các bạn Nông Học và Công Nghệ Sinh làm cùng phòng 202, 203.

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Cẩm

ii


TÓM TẮT

Nghiên cứu “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TỔNG HỢP HỢP CHẤT

CHITIN TỪ NẤM SỢI”.
Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2011 đến tháng 6/2011 tại Viện Nghiên Cứu
Công Nghệ Sinh Học Và Công Nghệ Môi Trường trường Đại Học Nông Lâm Thành
Phố Hồ Chí Minh.
Tất cả thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
Được bố trí 3 thí nghiệm nhằm đáp ứng mục tiêu đặt ra của đề tài như sau:
Thí nghiệm 1: Xác định môi trường tăng sinh thích hợp cho 4 chủng nấm
sợi Aspergillus niger, Mucor sp., Trichoderma sp. và Penicillum sp. Tất cả 6 môi
trường tăng sinh được sử dụng trong thí nghiệm này. Kết quả đã chọn được môi
trường tăng sinh số 3 thích hợp cho 3 chủng nấm Aspergillus niger, Mucor sp.,
Trichoderma sp., riêng chủng nấm Penicillum sp. lại thích hợp nhất với môi trường
tăng sinh thứ nhất và lượng sinh khối khô thu được của 4 chủng nấm lần lượt là 18,2
g/l, 1,4 g/l, 6,3 g/l và 2,2 g/l.
Thí nghiệm 2: Tìm ra chủng nấm sợi có hàm lượng chitin cao nhất. Sau
quá trình khảo sát giữa bốn chủng nấm sợi Aspergillus niger, Mucor sp.,
Trichoderma sp. và Penicillum sp. Sau cùng chúng tôi đã chọn ra được chủng
Trichoderma sp. là chủng có hàm lượng chitin trong vách tế bào nhiều nhất chiếm
23,8% trọng lượng khô so với 3 chủng còn lại lần lượt là Aspergillus niger 7,14%,
Mucor sp. 21,4%, Penicillum sp. 18,2%.
Thí nghiệm 3: Được thực hiện nhằm tìm ra những điều kiện tối ưu nhất
cho quá trình tổng hợp sinh khối tế bào và hợp chất chitin của chủng
Trichoderma sp. trong đó 3 yếu tố được tôi chọn lựa để tiến hành khảo sát là: thời
gian nuôi cấy nấm, thời gian lắc tăng sinh và pH của môi trường tăng sinh. Sau
quá trình khảo sát chúng tôi nhận thấy rằng chủng Trichoderma sp. tạo sinh khối tế
bào cao nhất sau 96 giờ nuôi cấy nhưng hàm lượng chitin được tổng hợp cao nhất
trong sinh khối lại ở 72 giờ nuôi cấy, riêng thời gian lắc tăng sinh cũng đạt tối ưu cùng
lượng thời gian là 72 giờ và pH môi trường tăng sinh thích hợp nhất là 4,5. Khi kết
hợp cả 3 điều kiện trên trong cùng một thí nghiệm thì hàm lượng sinh khối khô đạt

được là 8,4 g/l.

iii


MỤC LỤC
Nội dung

Trang

Trang tựa...........................................................................................................................i
Lời cảm ơn .......................................................................................................................ii
Tóm tắt ........................................................................................................................... iii
Mục lục ...........................................................................................................................iv
Danh sách các hình ..................................................................................................... viii
Danh sách các bảng ........................................................................................................ix
Danh sách các đồ thị ........................................................................................................ x
Danh sách các biểu đồ ..................................................................................................... x
Chương 1.MỞ ĐẦU....................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................... 2
Chương 2. TỔNG QUAN.............................................................................................. 3
2.1. Chitin ........................................................................................................................ 3
2.1.1. Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên ....................................................................... 3
2.1.2. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa của chitin..................................................... 4
2.1.2.1. Cấu trúc hóa học của chitin ................................................................................ 4
2.1.2.2. Tính chất lý hóa của chitin ................................................................................. 5
2.2. Chitosan .................................................................................................................... 5
2.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa của chitosan ................................................ 5
2.2.1.1. Cấu trúc hóa học ................................................................................................. 5

2.3. Nấm sợi..................................................................................................................... 6
2.3.1. Hình thái và kích thước ......................................................................................... 6
iv


2.3.2. Cấu tạo tế bào ........................................................................................................ 7
2.3.3. Sinh sản.................................................................................................................. 8
2.3.4. Ý nghĩa thực tiễn của nấm sợi ............................................................................... 8
2.4. Nấm Trichoderma sp ................................................................................................ 9
2.4.1. Đặc điểm hình thái (Gary J. Samuels, 2004) ......................................................... 9
2.4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh học, sinh hóa ................................................................... 11
2.4.3. Cấu tạo tế bào Trichoderma ................................................................................ 12
2.5. Aspergillus niger .................................................................................................... 12
2.6. Mucor sp ................................................................................................................. 12
2.7. Penicillum sp .......................................................................................................... 13
2.8. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin-chitosan trong thực tế trên thế
giới và ở Việt Nam ........................................................................................................ 14
2.9. Một số quy trình sản xuất chitin – chitosan thế giới và Việt Nam ......................... 17
2.9.1. Trên thế giới ........................................................................................................ 17
2.9.2. Ở Việt Nam.......................................................................................................... 20
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 24
3.1. Thời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu ................................................................ 24
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 24
3.1.2. Vật liệu, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu ............................................................... 24
3.1.2.1. Nguồn nấm ....................................................................................................... 24
3.1.2.2. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 24
3.1.2.3. Hóa chất ............................................................................................................ 24
3.1.2.4. Môi trường ........................................................................................................ 25
3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 26
v

3.2.1. Phương pháp cấy truyền các chủng nấm ............................................................. 26
3.2.2. Phương pháp lắc lên men .................................................................................... 26
3.2.3. Phương pháp thu nhận sinh khối nấm sợi và tách chiết chitin ............................ 26
3.2.4. Bố trí thí nghiệm .................................................................................................. 27
3.2.4.1 Khảo sát và lựa chọn môi trường tăng sinh ....................................................... 27
3.2.4.2. Khảo sát và lựa chọn chủng nấm ...................................................................... 27
3.2.4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp sinh khối tế bào và hợp
chất chitin của chủng Trichoderma sp........................................................................... 27
3.2.4.3.1. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự tổng hợp sinh
khối và hợp chất chitin .................................................................................................. 27
3.2.4.3.2. Khảo sát thời gian lên men ............................................................................ 28
3.2.4.3. 3.Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến quá trình thu nhận sinh khối ................. 28
3.2.5. Hiệu suất thu hồi sản phẩm ................................................................................. 28
3.2.6. Phương pháp bố trí và xử lý số liệu thí nghiệm .................................................. 28
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 30
4.1. Khảo sát sự phát triển hệ sợi và bào tử của các chủng nấm sợi trên môi trường
thạch PGA...................................................................................................................... 30
4.2. Khảo sát và lựa chọn môi trường tăng sinh ............................................................ 32
4.3. Khảo sát và lựa chọn chủng nấm sợi có khả năng tổng hợp sinh khối tế bào và các
hợp chất chitin cao ......................................................................................................... 35
4.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp sinh khối tế bào và hợp
chất chitin của chủng Trichoderma sp........................................................................... 37
4.4.1 Khảo sát khả năng ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự tổng hợp sinh khối
và hợp chất chitin .......................................................................................................... 37
4.4.2. Khảo sát thời gian lên men .................................................................................. 40
4.4.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến quá trình thu nhận sinh khối ....................... 41
vi

4.5. Hiệu suất thu hồi sản phẩm .................................................................................... 42
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 44
5.1. Kết luận................................................................................................................... 44
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 45
Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................................... 45
Tài liệu tiếng Anh .......................................................................................................... 46
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 48

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 2.6.1. Khuẩn ty Trichoderma sp (vùng màu trắng) phát triển trên môi trường agar
sau 2-3 ngày nuôi cấy (A) và trong tự nhiên (B) ( vùng màu xanh) ............................. 10
Hình 2.6.2. Hình dạng sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma sp .......................... 10
Hình 4.1.: Hình thái đại thể và vi thể của 4 chủng nấm trên thạch PGA ...................... 31
Hình 4.4.1: Hình dạng chủng nấm Trichoderma sp theo thời gian nuôi cấy ................ 48
Hình 4.4.2. Hình sinh khối tế bào khi lắc tăng sinh của chủng nấm Trichoderma sp .. 48

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 2.1 Hàm lượng chitin ............................................................................................. 4
Bảng 4.1. Sự phát triển hệ sợi và bào tử các chủng nấm trên môi trường thạch PGA.. 30
Bảng 4.2. Hiệu suất tổng hợp sinh khối tế bào của các chủng nấm sợi ....................... 35
Bảng 4.3.Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hiệu suất tổng hợp sinh khối và hàm
lượng chitin của chủng nấm sợi Trichoderma sp .......................................................... 37
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời gian lắc tăng sinh đến việc tổng hợp sinh khối tế bào
của chủng nấm Trichoderma sp .................................................................................... 40
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của pH đến quá trình tổng hợp sinh khối tế bào của chủng nấm
Trichoderma sp .............................................................................................................. 41
Bảng 4.6. Hiệu suất thu hồi chitin của chủng nấm Trichoderma sp ............................. 43

ix


DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị

Trang

Đồ thị 4.1: Sự biến thiên của hàm lượng sinh khối khô của Trichoderma sp. theo thời
gian nuôi cấy .................................................................................................................. 38
Đồ thị 4.2: Sự biến thiên của hàm lượng chitin của Trichoderma . theo thời gian nuôi
cấy .................................................................................................................................. 38
Đồ thị 4.3: Sự biến thiên % hàm lượng chitin của Trichoderma sp. theo thời gian nuôi
cấy .................................................................................................................................. 39
Đồ thị 4.4: Sự biến thiên của hàm lượng sinh khối khô của Trichoderma sp. theo thời
gian lắc tăng sinh ........................................................................................................... 40

Đồ thị 4.5: Sự biến thiên sinh khối tế bào của chủng Trichoderma sp. theo pH .......... 42

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ

Trang

Biểu đồ 4.1: Hàm lượng sinh khối khô sau khi lắc tăng sinh của Trichoderma sp....... 32
Biểu đồ 4.2: Hàm lượng sinh khối khô sau khi lắc tăng sinh của Aspergillus niger .... 33
Biểu đồ 4.3: Hàm lượng sinh khối khô sau khi lắc tăng sinh của Pennicillum sp ........ 33
Biểu đồ 4.4: Hàm lượng sinh khối khô sau khi lắc tăng sinh của Mucor sp ................. 34
Biểu đồ 4.5: Hàm lượng chitin của chủng nấm ............................................................. 36

x


Chương 1
1.1. Đặt vấn đề

MỞ ĐẦU

Chitin là một polymer sinh học có nhiều trong cấu trúc khớp, sụn của các động
vật bậc thấp, trong thành phần tế bào một số vi sinh vật như: nấm sợi, nấm men, vi
khuẩn,.. Quá trình chiết tách, thu nhận chitin và các dẫn xuất của nó, đặc biệt là
chitosan có ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y
học và bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, vải, sơn,
chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường,… Ngoài những ứng dụng trên, chitin còn có
ứng dụng cũng không kém phần quan trọng trong lĩnh vực thủy sản nhằm bổ sung vào
thức ăn cho tôm nhằm kích thích quá trình lột xác của tôm, mục đích rút ngắn thời
gian thu hoạch, tiết kiệm chi phí và nâng cao hiệu quả kinh tế đồng thời hạn chế nguy

cơ miễn dịch bệnh so với thời gian nuôi khá dài trước kia.
Với khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin - chitosan mà nhiều nước khác nhau
trên thế giới trong đó có cả nước ta đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm sản xuất ra các
sản phẩm này như: tách chiết thành công chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học
hoặc thời gian gần đây có kết hợp thêm phương pháp sinh học hay công nghệ phân lập
chitin bền vững của viện AIT .
Tuy nhiên, hiện nay các quy trình sản xuất chitin - chitosan quy mô lớn tại Việt
Nam chủ yếu là sử dụng phương pháp hóa học và nguyên liệu chủ yếu là từ vỏ tôm,
nên phải sử dụng hóa chất với nồng độ cao dẫn đến lượng chitin - chitosan thu được
chưa cao và nhiều tạp chất. Song chitin không chỉ có nhiều trong vỏ tôm mà còn có
trong vi khuẩn, sinh khối nấm sợi,… với hàm lượng cũng đáng kể. Đặc biệt từ trước
đến nay có rất nhiều nghiên cứu về quy trình sản xuất chitin nhưng nguyên liệu chủ
yếu lại chỉ là vỏ tôm mà chưa chú trọng đến những nguyên liệu khác cũng có khả năng
thu hồi chitin không thấp hoặc nếu có những nghiên cứu khác về nguyên liệu sản xuất
chitin thì rất ít.
1


Xuất phát từ thực tiễn trên, được sự hướng dẫn của Th.s Nguyễn Thị Thanh
Trúc cùng với sự chấp thuận của Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản, tôi thực hiện đề tài
“ Khảo sát khả năng tổng hợp hợp chất chitin từ sinh khối nấm sợi”.
1.2. Mục Tiêu Đề Tài
- Mục đích nghiên cứu:
+ Tìm ra môi trường tăng sinh thích hợp cho quá trình sinh bào tử của nấm sợi.
+ Tìm ra được chủng nấm sợi có khả năng tổng hợp hợp chất chitin cao.
+ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp sinh khối sợi nấm: thời
gian lắc tăng sinh, pH môi trường tăng sinh, thời gian nuôi cấy giống Trichoderma sp.

2

Chương 2
TỔNG QUAN
2.1. Chitin
2.1.1. Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên
Theo Braconout (1821), chitin được phát hiện trong cặn dịch chiết từ một loại
nấm được gọi là “Fungine”. Odier (1823) phân lập được một chất từ bọ cánh cứng gọi
là chitin hay “chiton”, nhưng không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Tuy
nhiên, Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống
cellulose.
Chitin - chitosan là một polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose
và chúng được tạo ra trung bình 20g trong năm/1m2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên
chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật.
Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số
động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong
động vật bậc cao, monome của chitin là thành phần chủ yếu trong mô da giúp cho sự
tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ
zygenmyctes, các sinh khối nấm sợi, một số loại tảo…
Chitin - chitosan là một polysacharite có đạm không độc, có khối lượng phân tử
lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharite (N-acetyl 𝛽𝛽-D-glucosamine) liên
kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ. Hơn nữa
chitin tồn tại rất hiếm ở dạng tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị
(coralente) với các protein, CaCO 3 và các hợp chất hữu cơ khác.
Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ lượng chitin chiếm
khá cao dao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô (Trần Thị Luyến, 2000). Vì vậy
vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan và các dẫn
xuất của chúng.
3

Bảng 2.1 Hàm lượng chitin
Nguồn

Hàm lượng

Gián

35%

Bọ cánh cứng

37%

Nhện

38%

Bò cạp

30%

Sâu

20-38%

Nấm

5-20%

Tôm

33%

Cua

70%

Mực

3-20%
( )

2.1.2. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa của chitin
2.1.2.1. Cấu trúc hóa học của chitin
Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc thì
người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị Nacetyl- 𝛽𝛽-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết 𝛽𝛽-1-4 glucozit.
Công thức cấu tạo của chitin:

Tên gọi khoa học: poly (1-4)-2-acetamido-2-deoxy- 𝛽𝛽-D-glucose; poly(1-4)-2-

acetamido-2-deoxy- 𝛽𝛽-D-glucopyranose.

Công thức phân tử: [ C 8 H 13 O 5 N] n
4


Phân tử lượng: M chitin = (203,09) n
2.1.2.2. Tính chất lý hóa của chitin
Chitin là chất có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hay dạng bột,
không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, acid loãng và các

dung môi hữu cơ như ete, rượu… Nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của muối
thioxianat liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN) 2 ) tạo thành dung dịch keo, tan
trong hệ dimetylacetamid – LiCl 8%, tan trong hexafluoro – isopropyl alcohol
(CF 3 CHOHCF 3 ) và hexafluoracetone sesquihyđrate (CF 3 COCF 3 .H 2 O). Chitin có khả
năng hấp thụ tia hồng ngoại có bước sóng 884 – 890 nm .
Chitin ổn định với các chất oxy hóa mạnh như thuốc tím (KMnO 4 ), oxy già
(H 2 O 2 ), nước javen (NaOCl – NaCl)…, lợi dụng tính chất này người ta sử dụng các
chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin.
Chitin khó hòa tan trong thuốc thử Schwcizci Sapranora. Điều này có thể do
nhóm acetamit (-NHCOCH 3 ) ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết.
Khi đun nóng trong acid HCl đậm đặc thì chitin sẽ bị phân hủy hoàn toàn thành
85,5% D-glucosamine và 12,5% acid acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở cầu
nối glucozit, tiếp theo là sự loại bỏ nhóm acetyl.
Khi đun nóng chitin trong NaOH đậm đặc thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo
thành chitosan.
2.2. Chitosan
2.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa của chitosan
2.2.1.1. Cấu trúc hóa học
Chitosan là một polymer hữu cơ có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 𝛽𝛽-D-

glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết 𝛽𝛽-1-4 glucozit.

5


Công thức cấu tạo:

Tên gọi khoa học: poly (1-4)-2-amino-2-deoxy- 𝛽𝛽-D-glucose; poly(1-4)-2-amino-2-

deoxy- 𝛽𝛽-D-glucopyranose.

Công thức phân tử: [ C 6 H 11 O 4 N] n

Phân tử lượng: M chitosan = (161.07) n
2.2.1.2. Tính chất hóa lý
Chitosan ở dạng bột có màu trắng ngà, còn ở dạng vảy có mảu trắng hay hơi
vàng.
Chitosan có tính kiềm nhẹ, không hòa tan trong nước, nhưng hoà tan trong acid
acetic loãng thành một dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan khi hòa tan trong dung
dịch acid acetic loãng sẽ tạo thành dung dịch keo dương, nhờ đó mà keo chitosan
không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như Pb,Hg…
Chitosan kết hợp với aldehyde trong điều kiện thích hợp để tạo thành gel, đây là
cơ sở để bẫy tế bào, enzyme.
Chitosan phản ứng với acid đậm đặc tạo ra muối khó tan. Chitosan tác dụng với
iot trong môi trường H 2 SO 4 cho phản ứng lên màu tím.
2.3. Nấm sợi
2.3.1. Hình thái và kích thước
Nấm sợi có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành một hệ sợi chằng chịt phát
triển rất nhanh gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm. Chiều ngang của khuẩn ti thay đổi
từ 3 - 10 mm. Nấm sợi cũng có 2 loại khuẩn ti: khuẩn ti khí sinh mọc trên bề mặt môi

6


trường, từ đây sinh ra những cơ quan sinh sản. Khuẩn ti cơ chất mọc sâu vào môi
trường.
Khuẩn lạc của nấm sợi cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc xạ khuẩn.
Khuẩn lạc nấm sợi khác với xạ khuẩn ở chỗ nó phát triển nhanh hơn, thường to hơn
khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần. Dạng xốp hơn do kích thước khuẩn ti to hơn. Thường
thì mỗi khuẩn lạc sau 3 ngày phát triển có kích thước 5 - 10 mm, trong khi đó khuẩn

lạc xạ khuẩn chỉ khoảng 0,5 - 2 mm.
2.3.2. Cấu tạo tế bào
Cũng như nấm men, nấm sợi có cấu tạo tế bào điển hình như ở sinh vật bậc cao.
Thành phần hoá học và chức năng của các cấu trúc này cũng tương tự như ở nấm men.
Điều sai khác cơ bản giữa nấm sợi và nấm men là ở tổ chức tế bào.
Nấm men chỉ là những tế bào riêng rẽ hoặc xếp với nhau theo kiểu cây
xương rồng. Nấm sợi có tổ chức tế bào phức tạp hơn, trừ một số nấm sợi bậc thấp có
cấu tạo đơn bào phân nhánh. Ở những nấm sợi bậc thấp này, cơ thể là một hệ sợi nhiều
nhân không có vách ngăn.
Đa số nấm sợi có cấu tạo đa bào, tạo thành những tổ chức khác nhau như sợi
khí sinh, sợi cơ chất. Sợi cơ chất của nấm sợi không đơn giản như ở xạ khuẩn mà phức
tạp hơn. Có những loài có sợi cơ chất giống như rễ chùm ở thực vật gọi là rễ giả, ví dụ
như ở Aspergillus niger. Ở những loài nấm sợi ký sinh trên thực vật, sợi cơ chất tạo
thành những cấu trúc đặc biệt gọi là vòi hút.
Ở một số loài nấm sợi, các sợi nấm nối với nhau thông qua các cầu nối, các cầu
nối hình thành giữa các sợi nằm gần nhau gọi là sự hợp nối do có hiện tượng 2 khối
nguyên sinh chất trộn lẫn với nhau. Đó có thể là một hình thức lai dinh dưỡng.
Một số loài nấm sợi có cấu tạo gần giống mô thực vật gọi là mô giả. Đó là các
tổ chức sợi xốp gồm các sợi nấm xếp song song với nhau tạo thành một tổ chức sợi
xốp. Ngoài tổ chức sợi xốp còn có tổ chức màng mỏng giả gần giống như màng mỏng
ở thực vật bậc cao. Chúng gồm những tế bào có kích thước xấp xỉ nhau hình bầu dục,
xếp lại với nhau. Hai tổ chức trên có ở thể đệm và hạch nấm. Thể đệm cấu tạo bởi
nhiều khuẩn ti kết lại với nhau, từ đó sinh ra các cơ quan sinh sản của nấm sợi. Hạch
7


nấm thường có hình tròn hoặc hình bầu dục không đều, kích thước tuỳ theo loài, từ
dưới 1 mm đến vài cm. Đặc biệt có loài có kích thước hạch nấm tới vài chục cm. Hạch
nấm là một tổ chức giúp cho nấm sống qua những điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Sợi
nấm tồn tại trong hạch không phát triển. Khi gặp điều kiện thuận lợi hạch sẽ nảy mầm

và phát triển bình thường.
2.3.3. Sinh sản
Nấm mốc có 3 hình thức sinh sản chính: sinh sản dinh dưỡng, sinh sản vô tính,
sinh sản hữu tính.
2.3.4. Ý nghĩa thực tiễn của nấm sợi
Nấm sợi là một nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong thiên nhiên. Chúng
tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá vật chất, khép kín các vòng tuần hoàn
vật chất trong tự nhiên. Khả năng chuyển hoá vật chất của chúng được ứng dụng trong
nhiều ngành, đặc biệt là chế biến thực phẩm (làm rượu, làm tương, nước chấm v.v....).
Mặt khác, có nhiều loại nấm sợi mọc trên các nguyên, vật liệu, đồ dùng, thực phẩm ...
phá hỏng hoặc làm giảm chất lượng của chúng. Một số loài còn gây bệnh cho người,
động vật thực vật (bệnh lang ben, vẩy nến ở người, nấm rỉ sắt ở thực vật v.v...).
Ngoài các nhóm vi sinh vật chính đã mô tả ở trên, thuộc về các vi sinh vật có
kích thước hiển vi có thể xếp vào đối tượng của vi sinh vật học còn có các nhóm tảo
đơn bào gọi là vi tảo, các nhóm nguyên sinh động vật như trùng roi, amip v.v...
Tất cả những sinh vật nhỏ bé nói trên tạo thành thế giới vi sinh vật vô cùng
phong phú, chúng phân bố ở khắp mọi nơi trên hành tinh chúng ta. Chúng tham gia
vào các quá trình chuyển hoá vật chất, khép kín các vòng tuần hoàn vật chất trong
thiên nhiên, làm cho sự cân bằng vật chất được ổn định và từ đó bảo vệ sự cân bằng
sinh thái. Người ta có thể sử dụng nhiều nhóm vi sinh vật vào mục đích bảo vệ môi
trường. Ví dụ như nhóm vi sinh vật phân huỷ chất hữu cơ trong rác thải, nhóm vi sinh
vật phân huỷ các chất độc hại thành chất không độc. Trong công nghệ xử lý chất thải
bằng phương pháp sinh học có sử dụng rất nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau. Vi sinh
vật còn được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất như chế tạo phân bón sinh học,
thuốc bảo vệ thực vật sinh học ... nhằm mục đích thay thế các chất hoá học độc hại với
8


môi trường. Sự phân bố rộng rãi của vi sinh vật trong các môi trường tự nhiên đóng
vai trò quyết định vào khả năng tự làm sạch môi trường đó, cùng với những yếu tố lý

học, hoá học và sinh học khác. Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc làm nên
khả năng chịu tải của môi trường, đó chính là khả năng tự làm sạch môi trường, giữ
cho môi trường tự nhiên không bị ô nhiễm.
Tuy nhiên, bên cạnh những nhóm vi sinh vật có khả năng làm sạch môi
trường, lại có những nhóm gây ô nhiễm môi trường. Đó chính là nhóm các vi sinh vật
gây các bệnh vô cùng nguy hiểm cho người, động vật và thực vật.
2.4. Nấm Trichoderma sp
2.4.1. Đặc điểm hình thái (Gary J. Samuels, 2004)
Khuẩn ty của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển rất nhanh trên môi
trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh
vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của
môi trường PGA hóa vàng.
Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định. Cuống bào tử là
một nhóm sợi nấm bện vào nhau. Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những
cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc
(T.koningii), có kích thước từ 1-7µm, có hình đệm rất chắc hoặc dạng như bông không
rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng
hoạt động như chồi mầm.
Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống
sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn,
không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Đặc điểm nổi bật của nấm
Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng (như T.virens),
vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc hình oval (với tỉ lệ dài: rộng từ
1-1.1µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài: rộng hơn là 1,4µm), đa số các bào tử trơn
láng. Kích thước không quá 5µm.

9


A

B

Hình 2.4.1. Khuẩn ty Trichoderma sp (vùng màu trắng) phát triển trên môi trường
agar sau 2-3 ngày nuôi cấy (A) và trong tự nhiên (B) ( vùng màu xanh)
( reesei
o/img/T koningii GJS.jpg)
Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà
T.harzianum có thể tồn tại 110 - 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng.
Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của
Trichoderma trong môi trường không cung cấp chất dinh dưỡng nên chlamydospores
có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học.

Hình 2.4.2. Hình dạng sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma sp.
( reesei
o/img/T koningii GJS.jpg)
10


2.4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh học, sinh hóa
Môi trường sống: Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ở đất nông nghiệp,
đồng cỏ, rừng, đầm muối và đất sa mạc. Hầu hết chúng là những vi sinh vật hoại sinh,
nhưng chúng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm
thấy trên thực vật sống, chúng có thể tồn tại trong tất cả các vùng khí hậu từ miền cực
Bắc đến những vùng núi cao cũng như miền nhiệt đới. Tuy nhiên có một sự tương
quan giữa sự phân bố các loại nấm và điều kiện môi trường. Loài Trichoderma
harizianum có ở các vùng khí hậu nóng. Điều này tương quan với nhu cầu nhiệt độ tối
đa cho từng loài.
Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid, theo Gochenaur (1970) cho
rằng có thể có tương quan giữa sự hiện diện cuả T.viride với đất acid trong vùng khí

hậu rất lạnh ở Peru. Trichoderma phát triển tốt nhất ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và
chúng cũng có thể phát triển tốt trên đất kiềm nếu như ở đó có một lượng CO 2 và
bicarbonat. Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ
carbohydrate, amino acid ammonia.
Trichoderma vì ưa độ ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm ướt,
những khu rừng khác nhau. Trichoderma hamatum và Trichoderma pseudokoninggii
có thể chịu điều kiện độ ẩm cao hơn các loài khác. Tuy nhiên, Trichoderma sp thường
không chịu được độ ẩm thấp và điều này là một trong những yếu tố làm cho số lượng
Trichoderma giảm rõ rệt trong những nơi có độ ẩm thấp, song các loài khác nhau thì
yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau.
Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển trong đất có pH từ 2,5 – 9,5. Phát
triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là 250C 300C. Một vài dòng phát triển tốt ở 350C. Một số ít phát triển được ở 400C (Gary J.
Samuels, 2004). Theo Prasun K. M. và Kanthadai R. (1997) hình thái khuẩn lạc và bào
tử của Trichoderma khác nhau khi ở nhiệt độ khác nhau. Ở 350C chúng tạo ra những
khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ ở mép bất thường, ở 370C không
tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy.

11


2.4.3. Cấu tạo tế bào Trichoderma
Nấm sợi nói chung thành tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, chitosan và các thành
phần khác gồm β-glucan,α-glucan, mannoprotein (Siu-Wai Chiu và David Moore,
2001), chất màu, lipid (8-33%) (Lâm Thanh Hiền, 1999). Màng tế bào dầy khoảng
7µm thành phần chủ yếu là lipid (40%) và protein (38%). Nhân phân hóa, thường hình
tròn, đôi khi kéo dài, đường kính khoảng 2 - 3µm. Ty thể hình elip, luôn di động để
tham gia vào quá trình hô hấp của tế bào (Lâm Thanh Hiền, 1999).
2.5. Nấm Aspergillus niger
Khuẩn ty phát triển, phân nhánh và có vách ngăn ngang hoàn chỉnh, đặc biệt ở
vách ngăn ngang có một lỗ nhỏ để cho tế bào chất thông thương qua lại giữa hai tế

bào. Khuẩn ty đứt thành khúc và mỗi khúc hay đoạn có thể phát triển cho ra khuẩn ty
mới. Các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng. Bào tử bụi có màu
đen.
Mỗi tế bào chứa chitin trong các vi sợi, ngoài ra còn có manose, glucose,
amino, đường và protein cùng với một hệ enzyme trong thành phần vỏ tế bào.
Mỗi bào tử có đường kính khoảng 5µm, vỏ bào tử có một đai mỏng bên ngoài
và mỗi bào tử nang nảy mầm cho một khuẩn ty mới.
Nấm xuất hiện ở hầu hết các vùng có khí hậu khác nhau và phát triển phổ biến
trong đất, trong vùng nước mặn hay nước ngọt, hoại sinh trên xác bã động thực vật và
ký sinh trên động vật và thực vật.
2.6. Mucor sp
Nấm ký sinh trên động vật thực vật và trên cả nấm khác. Khuẩn ty phát triển và
phân nhánh có màu trắng.
Đường kính của sợi nấm thường từ 3 - 5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến
1mm.Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet.
Tế bào nấm có cấu trúc tương tự như những tế bào vi sinh vật chân hạch khác,
Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có cellulose. Chitin là
thành phần chính của vách tế. Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzyme
12


chitin syntaze. Tế bào chất của tế bào nấm chứa mạng nội mạc (endoplasmic
reticulum), không bào (vacuoles), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và
lipid), đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực
vật. Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribô thể (ribosomes) và những thể khác chưa rõ chức
năng.
2.7. Penicillum sp
Penicillium đặc trưng cho giống mốc xanh, chúng thường ở trên vỏ cây có múi,
phô mai và nhiều loại trái cây khác, da và nhiều loại thức ăn khác. Penicillium
notatum là loài tổng hợp penicillin giúp ích cho con nguời, Penicillium griseofulvum

tổng hợp griseofulvin là một loại thuốc trị nấm; nhiều loại phô-mai lên men từ
Penicillium camenberi và Penicillium requeforti nhưng cũng có những loài làm hư
hỏng trái cây như Penicillium digitatum, P. italicum và P. expansum. Trái cây có múi
và phô-mai là 2 sản phẩm rất thu hút bào tử Penicillium trong không khí.
Đa số hình sợi, hiếu khí bắt buộc. Sợi có vách ngăn, sợi nấm thường là một ống
hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính sợi nấm thường từ 3
– 5 µm, có khi đến 10 µm. Chiều dài của sợi nấm có khi tới vài chục cm. Vách tế bào
nấm được cấu tạo bởi vi sợi chitin.
Tế bào chất chứa nội mạc endoplasmic reticulum, không bào (vacuoles) ty thể
(mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid), đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào thực
vật. Ngoài ra tế bào nấm còn có ribosomes và những thể khác chưa rõ chức năng.
Không có diệp lục tố nên chúng được cung cấp chất dinh dưỡng từ bên ngoài
(nhóm dị dưỡng)
Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân. Nhân tế
bào có hình cầu hay hình bầu dục với lớp màng kép bên trong màng nhân chứa ARN,
phospholipid và protein.
Là bào tử nấm hở, giá bào tử trần nhẫn, phát triển hệ sợi từ nền, phần lớn từ 3 –
3,5 µm x 150 – 350 µm mang 1 – 2 nhánh, nhánh cùng với các vòng cuốn thể bình tạo
thành chuỗi 3 vòng , nhánh nhẵn từ 3 – 3,5 x 15 – 15 µm, cuống bình từ 2 – 5 cái. Thể
13


bình xếp vòng từ 4 – 6 cái. Bào tử trần hình trứng, elip có đường kính trục lớn từ 3 –
3.2 µm tạo thành chuỗi song song hay chồng chéo nhau.
2.8. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin-chitosan trong thực tế trên
thế giới và Việt Nam
Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa và các ứng dụng
chitin – chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX.
Trước đây người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn
nguyên liệu quá ít không đủ để đáp ứng nhu cầu về sản xuất trong thời kỳ bấy giờ.

Đồng thời trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm và cua. Trong một thời
gian dài, các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải trực tiếp ra môi trường
dẫn đến việc ô nhiễm môi trường quanh khu vực đó nghiêm trọng. Năm 1977, Viện kỹ
thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ
tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp.
Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần chitin sẽ được
dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh
vực công nghiệp.
Hiện nay, đi đầu trong lĩnh vực này là Nhật và Mỹ đã sản xuất theo thứ tự là
600 tấn/năm và 400 tấn/năm, chitosan với giá từ 200 – 300 USD/kg. Ngoài ra còn có
các nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp cũng sản xuất sản phẩm này nhưng với số
lượng thấp (khoảng 2 tấn/năm).
Năm 1999, Viện AIT nghiên cứu “công nghệ phân lập bền vững chitin –
chitosan, bằng phương pháp lên men bằng cách dùng các loại khuẩn lactobacillus.
Việc nghiên cứu chitin và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phục vụ đời
sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta. Vào những năm 1978 đến
1980, Trường đại học Thủy Sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin –
chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất.
Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách,
trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thị trường
của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn
14