PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC HIỆN DIỆN TRÊN TRÉ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN
CỦA VI KHUẨN LACTIC HIỆN DIỆN TRÊN TRÉ

Họ và tên sinh viên: ỪNG THỊ MỸ LINH
Ngành: BẢO QUẢN VÀ CHẾ BIẾN NÔNG SẢN THỰC PHẨM
Niên khóa: 2007 – 2011

Tháng 08/2011


PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA
VI KHUẨN LACTIC HIỆN DIỆN TRÊN TRÉ

Tác giả

ỪNG THỊ MỸ LINH

Khóa luận tốt nghiệp được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng Kỹ sư ngành
Bảo quản và chế biến nông sản thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:
TS. HỒ THỊ NGUYỆT THU

Tháng 08 năm 2011
i

LỜI CẢM ƠN
Để bày tỏ lòng thành kính ghi ơn, con xin gửi đến Ông bà, Cha mẹ lời biết ơn
sâu sắc nhất. Cảm ơn cha mẹ đã sinh thành, nuôi dạy con khôn lớn, tạo điều kiện tốt
nhất cho con học hành, an ủi, động viên viên con khi con cảm thấy buồn phiền hay mệt
mỏi, luôn chắp cánh cho những ước mơ để con có được như ngày hôm nay.
Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ
Thực phẩm, Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm tp. Hồ Chí Minh đã tận tình
dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt khóa học.
Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến cô Hồ Thị Nguyệt Thu - người đã trực tiếp
hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, chỉ bảo, động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn cô Vũ Thị Lâm An, cô Nguyễn Minh Hiền đã giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị, dụng cụ cho em khi thực hiện đề tài.
Và cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn Lê Thị Minh Nguyệt, các bạn lớp DH07BQ,
các bạn thực tập tại phòng vi sinh, hóa sinh, kỹ thuật thực phẩm thuộc khoa Công nghệ
Thực phẩm đã chia sẽ, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thời gian
thực hiện luận văn.
Chân thành cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07/2011
Ừng Thị Mỹ Linh

ii


TÓM TẮT
Tré là một sản phẩm lên men truyền thống khá phổ biến ở miền trung Việt
Nam. Đây là một trong hàng trăm món ăn xứ Huế đã được bà Trương Đăng Thị
Bích dạy làm món ăn bằng thơ thất ngôn tứ tuyệt. Tré có hương vị đặc biệt của nhiều

thành phần và gia vị khác nhau trong công thức chế biến. Tuy nhiên, sản phẩm này
được chế biến theo quy mô thủ công nên vấn đề chất lượng vệ sinh an toàn thực
phẩm vẫn là mối quan tâm lớn của người tiêu dùng.
Chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập và khảo sát khả năng sinh bacteriocin
của vi khuẩn lactic hiện diện trên tré” với mong muốn cải thiện chất lượng sản
phẩm, định hướng chế biến thành thực phẩm chức năng thông qua việc tìm ra chủng
vi khuẩn lactic có khả năng kháng lại một số chủng vi sinh vật gây bệnh thường gặp.
Nghiên cứu được tiến hành trên các mẫu tré vào ngày ăn được của 3 cơ sở sản
xuất (Đông Ba, Bà Đệ và Bình Định). Trong đó, thời điểm khảo sát của tré Đông Ba
là sau 2 ngày lên men, tré Bà Đệ sau 3 ngày lên men và tré Bình Định là 5 ngày.
Việc đo pH và đếm tổng lượng vi khuẩn lactic của tré vào ngày lên men, khảo sát
các phản ứng sinh hóa và khả năng sinh bacteriocin của những chủng vi khuẩn lactic
phân lập đã được thực hiện.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, giá trị pH của các mẫu tré ở 3 cơ sở khảo sát
khác nhau rất có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,001). Trong đó, tré Đông Ba có pH
thấp nhất (4,03 ± 0,03), kế đến là tré Bình Định (4,52 ± 0,04) và cao nhất là tré Bà
Đệ (4,58 ± 0,08).
Vào ngày ăn được của sản phẩm, tổng lượng vi khuẩn lactic trên tré của 3 cơ
sở khảo sát không có sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95%. Trong đó, tổng
lượng vi khuẩn lactic trên tré vào thời điểm khảo sát của 3 cơ sở Đông Ba, Bình
Định và Bà Đệ lần lượt là 6,62.108, 5,6.108 và 5,3.108 CFU/g.
Chúng tôi ghi nhận có 5 dạng khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tại 3 cơ sở khảo
sát; trong đó, phần lớn là vi khuẩn có hình thái tế bào dạng que chiếm 86,67%, dạng
cầu trực chiếm 10% và dạng cầu chiếm 3,33% (các chủng khảo sát). Cơ sở tré Đông
Ba đa dạng về hình dạng khuẩn lạc nhất (4 dạng), hai cơ sở còn lại đều có
iii


3 dạng. Xét về sự phân bố các dạng tế bào, cơ sở tré Bình Định là đa dạng nhất (có
đủ 3 loại hình dạng tế bào), kế đến là cơ sở tré Bà Đệ có 2 dạng và cơ sở tré Đông

Ba chỉ có một dạng (dạng que).
Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng lactic phân lập cho
thấy mẫu tré Bình Định có 1 chủng dạng III, tré Đông Ba có 1 chủng dạng IV, tré Bà
Đệ có 1 chủng dạng V là có khả năng kháng lại Staphylococcus aureus spp. aureus
CIP 20256. Một chủng dạng IV của cơ sở tré Bình Định cũng ghi nhận được có khả
năng kháng lại Salmonella indiana LMBA.

iv


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ....................................................................................................................... ii
Tóm tắt ............................................................................................................................iii
Mục lục ............................................................................................................................ v
Danh sách chữ viết tắt ..................................................................................................viii
Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix
Danh sách các hình .......................................................................................................... x
Chương 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1
1.2 Mục đích và yêu cầu .............................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN ............................................................................................... 3
2.1 Các sản phẩm thịt lên men truyền thống ............................................................... 3
2.2 Quá trình lên men lactic ......................................................................................... 4
2.2.1 Lên men lactic đồng hình ................................................................................. 5
2.2.2 Lên men lactic dị hình ...................................................................................... 6
2.3 Vi khuẩn lactic ....................................................................................................... 6
2.3.1 Đặc điểm hình thái và sinh hóa ........................................................................ 6
2.3.2 Phân loại vi khuẩn lactic .................................................................................. 7
2.3.3 Vai trò của vi khuẩn lactic đối với sức khỏe con người................................... 7

2.3.4 Ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm ................................................................ 8
2.4 Bacteriocin ............................................................................................................. 9
2.4.1 Khái niệm ......................................................................................................... 9
2.4.2 Phân loại ......................................................................................................... 10
2.4.3 Cơ chế hoạt động ............................................................................................ 11
2.4.4 Lợi ích và hạn chế .......................................................................................... 12
2.4.4.1 Lợi ích của bacteriocin ............................................................................ 12
2.4.4.2 Hạn chế của bactericin ............................................................................ 13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 14
3.1 Thời gian và địa điểm .......................................................................................... 14
v


3.2 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 14
3.2.1 Nguyên liệu thí nghiệm .................................................................................. 14
3.2.2 Môi trường, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ................................................... 14
3.2.2.1 Môi trường và thuốc thử.......................................................................... 14
3.2.2.2 Dụng cụ ................................................................................................... 15
3.2.2.3 Thiết bị .................................................................................................... 15
3.3 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 15
3.4 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 15
3.4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên tré ................................................................ 15
3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu .............................................................................. 16
3.4.1.2 Đồng nhất mẫu ........................................................................................ 16
3.4.1.3 Kỹ thuật đo pH ........................................................................................ 16
3.4.1.4 Pha loãng mẫu và cấy đĩa ........................................................................ 17
3.4.1.5 Đếm khuẩn lạc và cấy chuyền ................................................................. 17
3.4.2 Định danh sơ bộ bằng các phản ứng sinh hóa ................................................ 18
3.4.2.1 Nhuộm Gram ........................................................................................... 18
3.4.2.2 Thử catalase ............................................................................................. 18

3.4.2.3 Kiểm tra khả năng di động ...................................................................... 18
3.4.2.4 Kiểm tra khả năng lên men lactic ............................................................ 18
3.4.2.5 Kiểm tra kiểu lên men ............................................................................. 19
3.4.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân
lập .................................................................................................................. 19
3.4.3.1 Tăng sinh và thu hoạch dịch ly tâm......................................................... 19
3.4.3.2 Khảo sát sơ bộ khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic
phân lập ................................................................................................... 20
3.4.3.3 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân
lập bằng phương pháp khuếch tán trên thạch .......................................... 20
3.5 Xử lý số liệu ......................................................................................................... 21
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 22
4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên tré...................................................................... 22
4.1.1 Khảo sát pH của sản phẩm tré vào ngày ăn được .......................................... 22
vi


4.1.2 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên tré ................................................................ 23
4.2 Tỷ lệ phần trăm các dạng khuẩn lạc .................................................................... 24
4.3 Tính chất sinh hóa của các dạng khuẩn lạc phân lập ........................................... 28
4.4 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập ...... 30
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 34
5.1 Kết luận ................................................................................................................ 34
5.2 Đề nghị ................................................................................................................. 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 36
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 42

vii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
ACE

Angiotensin Converting Enzyme

ATCC

American Type Culture Collection

ATP

Adenosine Triphosphate

CDC

Centers for Disease Control and Prevention

CFU

Colony Forming Unit

CIP

Collection of Institut Pasteur

E. coli

Escherichia coli

EMP

Embden – Meyerhof – Parnas Pathway

FDP

Fructose - 1,6 diphosphate

HIV

Human Immunodeficiency Virus

LAB

Lactic Acid Bacteria

Lb.

Lactobacillus

LDH

Lactate Dehydrogenase

Li.

Listeria

LMBA

Laboratoire de Microbiologie et de Biochimie Appliquée

MRD

Maximum Recovery Diluent

MRS

De Man, Rogosa and Sharpe

NB

Nutritive Broth

PKP

Phosphoketolase Pathway

TSA

Tryptone Soy Agar

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1: Giá trị pH trên tré của 3 cơ sở khảo sát. ....................................................... 22
Bảng 4.2: Số lượng vi khuẩn lactic (CFU/g) trên tré của 3 cơ sở khảo sát. ................. 23
Bảng 4.3: Các dạng khuẩn lạc điển hình trên tré của 3 cơ sở khảo sát. ........................ 24
Bảng 4.4: Phần trăm các dạng khuẩn lạc. ..................................................................... 27

Bảng 4.5: Đặc tính sinh hóa của các dạng khuẩn lạc phân lập. .................................... 29
Bảng 4.6: Số lượng và phần trăm các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng
khuẩn sơ bộ. ................................................................................................. 31

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Quá trình lên men lactic theo hai con đường EMP và PKP ........................... 5
Hình 2.2: Cơ chế hoạt động của bacteriocin nhóm I và nhóm II ................................. 12
Hình 3.1: Trình tự thao tác pha loãng và định lượng tổng số vi khuẩn lactic
trên tré .......................................................................................................... 16
Hình 3.2: Tăng sinh và thu hoạch dịch ly tâm .............................................................. 19
Hình 3.3: Mô tả cách bố trí các giếng và vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin ...... 20
Hình 4.1: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng I ............................................. 25
Hình 4.2: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng II............................................ 25
Hình 4.3: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng III .......................................... 26
Hình 4.4: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng IV .......................................... 26
Hình 4.5: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng V ........................................... 26
Hình 4.6: Vòng kháng khuẩn của khuẩn lạc dạng IV tré Đông Ba (I.9) đối với
Staphylococcus aureus spp. aureus CIP 20256 ........................................... 31
Hình 4.7: Vòng kháng khuẩn của khuẩn lạc dạng III tré Bình Định (III.33) đối với
Staphylococcus aureus spp. aureus CIP 20256 ........................................... 32
Hình 4.8: Vòng kháng khuẩn của khuẩn lạc dạng V tré Bà Đệ (II.31) đối với
Staphylococcus aureus spp. aureus CIP 20256 ............................................ 32
Hình 4.9: Vòng kháng khuẩn của khuẩn lạc dạng IV tré Bình Định (III.42) đối
với Salmonella indiana LMBA ................................................................... 33

x

Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Trong những thập niên vừa qua, tình trạng ngộ độc thực phẩm vẫn luôn diễn ra.
Theo CDC (2011), ước tính ở Mỹ trung bình 1 năm có khoảng 48 triệu người bệnh,
128000 ca nhập viện và 3000 người tử vong do ngộ độc thực phẩm. Nguyên nhân chủ
yếu là các vi sinh vật gây bệnh phát triển trong thực phẩm như Salmonella,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli,... Do đó, con người mong muốn rằng sản
phẩm phải vừa đảm bảo chất lượng cảm quan vừa bảo quản được lâu mà phải không
gây hại đến sức khỏe người tiêu dùng (Jeevaratnam và ctv, 2004). Để đáp ứng nhu cầu
trên, hiện tại người ta thường bổ sung các chất bảo quản vào trong thực phẩm.
Cùng với sự phát triển của xã hội, trình độ của con người càng được nâng cao.
Người tiêu dùng đã nhận thức rõ hơn về tác động của phụ gia thực phẩm đối với sức
khỏe và ưa chuộng các loại thực phẩm chế biến không bổ sung chất bảo quản hóa học
tổng hợp. Xuất phát từ yêu cầu cao về chất lượng của sản phẩm từ phía người tiêu
dùng cũng như những yêu cầu nghiêm ngặt của chính phủ về vấn đề an toàn thực
phẩm, các nghiên cứu, tìm hiểu về các chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên
ngày càng được quan tâm và khuyến khích trong lĩnh vực thực phẩm.
Theo xu hướng nghiên cứu trên, một trong những đối tượng được chú ý đó là
nhóm vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic, trong quá trình lên men, ngoài việc tạo ra sản
phẩm chính là acid lactic, chúng còn có thể sinh ra một số chất có khả năng kháng
khuẩn như hydrogen peroxide, cacbon dioxide, diacetyl, bacteriocin, reuterin,
reutericyclin (Ouwehand và Vesterlund, 2004). Đặc tính kháng khuẩn của nhóm vi
khuẩn này đã được chứng minh bằng những khám phá các chất kháng khuẩn đặc hiệu
từ những thập niên 40 như diplococcin sinh ra bởi Streptococcus cremoris (Oxford,
1944), nisin sinh ra bởi Lactococcus lactis (Mattick và Hirsch, 1947; trích bởi
1

Thomas và Delves-Broughton, 2005),… Từ đó trở đi, người ta ngày càng quan tâm
hơn đến việc sử dụng vi khuẩn lactic để bảo quản sản phẩm chống lại những vi sinh
vật không mong muốn, đặc biệt là trong các sản phẩm thịt và sữa (Vermeiren và ctv,
2006; Kouakou và ctv, 2009; Alegría và ctv, 2010; Nielsen và ctv, 2010; Hartmann và
ctv, 2011).
Đề tài “Phân lập và khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic hiện
diện trên tré” được thực hiện nhằm tìm ra các chủng vi khuẩn lactic trên sản phẩm tré
có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh. Từ đó, có thể sử dụng làm giống
khởi động cho quá trình lên men và cải thiện chất lượng sản phẩm tré cũng như các
thực phẩm lên men khác.
1.2 Mục đích và yêu cầu
Đề tài được thực hiện với mục đích tìm ra những chủng vi khuẩn có khả năng
sinh bacteriocin hiện diện trên tré.
Yêu cầu của đề tài:
-

Khảo sát pH sản phẩm tré của 3 cơ sở sản xuất vào ngày ăn được.

-

Phân lập các chủng vi khuẩn lactic có trong 3 loại tré khác nhau vào ngày ăn
được của sản phẩm.

-

Thực hiện một số phản ứng sinh hóa nhằm định danh sơ bộ vi khuẩn lactic.

-

Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập.

2


Chương 2
TỔNG QUAN

2.1 Các sản phẩm thịt lên men truyền thống
Thịt là sản phẩm giàu protein đóng vai trò quan trọng trong hầu hết các nền văn
hóa ẩm thực và xã hội (Heinz và Hautzinger, 2007). Ở các vùng khác nhau, sự khác
biệt về thị hiếu trên hương vị của sản phẩm là khác nhau. Chính vì vậy mà các sản
phẩm thịt rất đa dạng, đặc biệt là các sản phẩm thịt lên men.
Ở châu Âu, xúc xích lên men tự nhiên là sản phẩm truyền thống có nguồn gốc
từ các nước vùng Địa Trung Hải trong suốt thời kì La Mã. Sau đó, sản phẩm này lan
rộng sang Đức, Hungary và một số nước khác như Mỹ, Argentina và Úc. Trong đó xúc
xích lên men ở vùng phía Bắc có pH thấp hơn 5, còn xúc xích lên men ở vùng Địa
Trung Hải được làm khô hơn và có pH trong khoảng 5,3 - 6,2 (Comi và ctv, 2005;
Demeyer, 2004; trích bởi Talon và ctv, 2007). Một số xúc xích khô lên men nổi tiếng
trên thế giới như salami của Hungari và Ý, chorizo của Tây Ban Nha,… Bên cạnh xúc
xích lên men, châu Âu còn có những sản phẩm thịt lên men truyền thống khác, đặc
biệt là món jambon tươi lên men (Parma Ham của Ý, Jamo Serrano của Tây Ban Nha,
Black Forest và Guestphalia của Đức) (Heinz và Hautzinger, 2007).
Ở Nam Mỹ, Argentina là quốc gia có nhiều sản phẩm thịt chế biến nhất. Một
trong những sản phẩm thịt truyền thống của vùng này là salami, ở dạng tươi và có lên
men. Thành phần chính của sản phẩm gồm 53% thịt heo, 33% thịt bò và 14% mỡ.
Salami là sản phẩm có quá trình ủ chín nhanh (khoảng 10 ngày), quá trình ủ chín và
lên men diễn ra trong phòng lạnh (Heinz và Hautzinger, 2007).
Ở châu Á, các sản phẩm thịt lên men truyền thống tập trung chủ yếu ở khu vực
Đông Nam Á. Các sản phẩm thịt lên men sử dụng nguyên liệu chính là thịt heo.

Philippin nổi tiếng với longanisa là một loại xúc xích lên men không triệt để. Trước
khi lên men, hổn hợp nguyên liệu được trữ ở nhiệt độ 2 – 4 oC trong 2 - 3 ngày. Sản
3


phẩm lên men nhờ hệ vi khuẩn lactic tự nhiên có sẵn trên thịt ở nhiệt độ phòng trong
thời gian ngắn từ 12 đến 24 giờ làm pH của bột thịt giảm từ 6 xuống 5,2. Bên cạnh đó,
sản phẩm nham của Thái Lan cũng khá nổi tiếng với thời gian sử dụng sản phẩm khá
dài (khoảng từ 1 đến 2 tháng). Nham có pH khoảng 4,45 - 4,55 sau 7 ngày lên men ở
nhiệt độ 25 – 45 oC (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2006).
Ở Việt Nam, khi nói đến sản phẩm thịt lên men người ta luôn nhắc đến nem
chua. Nem chua là một món ăn chơi và cũng là món ăn khá phổ biến ở vùng Đông
Nam Á. Thịt heo xay, da heo cắt sợi, muối, tiêu đen, tỏi,… được trộn lẫn và gói trong
lá chuối, tiếp xúc trực tiếp với bột thịt có thể gói thêm lá ổi hay lá chùm ruột để tạo
hương vị đặc biệt cho sản phẩm. Nem chua được lên men ở nhiệt độ phòng
(28 – 30 oC) và ăn được vào khoảng ngày thứ 3 của quá trình lên men. Nem chua có
thể bảo quản ở nhiệt độ thường 5 ngày, sau đó phải bảo quản lạnh (Nguyễn Đức
Lượng, 2006; Heinz và Hautzinger, 2007). Tré cũng là một sản phẩm lên men từ thịt
nhưng ít được nhắc đến như nem chua. Tré khá phổ biến ở miền Trung Việt Nam, đặc
biệt là Huế, Đà Nẵng và Bình Định. Đây là sản phẩm lên men từ thịt chín. Nguyên liệu
sử dụng chủ yếu là thịt đầu heo, có thể dùng thịt ba chỉ (một số cơ sở có bổ sung thịt
bò rim), riềng, tiêu, muối, đường, thính,… Tré thường được gói bằng lá chuối, bên
trong có thể gói thêm lá ổi và bao nilon, riêng đối với tré Bình Định người ta còn bó
thêm lớp rơm bên ngoài.
2.2 Quá trình lên men lactic
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vào vi sinh
vật. Lên men lactic được phân thành hai dạng: lên men đồng hình và lên men dị hình.
Sở dĩ tồn tại hai kiểu lên men trên là do sự khác biệt về hệ enzyme có hoặc thiếu một
số enzyme chính của con đường Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) và phosphoketolase
(PKP) (Axelsson, 2004). Quá trình lên men chuyển hóa đường thành acid lactic được

tóm lược trong Hình 2.1.

4


Hình 2.1: Quá trình lên men lactic theo hai con đường EMP và PKP.
(nguồn: Wink, 2007)
2.2.1 Lên men lactic đồng hình
Lên men đồng hình là quá trình lên men bằng con đường Embden-MeyerhofParnas (EMP) nhờ sự có mặt enzyme FDP aldolase và tạo thành pyruvate. Acid
pyruvic được chuyển thành acid lactic nhờ enzyme lactate dehydrogenase (LDH).
Lactate có hai dạng đồng phân là L và D có thể là sản phẩm của hai enzyme L-LDH và
D-LDH khác nhau, cả hai enzyme này đều được tìm thấy có trong hầu hết các
Lactobacillus. Kết thúc quá trình lên men đồng hình thu được 2 mol acid lactic và
2 phân tử ATP/1 mol hexose. Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình như
Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus và một vài chủng của nhóm Lactobacillus
(Mozzi và ctv, 2010; Axelsson, 2004).

5


Tùy thuộc vào điều kiện sống như sự thiếu hụt hay dư thừa cacbon trong quá
trình chuyển hóa đường mà nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình này có thể tạo
thêm các sản phẩm khác như formate, acetate, ethanol, CO 2 ,… (Mozzi và ctv, 2010).
2.2.2 Lên men lactic dị hình
Quá trình lên men dị hình thường diễn ra theo con đường pentose-phosphate
(hay còn gọi là con đường phosphoketolase (PKP)) nhờ sự có mặt của enzyme
phosphoketolase. Quá trình lên men đường pentose tạo ra pyruvate, acetyl-P và sản
phẩm tiếp theo của sự chuyển hóa chính là lactate và acetate. Kết quả của quá trình lên
men dị hình là 1 mol acid lactic, 1 mol ethanol, 1 mol CO 2 và 1 ATP/1 mol hexose.
Các vi khuẩn lactic lên men dị hình như Leuconostoc, Oenococcus và một số chủng

của nhóm Lactobacillus. Nhóm vi khuẩn này cũng có thể chuyển hóa đường hexose
thành lactate, CO 2 , ethanol,… (Mozzi và ctv, 2010; Axelsson, 2004).
Theo Axelsson (2004), bên cạnh 2 nhóm vi khuẩn lactic trên còn một nhóm
trung gian. Nhóm vi khuẩn này có cả 2 hệ thống enzyme của quá trình EMP và PKP.
Chính vì vậy nên chúng lên men đồng hình với cơ chất là đường hexose và lên men dị
hình với đường pentose.
2.3 Vi khuẩn lactic
Năm 1872, nhà hóa học Thụy Điển Karl W. Scheele lần đầu tiên đã tách được
acid lactic trong sữa bò lên men chua (Coley, 2004). Năm 1857, Louis Pasteur chứng
minh được rằng sự hình thành acid lactic trong quá trình lên men sữa có liên quan đến
một nhóm vi khuẩn đặc biệt (Koertge và ctv, 2008). Năm 1878, Joseph Lister phân lập
thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactis (Lister, 1878) (hiện
nay gọi là Streptococcus lactis). Từ đó đến nay các nhà khoa học liên tiếp phân lập
được các chủng vi khuẩn lactic khác nhau.
2.3.1 Đặc điểm hình thái và sinh hóa
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn lên men từ các loại đường khác nhau, đặc biệt
là khả năng sử dụng đường lactose. Vi khuẩn lactic có dạng hình cầu, lưỡng cầu hoặc
hình que; chúng có thể đứng đơn độc hoặc sắp xếp với nhau dạng bắt cặp hoặc dạng
chuỗi. Đây là nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không có khả năng di
động. Chúng phân giải nitrat, phản ứng catalase âm và là nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy
nghi (Larpent, 1989; trích bởi Mai Huỳnh Cang, 2005).
6


Vi khuẩn lactic khó nuôi cấy, chúng đòi hỏi môi trường phải có thành phần
dinh dưỡng cao. Ngoài nguồn cơ chất là carbohydrate, để sinh trưởng và phát triển
bình thường thì trong môi trường nuôi cấy cần có tương đối đầy đủ các acid amin, các
hợp chất chứa nitro, một số vitamin B 1 , B 2 , B 6 , PP,… (Lương Đức Phẩm, 2000).
2.3.2 Phân loại vi khuẩn lactic
Theo Axelsson (2004), các vi khuẩn lactic thường phân loại dựa trên hình dáng

tế bào và nhìn chung vi khuẩn lactic chia thành hai nhóm:
-

Tế bào hình que: Carnobacterium và Lactobacterium.

-

Tế bào hình tròn: Aerococcus, Enterococccus, Lactococcus, Vangococcus,
Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus và
Weissella.

2.3.3 Vai trò của vi khuẩn lactic đối với sức khỏe con người
Theo Luckey (1977), tổng số vi sinh vật trên cơ thể con người khoảng
1013 - 1014 tế bào và con số này lớn hơn tổng số tế bào của cơ thể 10 lần. Trên cơ thể
con người, nơi tập trung nhiều vi sinh vật nhất là đường tiêu hóa, đường sinh sản và da
(Mikelsaar và ctv, 2004). Cũng theo tác giả này, vi sinh vật trên người bao gồm rất
nhiều nhóm và chủng khác nhau, có khoảng 500 chủng trong đó có Lactobacillus. Các
Lactobaccillus tìm thấy trong hệ thống tiêu hóa, âm đạo, trên da, mũi, kết mạc, tai, sữa
mẹ và tinh trùng.
Lactobacillus đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người. Chúng liên
quan đến việc tạo thành rào cản vi khuẩn, chống lại các vi khuẩn gây bệnh tiềm ẩn và
đặc biệt là các bệnh liên quan tới nhiễm trùng đường tiêu hóa (Mikelsaar và ctv, 2004).
Ngoài ra, chúng còn có tác dụng giúp cơ thể vật chủ chống dị ứng, chống oxi hóa và
giảm cholesterol (Lichtenstein và Goldin, 2004).
Các thí nghiệm cho thấy vi khuẩn lactic có hiệu quả chống đột biến và được
ứng dụng trong phòng chống ung thư đại tràng. Điều này có thể là do khả năng gắn kết
với hetrocylic amin – chất gây ung thư hình thành trong các sản phẩm thịt nấu chín
(Wollowski và ctv, 2001). Thử nghiệm trên người cho thấy rằng vi khuẩn lactic cũng
có khả năng chống ung thư bằng cách giảm hoạt động của enzyme β-glucuronidase
(Hosoda, 1996).

7


Một vài thử nghiệm lâm sàng cho thấy khi tiêu thụ sữa lên men với một số
chủng vi khuẩn lactic khác nhau có thể giảm huyết áp. Người ta cho rằng điều này là
do chất ức chế ACE sinh ra trong quá trình lên men (Sanders, 2000).
Vi khuẩn lactic được cho rằng có tác động có lợi đối với hệ thống miễn dịch
của cơ thể, chúng có khả năng c ải thiện chức năng miễn dịch và phòng chống nhiễm
trùng của cơ thể. Các vi khuẩn lactic chống lại những tác nhân gây bệnh bằng cách ức
chế cạnh tranh và có nhiều bằng chứng cho thấy chúng cải thiện chức năng miễn dịch
bằng cách gia tăng số lượng tế bào sản xuất IgA, tăng hoặc cải thiện thực bào cũng
như tăng tỷ lệ tế bào lympho T (Reid và ctv, 2003).
Một số tác giả cho rằng trong điều trị nhiễm khuẩn âm đạo như HIV, bệnh lậu ở
phụ nữ, sự gia tăng Lactobacillus trong âm đạo có thể giảm nguy cơ mắc các bệnh
trên. Tuy nhiên cần lưu ý rằng chỉ có một số chủng Lactobacillus có thể tồn tại ở âm
đạo (Reid và ctv, 2003).
2.3.4 Ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm
Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau mà các
chủng vi khuẩn lactic đã được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất và chế biến.
Khoảng 6000-1000 trước công nguyên, con người đã tạo ra các sản phẩm lên men như
bia, bánh mì, rượu, phô mai, bơ, yaourt,…
 Trong ngành công nghệ thực phẩm
 Chế biến các sản phẩm từ sữa như bơ, yaourt, phô mai,... nhờ các chủng vi
khuẩn lactic như Lb. bulgaricus, Streptococcus thermophillus, Lb.
acidophilus, Lb. casei,… (Vương Thị Việt Hoa, 2006).
 Muối chua rau quả không những nhằm mục đích bảo quản rau quả mà còn
tăng giá trị dinh dưỡng và cảm quan nhờ quá trình lên men của các vi khuẩn
như Leuconostoc mesenteroides, Lb. brevis, Lb. plantarum và Pediococcus
pentosaceus (Vương Thị Việt Hoa, 2006).
 Sản xuất acid lactic và muối lactate. Tùy vào nguyên liệu của quá trình sản

xuất acid lactic và muối lactate khác nhau mà người ta chọn các chủng vi
khuẩn khác nhau. Một số chủng vi khuẩn thường sử dụng như Lb.
delbrueckii, Lb. delbrueckii subsp bulgaricus và Lb. plantarum (Vương Thị
Việt Hoa, 2006).
8


 Trong các lĩnh vực khác
 Ứng dụng trong y học.
 Ứng dụng trong ngành công nghệ vật liệu.
 Ứng dụng trong ngành mỹ phẩm.
 Ứng dụng trong sản xuất chế phẩm làm thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản.
Ngoài những ứng dụng trên, vi khuẩn lactic ngày được quan tâm nhờ vào khả
năng sinh bacteriocin. Đây là chất kháng khuẩn có bản chất sinh học nên đem lại cho
con người nhiều sự kỳ vọng trong tương lai.
2.4 Bacteriocin
2.4.1 Khái niệm
Colicin là bacteriocin do Escherichia coli sinh ra, được khám phá lần đầu tiên
bởi Gratia vào năm 1925. Dựa vào các đặc điểm của colicin, ban đầu bacteriocin được
xác định là một protein kháng khuẩn, có phổ kháng khuẩn rất hẹp, được hấp thụ vào
các receptor trên màng tế bào xác định (Jacob và ctv, 1953; trích bởi Hoover và Chen,
2005). Sau đó, việc khám phá ra bacteriocin của vi khuẩn Gram dương đã mở rộng
khái niệm bacteriocin. Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương không có các receptor
trên màng tế bào mục tiêu, có khối lượng phân tử nhỏ hơn colicin, cơ chế hoạt động
khác nhau, có phổ kháng khuẩn rộng hơn (Jack, 1995; Jame, 1991; Riley, 1998).
Bacteriocin của LAB là phân tử tích điện dương, kỵ nước hoặc lưỡng cực, cấu tạo từ
20 - 60 acid amin (Nes và Holo, 2000).
Theo De Vugst và Vandamme (1994), bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có
bản chất là protein và hoạt động của bacteriocin cho thấy khả năng chống lại một số
chủng có quan hệ gần với chủng sản xuất ra nó (trích bởi Ogunbanwa và ctv, 2003).

Theo Ouwehand và Vesterlund (2004), bacteriocin có quan hệ với các antibiotic
nhưng nó khác antibiotic ở một vài đặc điểm sau:
-

Bacteriocin do ribosome tổng hợp

-

Tế bào chủ miễn dịch với bacteriocin do chúng sinh ra.

-

Cách thức tác động khác với antibiotic.

-

Chúng có phổ kháng khuẩn hẹp, thông thường chỉ có tác dụng kháng lại các
vi sinh vật có quan hệ gần với chủng vi khuẩn sinh ra chúng.
9


2.4.2 Phân loại
Thông thường bacteriocin của vi khuẩn Gram dương được phân thành 3 nhóm
(Ouwehand và Vesterlund, 2004):
2.4.2.1Nhóm I (Lantibiotic)
Lantibiotic là nhóm bacteriocin có khối lượng phân tử nhỏ (< 5 kDa), chúng
thường chứa các acid amin ít tìm thấy trong tự nhiên như lantibionine, β methyllantione và một số các acid amin được khử hydro trong thành phần

(Ouwehand và

Vesterlund, 2004). Theo Hoover và Chen (2005), dựa vào khả năng kháng khuẩn và
cấu trúc hóa học, nhóm lantibiotic được chia ra thành 2 nhóm nhỏ: lantibiotic A và
lantibiotic B.
-

Nhóm lantiobitic A: gồm các peptide thuôn dài, tích điện dương. Một vài
bacteriocin đại diện cho nhóm lantiobitic A như nisin, lactocin S, lacticin
481,…

-

Nhóm lantiobitic B: gồm các peptide hình cầu nhỏ hơn, tích điện âm hoặc
không tích điện. Một vài bacteriocin đại diện cho nhóm lantiobitic B như
mersacidin, cinnamycin, ancovenin, duramycin, actagardine,…

2.4.2.2 Nhóm II
Đây là nhóm bacteriocin lớn nhất, nhóm này bao gồm các bacteriocin có khối
lượng phân tử nhỏ (< 10 kDa), thông thường nhóm II ổn định nhiệt, không chứa
lantionine và có peptide hoạt động màng. Có thể nhóm này hoạt động thông qua các
phân tử receptor trên màng tế bào mục tiêu. Tuy nhiên điều này cần được làm rõ thêm
(Ouwehand và Vesterlund, 2004). Nhóm II được chia thành 3 nhóm nhỏ là:
-

Nhóm IIa bao gồm các peptide giống pediocin, chúng có đều có dãy các
acid amin sau –Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys. Nhóm này thu hút được
nhiều sự chú ý nhờ khả năng kháng lại Listeria (Ennahar và ctv, 2000). Một
số bacteriocin nhóm IIa như pediocin PA – 1/AcH, sakacin A và P (Hoover
và Chen, 2005).

-

Nhóm IIb là nhóm bacteriocin cần có hai peptide cho hoạt động, hai peptide
này trình tự các acid amin khác nhau (Cleveland và ctv, 2001) như
lactococcin G và M, plantaricin A, S, EF và JK (Hoover và Chen, 2005).
10


-

Nhóm IIc là nhóm bacteriocin kích hoạt bởi thiol và nhân tố sec- điều tiết
hoạt động của bacteriocin (Ouwehand và Vesterlund, 2004) như acidocin B,
carnobacteriocin A, divergicin A, enterocin P và B (Hoover và Chen, 2005).

2.4.2.3 Nhóm III
Là nhóm bacteriocin có khối lượng phân tử lớn (> 30 kDa), không bền nhiệt.
nhóm này có thể có những enzyme ngoại bào chống lại các vi khuẩn có thể bắt chước
các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Một số bacteriocin thuộc nhóm III như
helveticin J và V-1829 (Hoover và Chen, 2005).
Ngoài ra, theo Klaenhammer (1993), bacteriocin còn có nhóm IV là những
bacteriocin phức tạp cần thiết có một nửa là carbohydrate hay lipid cho sự hoạt động
của chúng (trích bởi Hoover và Chen, 2005).
2.4.3 Cơ chế hoạt động
Hầu hết các bacteriocin của nhóm LAB tương tác với các lipid tích điện âm và
hình thành các lỗ trên màng cytoplasmic của vi khuẩn Gram dương. Độ dẫn thông và
tính bền của các lỗ này tạo ra bởi nhóm I có thể tăng thêm nhờ sự sắp xếp các phân tử
(lipid II, tiền chất peptidoglycan); trong khi đó, đối với nhóm II, các receptor trên
màng có mục tiêu hoạt động rõ ràng để xác định đặc tính. Nhóm I có thể tạo ra dạng lỗ
theo mô hình cái nêm và nhóm II có thể có chức năng tạo các lỗ bằng cách uốn cong
tạo dạng thùng chứa tròn hoặc theo cơ chế tấm lót, theo đó peptide định hướng song
song với bề mặt của màng và tiếp xúc vào cấu trúc màng (Abee, 1995; Moll và ctv,

1999; Venema và ctv, 1995; trích bởi Hoover và Chen, 2005).
Các bacteriocin thuộc nhóm I có cơ chế hoạt động giống như nisin. Nisin được
xem như một chất tẩy rửa tích điện dương hoạt động bề mặt, việc hấp thụ qua thành tế
bào là cần thiết cho bước phá vỡ màng tế bào, tiếp theo là sự ngừng hoạt động của
nhóm sulfhydryl. Bruno và ctv (1992) chỉ ra rằng nisin làm mất hoàn toàn động lực
proton cơ bản của Listeria monocytogenes Scott A. Các chủng khác của Li.
monocytogenes cũng nhạy cảm với nisin như vậy, nisin làm thay đổi pH và thế điện
năng màng của tế bào (trích bởi Hoover và Chen, 2005).
Theo Zajdel và ctv (1985), lactostrepcin, las 5 ức chế quá trình sinh tổng hợp
AND, ARN và protein. Đây có thể là kết quả của sự phá vỡ màng tế bào và thất thoát
các chất nội bào (trích bởi Hoover và Chen, 2005).
11


Có thể thay đổi tính nhạy cảm của tế bào vi khuẩn Gram (-) đối với bacteriocin
của một vài chủng Lb. plantarum bằng sự chuyển đổi chúng thành những tế bào trần.
Sự bất hoạt các vi khuẩn gây bệnh Gram âm bởi bacteriocin của vi khuẩn Gram dương
thông thường đòi hỏi phải sử dụng chất nắm bắt (chelating agent). Các chất nắm bắt
này giảm bớt sự cản trở của lipopolysacharide (LPS) ngoài màng tế bào (Andersson,
1986; Stevens và ctv, 1991; Shefet và ctv, 1995; Sanell và ctv, 1997; Helander và ctv,
1997; trích bởi Hoover và Chen, 2005).

Hình 2.2: Cơ chế hoạt động của bacteriocin nhóm I và nhóm II.
(nguồn: Cotter và ctv, 2005)
2.4.4 Lợi ích và hạn chế
2.4.4.1Lợi ích của bacteriocin
Ngày nay, các bacteriocin dần thay thế các chất bảo quản hóa học vì những ưu
điểm sau:

12

 Theo Cleveland và ctv (2001), tính độc của bacteriocin chưa được biết đến
còn đối với các antibiotic, sẽ gây ra tính độc nếu sử dụng ở liều lượng cao.
Bacteriocin được coi là một phụ gia thực phẩm an toàn (Gillor và ctv, 2005).
 Với bản chất là các peptide hay protein nên bacteriocin nhanh chóng bị thoái
biến bởi các tác nhân như enzyme, nhiệt độ,… Vì vậy, sẽ không ảnh hưởng
đến môi trường.
 Bacteriocin chỉ có tác dụng trên những chủng vi khuẩn gần nó cho nên các
bacteriocin không ảnh hưởng đến những chủng vi khuẩn có lợi.
 Có thể sử dụng kết hợp với các chất bảo quản sinh học khác nhằm đem lại
hiệu quả cao trong việc sử dụng như một chất kháng khuẩn (Jeevaratnam và
ctv, 2004).
2.4.4.2Hạn chế của bactericin
Mặc dù được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp nhưng bacteiocin
vẫn tồn tại những hạn chế như:
 Ít được biết đến như chất bảo quản hóa học.
 Có phổ kháng khuẩn hẹp nên chỉ có tác dụng đối với một số vi sinh vật.
 Bản chất của bacteriocin là protein nên bị thoái biến nhanh chóng bởi các
tác nhân như enzyme, nhiệt, UV,…
 Chi phí cao nếu sử dụng chế phẩm bacteriocin tinh khiết.

13


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
Đề tài được thực hiện từ ngày 03/05/2011 đến ngày 30/07/2011 tại phòng thí
nghiệm vi sinh, phòng hóa sinh và xưởng chế biến thịt cá thuộc khoa Công nghệ Thực

phẩm, trường Đại học Nông Lâm, tp. Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Nguyên liệu thí nghiệm
 Dựa trên sự nổi tiếng của thương hiệu trên các phương tiện truyền thông,
báo chí, internet chúng tôi đã chọn mua tré tại 3 cơ sở:
-

Tré Đông Ba (Huế).

-

Tré Bà Đệ (Đà Nẵng).

-

Tré Bình Định (đặt mua tại chợ Thủ Đức, tp. Hồ Chí Minh).

 Ba chủng gây bệnh chỉ thị:
-

Staphylococcus aureus spp. aureus CIP 20256.

-

E. coli ATCC 25922.

-

Salmonella indiana LMBA.

 Kháng sinh đối chứng: Ofloxacin 200 mg mua tại cửa hiệu thuốc tây.
3.2.2 Môi trường, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
3.2.2.1Môi trường và thuốc thử
 Môi trường MRD (Maximum Recovery Diluent) dùng để pha loãng mẫu.
 Môi trường canh và thạch MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) dùng để đếm,
phân lập, tăng sinh và giữ giống vi khuẩn lactic.
 Môi trường NB (Nutritive Broth, Difco) tăng sinh và giữ giống các chủng vi
khuẩn gây bệnh.
 Môi trường TSA (Tryptone Soy Agar, Difco) dùng để khảo sát khả năng
sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic phân lập.
14