NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH NHÂN NUÔI NẤM Trichoderma virens, SẤY KHÔ VÀ XAY NGHIỀN TẠO CHẾ PHẨM NLU – Tri

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH
NHÂN NUÔI NẤM Trichoderma virens, SẤY KHÔ VÀ XAY
NGHIỀN TẠO CHẾ PHẨM NLU – Tri

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THÀNH LỢI
Ngành: NÔNG HỌC
Niên khóa: 2006 – 2010

12/2010


NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH NHÂN NUÔI NẤM Trichoderma virens,
SẤY KHÔVÀ XAY NGHIỀN TẠO CHẾ PHẨM NLU – Tri

Tác giả

NGUYỄN THÀNH LỢI

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng kỹ sư ngành
Nông học

Giáo viên hướng dẫn:
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

12/2010

i


LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành khóa luận này không chỉ là thành quả của tôi mà còn là công
sức và tấm lòng của tất cả thầy cô, gia đình và bạn bè.
Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Lê Đình Đôn, người đã luôn theo sát
và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành nhất đến anh Đinh Văn Cương đã luôn
hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận. Chân thành cảm
ơn đến bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã
tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất để tôi hoàn thành tốt khóa luận.
Tôi xin tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ
Chí Minh, các thầy cô trong khoa Nông Học, những người luôn tận tụy truyền đạt kiến
thức cho các thế hệ sinh viên.
Con muốn giành sự biết ơn sâu sắc tới cha mẹ và gia đình cùng những người
thân đã nuôi dạy, cổ vũ, động viên và giúp đỡ con trong suốt quá trình học tập để hoàn
thành chương trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

ii


TÓM TẮT
Đề tài: “Nghiên cứu cải tiến quy trình nhân nuôi nấm Trichoderma
virens, sấy khô và xay nghiền tạo chế phẩm NLU – Tri” được thực hiện tại Bộ môn
Công Nghệ Sinh Học, Viện Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ
Chí Minh từ tháng 12/2010 đến tháng 4/2011 nhằm cải tiến quy trình sản xuất chế
phẩm phòng trừ sinh học NLU – Tri phục vụ cho nhu cầu phòng trừ sinh học của
người dân, cải tiến môi trường nhân nuôi, làm khô nấm sau khi nhân nuôi, nghiền để

thu nhận bào tử nấm.
Đề tài gồm ba thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Bộ Môn
Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM.


Thí nghiệm 1: Nghiên cứu cải tiến môi trường thứ cấp nhân nuôi cấy

nấm Trichoderma virens.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố, gồm 6
nghiệm thức, 5 lần lặp lại gồm các công thức phối trộn môi trường trong phòng thí
nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Kết quả thí nghiệm: Dựa vào các chỉ tiêu mật số bào tử sống, độ ẩm của sản
phẩm, mật số bào tử sống sau khi sấy ở 30 0C và 35 0C, hiệu quả kinh tế, chọn ra được
môi trường nuôi cấy nấm thích hợp là môi trường cám : trấu : tấm với tỷ lệ 1:2:1 và 50
% nước, nấm được sấy ở nhiệt độ 30 0C.


Thí nghiệm 2: Cải tiến quy trình làm khô nấm sau khi nuôi cấy.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố, gồm 4
nghiệm thức và 4 lần lặp lại là các biện pháp làm khô nấm sau khi nhân nuôi trên môi
trường cám : trấu : tấm với tỷ lệ 1:2:1 và 50 % nước được 12 ngày, tất cả các nghiệm
thức được sấy ở 30 0C.
Kết quả thí nghiệm: dựa vào các chỉ tiêu thời gian sấy khô, tỉ lệ nhiễm tạp
trong quá trình sấy và mật số bào tử sống nấm sau khi sấy, chọn được phương pháp
làm khô nấm là sau khi nhân nuôi nấm Trichoderma virens trên môi trường thứ cấp là

iii

nấm nhân nuôi trên môi trường cám : trấu : tấm với tỉ lệ 1:2:1 và 50 % nước được 12
ngày rồi đổ ra khay hong trong phòng 2 – 3 ngày trước khi sấy sẽ tiết kiệm được thời
gian sấy, số bào tử/gam chế phẩm Trichoderma virens cũng đạt tối đa.


Thí nghiệm 3: Cải tiến quy trình xay nghiền chế phẩm Trichoderma

virens.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 4 nghiệm thức,
4 lần lặp lại với các cỡ sàng: 0,15 mm; 0,20 mm; 0,25 mm; 0,30 mm.
Kết quả thí nghiệm: dựa vào các chỉ tiêu tỉ lệ bào tử sống bị hao hụt, tỉ lệ
khối lượng hao hụt do nghiền và mức độ hòa tan trong nước, chọn ra được phương
pháp xay nghiền chế phẩm phù hợp là xay nghiền ở cỡ sàng 0,3 mm.


Tóm lại, sau khi hoàn thành cả 3 thí nghiệm thì chọn ra được môi trường

nhân nuôi nấm phù hợp đạt hiệu quả kinh tế cao nhất là môi trường trấu : tấm : cám
với tỷ lệ 1:2:1 và 50 % nước, phương pháp làm khô nấm thích hợp là hong nấm trong
phòng kín 2 ngày, sau đó sấy nấm ở 30 0C, nghiền với cỡ sàng là 0,3 mm.

iv


MỤC LỤC
Trang tựa....................................................................................................................... i
Lời cảm tạ ....................................................................................................................ii
Tóm tắt ........................................................................................................................iii
Mục lục ........................................................................................................................ v
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................viii

Danh sách các hình ..................................................................................................... ix
Danh sách các bảng ..................................................................................................... x
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ...................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
1.2 Mục đích và yêu cầu ............................................................................................ 2
1.2.1 Mục tiêu ............................................................................................................ 2
1.2.2 Yêu cầu ............................................................................................................. 3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
2.1 Nguồn gốc của Trichoderma ............................................................................... 4
2.2 Đặc điểm của nấm Trichoderma ........................................................................ 4
2.2.1 Hình thái, sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử của Trichoderma .............. 4
2.2.1.1 Đặc điểm hình thái......................................................................................... 4
2.2.1.2 Sự sinh trưởng của Trichoderma ................................................................... 5
2.2.1.3 Sự hình thành bào tử trên môi trường ........................................................... 5
2.2.2 Điều kiện sống trong tự nhiên của nấm Trichoderma ...................................... 6
2.2.2 Tiềm năng sử dụng Trichoderma trong phòng trừ sinh học............................. 7
2.3 Vai trò của quần thể nấm Trichoderma trong đất ............................................... 7
2.3.1 Khả năng đối kháng của Trichoderma ............................................................. 8
2.3.2 Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma ....................................................... 10
2.3.3 Vai trò của Trichoderma trong xử lý hạt giống.............................................. 11
2.3.4 Các sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma ............................................... 12

v


2.4 Các phương pháp lên men tạo chế phẩm sinh học ........................................... 13
2.4.1 Phương pháp lên men chìm ............................................................................ 13
2.4.2 Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm ................. 14
2.4.3 Phương pháp lên men hai giai đoạn tạo chế phẩm nấm ................................. 14
2.4.4 Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm ................................................ 15

2.5 Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm Trichoderma ............................. 15
2.6 Những nghiên cứu trong nước và ngoài nước về nấm Trichoderma ................ 17
2.6.1 Nghiên cứu ngoài nước .................................................................................. 17
2.6.2 Nghiên cứu trong nước ................................................................................... 19
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ........................ 23
3.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu cải tiến môi trường thứ cấp
nhân nuôi cấy nấm Trichoderma virens ...................................................... 23
3.1.1 Mục đích ......................................................................................................... 23
3.1.2 Vật liệu thí nghiệm ......................................................................................... 23
3.1.3 Phưong pháp thí nghiệm ................................................................................. 23
3.2 Thí nghiệm 2: Hoàn thiện quy trình làm khô nấm sau khi nuôi cấy ................. 26
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm ......................................................................................... 26
3.2.2 Phưong pháp thí nghiệm ................................................................................. 26
3.3 Thí nghiệm 3: Hoàn thiện quy trình xay nghiền chế phẩm
Trichoderma virens...................................................................................... 27
3.3.1 Vật liệu thí nghiệm ......................................................................................... 27
3.3.2 Phương pháp thí nghiệm................................................................................. 27
3.4 Xử lý số liệu ...................................................................................................... 28
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 29
4.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu cải tiến môi trường thứ cấp
nhân nuôi cấy nấm Trichoderma virens ...................................................... 29
4.1.1 Mật số bào tử sống.......................................................................................... 29
4.1.2 Ẩm độ và mật số bào tử sống của các nghiệm thức sau sấy theo thời gian ... 30
4.1.3 Hiệu quả kinh tế.............................................................................................. 33
4.2 Thí nghiệm 2: Hoàn thiện quy trình làm khô nấm sau khi nuôi cấy ................. 34
4.3 Thí nghiệm 3: Hoàn thiện quy trình xay nghiền chế phẩm

vi

Trichoderma virens...................................................................................... 35
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................................................. 38
5.1 Kết luận.............................................................................................................. 38
5.2 Đề nghị .............................................................................................................. 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 39
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 42

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
NSC :

ngày sau cấy

NT

nghiệm thức

:

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1: Toàn cảnh thí nghiệm nghiên cứu cải tiến môi trường thứ cấp
nhân nuôi cấy nấm Trichoderma virens ........................................................... 44
Hình 2: Bào tử Trichoderma virens ở môi trường cám : tấm : trấu
với tỷ lệ 1:2:1 và 50 % nước được 12 ngày sau khi cấy nấm........................... 44
Hình 3: Làm khô nấm trong phòng kín và sấy bằng máy ........................................ 45

Hình 4: Nấm Trichoderma virens khi sấy trực tiếp bằng máy
và hong trong phòng sau 36 giờ ....................................................................... 45
Hình 5: Bào tử nấm Trichoderma virens trước và sau khi sấy ở 30 0C .................... 46
Hình 6: Chế phẩm NLU – Tri ................................................................................... 47

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1: Mật số bào tử sống ở các nghiệm thức môi trường
theo thời gian nuôi cấy .................................................................................... 29
Bảng 4.2: Ẩm độ của từng nghiệm thức ở 30 0C và 35 0C theo thời gian sấy .......... 31
Bảng 4.3: Mật số bào tử sống của các nghiệm thức khi sấy ở 30 0C
và 35 0C ở các giai đoạn .................................................................................. 32
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của môi trường thứ cấp tới khối lượng
chế phẩm thô tạo ra, hiệu quả kinh tế và chênh lệch
lợi nhuận so với nghiệm thức đạt hiệu quả cao nhất ....................................... 33
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của thời gian hong ở nhiệt độ phòng tới thời gian sấy,
tỉ lệ nhiễm tạp và mật số bào tử/gam chế phẩm thô tạo ra .............................. 34
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của kích cỡ sàng máy nghiền tới tỉ lệ hao hụt bào tử sống
và tỉ lệ hao hụt khối lượng chế phẩm thô. ....................................................... 36
Bảng 4.7: Ảnh hưởng của kích thước lỗ sàng đến độ hòa tan sản phẩm thô
trong nước, độ vón cục và số lần tắc vòi phun ................................................ 37

x


Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, nền nông nghiệp Việt Nam có những bước tiến
vượt bậc, ngoài việc đáp ứng nhu cầu lương thực – thực phẩm trong nước, sản lượng
nhiều loại nông sản xuất khẩu của Việt Nam được xếp vào hàng đầu thế giới. Tuy
nhiên, chất lượng và hiệu quả của việc sản xuất nông sản hàng hoá ở nước ta còn nhiều
hạn chế so với các nước trong khu vực. Để khắc phục vấn đề này, chúng ta cần quan
tâm đến việc xây dựng nền nông nghiệp theo hướng sinh thái bền vững, tăng nhanh số
lượng và nâng cao chất lượng nông sản. Theo đó, công tác giống cây trồng và bảo vệ
thực vật có vai trò rất quan trọng.
Công tác phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng hiện nay được áp dụng bằng
nhiều biện pháp. Trong đó, biện pháp hoá học vẫn được xem là hữu hiệu nhất. Một vài
hoá chất trừ sâu có tính chọn lọc cao, ít độc hại cho môi trường đã được sử dụng,
nhưng những hoá chất này thường quá đắt chỉ để sử dụng cho phạm vi nông trại nhỏ.
Bên cạnh đó, biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại bằng thuốc hoá học ồ ạt như hiện nay
(có trên 400 hoạt chất nông dược sử dụng ở Việt Nam, cục BVTV, 2008), nông dân
thường pha thuốc với nồng độ cao và phun nhiều lần cho một vụ trồng đã thể hiện rõ
những mặt trái của nó như làm cho các loại sâu bệnh hại trở nên kháng thuốc, gây ảnh
hưởng xấu đến chất lượng nông sản, sức khỏe của người sản xuất cũng như người tiêu
thu, đặc biệt là gây ô nhiễm môi trường một cách nghiêm trọng.
Trước tình hình đó, biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại bằng sinh học đã được
nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu. Nhiều tác nhân ký sinh, đáng chú ý là
một số loại nấm, chúng có thể đối kháng trên một số loại tác nhân gây bệnh hại gây ra
tổn thất cho cây trồng. Đồng thời, không những ngăn chặn được một số bệnh hại trên

1


đồng ruộng, những chế phẩm nấm đối kháng không ảnh hưởng đến những loài thiên
địch bản xứ trong tự nhiên như động vật ăn thịt, ký sinh và côn trùng có ích.
Sự bảo tồn các loài thiên địch tự nhiên này là chìa khoá vững chắc để phòng
trừ sâu bệnh hại trên cây trồng một cách an toàn và hiệu quả. Một số kết quả đã đạt

được của việc phòng trừ nấm gây bệnh bằng phương pháp sinh học cho thấy tính hiệu
quả của nó, nấm gây bệnh không kháng thuốc, không gây ô nhiễm môi trường. Theo
Cook và Barker (1983), phòng trừ sinh học là việc sử dụng một hoặc nhiều sinh vật
nhằm làm giảm lượng độc tố hoặc hoạt động gây hại của tác nhân gây bệnh. Định
nghĩa này bao gồm việc sử dụng các biến thể ít độc lực của mầm bệnh, sự sử dụng ký
chủ kháng bệnh và vi sinh đối kháng.
Hiện nay, phòng trừ dịch hại cây trồng bằng biện pháp sinh học được đẩy
mạnh ở nhiều nước, được coi như là một lĩnh vực quan trọng. Biện pháp chủ yếu là
khai thác và sử dụng khả năng đối kháng của một số loại nấm đối với các loại nấm gây
hại cây trồng. Nhiều công trình nghiên cứu về nấm Trichoderma và sản xuất chế phẩm
của nấm Trichoderma để hạn chế những nấm gây hại cho cây trồng như nấm
Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium, Pythium và Botrytis gây bệnh trên lúa, ngô và một
số cây trồng khác đã thu được những kết quả mong muốn. Tuy nhiên, hiện nay vẫn
chưa tìm ra được một quy trình cụ thể để sản xuất Trichoderma phục vụ cho nhu cầu
của người dân, tìm ra một môi trường thích hợp để nhân nuôi nấm, làm khô nấm sau
khi nhân nuôi, nghiền để thu nhận bào tử nấm.
Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu cải tiến quy trình nhân nuôi nấm Trichoderma
virens, sấy khô và xay nghiền tạo chế phẩm NLU – Tri” đã được tiến hành tại phòng
thí nghiệm của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM
dưới sự hướng dẫn của TS. Lê Đình Đôn.
1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục tiêu
−

Tìm ra một môi trường thích hợp để nhân nuôi nấm.

−

Tìm ra cách làm khô nấm phù hợp sau khi nhân nuôi.

−

Tìm ra phương pháp nghiền để thu nhận bào tử nấm.

2


1.2.2 Yêu cầu
−

Theo dõi tỉ lệ bào tử nảy mầm, mật số bào tử nấm Trichoderma

virens/gam được nuôi trên môi trường thứ cấp và tỉ lệ nhiễm tạp.
−

Theo dõi ẩm độ của các nghiệm thức sau khi hong trong phòng kín,

thời gian sấy khô của các nghiệm thức, tỉ lệ sống, tỉ lệ nhiễm tạp trong quá trình sấy và
mật số bào tử/gam chế phẩm Trichoderma virens.
−

Ghi nhận chỉ tiêu tỉ lệ hao hụt do nghiền, tỉ lệ hao hụt bào tử nấm do

nghiền, độ tan của bào tử trong nước.

3


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1

Nguồn gốc của Trichoderma

Trichoderma được tìm thấy khắp mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực
Bắc. Chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới hơn là
những khu rừng ôn đới hay rừng phương bắc. Trichoderma tồn tại trong những môi
trường như rễ cây, thân cây, trong đất, sống trên xác thực vật đã chết, xác hữu cơ hay
kí sinh trên những loại nấm khác.
2.2 Đặc điểm của nấm Trichoderma
2.2.1 Hình thái, sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử của Trichoderma
2.2.1.1 Đặc điểm hình thái
Trichoderma là một loại nấm mốc. Đa số chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ tối
ưu giữa 25 – 30 0C, một vài loài phát triển tốt ở 35 0C, một ít là phát triển ở 40 0C.
Khuẩn lạc: Theo Persoon ex Gay (1801), trên cùng một môi trường nuôi cấy
mỗi loài Trichoderma có hình dạng khuẩn lạc khác nhau. Khuẩn lạc Trichoderma,
phát triển nhanh chóng và thành thục trong vòng 5 – 7 ngày. Trên môi trường PDA, ở
25 0C ban đầu đám khuẩn lạc có màu trắng, khi bào tử xuất hiện thì chuyển sang xanh
đậm hoặc xanh vàng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch (môi
trường PDA) hoá vàng (Tăng Thị Ánh Thơ, 2005).
Cuống bào tử: Những loài Trichoderma thì chưa được xác định rõ ràng về đặc
điểm của cuống bào tử. Cuống bào tử mọc lên trong những cụm hay những nốt sần dọc
theo sợi nấm hay trong khu vực tỏa ra của khóm những nốt sần có kích thước từ 1 – 7
mm, chúng có thể rất rắn chắc hoặc chúng có thể có dạng như bông và không rắn chắc
(Samuels,2004); (trích dẫn bởi Trần Tấn Đạt, 2005).
Bào tử: Trichoderma có bào tử có màu xanh đặc trưng, nhưng có thể là màu
trắng, vàng hay xanh xám tùy thuộc vào loài. Bào tử luôn luôn đơn bào. Ở đa số loài
chúng có dạng hình elip đến dạng chữ nhật với tỉ lệ dài/rộng từ 1,0 – 1,1 µm, bào tử

4

luôn luôn dài dưới 5 µm. Có loài thì bào tử trơn láng có loài thì bào tử có nhiều nốt sần
(Trần Thị Mộng Thi, 2005).
Chlamydospores: Đây là những bào tử có tính chống chịu cao, những bào tử
chlamydospore được tin rằng là những cấu trúc ở dạng ngủ, mà những cấu trúc này
làm tăng khả năng sống sót trong đất, vốn là môi trường sống nguyên thuỷ của loài
Trichoderma. Chalamydospores có thể được tận dụng trong điều chế chất kiểm soát
sinh học do khả năng sóng sót của chúng (Samuels, 2004); (trích dẫn bởi Trần Tấn
Đạt, 2005).
2.2.1.2 Sự sinh trưởng của Trichoderma
Trichoderma là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có khả
năng sử dụng nguồn hỗn hợp cacbon và nitrogen. Nguồn cacbon và năng lượng
Trichoderma sử dụng được là đường đơn và đường đa, cùng với hỗn hợp purines,
pyrinidines, acid amin, tanmins và caechins cô đọng và acid hữu cơ. Đặc biệt là acid
béo, methanol methylamine, formate và NH 3 là nguồn đạm bắt buộc phải có trong môi
trường nhân nuôi Trichoderma.
Môi trường có nhiều dinh dưỡng, muối, các nguồn sulfat và các hỗn hợp
vitamin cũng có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma. Nhưng
muối sodium chloride sẽ làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một số nấm
Trichoderma. Do đó trong môi trường nuôi trồng không được có mặt của muối này.
Nồng độ CO 2 trong môi trường nuôi trồng cũng ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng của nấm đối kháng trong đất. Tuy nhiên ảnh hưởng của CO 2 đến khả năng sinh
trưởng và sản xuất của Trichoderma phụ thuộc vào nồng độ pH của môi trường đất.
CO 2 nồng độ 10 % không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma. Tốc độ
mọc nhanh của Trichoderma ở nồng độ CO 2 cao trong môi trường kiềm, có thể giải
thích tại sao Trichoderma thường sống trong môi trường đất phèn, ẩm ướt, ít hiện diện
trên đất kiềm. vì thế CO 2 có ảnh hưởng đến sinh trưởng của Trichoderma tại độ pH có
giá trị cao.
2.2.1.3 Sự hình thành bào tử trên môi trường

Phần lớn các loài Trichoderma có cảm quan, dễ nảy mầm ở nhiều điều kiện
môi trường tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện tối sáng lẫn lộn, hay bào tử có thể xuất
hiện trong điều kiện sáng. Môi trường agar trong khoảng 20 – 30 giây ánh sáng 85 Lux

5


làm tăng hiệu quả nảy mầm. Nhiều tác giả công bố Trichoderma không hình thành bào
tử ở bước sóng dưới 254 nm hoặc trên 1100 nm và hình thành bào tử nhiều nhất ở
bước sóng 380 – 440 nm.
Các bào tử cảm quan hạn chế phát triển dưới ảnh hưởng của các hóa chất.
Các hỗn hợp như azaguanime, 5–fluorouracil, actiomycin D, cycloheximide, phenethyl
alcohol và ethidium bromide ngăn cản sự hình thành các hậu mô bào tử, đây là một
cấu trúc đặc biệt của cơ thể rất quan trọng trong hình thái học, làm tăng tiềm năng
trong phòng trừ sinh học. Trichoderma harzianum, Trichoderma hamatum,
Trichoderma viride và Trichoderma virens ở trong cả môi trường lỏng và rắn có nồng
độ acid thích hợp cho bào tử nảy mầm hơn là trong môi trường trung tính.
2.2.2 Điều kiện sống trong tự nhiên của nấm Trichoderma
Đa số các loài Trichoderma phát triển mạnh ở 25 – 30 0C, phát triển chậm ở
35 – 37 0C. Thêm vào đó, hình thái khác nhau cũng xuất hiện ở các mức nhiệt độ khác
nhau. Ở 35 0C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử
nhỏ và ở mép bất thường, trong khi ở 37 0C thậm chí không tạo bào tử sau 7 ngày nuôi
cấy (Samuels, 2004).
Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả năng này sẽ mất dần. Điều này
có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học của Trichoderma. Bào tử phân
sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và liên quan đến hiện tượng giảm
khả năng kháng nấm trong đất. Độ nhạy cảm đất kháng nấm được công bố trên đất
trung tính, đất kiềm chua và đất acid. Bào tử phân sinh kháng nấm ở trong đất nhiều
hơn bào tử chống chịu, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào tử phân sinh (Papavizas, 1985).
Sự thiết lập quần thể và hiện tượng nảy mầm trong đất:


−

Vi sinh vật trong đất hoạt động phụ thuộc vào nhiều loại chất nền, có

nhiều phương pháp xác định khác nhau. Khi cấy sợi nấm non (chưa có bào tử) vào đất
đều liên quan mật thiết đến thành phần môi trường đất. Bào tử sẽ được nhân lên và
thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ cân bằng duy trì trong đất từ 9 – 36 tuần
sau khi cấy nấm vào trong đất). Điều này phụ thuộc vào tuổi của nấm và liên quan đến
thành phần thức ăn của nấm. Việc hình thành quần thể sợi nấm Trichoderma từ thành
phần nuôi cấy không liên quan đến loại đất. Khi lên men Trichoderma, nếu thêm vào

6


chất Pyrax khô giúp tăng quần thể từ 5 x 103 lên 6 – 7 x 106 bào tử/gam đất (Papavizas
và Lewis, 1989).
−

Thiết lập quần thể tại vùng rễ cây: Trichoderma đã được phân lập từ rễ

cây và có khả năng dùng vào việc phòng trừ sinh học tại vùng rễ cây bị bệnh. Hiệu quả
của Trichoderma không chỉ xử lý hạt mà còn tiếp tục thiết lập quần thể dưới vùng rễ
cây sau khi xử lý hạt. Trichoderma xử lý hạt phát triển nhanh xung quanh hệ rễ tạo các
bào tử ngăn cản bệnh xâm nhiễm vào cây trồng. Nếu Trichoderma được cấy vào trong
đất với tác dụng chống bệnh cho cây thì bắt buộc phải cấy dọc theo bề mặt rễ.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy Trichoderma harzianum không thiết
lập quần thể xung quanh hệ rễ cây họ đậu và cây đậu Hà Lan con. Quan sát bào tử trên
vùng rễ cây gồm rễ, vỏ, lá mầm, hạt bị thối cho thấy số lượng bào tử Trichoderma trên

mỗi gam đất xung quanh hệ rễ luôn luôn ít. Bào tử của Trichoderma ít thiết lập quần
thể hay ít di chuyển vào vùng rễ cây. Với Trichoderma harzianum vài bào tử được tìm
thấy cách xung quanh hệ rễ cây 10 cm trên cây được xử lý hạt nhưng số lượng bào tử
được tìm thấy nhiều trên lá mầm Đậu Hà Lan bị thối và vỏ hạt giống kể cả mẫu bệnh
xung quanh rễ (Harma và ctv., 1983).
Có nhiều giải thích về số lượng bào tử Trichoderma tăng hoặc giảm trong
đất và Trichoderma không có khả năng thiết lập quần thể ở vùng rễ cây: thiếu dinh
dưỡng, thể hiện chất độc trong rễ cây hay sự hiện diện của chất kháng hoặc sự hiện
diện của vi sinh vật đối lập với Trichoderma tại vùng rễ của cây (Ví dụ: Pseudomonas
sản xuất chất độc chuyển đổi gây ảnh hưởng đến sự phát triển của bào tử nấm
Trichoderma) (Hubbard và ctv., 1983).
2.3 Tiềm năng sử dụng Trichoderma trong phòng trừ sinh học
2.3.1 Vai trò của quần thể nấm Trichoderma trong đất
Trichoderma có khả năng tái tạo lại quần thể, được xem là một hiện tượng
phòng trừ sinh học vẫn chưa được giải thích về cơ chế. Trichoderma có khả năng thiết
lập quần thể và tái hoạt động rất nhanh trên đất đã được xử lý khử trùng, xông hơi
bằng carbon disulfide để diệt nấm Armillaria mellea trên cây cam, quýt nhưng không
công bố bằng chứng quần thể nấm Trichoderma phòng chống bệnh. Ohr và ctv. (1973)
đã cung cấp bằng chứng thuyết phục nhất về khả năng phòng trừ nấm Armillaria

7


mellea của quần thể Trichoderma trên đất đã được xử lý xông hơi bằng Methyl
Bromide (trích dẫn bởi Nguyễn Thân, 2004).
Thêm vào những bằng chứng về vai trò quần thể Trichoderma trong đất
trong vấn đề phòng trừ sinh học như thêm sulfur vào đất để duy trì độ pH dưới 3,9 làm
tăng khả năng phòng trừ bệnh thối rễ và thối ngọn dứa ở Úc. Cách phòng trừ này đã
làm giảm túi bào tử của nấm phytophthora và làm tăng tính ưa acid của Trichoderma
viride (Cook và Baker, 1983). Khả năng hoạt động phòng trừ sinh học của

Trichoderma ở các thể tiềm sinh và sợi nấm được công bố không chỉ trong phòng thí
nghiệm (Cook và Baker, 1982) mà còn trong đất (Hubbard và ctv., 1983).
Trichoderma có khả năng khuếch tán chất độc của các nấm trong phòng thí nghiệm kể
cả các chất hữu cơ trong đất cũng như khả năng kéo dài phòng trừ sinh học của
Trichoderma.
Ngoài ra, khả năng thứ hai của Trichoderma là kháng nấm. Trichoderma
hamatum có rất nhiều trong đất hữu cơ tại vườn ươm ở Colombia có khả năng ngăn
chặn nấm Rhizoctonia solani và Trichoderma harzianum có nhiều khi phân lập từ đất
tại Mêxico có khả năng ngăn chặn nhiều loại nấm đất. Dưới nhiệt độ và tia phóng xạ
gama không thể diệt được nấm Rhizoctonia solani, ngược lại trên môi trường
Trichoderma harzianum có thể diệt được nấm này, đây là vai trò chính của
Trichoderma trong phòng trừ sinh học.
Khả năng ngăn cản của đất đến những loại nấm gây bệnh trong đất, đặc biệt
là R. solani, Pythium spp., có liên quan đến nấm Trichoderma đã được công bố rộng
rãi và là vấn đề được nghiên cứu trong nhiều năm nay.
2.3.2 Khả năng đối kháng của Trichoderma
Những loài Trichoderma được ứng dụng làm chế phẩm để chống lại bệnh
hại trên nhiều loại cây trồng như bông, nho, bắp, hành, đậu, mận, táo mà nguyên nhân
gây ra là do nấm Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotium, Botrytis, Fusarium
và Crinipellis. Trichodema không những ảnh hưởng trực tiếp lên mầm bệnh mà còn
ảnh hưởng gián tiếp lên hệ rễ giả, bằng khả năng loại bỏ mầm bệnh hay hỗ trợ cung
cấp thêm dưỡng chất cho cây. Những dữ kiện gần đây cho rằng những ảnh hưởng quan
trọng nhất của Trichoderma trong đấu tranh sinh học với những mầm bệnh trên cây là
tạo ra sức đề kháng cho cây chủ (Samuels, 2004).

8


Theo Harman (1990), khi cộng sinh trên rễ, Trichoderma ăn mòn, kí sinh và
cạnh tranh dinh dưỡng từ các loại nấm khác. Chúng phát triển mạnh cho cả hai cơ chế

kí sinh những loài nấm khác và tăng sự phát triển của cây và rễ. Cơ chế đối kháng của
Trichoderma là nấm kí sinh, tạo kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian,
chịu đựng những căng thẳng, tăng cường sự phát triển của rễ cây, hoà tan và cô đọng
dinh dưỡng vô cơ, gây ra sự đối kháng, tiết ra enzyme làm mất hoạt tính của mầm
bệnh.
Theo Samuels (2004), cơ chế đối kháng của Trichoderma được mô tả là tiết
ra nhiều loại chất kháng sinh để ức chế sự phát triển của nấm bệnh như:
−

Gliotoxin và gliovirin được sản xuất bởi Trichoderma virens. Chúng

kiềm chế sự nẩy mầm và phát triển của các loài Rhizoctonia solani và Pythium.
−

Alkyn pyrones (hương dừa): gồm có Trichoderma atroviride,

Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma hamatum. Hoạt động của
phytotoxin có thể ngăn chặn sự nẩy mầm của những noãn bào tử của Phytophthora
cinnamomea và bào tử đính của Botrytis cinerea.
−

Isonitriles: gồm có Trichoderma hamatum, Trichoderma harzianum,

Trichoderma viride, Trichoderma koningii và Trichoderma polysporum, hạn chế sự
phát triển của nấm gây bệnh.
−

Polyketides: Tiết ra từ Trichoderma harzianum.

−

Peptaibols: sản xuất ra từ Trichoderma polysporum, Trichoderma

harzianum, Trichoderma koningii hoạt động trên màng của nấm bệnh để ngăn cản sự
tổng hợp enzyme membrane – associated trong sự hình thành tế bào. Peptaibols hoạt
động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh.
−

Sesquiterpenes: Acid heptalidic được tạo ra bởi Trichoderma koningii,

Trichoderma viride, Trichoderma virens.
−

Steroids: viridin sản xuất bởi Trichoderma virens, hạn chế sự nẩy mầm

của bào tử. Nó có khả năng như một độc tố thực vật có hiệu lực như là một loại thuốc
diệt cỏ.
Ngoài ra, 3 loại enzyme ngoại bào khác sinh ra từ nấm Trichoderma đã
được tách chiết, tinh sạch cũng có hoạt tính phân hủy chitine N – acetylglucosaminase,
chitosesidase và endochitinase.

9


Theo Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng (2003), Trichoderma có thể đối
kháng với nhiều loài vi sinh vật nhờ nhiều cơ chế khác nhau như cạnh tranh dinh
dưỡng và không gian, ký sinh hoặc quấn lấy sợi nấm gây bệnh, tạo ra kháng sinh hay
tiết ra các enzyme (chitinase, β–1,3–glucanase) phân hủy vách tế bào chủ.
Ngoài khả năng kiểm soát mầm bệnh thực vật, Trichoderma còn có khả
năng cải tạo đất trồng, làm tăng độ phì nhiêu cho đất nhờ khả năng phân giải một số

phân lân khó tan và do nhiều enzyme phân hủy ngoại bào như là cellulase. Dưới tác
động của các enzyme các chất hữu cơ trong đất phân hủy nhanh hơn, làm tăng chất
dinh dưỡng dưới dạng dễ hấp thu cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt (Tăng Thị
Ánh Thơ, 2005).
Ngoài chất độc và kháng sinh, Trichoderma còn tiết ra nhiều chất khác như
exon và endoglucanase, cellobiase và chitinase có khả năng phân hủy thành tế bào của
nấm gây bệnh. Nấm Trichoderma cũng tương tự một số nấm mốc khác như
Gliocladium, Calvatia cho lượng enzyme chitanase cao. Loại enzyme này có nhiều
chức năng, trong đó chức năng phân hủy chitine là một chức năng chính, chitine là
thành phần chính cấu tạo vách tế bào nấm, yếu tố quan trọng trong hoạt động ký sinh
nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật. Chitine có cấu tạo và chức năng
giống cellulose, chitine có thể thay thế một phần hay toàn bộ cellulose trong thành tế
bào của một số loài thực vật. Chitine là chất rắn vô định hình, không tan trong nước,
kiềm, alcohol, hầu hết các acid và các dung môi hữu cơ khác. Chitine có thể bị phân
hủy bởi các acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc, H 2 SO 4 đậm đặc) hoặc bằng enzyme sinh
vật (Võ Ngọc Trân, 2005).
2.3.3 Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma
Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế. Weidling
(1932), đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho
hiện tượng đó là “giao thoa sợi nấm”. Hiện tượng giao thoa gồm 3 giai đoạn như sau:
−

Giai đoạn 1: Sợi nấm Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh.

−

Giai đoạn 2: Sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy sợi nấm gây bệnh cây.

−

Giai đoạn 3: Cuối cùng, sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng

vách tế bào của nấm gây bệnh, làm cho chất nguyên sinh trong nấm gây bệnh bị phân
hủy và gây chết nấm bệnh.

10


Rouscu và ctv (1996), đã quan sát dưới kính hiển vi về hiện tượng ký sinh
của nấm Trichoderma và mô tả như sau: Tại những điểm nấm Trichoderma tiếp xúc
với nấm gây bệnh đã làm cho nấm gây bệnh teo lại và chết. Ngược lại, ở những điểm
không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh nhưng nấm gây bệnh
vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm
Trichoderma đã gây độc cho nấm gây bệnh (Michrina và ctv., 1996) (trích dẫn bởi
Trần Thị Vân, 2010).
2.3.4 Vai trò của Trichoderma trong xử lý hạt giống
Có nhiều ghi nhận về khả năng kháng bệnh phòng trừ sinh học trên cây
trồng bị bệnh. Mặc dù có nhiều loài nấm Trichoderma có khả năng dùng vào phòng
trừ sinh học nhưng chưa có một sản phẩm thương mại nào được đăng ký tại Mỹ
(Papavizas và Lewis, 1981). Có nhiều lý do, một trong những lý do này là cần một số
lượng lớn nguyên liệu phòng trừ sinh học trên một diện tích đất thí nghiệm lớn
(Harman và ctv., 1980); (trích dẫn bởi Nguyễn Thân, 2004).
Sử dụng Trichoderma vào việc xử lý hạt giống có liên quan đến khả năng
xâm nhập của Trichoderma vào trong đất, phương pháp này đòi hỏi một số lượng lớn
bào tử để áp dụng. Tuy nhiên đây là một phương pháp rất có ý nghĩa trong việc phòng
trừ nấm gây bệnh ở giai đoạn hạt đến giai đoạn cây con. Khả năng phòng trừ sinh học
của nấm Trichoderma với bệnh chết rạp cây con do nấm Rhizoctonia solani và
Pythium spp, có hiệu quả trên hạt giống đậu Hà Lan và củ cải đường (Haman và ctv.,
1980). Hạt giống bắp được xử lý bằng Trichoderma harzianum và hạt giống đậu nành
được xử lý Trichoderma pseudokoningii có hiệu quả làm ngăn chặn nguồn bệnh và

làm tăng năng suất trong việc phòng trừ nấm Rhizoctonia trên cánh đồng nhiễm nấm
này và có hiệu quả khi dùng nấm Trichoderma harzianum xử lý hạt bông phòng trừ
nấm Rhizoctonia solani tại Israel.
Hiệu quả thành công trong việc dùng Trichoderma xử lý hạt giống ảnh
hưởng từ nhiều yếu tố phân lập: tuổi của hạt giống gieo trồng, nhiệt độ và tái hoạt
động của đất, loại đất và vi sinh vật hiện diện trong đất, dinh dưỡng trong quá trình
cấy nấm, mật độ nấm khi cấy vào đất, tiềm năng bệnh gây hại trong đất, và tuổi của
cây trồng (Papavizas và Lewis, 1981); (trích dẫn bởi Nguyễn Thân, 2004).

11


Trichoderma có hiệu quả nhất trong việc phòng trừ bệnh chết rạp cây con,
khả năng tạo sinh khối trong đất và hệ rễ ngăn cản bệnh gây hại cây bằng cách cạnh
tranh, kí sinh trên nấm hoặc kháng sinh học. Ngoài ra chúng còn gây ảnh hưởng mạnh
đến vi khuẩn và các loại nấm khác trong đất (Hadar và ctv., 1984).
2.3.5 Các sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma
Theo Weidling (1932) là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm được trao đổi
của Trichoderma. Weidling và Emerson (1939), đã phân lập được chất kết tinh từ chất
trao đổi hữu cơ rất độc khi pha loãng nhiều lần khi dùng Trichoderma chống
Rizoctonia solani. Chất này tên thông thường: Gliotoxin chất độc thứ 2 do Brian và
Mc Growan (1958), công bố là viridin sản xuất từ Trichoderma viride. Webster và
Lomas ghi nhận là 2 chất kháng sinh này đều hiện diện trên môi trường được lọc từ
Trichoderma viride sau đó Weidling cô lập ra sản phẩm gọi là gliotoxin, Brian và Mc
Growan cô lập viridin. Dennis và Webstre (1965), ghi nhận Trichoderma spp. Có khả
năng sinh ra các độc tố kháng với các loại nấm gây bệnh, khác với Gliotoxin và
Viridin, sản phẩm đó là chất kháng sinh (trích dẫn bởi Nguyễn Thân, 2004).
Ngoài chất độc là chất trao đổi và kháng sinh ra, Trichoderma còn có thể tiết
ra nhiều enzyme khác như exo và endoglucanases, cellobiase và chitinase có khả năng
phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh.

Nấm Trichoderma cũng như một số nấm mốc khác như Gliocladium cho
lượng enzyme chitinase cao. Chitinase có nhiều chức năng, một trong những chức
năng chính là khả năng phân hủy chitine là thành phần chất dính cấu tạo vách tế bào
nấm, yếu tố này rất quan trọng trong hoạt động ký sinh nhằm đối kháng lại các loài
nấm gây bệnh thực vật.
Chitine có cấu tạo và chức năng giống như cellulose, trong tự nhiên chitine
là thành phần hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng. Chitine có thể thay thế
một phần hay toàn bộ cellulose trong thành phần tế bào của một số loài thực vật.
Chitine là chất rắn vô định hình, nó không tan trong nước, hầu hết các acid,
kiềm, alcohol và các dung môi hữu cơ khác. Chitine có thể bị phân hủy bởi acid vô cơ
mạnh (HCl đậm đặc, H 2 SO 4 đậm đặc) hoặc bằng enzyme sinh vật. Quá trình thủy
phân sẽ cắt các liên kết β – glycoside cho ra olisaccharide.

12


Trong quá trình ký sinh trên nấm bệnh, Trichoderma có thể tiết ra các loại
enzyme để phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh.
Ngoài ra, 3 loại enzyme ngoại bào khác sản sinh ra từ nấm Trichoderma đã
được tách chiết, tinh sạch cũng có hoạt tính phân hủy chitine N acetylglucoamidase,
Chitosesidase và Endochitinase.
2.4 Các phương pháp lên men tạo chế phẩm sinh học
Hiện nay, trên thế giới có nhiều phương pháp lên men tạo chế phẩm sinh
học để trừ nấm bệnh, sâu hại cây trồng trong nông nghiệp. Người ta đã xây dựng
những quy trình để thu nhận sản phẩm lên men khá hoàn chỉnh và được áp dung vào
thực tế sản xuất lớn ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, quy trình lên men vẫn đang còn
trong giai đoạn tìm kiếm một phương pháp thích hợp, chọn lựa điều kiện và môi
trường nuôi cấy tối ưu để đạt số lượng bào tử gồm chất khô cao, giá thành sản phẩm rẻ
đồng thời sản phẩm tạo ra dễ bảo quản, giữ được hoạt tính lâu bền ở nhiệt độ bình
thường.

Một số phương pháp lên men chế tạo chế phẩm sinh học đã được nghiên
cứu và ứng dụng như sau:
2.4.1 Phương pháp lên men chìm
Nhiều tác giả đã áp dụng phương pháp lên men chìm để nuôi cấy các nấm
diệt sâu như nấm Beauveria bassiana (Samsinakova, 1961), Metarrhizium anisopliae
(Adamek, 1965). Nấm nuôi cấy chìm phát triển cho dạng Chlamydospores, còn khi
nuôi bề mặt hoặc nấm phát triển cho dạng conidia (Nguyễn Thân, 2004).
Khi nuôi cấy chìm nấm thường phát triển qua 6 giai đoạn:
−

Giai đoạn 1: bào tử phồng lên, tạo thành một hay nhiều ống mầm.

−

Giai đoạn 2: các sợi nấm phân nhánh.

−

Giai đoạn 3: tạo thành chlamydospores lần thứ nhất.

−

Giai đoạn 4: các chlamydospores phát triển lại tạo thành sợi nấm.

−

Giai đoạn 5: sợi nấm phát triển bắt đầu tạo chlamydospores lần thứ 2.

−

Giai đoạn 6: tạo thành chlamydospores lần 2.

Nếu tiếp tục nuôi cấy sẽ xảy ra sự phân ly hoàn toàn của sợi nấm. Lượng
chlamydospores lần thứ 2 ổn định một thời gian, sau đó cũng giảm đi.

13


Nhược điểm của phương pháp lên men chìm là chỉ thu được chế phẩm ở
dạng bào tử chồi chlamydospores, không bền vững, dễ bị mất hoạt tính vì có thời gian
sống ngắn, có cấu trúc không bền vững.
2.4.2 Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm
Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm đã được
thực hiện bởi Evlacchova (1968), đã áp dụng phương pháp lên men này để tạo chế
phẩm Boverin, chất diệt sâu vi sinh trên cơ sở nấm Beauveria bassiana. Môi trường
dinh dưỡng được đun sôi ở 100 0C và khi nguội cho thêm chất kháng sinh
Streptomycine (0,01%) để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men
(Nguyễn Thân, 2004).
Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp này có hiệu quả cần thực hiện 5
nguyên tắc chủ yếu sau:
−

Nguyên tắc 1: Bào tử nấm được cấy phủ kín khắp bề mặt môi trường

dịch (đã đun sôi 100 0C/20 phút). Các bào tử nấm sau khi cấy sẽ tự điều hòa khuyếch
tán thành một màng mỏng khắp bề mặt môi trường, ngăn ngừa vi sinh vật lạ phát triển.
−

Nguyên tắc 2: Lượng bào tử trên một đơn vị bề mặt môi trường được

cấy một lượng lớn đủ áp đảo được phát triển ban đầu của các vi sinh vật lạ (1 – 2 tỉ bào
tử/cm2).
−

Nguyên tắc 3: Ngay sau khi nảy mầm, bào tử của các nấm sẽ tiết ra các

chất trao đổi chất, giống kháng sinh để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm lạ.
−

Nguyên tắc 4: Tạo môi trường pH từ 5 – 5,5 thuận lợi hơn cho sự phát

triển của nấm, ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
−

Nguyên tắc 5: Sử dụng dụng cụ, thiết bị và phòng nuôi cấy sạch sẽ, hạn

chế tối thiểu sự nhiễm tạp của nấm nuôi.
2.4.3 Phương pháp lên men hai giai đoạn tạo chế phẩm nấm
Phương pháp lên men hai giai đoạn thực chất là phương pháp lên men chìm
(giai đoạn 1) và sau đó chuyển sang lên men bề mặt (giai đoạn 2).
Như đã nêu trong phương pháp lên men chìm, sự phát triển của nấm xảy ra
gồm 6 pha phát triển, thuận lợi nhất cho sự chuyển sang giai đoạn nuôi bề mặt là kết
thúc pha 3 và bắt đầu pha 4, nghĩa là trong dịch nuôi cấy tạo nhiều Chlamydospores
lần thứ nhất, bắt đầu phát triển thành sợi nấm.

14