XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUẨN PHÁT HIỆN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS VÀ STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUẨN PHÁT HIỆN VI KHUẨN
STREPTOCOCCUS SUIS VÀ STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2
BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Họ và Tên sinh viên: CAO ANH THI
Ngành: BQCBNS VÀ VI SINH THỰC PHẨM
Niên khóa: 2007 - 2011

Tháng 8/2010


XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUẨN PHÁT HIỆN VI KHUẨN
STREPTOCOCCUS SUIS VÀ STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 BẰNG KỸ
THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Tác giả

CAO ANH THI

Khóa luận đƣợc đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sƣ ngành
Bảo Quản Chế Biến Nông Sản Và Vi Sinh Thực Phẩm

Giáo viên hƣớng dẫn:
Ths. Uông Nguyễn Đức Ninh

Tháng 8 năm 2010

LỜI CẢM ƠN
 Em xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã tạo mọi đều kiện cho
em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng.
Toàn thể Thầy, Cô trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm trƣờng Đại Học Nông
Lâm TP.HCM đã trang bị cho em những kiến thức quý báu.
Ban Giám Đốc Viện Pasteur TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi để em thực
hiện đề tài tốt nghiệp.
 Đặc biệt em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến:
Bs. Nguyễn Thị Kim Hoàng, Ths. Uông Nguyễn Đức Ninh và chị Võ Thị Trang
Đài phòng Vi khuẩn hô hấp, Khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur TP.HCM đã
tận tình hƣớng dẫn, đóng góp những ý kiến chân thành trong suốt thời gian thực
hiện báo cáo tốt nghiệp.
 Xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ và tất cả những ngƣời thân trong gia đình, bạn bè
luôn là nguồn động viên, khích lệ to lớn giúp em vƣợt qua mọi khó khăn trong suốt
thời gian qua.
TP.HCM, ngày 30 tháng 7 năm 2011

Cao Anh Thi


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Sinh viên thực hiện: Cao Anh Thi, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trƣờng Đại
Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Ngƣời hƣớng dẫn: Bs. Nguyễn Thị Kim Hoàng,
Ths. Uông Nguyễn Đức Ninh.
Đề tài: “Xây dựng quy trình chuẩn phát hiện Streptococcus suis và
Streptococcus suis type 2 bằng kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR)” đƣợc
thực hiện tại phòng xét nghiệm Vi Khuẩn Hô Hấp – Khoa Vi Sinh Miễn Dịch – Viện

Pasteur TP.HCM từ tháng 03/2011 đến tháng 07/2011.
Đề tài thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 16S-195(s), 16S-489(as) để phát
hiện S.suis. Mồi đƣợc xây dựng dựa trên gen mã hóa thành phần câu tạo tiểu đơn vị
30S ribosome của S.suis. Để phát hiện S.suis type 2, phản ứng PCR sử dụng mồi
cps2JF và cps2JR để khuếch đại một đoạn thuộc gen cps2J mã hóa cho vách tế bào của
S.suis type 2. Bên cạnh đó, đề tài cũng thử nghiệm kỹ thuật Multiplex PCR để tìm
S.suis type 2 và so sánh chất lƣợng DNA đƣợc tách chiết bằng bộ kit thƣơng mại và từ
phƣơng pháp tách nhanh theo quy trình của CDC. Kết thúc đề tài, chúng tôi có những
ghi nhận sau đây:
Phản ứng PCR có tổng thể tích 25 µl với thành phần nhƣ sau: 1x PCR Buffer, 2,5
units Taq DNA Polymerase, 200 µM cho mỗi loại dNTP, 0,4 µM 16S-195(s) và 16S489(as), 0,26 µg DNA S.suis. Đây là quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát hiện
S.suis. Đối với S.suis type 2, phản ứng chỉ thay đổi dùng 0,26 µg DNA S.suis type 2,
0,4 µM cps2JF và cps2JR.
Qua khảo sát với 10 chủng đối chứng và S.suis type 9, type 16, chúng tôi nhận
định: Mồi cps2JF và cps2JR đặc hiệu cho S.suis type 2 với kích thƣớc sản phẩm PCR
là 236 bp. Cặp mồi 16S-195(s), 16S-489(as) đặc hiệu cho S.suis, sản phẩm PCR có
kích thƣớc 294 bp. Giới hạn cho phản ứng PCR phát hiện S.suis là:
LOD (µg DNA/25µl) = 0,00144 ÷ 0,00446
So với phƣơng pháp tách nhanh DNA theo quy trình của CDC thì dùng bộ kit
thƣơng mại cho chất lƣợng DNA tốt hơn. Phản ứng Multiplex PCR đƣợc xây dựng
nhƣ sau: 1x Multiplex PCR Master Mix, 0,4 µM 16S-195(s) và 16S-489(as), 0,4 µM
16S-195(s) và 16S-489(as), 0,26 µg DNA S.suis type 2.


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ii
TÓM TẮT LUẬN VĂN .............................................................................................. iii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... v
DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................... vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH ..........................................................................................vii
CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu .......................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu ............................................................................................................ 2
1.2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 2
CHƢƠNG II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1. Tình hình nhiễm Streptococcus suis ở ngƣời trên thế giới và Việt Nam ........... 3
2.1.1. Trên thế giới ..................................................................................................... 3
2.1.2. Tại Việt Nam .................................................................................................... 3
2.2. Tổng quan về Streptococcus suis ........................................................................... 4
2.2.1. Hình thể ............................................................................................................ 4
2.2.2. Tính chất nuôi cấy ............................................................................................ 4
2.2.3. Tính chất sinh hóa ............................................................................................ 4
2.2.4. Các yếu tố độc lực ............................................................................................ 5
2.2.5. Cƣ trú và đƣờng lây truyền .............................................................................. 5
2.2.6. Khả năng gây bệnh ........................................................................................... 6
2.2.6.1. Gây bệnh ở lợn ....................................................................................... 6
2.2.6.2. Gây bệnh ở ngƣời ................................................................................... 6
2.2.7. Chẩn đoán vi sinh ............................................................................................. 7
2.3. Điều trị và dự phòng bệnh liên cầu lợn ................................................................ 8
2.3.1. Điều trị ............................................................................................................. 8
2.3.2. Dự phòng .......................................................................................................... 9


2.3.2.1. Phòng bệnh cho lợn ................................................................................. 9
2.3.2.2. Phòng bệnh cho ngƣời ............................................................................. 9
2.4. Giới thiệu kỹ thuật PCR ........................................................................................ 9
2.4.1. Lịch sử hình thành ............................................................................................. 9
2.4.2. Phản ứng PCR ................................................................................................. 10

2.4.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose ......................................... 11
2.4.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR ...................................................... 11
2.4.5. Ƣu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR ........................................................... 13
2.4.5.1. Ƣu điểm ................................................................................................ 13
2.4.5.2. Hạn chế ................................................................................................. 14
2.5. Tổng quan các nghiên cứu về S.suis.................................................................... 14
CHƢƠNG III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 17
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................................... 17
3.2. Vật liệu thí nghiệm ............................................................................................... 17
3.3. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................... 17
3.4. Môi trƣờng, hóa chất và sinh phẩm .................................................................... 19
3.4.1. Môi trƣờng ...................................................................................................... 19
3.4.2. Hóa chất và sinh phẩm .................................................................................... 19
3.5. Nội dung đề tài ...................................................................................................... 20
3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 20
3.6.1. Nuôi cấy .......................................................................................................... 20
3.6.2. Tách chiết DNA .............................................................................................. 21
3.6.2.1. Tách DNA bằng bộ kit thƣơng mại ....................................................... 21
3.6.2.2. Phƣơng pháp tách DNA nhanh theo quy trình của CDC ...................... 21
3.6.3. Quy trình thực hiện phản ứng PCR ................................................................. 22
3.6.4. Xây dựng quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát hiện S.suis ..................... 23
3.6.4.1. Khảo sát nồng độ mồi tối ƣu ................................................................. 23
3.6.4.2. Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ƣu ............................................................. 23
3.6.4.3. Khảo sát lƣợng DNA tối ƣu................................................................... 23
3.6.5. Xác định độ đặc hiệu ....................................................................................... 24
3.6.6. Xác định giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection) .............................. 24


3.6.7. So sánh chất lƣợng DNA từ hai phƣơng pháp tách chiết ................................ 24
3.6.8. Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện S.suis type 2 .................. 24

3.6.9. Phản ứng Multiplex PCR phát hiện S.suis type 2 ........................................... 25
CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 26
4.1. Xây dựng quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát hiện S.suis ..................... 26
4.1.1. Khảo sát nồng độ mồi tối ƣu .................................................................... 26
4.1.2. Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ƣu ................................................................ 26
4.1.3. Khảo sát lƣợng DNA tối ƣu...................................................................... 27
4.2. Xác định độ đặc hiệu ............................................................................................ 28
4.3. Xác định giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection) ................................. 29
4.4. Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện S.suis type 2 ................... 30
4.5. So sánh chất lƣợng DNA từ hai phƣơng pháp tách chiết ................................. 31
4.6. Phản ứng Multiplex PCR phát hiện S.suis type 2 ............................................. 32
CHƢƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 33
5.1. Kết luận ................................................................................................................. 33
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 2.1:
Các mồi dùng cho phản ứng PCR phát hiện S.suis type 1, 2, ½, 7 và 9........................ 16
Bảng 2.2:
Cặp mồi đƣợc dùng trong đề tài .................................................................................... 16
Bảng 4.1:
Xác định giới hạn phát hiện cho phản ứng PCR phát hiện S.suis ................................. 29

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADH

:

arginine dihydrolase

ATCC

:

American Type Culture Collection

bp

:

base pair

ctv

:

cộng tác viên

CDC

:

Centers for Disease Control and Prevention

DNA

:

Deoxyribonucleic acid

dNTP

:

deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA

:

Ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA

:

Enzym – Linked Immunosorbent Assay

LOD

:

Limit of detection

PCR

:

Polymerase chain reation

RT-PCR

:

Real time PCR

RNA

:

Ribonucleic acid

S.suis

:

Streptococcus suis

TP.HCM

:

Thành phố Hồ Chí Minh

TE buffer

:

Tris-EDTA buffer

TBE

:

Tris Borate EDTA

UV

:

Ultra Violet

µg

:

microgram

µl

:

microliter

µm

:

micrometer

µM

:

micromole/liter

mm

:

milimeter

mM

:

milimole/liter

nm

:

nanometer

16S rDNA

:

16S Ribosomal nucleic acid

16S rRNA

:

16S Ribosomal ribonucleic acid


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 2.1: S.suis sau khi nhuộm Gram trên mẫu bệnh phẩm .......................................... 4
Hình 2.2: Nuôi cấy S.suis trên thạch máu tạo tiêu huyết α ............................................. 4
Hình 2.3: Hình ảnh triệu chứng lâm sàng của các bệnh nhân nhiễm liên cầu lợn ......... 7
Hình 2.4: Một chu kỳ phản ứng PCR ........................................................................... 10
Hình 2.5: Cấu trúc của phân tử dNTP .......................................................................... 12
Hình 2.6: Các mồi dựa trên gen cps của S.suis type 2 .................................................. 15
Hình 2.7: Các mồi sử dụng cho phản ứng PCR phát hiện S.suis type 1 và 9 ............... 15
Hình 3.1: Bể ủ nhiệt ...................................................................................................... 18
Hình 3.2: Máy ly tâm lạnh ............................................................................................ 18
Hình 3.3: Máy PCR ...................................................................................................... 18

Hình 3.4: Tủ cấy vi sinh ............................................................................................... 18
Hình 3.5: Máy chụp hình gel ........................................................................................ 19
Hình 3.6: Máy điện di ................................................................................................... 19
Hình 4.1: Khảo sát nồng độ mồi tối ƣu ........................................................................ 26
Hình 4.2: Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ƣu .................................................................... 27
Hình 4.3: Khảo sát lƣợng DNA tối ƣu ......................................................................... 27
Hình 4.4: Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện S.suis ........................... 28
Hình 4.5: So sánh chất lƣợng DNA từ hai phƣơng pháp tách chiết ............................. 32
Hình 4.6: Xác định độ đặc hiệu cho S.suis type 2 ........................................................ 33
Hình 4.7: Phản ứng Multiplex PCR phát hiện S.suis type 2......................................... 34


Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Streptococcus suis hay còn gọi là liên cầu lợn, gây bệnh thứ phát sau khi lợn bị
một số bệnh khác nhƣ bệnh tai xanh, viêm phổi…. Liên cầu lợn tồn tại ở lợn bệnh và
cả lợn khỏe mạnh dẫn đến nguy cơ gây bệnh trên ngƣời cao. Vi khuẩn này có thời gian
ủ bệnh ngắn, bệnh diễn biến nhanh và phức tạp đe dọa tính mạng của bệnh nhân. Kể từ
khi ca nhiễm liên cầu lợn đầu tiên đƣợc phát hiện trên ngƣời vào năm 1968 ở Đan
Mạch, đến nay số bệnh nhân ngày càng gia tăng, xuất hiện ở nhiều nƣớc trên thế giới.
Việt Nam là một trong những quốc gia sản xuất và tiêu thụ thịt lợn với số lƣợng
cao, cùng với sự bùng phát dịch lợn tai xanh trong những năm gần đây, dẫn đến sự gia
tăng nguy cơ mắc bệnh liên cầu lợn ở ngƣời. Việc xét nghiệm chẩn đoán nhanh để đƣa
ra hƣớng điều trị thích hợp và kịp thời mang ý nghĩa quan trọng đối với bệnh nhân
nhiễm trùng cấp tính do S.suis. S.suis có nhiều type huyết thanh khác nhau nhƣng
trong đó type 2 đƣợc phân lập từ hầu hết những bệnh nhân nhiễm liên cầu lợn ở nhiều
nƣớc trên thế giới. Trong đề tài này, chúng tôi xây dựng một quy trình chuẩn phát hiện
Streptococcus suis và Streptococcus suis type 2 bằng kỹ thuật PCR – một ứng dụng
của lĩnh vực sinh học phân tử. PCR giúp chẩn đoán nhanh cùng với độ nhạy và độ đặc

hiệu cao làm cho thời gian trả lời kết quả đƣợc rút ngắn. Ngoài ra, đề tài cũng bƣớc
đầu thử nghiệm tìm S.suis type 2 bằng phản ứng đa mồi.
1.2. Mục đích đề tài và mục tiêu nghiên cứu
1.2.1. Mục đích
Xây dựng quy trình phát hiện Streptococcus suis và Streptococcus suis type 2
bằng kỹ thuật PCR.


1.2.2. Mục tiêu nghiên cứu
-

Xây dựng qui trình chuẩn phát hiện Streptococcus suis và S.suis type 2 bằng kỹ
thuật PCR.

-

Xác định độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện

-

So sánh phƣơng pháp tách chiết DNA bằng bộ kit và phƣơng pháp tách DNA
nhanh dùng cho liên cầu khuẩn (Fast Extraction of DNA for Streptococcal culture
isolates).

-

Phát triển kỹ thuật Multiplex PCR để phát hiện S.suis type 2.


Chƣơng 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình nhiễm Streptococcus suis ở ngƣời trên thế giới và Việt Nam
2.1.1. Trên thế giới
Tính đến năm 2007, trên toàn thế giới ghi nhận đƣợc 409 ca nhiễm S.suis ở
ngƣời. Các trƣờng hợp ngƣời mắc bệnh liên cầu lợn đã đƣợc thông báo ở các nƣớc:
Hoa Kỳ, Canada, Brazil, Anh, Pháp, Hà Lan, Đan Mạch, Na Uy, Tây Ban Nha, Đức,
Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan và Việt Nam (Wertheim và ctv, 2009). Tại Trung
Quốc, 3 vụ dịch nhiễm liên cầu lợn ở ngƣời đã xảy ra ở tỉnh Giang Tô vào năm 1998,
1999 và tỉnh Tứ Xuyên năm 2005. Kết quả xét nghiệm cho biết tác nhân gây bệnh chủ
yếu là S.suis type 2.Vụ dịch năm 1998 có 25 ca nhiễm, 14 trƣờng hợp tử vong (Tang
và ctv, 2006). Năm 2005 ghi nhận đƣợc 204 trƣờng hợp nhiễm bệnh và có 38 ngƣời tử
vong (Sriskandan và ctv, 2006; Tang và ctv, 2006).
2.1.2. Tại Việt Nam
Giai đoạn từ năm 1996 đến 1998, mỗi năm chỉ ghi nhận đƣợc khoảng 3 bệnh
nhân. Năm 1999 đến năm 2003, trung bình mỗi năm là 13 trƣờng hợp. Trong năm
2004, có 19 trƣờng hợp. Tính đến tháng 7 năm 2007, tổng số các bệnh nhân nhiễm
Streptococcus suis vào khoảng 230 trƣờng hợp (Trần Tịnh Hiền và ctv, 2010; Huỳnh
Hồng Quang, 2010). Nghiên cứu thực hiện tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới từ năm 1996
đến năm 2005 về viêm màng não mủ ở ngƣời lớn thì S.suis là tác nhân gây bệnh hàng
đầu (38,6%), kế đến là Streptococcus pneumoniae (18,4%) (Trần Tịnh Hiền, 2010).
Theo điều tra của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ƣơng, chỉ 2 tuần đầu của tháng 5
năm 2011, cả nƣớc đã có 14 trƣờng hợp nhiễm liên cầu lợn. Bên cạnh đó, trong một
cuộc khảo sát ở các lò mổ tại TP.HCM của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới đã cho thấy
khoảng 10% S.suis type 2 có trong thịt lợn dù đã kiểm dịch. S.suis type 2 đƣợc tìm
thấy nhiều nhất ở những ngƣời mắc bệnh liên cầu lợn tại miền nam Việt Nam.
( />

2.2. Tổng quan về Streptococcus suis
Về phân loại khoa học, Streptococcus suis đƣợc xếp loại vào:
Giới: Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Lactobacillales; Họ:

Streptococcaceae; Giống: Streptococcus; Loài: Streptococcus suis
( />S.suis thuộc nhóm D theo phân loại của Lancefield (xem phụ lục 1).
2.2.1. Hình thể
Cầu trùng Gram dƣơng, đƣờng kính 1 – 2 µm,
đứng riêng lẻ, xếp đôi hoặc tạo chuỗi ngắn (xem hình
2.1). Vi khuẩn không di động, không sinh nha bào và
tạo vỏ (capsule) trong cơ thể kí chủ. Một số trƣờng
hợp, (dƣới ảnh hƣởng kháng sinh, đột biến) vi khuẩn
có các dạng giả trực trùng, hình thể bất thƣờng hoặc
đôi khi bắt màu Gram sai (bắt màu Gram âm)
(Nguyễn Thị Kim Hoàng, 2009).

Hình 2.1: S.suis sau khi
nhuộm Gram trên mẫu bệnh phẩm

(Nguồn: />2.2.2. Tính chất nuôi cấy
S.suis là vi khuẩn kị khí tùy ý, phát triển
đƣợc trong khoảng nhiệt độ từ 10 – 450C nhƣng
tốt nhất là 370C. Nuôi cấy S.suis trên thạch máu,
vi khuẩn tạo khuẩn lạc nhỏ, lồi, tròn, bờ đều,
màu xám hoặc trong, hơi nhầy. Trên thạch máu
cừu tạo ra những vùng tan máu không hoàn toàn
(tan máu α), xung quanh khuẩn lạc có màu xanh.
Tuy nhiên gây tan máu β (tan máu hoàn toàn)
trên thạch máu ngựa, tạo vòng sáng đƣờng kính
3 – 4 mm xung quanh khuẩn lạc.

Hình 2.2: Nuôi cấy S.suis trên
thạch máu tạo tan máu α

2.2.3. Tính chất sinh hóa (xem phụ lục 3)
-

Thử nghiệm catalase âm tính

-

Thử nghiệm thủy phân esculin dƣơng tính

-

Không phát triển trong môi trƣờng chứa 6,5% NaCl

-

Kháng optochin (không có vòng vô khuẩn xung quanh đĩa optochin)

-

Thử nghiệm Voges Proskauer (VP) âm tính

-

Sinh acid trong canh thang 1% lactose, trehalose

-

Ngƣng kết kháng huyết thanh nhóm D (Lancefield)

-

Thử nghiệm ADH dƣơng tính

2.3.4. Các yếu tố độc lực
Dựa vào kháng nguyên vỏ cấu trúc polysaccharides, liên cầu lợn đƣợc chia thành
35 type huyết thanh. Các type đƣợc đánh số thứ tự từ 1 đến 34 và type ½.
Một số yếu tố độc lực của vi khuẩn đã đƣợc ghi nhận, đó là vách vi khuẩn CPS
(capsular polysaccharide), protein phóng thích MRP (muramidase related protein),
protein ngoài tế bào EF (extracellular factor), haemolysin (suilysin) và adhesin. Tuy
nhiên cơ chế sinh bệnh của S.suis vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu rõ ràng
( Độc lực vi khuẩn
tùy thuộc serotype. Không phải tất cả các type đều có khả năng gây bệnh và không
phải các chủng của cùng một type gây cùng một thể bệnh lâm sàng (Nguyễn Thị Kim
Hoàng, 2009). Hầu hết nghiên cứu độc lực của S.suis đƣợc thực hiện trên type 1, 2, ½,
7, 9 và 14, vì đây là các type gây bệnh cho ngƣời thƣờng gặp nhất (Okwumabua và
ctv, 2006).
2.3.5. Cƣ trú và đƣờng lây truyền
Lợn là ký chủ chính của S.suis, tuy nhiên cũng đƣợc tìm thấy ở các loài vật khác
nhƣ ngựa, chó, mèo, chim...Ruồi và chuột đƣợc ghi nhận là vật trung gian truyền bệnh
cho các đàn lợn ( />S.suis thƣờng trú ở đƣờng hô hấp trên (amygdales, khoang mũi), và cũng có thể đƣợc
tìm thấy ở đƣờng tiêu hoá và sinh dục (Wertheim và ctv, 2009). Vi khuẩn xâm nhập
vào các vết thƣơng, vết trầy xƣớc qua đƣờng hô hấp, đƣờng tiêu hóa hay lây nhiễm từ
lợn mẹ sang lợn con trong quá trình sinh.


S.suis từ lợn bệnh hay lợn mang vi khuẩn nhƣng không có triệu chứng đều có thể
lây truyền sang ngƣời. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể ngƣời thông qua các vết thƣơng,
vết trầy xƣớc trên da hoặc niêm mạc mũi, miệng do sự tiếp xúc trực tiếp với lợn, hít
phải các hạt khí dung có chứa mầm bệnh lơ lửng trong không khí, hay ăn thịt lợn bệnh

mà chƣa đƣợc nấu chín kỹ. Hiện nay vẫn chƣa có báo cáo bệnh liên cầu lợn có thể lây
truyền từ ngƣời sang ngƣời (Wertheim và ctv, 2009; Sriskandan và ctv, 2006).
2.3.6. Khả năng gây bệnh
2.3.6.1. Gây bệnh ở lợn
Tần suất mắc bệnh thƣờng xảy ra ở những quốc gia có mật độ gia súc đông đúc.
Tỉ lệ mang liên cầu lợn không triệu chứng trong một đàn lợn khoảng 60% - 100% (TS.
Trần Đình Bình, 2007). Mặc dù tỉ lệ lợn mang trùng cao nhƣng tỉ lệ mắc bệnh thấp,
hiếm khi quá 5% và trong một trại chăn nuôi có sự xuất hiện lặp đi lặp lại của những
ca bệnh riêng lẻ thƣờng gặp hơn là xảy ra dịch thật sự (Nguyễn Thị Kim Hoàng, 2009;
Wertheim và ctv, 2009).
Bệnh do S.suis gây ra là bệnh thứ phát sau khi lợn bị một bệnh khác nhƣ viêm
phổi, viêm màng phổi hoặc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản…Bên cạnh đó, theo
Wisselink và ctv (2002) lợn con từ 3 đến 12 tuần tuổi là đối tƣợng rất dễ mắc bệnh.
Lợn bệnh có biểu hiện lâm sàng đa dạng: lợn chết mà không có dấu hiệu báo trƣớc
(đột tử), viêm màng não, nhiễm trùng huyết, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, sẩy thai,
viêm phổi…( />2.3.6.2. Gây bệnh ở ngƣời
Bệnh nhiễm liên cầu lợn ở ngƣời đƣợc xem là bệnh có yếu tố nghề nghiệp. Bệnh
thƣờng xảy ra ở những ngƣời chăn nuôi lợn, giết mổ lợn, buôn bán, chế biến thịt lợn,
bác sĩ thú y...Ngoài ra những ngƣời có khả năng miễn dịch kém nhƣ nhiễm HIV, lao,
đái tháo đƣờng, ung thƣ, cắt lách, nghiện rƣợu…cũng là đối tƣợng dễ bị lây nhiễm
(Trần Tịnh Hiền, 2010). Theo ghi nhận của Wertheim và ctv (2009) bệnh nhân thƣờng
ở độ tuổi 47 – 55, tỉ lệ mắc bệnh giữa nam và nữ giới là 3,5:1 đến 6,5:1. Nhiễm S.suis
có thể gây ra những bệnh nguy hiểm, hay gặp nhất là viêm màng não, nhiễm trùng
huyết hay hội chứng sốc nhiễm độc. Thời gian ủ bệnh kéo dài 1 - 3 ngày, có thể tới 10
ngày (Bộ Y Tế, 2007). Bệnh thƣờng xảy ra vào các tháng nắng nóng trong năm,


thƣờng là từ tháng 3 đến tháng 8 (Nguyễn Thị Hồng Lan, Trần Tịnh Hiền, 2007;
Wertheim và ctv, 2009).
Bệnh nhân mắc thể viêm màng não thƣờng có biểu hiện sốt, đau đầu, nôn, có thể

đi vào hôn mê. Các biểu hiện lâm sàng bị viêm màng não do S.suis tƣơng tự nhƣ các
bệnh nhân mắc bệnh viêm màng não mủ do các vi khuẩn khác.Tỉ lệ rối loạn tri giác là
68,1%, đặc biệt tỉ lệ giảm hay mất thính lực rất cao 51,9% đến 64% (Nguyễn Thị
Hồng Lan, Trần Tịnh Hiền, 2007). Những bệnh nhân viêm màng não, nếu phát hiện
sớm có thể điều trị kịp thời, nhƣng nếu để muộn có thể dẫn đến phù não, tử vong hoặc
để lại các di chứng thần kinh nặng nề nhƣ động kinh, ngớ ngẩn…
Bệnh nhân nhiễm trùng huyết sốt cao liên tục, nhanh chóng xuất hiện các tử ban
(xuất huyết hoại tử dƣới da). Các tử ban này nhanh chóng lan khắp ngƣời kèm theo
tình trạng choáng, sốc, tụt huyết áp, suy chức năng hô hấp, tuần hoàn, thận, gan và
nhanh chóng tử vong.

Hình 2.2: Hình ảnh triệu chứng lâm sàng của các bệnh nhân nhiễm liên cầu lợn
(Nguồn:

/>
lon.htm; />%20LAN.pdf)


2.3.7. Chẩn đoán vi sinh
Sử dụng các mẫu bệnh phẩm khác nhau nhƣ máu, dịch não tủy, đàm…để tiến
hành xét nghiệm chẩn đoán. Kỹ thuật phân lập và định danh vi khuẩn dựa trên các tính
chất sinh hóa là chuẩn vàng. Do đó, đây vẫn là phƣơng pháp chẩn đoán chủ yếu, đƣợc
sử dụng phổ biến hiện nay.
Bệnh phẩm

Nhuộm Gram
Gram (+)
Nuôi cấy trên thạch máu cừu
Catalase –

Tan máu α

Streptococci

Thử nghiệm các tính chất sinh hóa

API 20Strep (xem phụ lục 6)

Ngƣng kết kháng huyết thanh nhóm D

Ngƣng kết kháng huyết thanh nhóm D

S.suis

S.suis

Phƣơng pháp huyết thanh học: có thể dựa vào những kỹ thuật khác nhau, nhƣng
thông thƣờng là thử nghiệm ELISA dùng kháng nguyên vỏ đƣợc tinh chế.
Phƣơng pháp miễn dịch học (thử nghiệm tụ Latex).
Thử ngiệm sinh học phân tử: PCR, Multiplex PCR, RT - PCR…
2.3. Điều trị và dự phòng bệnh liên cầu lợn
2.3.1. Điều trị
S.suis dễ bị tiêu diệt bởi các chất sát khuẩn thông thƣờng nhƣ chloramin B, nƣớc
javel…(Hoàng Văn Năm, 2008). Các chủng S.suis phân lập từ lợn đã kháng lại một số
kháng sinh nhƣ penicilline, macrolides (erythromycine), lincosamides. S.suis gây bệnh
trên ngƣời có các chủng kháng penicilline hoặc kháng các kháng sinh khác, nhƣng


nhìn chung vẫn còn nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh (Nguyễn Thị Kim Hoàng,
2009). Vì vậy nên sử dụng phối hợp nhiều loại kháng sinh. Hiện nay kháng sinh đƣợc

lựa chọn để điều trị là cephem thế hệ thứ 2 – 3. Khi có kết quả kháng sinh đồ có thể
thay đổi thuốc điều trị nếu thấy cần thiết hoặc tùy theo tình huống cụ thể.
2.3.2. Dự phòng
2.3.2.1. Phòng bệnh cho lợn
- Tuân thủ các quy định về chăn nuôi nhƣ: thực hiện vệ sinh chuồng trại sạch sẽ,
thoáng khí sẽ làm giảm nguy cơ lây nhiễm từ môi trƣờng, tăng sức đề kháng cho lợn.
- Tiêm vaccin phòng bệnh cho lợn là biện pháp hiệu quả giúp giảm các vụ dịch xảy ra
trên lợn, qua đó làm giảm nguy cơ lây nhiễm và mắc bệnh liên cầu lợn ở ngƣời.
- Đối với vùng có lợn bệnh cần theo dõi, phải cách ly và điều trị kịp thời cho đến khi
khỏi hẳn bệnh mới cho nhập đàn. Cấm hoàn toàn việc di chuyển và giết mổ lợn tập
trung khi có dịch bệnh lợn xảy ra.
2.3.2.2. Phòng bệnh cho người
- Không giết mổ, mua, bán thịt lợn không rõ nguồn gốc, thịt lợn bệnh; không ăn thịt
lợn chƣa nấu chín kỹ.
- Nên chọn mua thịt đã qua kiểm định của cơ quan thú y.
- Trang bị bảo hộ lao động khi tiếp xúc với lợn, các sản phẩm tƣơi sống của lợn.
Hiện chƣa có vaccin phòng bệnh cho ngƣời. Một vài nƣớc đã nghiên cứu phát
triển vaccin để phòng bệnh cho vật nuôi và ngƣời nhƣ các loại vaccin sản xuất từ vi
khuẩn bị làm chết, vi khuẩn còn sống giảm độc lực, vaccin điều chế từ protein của vi
khuẩn; tuy nhiên hiệu quả chƣa đƣợc đánh giá đầy đủ (Nguyễn Thị Kim Hoàng, 2009;
/>2.4. Giới thiệu kỹ thuật PCR
2.4.1. Lịch sử hình thành
Phƣơng pháp PCR đƣợc Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Kỹ thuật
phân tích PCR đã đƣợc sử dụng phổ biến nhờ 2 bƣớc tiến quan trọng. Đó là sự phát
hiện ra các men polymerase chịu nhiệt và máy chu kỳ nhiệt. Enzym polymerase chịu
nhiệt đƣợc trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt nhƣ Thermus aquaticus (Taq polymerase),
Thermus thermophilus (rTth)…Nhiệt độ phản ứng PCR có thể đƣa lên cao hay hạ


xuống thấp trong một thời gian rất ngắn trong buồng ủ của máy chu kỳ nhiệt (máy luân

nhiệt hay máy PCR).
2.4.2. Phản ứng PCR
PCR cần rất nhiều thành phần. Những thành phần chủ yếu là:
+ DNA mẫu (DNA template) chứa đoạn DNA cần khuếch đại
+ Cặp mồi (primer) xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại
+ DNA polymerase xúc tác cho việc nhân lên của DNA
+ dNTP là nguyên liệu để xây dựng DNA mới
+ Dung dịch đệm
Một phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu
kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài chuỗi.

Hình 2.4: Một chu kỳ phản ứng PCR
(Nguồn: /> Giai đoạn biến tính:
Liên kết hydro bị phá vỡ, DNA biến tính từ mạch đôi thành dạng mạch đơn ở
nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử.
 Giai đoạn bắt cặp:


Nhiệt độ đƣợc hạ xuống thấp hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của mồi, giúp cho các
mồi tìm kiếm và bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA đích.
 Giai đoạn kéo dài chuỗi:
Nhiệt độ phản ứng nhanh chóng tăng lên, thích hợp với hoạt động của enzyme
DNA polymerase. DNA polymerase sẽ lấy các dNTP từ môi trƣờng phản ứng để gắn
vào đầu 3’ của mồi theo nguyên tắc bổ sung với trình tự DNA đích.
2.4.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose
Sau nhiều chu kỳ khuyếch đại (thƣờng từ 30 - 40 chu kỳ) từ một phân tử DNA
đích đã tạo ra vô số bản sao (khoảng 106) có kích thƣớc xác định mong muốn.
Đệm điện di (Tris acetate EDTA (TAE) hay Tris borate EDTA (TBE)) tạo môi
trƣờng có pH ổn định. “Loading dye” (chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue
và 0,25% xylencyanol) kéo DNA xuống đáy bản gel để chúng không khuếch tán vào

dung dịch đệm điện di ( />Gel agarose đƣợc nhuộm với Ethidium bromide, là một chất màu chèn vào DNA và
phát sáng khi chịu tác động của tia UV.
Sản phẩm PCR trộn với “loading dye” rồi chuyển vào các giếng trên gel agarose
đặt trong dung dịch đệm điện di. Nguyên tắc điện di dựa trên khả năng tích điện âm
của phân tử DNA trong dung dịch đệm điện di. Khi chịu tác động bởi điện trƣờng,
DNA di chuyển trong gel agarose nhanh hay chậm tùy theo kích thƣớc của chúng. Kết
thúc quá trình điện di, chụp hình gel dƣới tia UV. Sản phẩm PCR hiển thị dƣới dạng
băng vạch sáng tại những vị trí khác nhau tƣơng ứng với chiều dài của chúng.
2.4.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR
 DNA mẫu (DNA Template)
Việc tách chiết DNA phải đƣợc coi trọng, đặc biệt trong các phòng thí nghiệm áp
dụng PCR để chẩn đoán phát hiện bệnh, tránh trƣờng hợp âm tính giả do không tách
chiết đƣợc hay gây tổn hại làm đứt gãy DNA.
 Enzyme polymerase
Bị phân hủy bởi nhiệt độ cao trong giai đoạn biến tính phân tử DNA. Nhờ sử
dụng enzym polymerase chịu nhiệt mà phản ứng PCR trở nên đơn giản và đặc hiệu
hơn (tăng khả năng bắt cặp chính xác của mồi).


 Mồi (Primer)
Việc thiết kế mồi phải tuân thủ một số nguyên tắc:
+ Có khoảng 18 đến 30 oligonucleotides, bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào
đoạn DNA đích.
+ Chọn mồi đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các
trình tự lặp lại trên gen.
+ Trình tự nằm giữa hai mồi không quá lớn. Mồi càng ngắn thì quá trình gắn vào
khuôn mẫu DNA càng nhanh, tạo thành sợi đôi ổn định trong tổng hợp DNA.
+ Trình tự của mồi đƣợc chọn có khoảng 40% - 60% G và C. Tránh G và C ở đầu
3’ của mồi vì nó có thể làm tăng cơ hội tạo ra hiện tƣợng primer-dimers (hai mồi bắt
cặp với nhau và tránh sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi).

+ Nhiệt độ nóng chảy Tm = 4(G+C) + 2(A+T) khoảng 65 - 700C và không cách
biệt quá xa giữa hai mồi.
(Nguồn: /> dNTP (Deoxynucleoside Triphosphate)
dNTP có cấu tạo gồm một đƣờng deoxyribose có gắn một trong bốn loại base:
adenine (dATP), thyamine (dTTP), cytosine (dCTP) hay guanine (dGTP) ở carbon số
1. Ba phân tử phosphate đƣợc gắn tại cacbone số 5 và đây chính là nơi mà dNTP gắn
vào đầu 3' của mồi. Năng lƣợng để cho phản ứng này xảy ra đƣợc lấy từ các nối
phosphate trên dNTP. Lƣợng dNTP tối ƣu là 200 µM cho mỗi loại dNTP. Việc tăng
nồng độ dNTP không làm tăng đáng kể lƣợng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh
các yếu tố khác.

Hình 2.5: Cấu trúc của phân tử dNTP
(Nguồn: />

 Dung dịch đệm (Buffers):
Thƣờng chứa muối đệm Tris HCl 10 mM, KCl 50 mM và MgCl2 1.5 mM. Để có
đƣợc một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phản ứng rõ nét, ngƣời ta phải tối ƣu hóa
nồng độ MgCl2. Ion Mg2+ tăng khả năng bám nối của mồi, gắn liên kết dNTP với DNA
polymerase. Việc tăng nồng độ ion Mg2+ có thể làm xuất hiện các sản phẩm không đặc
hiệu. Tuy nhiên nếu thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lƣợng sản phẩm PCR thấp. Nồng độ
ion Mg2+ tối ƣu phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA template và thành
phần buffer (một số buffer thƣơng mại đã có sẵn 1 lƣợng nhất định ion Mg2+).
 Số lƣợng chu kỳ của phản ứng PCR:
Trong giai đoạn đầu của phản ứng PCR, số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân
tỉ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên
nhân sau:
+ Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
+ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng
+ Các bản sao vừa đƣợc tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau.
 Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR:

+ Thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng đƣợc yêu cầu thay
đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác.
+ Mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần tiến hành trên cùng một loại thiết bị.
2.4.5. Ƣu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR
2.4.5.1. Ƣu điểm
- Thời gian thực hiện nhanh
- Đơn giản và ít tốn kém: đƣợc thực hiện gồm các thành phần, hóa chất dễ tìm và dễ
tồn trữ hơn so với trƣờng hợp huyết thanh học.
- Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể tự động hóa nên giảm chi phí phát hiện vi sinh vật
gây bệnh.
- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao
- Có thể phát hiện những vi khuẩn khó nuôi cấy. Việc tăng sinh là đơn giản hoặc
không cần thiết.


2.4.5.2. Hạn chế
- Phƣơng pháp này không phân biệt đƣợc tế bào sống với tế bào chết
- Định tính chứ không định lƣợng vi sinh vật trong mẫu.
- PCR không hoạt động đƣợc với những đoạn DNA lớn hơn 3kb, tốt nhất là kích thƣớc
từ 1,5kb trở xuống.
- Taq polymerase có tỉ lệ sai lỗi khá cao (1/104), nghĩa là cứ 10000 nucleotide thì
enzym gắn sai 1 nucleotide. Sai sót này không nghiêm trọng nếu chỉ xét theo kích
thƣớc hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại (định tính) nhƣng có ý nghĩa rất lớn
khi cần xác định trình tự nucleotide của DNA.
- Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đƣợc đặt ra đối với kỹ thuật PCR. Nguồn ngoại
nhiễm thƣờng là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trƣớc. Do đó các
công đoạn thao tác khác nhau nhƣ thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm
khuếch đại phải đƣợc tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau. Dụng cụ dùng để thiết
lập phản ứng không sử dụng vào các thao tác khác (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2003).
2.5. Tổng quan các nghiên cứu về S.suis

Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện S.suis
cũng nhƣ các type gây bệnh phổ biến. Năm 1999, Hilde E. Smith và ctv đƣa ra quy
trình PCR phát hiện S.suis từ các mẫu amygdales của lợn. Mồi sử dụng trong phản ứng
PCR đƣợc thiết kế dựa trên gen cps (capsular biosynthesis) mã hóa cho vách tế bào
của S.suis type 2. Trình tự của từng đoạn khác nhau thuộc gen cps cho phép định danh
đƣợc serotype của S.suis (xem hình 2.4). Từ đó họ đã phát triển kỹ thuật PCR dựa trên
những đoạn gen cps riêng biệt của S.suis type 1 và type 9, mục đích phát hiện S.suis
type 1 và 9 (xem hình 2.5). Bên cạnh đó, phản ứng PCR phát hiện S.suis sử dụng cặp
mồi 16S-195(s) và 16S-489(as) (Smith và ctv, 1999; C.Marois và ctv, 2004). Phản ứng
khuếch đại một đoạn trong gen 16S rDNA của S.suis. Đây là gen mã hóa cho 16S
rRNA, là thành phần cấu tạo tiểu đơn vị 30S ribosome.


Hình 2.6: Các mồi dựa trên gen cps của S.suis type 2
(Nguồn: Smith và ctv, 1999)

Hình 2.7: Các mồi sử dụng cho phản ứng PCR phát hiện S.suis type 1 và 9
(Nguồn: Smith và ctv, 1999)
Năm 2003, Okwumabua và ctv xây dựng quy trình PCR với cặp mồi JP4 và JP5
dựa trên gen gdh (glutamate dehydrogenase) của S.suis type 2. Sản phẩm PCR có kích
thƣớc 688 bp cho tất cả serotype của S.suis. Tuy nhiên cặp mồi này chỉ sử dụng để
phát hiện S.suis từ môi trƣờng nuôi cấy thuần. Ngoài ra họ cũng trình bày các loại mồi
khác nhau dùng cho phản ứng PCR xác định các type gây bệnh phổ biến (xem bảng
2.1). Họ đã khảo sát trên rất nhiều chủng khác nhau và khẳng định các mồi này đặc
hiệu cho S.suis cũng nhƣ serotype của chúng.