XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC MỘT SỐ LOẠI THUỐC HOÁ HỌC VÀ SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN TRÁI THANH LONG (Hylocereus undatus L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC
MỘT SỐ LOẠI THUỐC HOÁ HỌC VÀ SINH HỌC
TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN TRÁI
THANH LONG
(Hylocereus undatus L.)

NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT
KHÓA: 2007-2011
SINH VIÊN THỰC HIỆN: PHẠM QUỐC VINH

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08/2011


i

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC
MỘT SỐ LOẠI THUỐC HOÁ HỌC VÀ SINH HỌC
TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN TRÁI
THANH LONG (Hylocereus undatus L.)

Tác giả

PHẠM QUỐC VINH

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu

cấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ thực vật

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
TS. VÕ THỊ THU OANH
ThS. NGUYỄN THÀNH HIẾU

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08/2011


ii

LỜI CẢM ƠN
Thành kính khắc ghi công ơn ông bà, cha mẹ đã suốt đời tận tụy, hy sinh để con
có được ngày hôm nay.
Xin chân thành cảm ơn:
 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm
 Ban chủ nhiệm khoa Nông Học
 Bộ môn Bảo vệ thực vật
Và thầy Võ Thái Dân cùng toàn thể quý thầy cô khoa Nông Học đã hết lòng
truyền đạt những kiến thức quí báu trong suốt quá trình em theo học tại trường.
Trân trọng biết ơn cô Võ Thị Thu Oanh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong
suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
Xin cảm ơn anh Nguyễn Thành Hiếu cùng toàn thể các anh chị trong phòng Bảo
Vệ Thực Vật của Viện cây ăn quả Miền Nam đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và
làm việc tại đây.
Cảm ơn bạn bè cùng anh chị em đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học tập và làm đề tài.

Tiền Giang, ngày tháng 08 năm 2011
Người thực hiện

Phạm Quốc Vinh


iii

TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Xác định tác nhân và khảo sát hiệu lực một số loại thuốc
hoá học trong phòng trừ bệnh thối nhũn trái thanh long (Hylocereus undatus L.)” được
tiến hành tại xã Quơn Long – Chợ Gạo – Tiền Giang và Phòng thí nghiệm Bộ môn
Bảo Vệ Thực Vật – Viện Cây Ăn Quả Miền Nam thuộc ấp Đông, xã Long Định Châu Thành - Tiền Giang, thời gian từ tháng 2/2011 đến 7/2011.
Việc nghiên cứu một số biện pháp phòng trừ thối nhũn đầu trái thanh long nhằm
xác định tác nhân gây bệnh và tìm ra biện pháp phòng trừ bệnh một cách có hiệu quả.
Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2011 đến tháng 7/2011 tại Tiền Giang. Đề tài ghi
nhận một số kết quả sau:
Tác nhân gây bệnh: có hai tác nhân xuất hiện với tỷ lệ nhiều nhất là vi khuẩn
Vk5 xuất hiện với tần xuất là 68,42% và một loại nấm xuất hiện với tần xuất 70,21%.
Qua giám định theo tài liệu của Clements (1973) thì nấm phân lập được là nấm
Rhizopus sp.
Dựa vào một số đặc trưng về phản ứng sinh hóa và gây thối nhũn khoai tây có
thể kết luận vi khuẩn Vk5 phân lập được thuộc chi vi khuẩn Erwinia sp.(Schaad,
1988).
Các nghiệm thức Ditacin , Avalon và Biogreen có hiệu quả rất tốt trong phòng
trừ bệnh thối nhũn trái thanh long.
Phun các loại thuốc Ditacin, Avalon và Biogreen có kết hợp với rút râu bông trái
sớm sau khi hoa nở (thụ phấn hoàn toàn) trong điều kiện mùa mưa sẽ làm giảm tỷ lệ
bệnh.


iv

MỤC LỤC
Nội dung

Trang

TRANG TỰA ................................................................................................................. i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
TÓM TẮT .................................................................................................................................iii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...................................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................................... vii
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................................viii
Chương 1 GIỚI THIỆU .............................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................................. 1
1.2 Mục đích ............................................................................................................................... 2
1.3 Yêu cầu ................................................................................................................................. 2
1.4 Giới hạn đề tài ...................................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................................... 3
2.1 Tổng quan về cây thanh long................................................................................................ 3
2.1.1 Phân loại khoa học cây thanh long .................................................................................... 3
2.1.2 Nguồn gốc ......................................................................................................................... 3
2.1.3 Đặc điểm thực vật học ....................................................................................................... 3
2.2 Thành phần bệnh hại trên cây thanh long ............................................................................. 5
2.3 Tổng quan về bệnh thối nhũn ............................................................................................... 7
2.3.1 Triệu chứng bệnh thối nhũn............................................................................................... 7
2.3.2 Tác nhân gây ra bệnh thối nhũn ........................................................................................ 7
2.3.3 Vi khuẩn gây thối nhũn cây trồng Erwinia sp ................................................................... 8
2.3.4 Nấm gây bệnh Rhizopus sp.............................................................................................. 11
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 13
3.1 Vật liệu ............................................................................................................................... 13

3.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................................... 13
3.2.1. Phân lập, nuôi cấy và xác định tác nhân ......................................................................... 13
3.2.2 Kiểm chứng tác nhân thông qua quy trình Koch ............................................................. 14
3.2.4 Phản ứng sinh hóa............................................................................................................ 15
3.2.4.1 Thí nghiệm khả năng thủy phân tinh bột ...................................................................... 15
3.2.3 Thí nghiệm khả năng gây thối nhũn khoai tây ................................................................ 16


v

3.2.5 Khảo sát hiệu quả của một số loại thuốc hoá học đến khả năng kiểm soát bệnh thối đầu
trái thanh long ở điều kiện in vitro ........................................................................................... 17
3.2.6 Nghiên cứu hiệu quả quản lý tổng hợp bệnh bằng một số loại thuốc ở điều kiện ngoài
đồng .......................................................................................................................................... 18
3.3.7 Phương pháp thống kê số liệu ......................................................................................... 19
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 20
4.1 Phân lập tác nhân gây bệnh thối trái thanh long ................................................................. 20
4.2 Kết quả chủng Koch ngoài đồng ....................................................................................... 20
4.3 Kết quả phản ứng sinh hóa ................................................................................................. 21
4.4 Kết quả thí nghiệm khả năng gây thối nhũn khoai tây ....................................................... 23
4.5 Nhuộm gram, quan sát hình dạng vi khuẩn và nấm ........................................................... 24
4.6 Kết quả khảo sát hiệu quả của một số loại thuốc hoá học đến khả năng kiểm soát bệnh thối
đầu trái thanh long ở điều kiện in vitro .................................................................................... 25
4.7 Kết quả khảo sát hiệu quả của một số loại thuốc hoá học đến khả năng kiểm soát bệnh thối
đầu trái thanh long ở điều kiện ngoài đồng ............................................................................. 26
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 28
5.1 Kết luận .............................................................................................................................. 28
5.2 Đề nghị ............................................................................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 29
PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 31

vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long .............................................................. 5
Bảng 2.2: Thành phần bệnh gây hại trên thanh long ................................................................. 6
Bảng 3.1: Các loại thuốc dùng trong thí nghiệm in vitro ........................................................ 17
Bảng 3.2: Các loại thuốc dùng trong thí nghiệm ngoài đồng .................................................. 18
Bảng 4.1: Kết quả phân lập tác nhân gây bệnh thối trái thanh long ở hai tỉnh Long An và Tiền
Giang ........................................................................................................................................ 20
Bảng 4.2: Kết quả chủng Koch vi khuẩn trên bông thanh long ............................................... 20
Bảng 4.3: Kết quả phản ứng sinh hóa của dòng vi khuẩn 5..................................................... 21
Bảng 4.4: Hiệu quả một số loại thuốc hóa học đến khả năng kiểm soát bệnh thối đầu trái
thanh long trong điều kiện in vitro ........................................................................................... 25
Bảng 4.5: Mức độ kháng của vi khuẩn đối với từng nghiệm thức........................................... 26
Bảng 4.6: Hiệu quả kiểm soát bệnh thối trái sau xử lý thuốc .................................................. 27


vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1.1: Triệu chứng thối nhũn trái thanh long ....................................................................... 7
Hình 4.1: Chủng vi khuẩn Vk5 vào bông búp ......................................................................... 21
Hình 4.2: Phản ứng Catalase ................................................................................................... 22
Hình 4.3: Trước và sau khi nhuộm Lugol ............................................................................... 22
Hình 4.4 : Môi trường chứa vi khuẩn và đối chứng ................................................................ 23
Hình 4.5 Chủng vi khuẩn Vk5 vào khoai tây và các dòng đối chứng ..................................... 23
Hình 4.6: Hình dạng vi khuẩn nhuộm gram .......................................................................... 24
Hình 4.7: Bào tử nấm............................................................................................................... 24

Hình 4.8: Nấm Rhizopus sp. .................................................................................................... 24
Hình 4.9: Bông trước khi phun ............................................................................................... 26
Hình 4.10: Bông sau khi phun lần 4 ........................................................................................ 26


viii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
VCAQMN

Viện cây ăn quả Miền Nam

BVTV

Bảo vệ thực vật

VK

Vi khuẩn

ctv

Cộng tác viên


1

Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề

Cây thanh long (Hylocereus undatus L.), thuộc họ xương rồng, có nguồn gốc ở
vùng Nam Mỹ, được du nhập bởi người Pháp và trồng ở Việt Nam trên 100 năm nay
(Peter Lo, 2001). So với các nước khác trong khu vực, Việt Nam hiện nay là nước có
diện tích trồng thanh long tương đối tập trung trên qui mô thương mại với diện tích
ước lượng 14.000 hecta, phần lớn tập trung tại tỉnh Bình Thuận với khoảng trên
11.000 hecta (Sở Nông Nghiệp và PTNT Bình Thuận, 2009), phần diện tích còn lại
được canh tác ở Long An, Tiền Giang và rải rác ở một số nơi khác.
Thanh long là cây trồng đặc sản có lợi thế cạnh tranh đứng thứ nhất trong 11
loại trái cây ở nước ta mà Bộ Nông Nghiệp và PTNT đã xác định trong hội nghị trái
cây có lợi thế cạnh tranh tại Tp. Hồ Chí Minh ngày 7/06/ 2004. Thanh long được xuất
khẩu sang nhiều nước như Trung Quốc, các nước Đông Nam Á, châu Âu, gần đây
thanh long được xuất cả sang Hoa Kỳ, Nhật Bản, Hàn Quốc và chuẩn bị xuất khẩu
sang Úc, Newzealand. Thanh long đem lại hiệu quả kinh tế cao và nâng cao thu nhập
đáng kể cho nông dân ở các vùng trồng thanh long. Đặc biệt thanh long còn góp phần
rất lớn trong việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng trong nông nghiệp và chương trình xóa
đói giảm nghèo làm thay đổi bộ mặt nông thôn của các huyện trồng thanh long.
Thời gian gần đây, trong thực tế sản xuất đã xuất hiện một loại dịch hại mới gây
ảnh hưởng không nhỏ cho cây thanh long, đó là bệnh thối nhũn trái thanh long. Tuy
chỉ mới xuất hiện nhưng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng trái
thanh long và đặc biệt bệnh có chiều hướng lây lan nhanh và rất khó phòng trị. Xuất
phát từ yêu cầu thực tiễn trên và được sự chấp thuận của khoa Nông học, trường Đại
học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tôi tiến hành đề tài “Xác định tác nhân và khảo sát
hiệu lực một số loại thuốc hoá học trong phòng trừ bệnh thối nhũn trái thanh long
(Hylocereus undatus L.)”.


2

1.2 Mục đích
Xác định tác nhân gây bệnh thối trái thanh long và khảo nghiệm một số loại

thuốc hóa học phòng trừ bệnh.
1.3 Yêu cầu
 Xác định và phân lập tác nhân gây bệnh thối nhũn trái.
 Khảo nghiệm tìm ra loại thuốc phòng trị bệnh thối nhũn trái hiệu quả.
1.4 Giới hạn đề tài
 Thời gian thực hiện: đề tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2011 đến tháng 07
năm 2011.
 Địa điểm thực hiện: Quơn Long – huyện Chợ Gạo – tỉnh Tiền Giang.
 Đề tài chỉ thực hiện đánh giá hiệu quả cuả một số loại thuốc bảo vệ thực vật
trên diện hẹp ở tỉnh Tiền Giang (Long An).


3

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cây thanh long
2.1.1 Phân loại khoa học cây thanh long
Theo kết quả phân loại khoa học, cây thanh long có tên khoa học là Hylocereus
undatus Haw thuộc:
Họ (familia): Cactaceae
Chi (genus): Hylocereus
Loài (species):

H. undatus

Tên tiếng Anh:

Dragon Fruit

(Nguồn: Nguyễn Văn Kế, 2003)
2.1.2 Nguồn gốc
Cây thanh long có nguồn gốc chủ yếu từ các vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới Mỹ
Latin, bao gồm cả Bắc, Trung và Nam Mỹ (Crane và Balerdi, 2005; Luders và
McMahon, 2006). Riêng ở Châu Á có tên gọi là thanh long vì tai trái giống vảy của
con rồng (Mizrahi và ctv, 2002). Thanh long được phát hiện đầu tiên ở Columbia và
được người dân địa phương sử dụng phổ biến (Crane và Balerdi, 2005). Thanh long đã
đưa vào trồng ở Việt Nam cách đây 100 năm (Luders và McMahon, 2006).
2.1.3 Đặc điểm thực vật học
Rễ cây: rễ thanh long không mọng nước nên nó không phải là nơi tích trữ
nước giúp cây chịu hạn. Thanh long có hai loại rễ là: địa sinh và khí sinh. Rễ địa sinh
phát triển từ phần lồi của gốc hom, sau khi đặt hom từ 10 – 20 ngày thì từ gốc hom
xuất hiện các rễ tơ màu trắng, số lượng rễ và kích thước của chúng cũng tăng dần theo
tuổi cây, những rễ lớn đạt kích thước từ 1 – 2 cm. Rễ địa sinh có nhiệm vụ bám vào
đất và hút các chất dinh dưỡng nuôi cây. Rễ phân bố chủ yếu ở tầng mặt (0 – 15 cm).
Rễ khí sinh mọc dọc theo thân cây phần trên không, bám vào cây chống nhằm giúp
cây leo lên giá đỡ. Những rễ khí sinh nằm gần đất sẽ đi dần xuống đất. Khi đất khô rễ
sợi sẽ chết đi, các rễ lớn hơn sẽ hoá bần làm giảm sự dẫn nước gần 10 lần để ngăn


4

chặn sự mất nước thông qua rễ khi đất ẩm rễ mọc lại một cách dễ dàng (Phan Kim
Hồng Phúc, 2002; Nguyễn Văn Kế, 2003).
Thân, cành: thân chứa nhiều nước có thể chịu hạn trong thời gian dài. Cành
thường có 3 cánh dẹp, xanh, hiếm khi có 4 cánh. Ở các nước khác có thứ 3, 4, 5 cánh.
Tiết diện ngang cho thấy có 2 phần: bên ngoài là nhu mô chứa diệp lục, bên trong lõi
cứng hình trụ. Mỗi cánh chia làm nhiều thùy có chiều dài 3 – 4 cm. Đáy mỗi thùy có
từ 3 – 5 gai ngắn. Chúng sử dụng C02 quang hợp theo hệ CAM (Crassulacean Acid
Metabolism) cho các cây mọc ở sa mạc. Mỗi năm cây cho từ 3 – 4 đợt cành, đợt cành

thứ nhất là cành mẹ của đợt cành thứ 2 và cứ như thế cành sắp sếp thành từng lớp trên
đầu trụ. Trong mùa ra cành khoảng thời gian giữa hai đợt cành từ 40 – 50 ngày. Số
lượng cành trên cây tăng theo tuổi cây, cây một tuổi trung bình có khoảng 30 cành, 2
tuổi khoảng 70 cành, 3 tuổi khoảng 100 cành, 4 tuổi khoảng 120 cành, ở cây 5 – 6 tuổi
cây chỉ duy trì khoảng 150 – 170 cành (Nguyễn Văn Kế, 2003).
Hoa: thanh long là cây ngày dài. Cây ra hoa khi được chiếu sáng đủ. Hoa
lưỡng tính, rất to có chiều dài trung bình 25 – 35 cm, nhiều lá đài và cánh hoa dính
thành ống, nhiều tiểu nhị và một nhụy cái dài 18 – 24 cm, đường kính 5 – 8 mm. Hoa
thường nở tập trung từ 20 – 23 giờ đêm và đồng loạt trong vườn. Từ khi hoa nở đến
tàn kéo dài độ 2 – 3 ngày, các đợt nụ đầu tiên rụng từ 30% đến 40% về sau tỉ lệ này
giảm dần khi gặp điều kiện thuận lợi.
Quả và hạt: sau khi thụ phấn, bầu noãn sẽ phát triển thành quả mọng. Trong 10
ngày đầu tốc độ phát triển tương đối chậm, sau đó gia tăng nhanh cả về kích thước lẫn
trọng lượng. Thời gian từ khi hoa thụ phấn đến khi thu hoạch chỉ từ 25 – 35 ngày. Quả
thanh long hình bầu dục, có nhiều tai xanh (do phiến hoa còn lại), đầu quả lõm sâu tạo
thành “hốc mũi”. Khi còn non quả màu xanh, lúc chín chuyển sang màu đỏ đậm
(Nguyễn Văn Kế, 1997; Trịnh Thị Cảnh, 1997).
Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long:
Sau một năm trồng thì cây bắt đầu cho trái bói, các năm 3, 4, 5 là những năm
có năng suất cao. Nếu cây được chăm sóc tốt, thời tiết thuận lợi sẽ làm năng suất cao
và ổn định nhiều năm (Vũ Công Hậu, 1996; Phan Kim Hồng Phúc, 2002).


5

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long
Thành Phần

Hàm lượng
(mg/100 gr thịt trái)

Thành Phần

Hàm lượng
(mg/100 gr thịt trái)

Nước

85,5

Vitamin C

3,00

Protein

1,10

Niacin

2,80

Glucose

0,57

Vitamin A

0,01

Fructose

3,20

Calcium

10,2

Sorbitol

32,7

Sắt

6,07

Carbohydrat

11,2

Magnesium

38,9

Chất xơ

1,34

Phospho

27,5

Tro

0,56

Kali

27,2

Năng lượng

67,7

Natri

2,90

(Nguồn : Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam, 2007)

2.2 Thành phần bệnh hại trên cây thanh long
Theo Gunasena (2007) thì trên thanh long có một số bệnh quan trọng như thối
nhũn thân do vi khuẩn Xanthomonas compistris bệnh này có liên quan đến sự tưới
nước quá nhiều và ẩm độ cao được báo cáo ở Mỹ và Úc. Bệnh đốm nâu do Dothiorella
và loét cũng được báo cáo ở vùng trồng thanh long ở Florida và Nicaragua. Bệnh thối
thân cũng được tìm thấy trên cây thanh long hoang dại và thanh long trồng ở Mexico
nguyên nhân do Botryosphaeria dothidea (Gunasena, 2007). Những tác nhân gây bệnh
khác nhau tạo những vết thương khác nhau về kích thước và vị trí. Bệnh loét có thể tấn
công lên trái, Fusariium oxysporum có thể tấn công lên dây leo (Gunasena, 2007). Ở
Colombia, hầu hết những vùng trồng thanh long đều bị nhiễm bệnh do nấm ở vùng rễ

(Gunasena, 2007 trích dẫn từ Bibliowicz, 1998).
Nhiều bệnh khác nhau ảnh hưởng lên cây thanh long ở nhiều nơi được nhiều
công trình khoa học báo cáo như: bị ảnh hưởng bởi virus X, thối thân, thối trái ở Đài
Loan và Nhật Bản, đốm thân ở Mexico và loét ở Nhật Bản và Mỹ. Bệnh loét trên thanh
long cũng được báo cáo ở Brazil (Masyahit, 2009). Cũng theo Masyahit (2009) thì
bệnh loét trên thanh long nguyên nhân đo nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra.


6

Theo Nguyễn Văn Hòa (2006) trên thanh long có khoảng 10 loại bệnh gây hại,
phổ biến nhất là bệnh thán thư và bệnh thối bẹ, nấm bồ hóng và còn những bệnh không
gây hại nghiêm trọng.
Bảng 2.2: Thành phần bệnh gây hại trên thanh long
Bệnh
hại

Tác nhân
gây bệnh

Bộ phận bị
hại

Thời điểm
ghi nhận

Mức độ
phổ biến

Thán thư

Collectotrichum
gloeosporioides

Trái, hoa

Mùa mưa

+++

Thối trái

Fusarium sp.

Trái

Trái sắp chín

++

Thối bẹ

Alternaria sp.,
bacteria

Cành

Cuối mùa nắng,
đầu mùa mưa

++

Thối bẹ

Fusarium sp., bacteria

Cành

Tháng 6 – 8

+++

Rám
cành

Macssonia agaves syd,
sphaceloma sp.

Cành

Cuối mùa nắng
đầu mùa mưa

++

Đốm nâu

Glocosporium avages

Cành

Quanh năm

+

Đốm đen

Ascochyta sp.

Trái và cành

+

Nấm bồ
hóng

Capnodium sp.

Cành, hoa,
trái

+++

Đốm
vòng
vàng

Chưa xác định

Cành

+

Bệnh
ghẻ

Chưa xác định

Cành

++

Ghi chú: + mức độ bệnh thấp, ++ mức độ bệnh trung bình, +++ mức độ bệnh khá phổ biến

(Nguồn: Nguyễn Văn Hòa, 2006)


7

2.3 Tổng quan về bệnh thối nhũn
2.3.1 Triệu chứng bệnh thối nhũn
Triệu chứng thối nhũn biểu hiện đầu tiên là một vùng mụn nước mất màu,
mọng nước, sau đó lan rộng ra nhanh chóng về đường kính do sự chết của tế bào.
Vùng bị nhiễm trở nên mềm nhũn ra và bề mặt trở nên mất màu. Mô bên trong vùng bị
nhiễm bệnh có màu như kem và nhày nhụa, tan chảy trong một khối chất nhày của
nhũng tế bào cây bị phá vở. Mặt ngoài của vùng bị nhiễm bệnh có thể vẫn còn giữ
được trạng thái nguyên vẹn trong khi bên trong thì các mô đã chuyển đổi hoàn toàn
thành một khối chất nhày nhụa, khối chất nhày này từ từ rịnh ra bên ngoài qua những
khe hở trên bề mặt vết bệnh, khi ra ngoài không khí chúng sẽ chuyển sang màu hơi
nâu đến nâu hoặc nâu đậm. Tất cả trái hoặc củ có thể bị thối nhũn hoàn toàn trong

khoảng 3 – 5 ngày. Trái hoặc củ bị nhiễm bệnh của nhiều cây hầu hết không có mùi
thối cho đến khi chúng biểu hiện triệu chứng thối nhũn ra bên ngoài, và vi khuẩn thứ
cấp phát triển trên mô đang bị phân hủy sinh ra mùi hôi thối. Tuy nhiên, cây họ thập
tự và cây hành khi bị nhiễm bởi vi khuẩn gây thối nhũn thì luôn luôn tạo ra một mùi
khó chịu (Agrios, 2005).

Hình 1.1: Triệu chứng thối nhũn trái thanh long
2.3.2 Tác nhân gây ra bệnh thối nhũn
Theo nhiều tác giả thì triệu chứng thối nhũn trên cây trồng do một trong những
tác nhân như sau: Erwinia nguyên nhân gây ra hiện tượng thối nhũn trên nhiều loại
trái cây, rau (E.carotovora pv. carotovora) và bệnh đốm đen ở khoai tây (E.
carotovora pv. atroseptica) (Agrios, 1997). Cũng theo Agrios (1997) thì Bacillus là


8

nguyên nhân gây thối nhũn khoai tây, lá thuốc lá, cà chua và đậu. Ngoài ra
Pseudomonas, Clostridium cũng là những tác nhân gây ra hiện tượng thối nhũn
(Agrios, 1997). Theo một báo cáo của Jin-Hyeuk Kwon và ctv (2000), thì Rhizopus
stolonifer là nguyên nhân gây ra thối nhũn quả bí ở Hàn Quốc. Rhizopus còn gây ra
thối nhũn khoai lang ở Hawaii theo báo cáo của Scot Nelson (2009). Ngoài những tác
nhân gây trên hiện tượng thối nhũn còn có nguyên nhân do nấm Mocor gây ra
(Michailides, 1990). Nấm Mocor gây ra hiện tượng thối trái được báo cáo bởi T.J.
Michailides và R.A. Spotts vào năm 1990.
Erwinia bao gồm 11 loài với những khả năng gây bệnh khác nhau. Tất cả
những dòng không gây ra bệnh thối nhũn có một số đặc điểm như sau: kị khí không
bắt buột, có tiêm mao, hình roi, gram âm và sản xuất acid từ fructose, glucose,
galactose và sucrose. Erwinia gây thối nhũn thuộc 3 nhóm: amylovora, herbicola, và
carotovora (Schaad, 1988).
Vi khuẩn Erwinia gây bệnh bằng cách gây mềm nhũn tế bào cây ký chủ, làm

mô cây bị thối, biến dạng. Lúc trước, tác nhân gây bệnh thối nhũn Erwinia được nhóm
trong một loài đơn, Erwinia carotovora được chia trong loài phụ. Sau này, nhóm này
được chia thành hai loài chính, Erwinia chrysanthemi và Erwinia carotovora. Xa hơn,
chúng được chia thành ba loài phụ là carotovora, atroseptica và betavasculorum. Hai
tác nhân thứ yếu khác với sự giới hạn cây ký chủ cũng được bao gồm trong nhóm vi
khuẩn gây thối nhũn là Erwinia cypripedii và Erwinia rhapontici. Vi khẩn gây thối
nhũn Erwinia có thể tấn công nhiều loại cây trồng ngoài đồng cũng như sản phẩn tồn
trữ trong kho (Kotoujansky, 1987).
2.3.3 Vi khuẩn gây thối nhũn cây trồng Erwinia sp
Vi khuẩn gây thối nhũn hiện diện trong mô cây đang thối nhũn trên đồng và cả
trong kho chứa, chúng tạo ra một mùi hôi rất khó chịu do quá trình thối nhũn mô tạo
ra. Mô bị nhiễm bệnh thường bị biến dạng và bị tan rã bởi ảnh hưởng của vi khuẩn.
Mô đang thối trở nên mền nhũn, hóa loãng ra như nước và trơ thành một khối nhầy
nhớt của vi khuẩn và mảnh vụng của mô tế bào chết rịnh ra bên ngoài (Agrios, 2005).
Nhiều trường hợp thối nhũn không do tác nhân gây bệnh cây trồng gây ra, như trường
hợp chúng không tấn công trực tiếp tế bào sống mà đúng hơn là chúng là sinh vật hoại
sinh hay là tác nhân kí sinh thứ cấp theo sau tác nhân gây bện chính, chúng phát triển


9

trên mô cây đã bị giết chết bởi tác nhân gây bệnh hoặc bị chết bởi điều kiện môi
trường, hay chúng tấn công những tế bào bị yếu đi không còn khả năng đối kháng lại
với bất cứ sự tấn công của sinh vật nào. Tuy nhiên, nhiều loài vi khuẩn tấn công tế bào
sống và là nguyên nhân gây thối nhũn cây trồng trên đồng và trong kho chứa (Agrios,
2005). Erwinia nhóm carotovora hay nhóm gây triệu chứng thối nhũn là nguyên nhân
gây thối nhũn trên nhiều loại trái cây, rau cải và trên cây cảnh (E. carotovora pv.
carotovora) và thối đen trên khoai tây (E. carotovora pv. atroseptica) (Agrios, 2005).
2.3.3.1 Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Erwinia thuộc họ Enterobacteriaceae, không sinh bào tử, có dạng hình

roi kích thước từ 0,5 – 1,0 µm đến 1,0 – 3,0 µm (Elphistone, 1987). Và cũng theo
Elphinstone thì vi khuẩn Erwinia là nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy ý, nghĩa là vi khuẩn có
thể sống trong cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí nhận định này được Mantesano khẳng
định lại vào năm 2002 trong một bài báo cáo của ông và nhiều bài báo cáo của nhiều
tác giả khác. Theo Hossain và ctv năm (2005) thì roi của vi khuẩn Erwinia carotovora
ssp carotovora có dạng hình xoắn ốc, roi là cơ quan giúp vi khuẩn có thể chủ động di
chuyển được trong môi trường loãng để tìm kiếm kí chủ và xâm nhiễm cũng phù hợp
với một báo cáo của Hossain (2005) nói về sự di động của vi khuẩn này và cũng theo
Hossain thì vi khuẩn Erwinia carotovora ssp carotovora di động được bằng cách cử
động roi vòng tròn.
2.3.3.2 Đặc điểm sinh lí – sinh hóa
Một số đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Erwinia carotovora: nhiệt độ tối
thích từ 25 – 300C, nhiệt độ gây chết trong 10 phút từ 48 – 51oC, thủy phân được
gelatin, khử được nitrat, không có phản ứng Indol. Khi sử dụng glucoza hoặc
seccaroza làm nguồn carbon vi khuẩn tạo ra được cả khí và acid, nhưng khi sử dụng
lactoza hoặc manitol làm nguồn carbon chỉ tạo ra acid (Lê Lương Tề và Vũ Triệu
Mân, 1999).
Vi khuẩn Erwinia carotovora là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, có khả năng sống được ở
nhiệt độ trên 36ºC và có khả năng sản xuất acid từ α – methyl glucoside (Hyytiainen,
2005). Cũng theo nhiều nguồn tài liệu thì vi khuẩn Erwinia carotovora là loại vi khuẩn
có hoạt tính của một số emzym như: pectase, lysase, polygalacturonase, cellulase và
protease (Hossain và ctv, 2005; Hyytiainen, 2005). Đây cũng là hệ enzym thể hiện tính


10

độc của vi khuẩn Erwinia carotovora nhóm gây triệu chứng bệnh thối nhũn. Để duy trì
và tổng hợp được những enzym này vi khuẩn Erwinia carotovora cũng yêu cầu một số
chất nhất định, một báo cáo của Palomaki chỉ ra rằng để tích lũy enzym
polygalacturonase ở vi khuẩn Erwinia carotovora thì chất C – Terminus là một chất

cần thiết.
Erwinia carotovora có khả năng sống được ở nhiệt độ 36ºC và gây bệnh nặng
nhất trong điều kiện nóng ẩm, đất ẩm ướt làm bệnh nặng hơn trong khi đất khô ẩm độ
không khí thấp làm bệnh kém phát triển (Elphinstone, 1987). Dựa vào những đặc điểm
này chúng ta có thể đề ra những biện pháp canh tác thích hợp để hạn chế tác hại của vi
khuẩn Erwinia gây ra.
Trong nghiên cứu giám định vi khuẩn, người ta dựa vào những đặc điểm sinh lý
– sinh hóa khác nhau này để phân biệt và phân loại vi khuẩn. Mỗi loài vi khuẩn có
những đặc điểm sinh lí – sinh hóa khác nhau đặc trưng cho loài và chỉ có loài đó mới
có và đây là cơ sở của việc giám định và định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh
hóa.
2.3.3.3 Phổ kí chủ của vi khuẩn Erwinia
Theo Sharma (2006) thì vi khuẩn Erwinia carotovora có thể tấn công được trên
khoai tây, rau cải, củ cải, hành, dưa hấu, cải bắp, hoa kiểng và nhiều loại cây trồng
khác. Cũng trong năm đó Henz và ctv cũng báo cáo vi khuẩn này gây thối nhũn trên
những nhóm cây trồng như trên. Cũng theo Hossaain thì vi khuẩn này cũng là nguyên
nhân gây thối nhũn nhiều loại cây trồng và là vi khuẩn gây ra nhiều bệnh quan trọng.
Montesano cũng khẳn định vi khuẩn Erwinia carotovora là nguyên nhân gây bệnh thối
nhũn trên nhiều loại cây trồng trong giai đoạn ngoài đồng và cả trong giai đoạn tồn trữ
trong kho (Montesano, 2002). Fuckovsky (2002) nhắc đến vi khuẩn Erwinia
carotovora như là một bệnh quan trọng đối với cây trồng trong vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới.


11

2.3.4 Nấm gây bệnh Rhizopus sp.
Ngành: Zygomycota, Lớp: Zygomyecetes, Bộ: Mucorales, Họ: Mucoraceae,
Chi: Rhizopus.
Lớp Zygomyecetes là những nấm có đặc điểm sợi nấm không có vách ngăn,

bào tử hình cầu và được sinh ra trong túi bào tử. Bào tử nghỉ có vách dày. Hình thức
sinh sản hữu tính là sinh ra bào tử tiếp hợp. Zygomyecetes là lớp nấm khí bắt buộc, bào
tử nấm bay trong không khí và lan truyền nhờ gió. Các loài trong lớp nấm
Zygomyecetes đa số là nấm hoại sinh hoặc ký sinh yếu trên cây trồng. Một số loài còn
gây bệnh trên người (Agrios, 2005).
Các nấm trong lớp Zygomyecetes là nguyên nhân gây thối nhũn trên nhiều loại
cây trồng, rau, trái cây, hoa, cây thân hành, thân củ, và cả cây lấy hạt. Zygomycyecetes
ký sinh yếu, hầu hết chúng là loài hoại sinh trên tế bào chết và nông sản sau thu hoạch.
Ngay cả khi chúng tấn công cây ngoài đồng thì sự tấn công đầu tiên là ở những vùng
cây tổn thương trước đó do cơ giới hay bị yếu do bệnh. Sau đó, sợi nấm được sinh ra
và lan rộng, tiết enzym phân giải vách tế bào, xâm nhập và giết chết những tế bào lân
cận (Agrios, 2005).
Rhizopus gây thối nhũn trên cây ăn trái, rau màu đã được phát hiện khắp nơi
trên thế giới. Chúng gây hại nông sản sau thu hoạch và cả cây trồng ngoài đồng.
Rhizopus được tìm thấy gây bệnh trên khoai tây, dâu tây, cây họ bầu bí, cây đào, cây
anh đào, đậu nành và nhiều loại trái cây rau cải khác. Bắp và nhiều loại ngũ cốc bị gây
hại nặng ở điều kiện ẩm độ cao. Cây thân hành, thân củ, rễ củ, và cây lấy hoa cũng bị
tấn công bởi nấm Rhizopus sp. Trong điều kiện thuận lợi bệnh sẽ tiến triển nhanh hơn
và thời gian gây hại sẽ ngắn hơn (Agrios, 2005).
Nấm Rhizopus gây hại quanh năm. Bào tử nấm được hình thành và phóng thích
vào mọi thời điểm trong năm. Bào tử được phóng thích vào không khí và rơi xuống bề
mặt cây trồng. Bào tử nào rơi xuống bề mặt bị tổn thương trước đó của cây trồng sẽ
nhanh chóng nảy mầm và xâm nhập vào cây. Khi xâm nhập chúng tiết ra enzym
pectinolytic để phân hủy pectic của vách tế bào và xâm nhập vào tế bào lân cận.
Những tế bào bị enzym phân hủy sẽ mất khả năng liên kết với nhau và tạo thành một
khối nhầy nhụa gây ra triệu chứng nhũn ở vùng bị bệnh trên cây trồng. Khi tế bào bị
vỡ ra, sợi nấm bắt đầu mọc ra ngoài và hình thành bào tử trên bề mặt bị tổn thương của


12

cây bệnh. Trong điều kiện không thuận lợi của môi trường như nhiệt độ và ẩm độ
không thích hợp sẽ làm chậm sự phát triển của bệnh. Điều này đã tạo điều kiện về thời
gian cho cây ký chủ hình thành những phản ứng tự vệ chống lại mầm bệnh như hình
thành tầng mô rỗng, tầng rụng và những cấu trúc khác để hạn chế sự phát triển của
nấm bệnh. Khi điều kiện không thuận lợi cho sự phát triển của nấm bệnh như nguồn
cung cấp dinh dưỡng cho nấm bị giảm, nấm có thể hình thành bào tử tiếp hợp để tồn
tại trong điều kiện không thuận lợi đó (Agrios, 2005).


13

Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu
Thu thập mẫu bệnh: các dụng cụ cần thiết để thu thập mẫu như: túi nylon, dao,
kéo, sổ ghi chép, . . .
Dụng cụ phân lập nấm, vi khuẩn trong phòng thí nghiệm như: đĩa petri, môi
trường nuôi cấy PDA (Potato Dextrose Agar) và NA (Nutrient Agar), giấy thấm, cồn,
bông, nước cất, tủ cấy, các dụng cụ cấy nấm, vi khuẩn, …
Các dụng cụ quan sát nấm và vi khuẩn: Kính hiển vi, lam, lamen, đèn cồn, nước
cất và các dụng cụ cần thiết trong phòng Lab.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phân lập, nuôi cấy và xác định tác nhân
Mẫu bệnh được thu thập và nhanh chóng mang về phòng thí nghiệm bệnh cây
của Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật - Viện cây ăn quả miền Nam để phân lập và định danh
tác nhân gây bệnh.
Thu mẫu bệnh: Mẫu bệnh được thu thập ở những bông trái có biểu hiện bệnh rõ
ràng, mẫu bệnh được đựng trong túi nylon riêng cho từng mẫu, ghi rõ địa chỉ nơi thu
thập và thời gian thu mẫu.

Xử lý mẫu: mẫu trái bệnh được lau sạch bằng cồn 70 độ trước khi được cắt nhỏ.
Dùng dao mổ đã được khử trùng trên ngọn đèn cồn cắt mẫu bệnh thành từng mảnh nhỏ
khoảng 2 x 2 mm. Mảnh cắt là nơi tiếp giáp giữa vùng mô khỏe và mô bệnh. Sau đó
những mảnh cắt được xử lý với cồn 70 độ trong khoảng 30 giây đến 1 phút và đem rửa
lại với nước cất vô trùng 3 – 4 lần và để khô tự nhiên trong tủ cấy trước khi cấy vào
môi trường dinh dưỡng. Mẫu bệnh được cấy trên môi trường NA, PDA và giữ ở nhiệt
độ phòng để quan sát kết quả.


Giám định tác nhân nấm
Nấm sau khi được phân lâp được giữ mẫu trên môi trường PDA để thực hiện
các bước giám định tiếp theo. Các kỹ thuật sử dụng trong giám định nấm như quan sát
tơ nấm, hạch nấm, bào tử,… bằng kính hiển vi.


14



Giám định tác nhân vi khuẩn
Dựa vào hình dạng, phản ứng khi nhuộm gram, hình dạng khuẩn lạc….Các
phản ứng sinh hóa dùng để định danh cho từng loại vi khuẩn riêng biệt được thực hiện
dựa trên tài liệu của N.S.Schaad (1988) bao gồm các phản ứng: khả năng phân giải các
nguồn cacbon khác nhau, khả năng khử nitrate, sống hiếm khí, sinh acid…



Phương pháp nhuộm và quan sát hình dạng vi khuẩn
Nhuộm gram
Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi
cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
- Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa
nước, thấm khô.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 30 giây, rửa nước, để khô
trong không khí.
- Soi kính: dùng vật kính đầu 100x để xem vi khuẩn.
Xem kết quả:
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng hoặc đỏ.
3.2.2 Kiểm chứng tác nhân thông qua quy trình Koch
Tác nhân sau khi phân lập được nhân nhanh sinh khối trên môi trường NA và
chủng nhân tạo trở lại lên trái thanh long để kiểm chứng tác nhân gây bệnh.
Thí nghiệm chủng bệnh nhân tạo ngoài đồng: thí nghiệm được bố trí tại vườn
thanh long ruột trắng ở Trại Thực Nghiệm – Viện Cây Ăn Quả Miền Nam, vườn thanh
long đang có nụ dưới 10 ngày tuổi và trái non (vừa rút râu) (đây là hai giai đoạn thanh
long dễ mẫn cảm nhất đối với bệnh thối trái).
Tiến hành chủng riêng từng loại vi khuẩn phân lập đã được chuẩn bị sẵn ở nồng
độ 3,6. 10-6 cfu/ml. Dùng ống tiêm y tế hút khoảng 1ml dung dịch chứa vi khuẩn và
tiêm vào nụ (20 nụ). Sau khi chủng tác nhân tiến hành bao nụ và trái để tránh lây
nhiễm bởi tác nhân bên ngoài.


15

3.2.4 Phản ứng sinh hóa
3.2.4.1 Thí nghiệm khả năng thủy phân tinh bột
Thí nghiệm được tiến hành như sau:

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của N. W. Schaad (1988), thí
nghiệm được bố trí trong đĩa petri ở điều kiện phòng thí nghiệm.
Cấy vi khuẩn trên môi trường agar tinh bột (starch agar) ủ 5 ngày. Sau đó dùng
pipett rút khoảng 5ml dung dịch Lugol’s Iodine đã được chuẩn bị sẵn cho vào vừa đủ
ngập đĩa Petri đã được chủng vi khuẩn. Quan sát phản ứng thuỷ phân tinh bột bởi vi
khuẩn sau 3-5 phút. Kết quả dương tính nếu khuẩn lạc không bắt màu với Iodine (vi
khuẩn đã phân huỷ tinh bột) và âm tính khi khuẩn lạc có màu nâu (tinh bột phản ứng
với idoine cho ra màu nâu, những vùng mất màu cho thấy tinh bột ở vùng đó đã bị vi
khuẩn sử dụng hết).
Chuẩn bị dung dịch nhuộm Lugol’s iodine:
Iodine

5g/100ml

KI

10g/100ml

Hòa toa iodine và KI trong 10 ml nước, thêm nước cất cho đủ. Khi sử dụng pha
loãng 5 lần với nước cất.
Chuẩn bị môi trường tinh bột:
Tinh bột khoai tây (tinh bột gạo)

10g

Nước cất

50ml

NA

1000ml

Hòa tinh bột trong 50 ml nước. Cho vào NA nóng, trộn đều hấp tiệt trùng 15
phút ở 121o C và đổ vào đĩa petri.
3.2.4.2 Catalase
Vi khuẩn được nuôi từ 18 – 24 giờ trên môi trường NA được dùng để kiểm tra
phản ứng Catalase. Sử dụng que cấy dích lấy khuẩn lạc đơn của vi khuẩn đặt lên lam
kính và cho vào một giọt hydrogen peroxide 3% (H2O2) vào khối vi khuẩn. Kết quả
được quan sát qua sự sủi bọt khí sinh ra từ khối tế bào vi khuẩn. Nếu có sủi bọt khí
chứng tỏ có phản ứng catalase dương tính và ngược lại.
3.2.4.3 Thí nghiệm khả năng phân giải citrate
Môi trường Simmon’s Citrate Agar:


16

MgSO4.7H2O

0.2 g/l

NH4H2PO4

1 g/l

K2HPO4

2 g/l

Sodium citrate

2g/l

NaCl

5g/l

Chỉ thị pH (bromethymol blue)

0.08g/l

Agar

15g/l

Hòa tan hỗn hợp trong 1 lít nước cất, chỉnh pH về 6,8 – 6,9. Cho môi trường
vào ống nghiệm hấp khử trùng trước khi cấy vi khuẩn.
Thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải citrate của vi khuẩn được thực hiện trên
môi trường Simmons’ citrate agar. Môi trường được chuẩn bị sẵn và đổ vào ống
nghiệm và hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau khi cấy vi khuẩn, đặt các ống
nghiệm ở điều kiện nhiệt độ phòng và quan sát kết quả ở thời điểm 4 ngày sau khi
chủng. Kết quả được quan sát thông qua sự thay đổi màu, nếu phản ứng dương tính thì
màu sắc của môi trường sẽ chuyển sang màu xanh da trời (vi khuẩn sử dụng citrate) và
âm tính ngược lại (không có sự thay đổi môi trường, vẫn giữ màu xanh lá cây ban đầu)
(N. W. Schaad, 1988).
3.2.3 Thí nghiệm khả năng gây thối nhũn khoai tây
Thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm để kiểm tra khả năng gây thối
nhũn khoai tây của tác nhân gây bệnh phân lập được.
Khoai tây được rửa sạch sau đó cắt ra từng mảnh dày khoảng 7 – 8 mm. Trước khi
chủng vi khuẩn và mảnh khoai tây, mảnh khoai tây được khử trùng bằng cách ngâm

trong cồn 700 trong 10 phút và để khô tự nhiên trước khi chủng vi khuẩn. Đặt mảnh
khoai tây vào đĩa petri được giữ ẩm bằng mảnh giấy thấm vô trùng có thấm ướt bằng
nước cất vô trùng. Dùng dao mổ vô trùng tạo một rảnh sâu khoảng 3 – 4 mm và chủng
vi khuẩn vào rảnh được tạo đó. Sau khi được chủng vi khuẩn đem đĩa petri đặt ở điều
kiện nhiệt độ phòng. Sau 24 giờ đem ra qua sát kết quả xem có hay không có hiện
tượng thối xảy ra.