ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG CÁ RÔ PHI ĐỎ ( Oreochromis spp ) TÍCH HỢP CHO CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG CÁ
RÔ PHI ĐỎ (Oreochromis spp) TÍCH HỢP CHO
CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG BẰNG
KỸ THUẬT MICROSATELLITE

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: ĐỖ BẢO TRÂM ANH

Niên khóa

: 2007 – 2011

Tháng 7 năm 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG CÁ

RÔ PHI ĐỎ (Oreochromis spp) TÍCH HỢP CHO
CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG BẰNG
KỸ THUẬT MICROSATELLITE

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. BÙI THỊ LIÊN HÀ

ĐỖ BẢO TRÂM ANH

Tháng 7 năm 2011


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin trân trọng gửi lòng biết ơn đến ThS. Bùi Thị Liên Hà, người đã
tận tình hướng dẫn, định hướng đề tài và truyền đạt kinh nghiệm, cũng như luôn tạo
điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Nguyễn Điền, người đã hết lòng chỉ
bảo, nhận xét, sửa từng lỗi trong luận văn của tôi và cho tôi những lời khuyên quý giá
để hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Cử nhân Công nghệ sinh học Lê Chính đã tận
tình giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm.
Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến bố mẹ vì bố mẹ luôn là chỗ dựa vững
chắc về tinh thần và tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt.
Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn:


Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II



Ban Chủ nhiệm, các Thầy, Cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học

đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Đồng chân thành gửi lời cảm ơn đến các Anh, Chị trong Phòng sinh học thực
nghiệm, các bạn sinh viên Công nghệ sinh học khóa 2007 cùng làm đề tài tại Viện
nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài, nhất là những lúc khó khăn.
TP Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2011
Đỗ Bảo Trâm Anh

iii


TÓM TẮT
Cá rô phi nói chung và cá rô phi đỏ nói riêng hiện đang được nuôi rộng rãi trên
thế giới. Cá rô phi là đối tượng nuôi rất triển vọng, thị trường có nhu cầu tăng nhanh.
Nghề nuôi cá rô phi ở châu Á được mở rộng là kết quả của việc nâng cao kỹ thuật nuôi
trồng và chất lượng giống. Vì thế, chương trình chọn giống khoa học đóng một vai trò
quan trọng trong hệ thống nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế của
việc sản xuất.
Sáu microsatellite được sử dụng để khảo sát mức độ đa dạng di truyền của hai
dòng cá rô phi đỏ có nguồn gốc từ Ecuador và Malaysia nhằm phục vụ cho công tác
chọn giống. Sáu microsatellite sử dụng đều cho đa hình trên các mẫu phân tích, số
lượng allele dao động từ 4 đến 6 allele trên một locus. Các locus có số lượng allele lớn
nhất là UNH216, UNH231 và UNH159 với số allele là 6. Locus có số lượng allele ít
nhất là UNH172 với 4 allele. Số lượng allele tổng số của dòng 1 là 32 lớn hơn so số
lượng allele tổng số của dòng 2 là 29. Gía trị allele trung bình của dòng 1 là 5,3 lớn

hơn so với giá trị allele trung bình của dòng 2 là 4,8. Dị hợp tử phát hiện có ý nghĩa
của sáu locus từ 0,25 đến 0,87. Gía trị FIS dao động từ thấp nhất là 0,089 tại locus
OM05 và cao nhất là 0,417 tại locus UNH231. Sự thiếu hụt dị hợp tử có ý nghĩa được
phát hiện trên hầu hết các locus cho thấy một mức độ cận huyết đáng quan tâm trên hai
dòng cá nghiên cứu. Giá trị FST cho thấy không có nhiều sự khác biệt di truyền có ý
nghĩa giữa hai dòng cá.
Từ kết quả đề tài cho thấy nên tiến hành lai tạo hai dòng cá này với những quần
đàn cá rô phi đỏ khác nhằm làm tăng biến dị di truyền phục vụ cho công tác chọn
giống được tốt hơn và góp phần giữ nguồn gene đa dạng cho việc chọn lọc các tính
trạng khác trong tương lai.

iv


SUMMARY
Thesis title: Genetic diversity of red tilapia broodstock populations
(Oreochromis spp) using microsatellite markers.
The tilapia, specifically red tilapia, have become globally important aquatic
species produced in many countries worldwide. Many farmers prefer to cultivate red
tilapia since it is much sought after in certain markets and the demand for this fish
tends to increase in the future. Red tilapia aquaculture in Asia has been expanding as a
result of the improvement in production technology and in seed quality. Thus, a sound
breeding program is a necessary part of the total aquaculture production system to
improve the economic efficiency of production.
In this study, six microsatellite markers were applied to quantify the genetic
diversity within and between two red tilapia races originated from Ecuador and
Malaysia for use in subsequent breeding programs. Six microsatellite loci were found
to be polymorphic in all accessions. The number of alleles produced from each marker
ranged from four to six. The loci UNH216, UNH231 and UNH159 produced the
highest number of alleles at six. The lowest number of alleles was observed at locus

UNH172 with four alleles. The total number of alleles of first race was higher at a
value of thirty-two, than that of second race with a value of twenty-nine. The mean
number of alleles of first race was higher at a value of 5.3, than that of second race
with a value of 4.8. The observed heterozygosity of the six loci ranged from 0.25 to
0.87. FIS value ranged from 0.089 at locus OM05 to 0.417 at locus UNH231. A
statistically significant heterozygosity deficit was detected across almost all of loci that
showed the risk of inbreeding level within the two races. FST value showed no
significant genetic differentiation between the two red tilapia races.
Results suggest that it should make hybridizations between the two red tilapia
races and other populations to improve genetic variation for better breeding programs
and to manage and conserve diversity of genetic source for selection of other traits in
the future.

v


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. iii
TÓM TẮT ................................................................................................................... iv
SUMMARY ................................................................................................................. v
MỤC LỤC................................................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................... x
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... xi
Chương 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu.................................................................................................................. 1
1.3. Nội dung thực hiện................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 3

2.1. Giới thiệu tổng quan về cá rô phi đỏ (Red tilapia) .................................................. 3
2.1.1. Phân loại ............................................................................................................. 3
2.1.2. Đặc điểm sinh học của cá rô phi đỏ ..................................................................... 4
2.1.3. Giá trị kinh tế của cá rô phi đỏ ............................................................................ 5
2.1.4. Đặc điểm chính của 2 dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu trong đề tài ......................... 5
2.1.4.1. Dòng cá rô phi đỏ nhập từ Ecuador .................................................................. 5
2.1.4.2. Dòng cá rô phi đỏ nhập từ Malaysia ................................................................. 5
2.2. Nghiên cứu kỹ thuật............................................................................................... 6
2.2.1. Ly trích DNA...................................................................................................... 6
2.2.2 Định lượng DNA bằng cách đo mật độ quang ...................................................... 6
2.2.3 Giới thiệu về kỹ thuật PCR .................................................................................. 7
2.2.3.1. PCR là gì.......................................................................................................... 7
2.2.3.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR......................................................................... 8
2.3. Di truyền quần thể.................................................................................................. 9
2.3.1. Một số khái niệm ................................................................................................ 9
2.3.1.1. Quần thể........................................................................................................... 9
vi


2.3.1.2. Locus, gene và allele ........................................................................................ 9
2.3.1.3. Vốn gene (gene pool) ......................................................................................10
2.3.2. Sự đa dạng di truyền trong quần thể ...................................................................10
2.3.2.1. Đa dạng di truyền............................................................................................10
2.3.2.2 Nguyên nhân dẫn đến sự đa dạng di truyền trong quần thể ...............................10
2.4. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền trong quần thể.............................11
2.4.1. Các chỉ thị hình thái ...........................................................................................11
2.4.2. Các chỉ thị isozyme ............................................................................................11
2.4.3. Các chỉ thị DNA ................................................................................................12
2.4.4. Chỉ thị SSR ........................................................................................................13
2.4.4.1. Khái niệm microsatellite .................................................................................14

2.4.4.2. Cơ chế hình thành microsatellite .....................................................................14
2.4.4.3. Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng primer SSR .....................................15
2.4.4.4. Vai trò của microsatellite ................................................................................17
2.5. Ứng dụng microsatellite trong nghiên cứu đa dạng di truyền.................................18
2.5.1. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trong nước................................................18
2.5.2. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới ..............................................19
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...............................................................20
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .........................................................................20
3.2. Vật liệu .................................................................................................................20
3.2.1. Các dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu ......................................................................20
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm ...........................................................................................20
3.2.2.1. Primer ............................................................................................................20
3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong ly trích DNA ............................................................21
3.2.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR ..........................................................21
3.2.2.4. Các hóa chất dùng trong điện di agarose .........................................................22
3.2.3. Thiết bị thí nghiệm.............................................................................................22
3.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................22
3.3.1. Phương pháp ly trích DNA tổng số. ...................................................................22
3.3.2. Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR và khảo sát hoạt động primer................24
3.3.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp ................................................................................25
vii


3.3.2.2. Khảo sát nồng độ MgCl2 .................................................................................25
3.3.2.3. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR ........................................................25
3.3.3. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền 2 dòng cá rô phi đỏ............................26
3.3.3.1. Thực hiện phản ứng PCR trên hàng loạt mẫu ..................................................26
3.3.3.2. Phân tích đa dạng di truyền 2 dòng cá rô phi đỏ bằng phần mềm.....................27
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................28
4.1. Sản phẩm ly trích DNA.........................................................................................28

4.2 Khảo sát tính hoạt động của 6 cặp primer và tối ưu hóa phản ứng PCR..................29
4.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu .........................................................................29
4.2.2. Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu ..........................................................................31
4.2.3. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR ...........................................................32
4.3. Khảo sát đa dạng di truyền 2 dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu trong đề tài ................33
4.3.1. Kết quả PCR trên 60 mẫu dòng 1 và 53 mẫu dòng 2 ..........................................33
4.3.2. Đặc điểm di truyền 2 dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu trong đề tài .........................35
4.3.3. Đánh giá chỉ số cận huyết ..................................................................................39
4.3.4. Kiểm tra cân bằng Hardy - Weinberg .................................................................39
4.3.5. Đánh giá khác biệt di truyền giữa 2 dòng cá rô phi đỏ........................................40
4.4. Đánh giá tổng quát về tính đa dạng di truyền của 2 dòng cá rô phi đỏ ...................40
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................42
5.1. Kết luận ................................................................................................................42
5.2. Đề nghị .................................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................43
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µg: microgram
µl: microlite
µM: micromol/lite
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Ar: allelic richness
bp: base pair
DMSO: Dimethyl sulfoxide
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
GTE: Glucose-Tris-EDTA
He: expected heterozygosity (dị hợp tử mong đợi)
Ho: observed heterrozygosity (dị hợp tử phát hiện)
ISSR: Inter Simple Sequence Repeats
mM: milimolar (milimol/lite)
Na: number of alleles per locus (số lượng allele trên locus)
PCR: Polymerase chain reaction
RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
SDS: Sodium Dodecyl Sulphate
SSR: Single sequence repeat
STE: Sodium Chloride-Tris-EDTA
Ta : Annealing tenperature
TBE: Tris Borate EDTA
Tm: Melting temperature
VNTR: Variable Number Tamdem Repeat)

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 So sánh chi chí và lĩnh vực áp dụng của một số loại chỉ thị phân tử ............ 12
Bảng 3.1 Các primer microsatellite dùng trong thí nghiệm.......................................... 21
Bảng 3.2 Gradient nhiệt độ lai cho từng cặp microsatellite.......................................... 25
Bảng 3.3 Khảo sát nồng độ MgCl2 cho từng cặp microsatellite ................................... 25
Bảng 3.4 Thành phần buffer, dNTP, primer, DNA, Taq cho 1 phản ứng PCR............. 26
Bảng 3.5 Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp ....................... 26
Bảng 4.1 Nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho 6 cặp primer microsatellite .......................... 30
Bảng 4.2 Nồng độ MgCl2 tối ưu của 6 cặp primer microsatellite ................................. 32

Bảng 4.3 Thể tích H2O cho 1 phản ứng PCR............................................................... 32
Bảng 4.4 Tóm tắt kết quả khảo sát trên 10 mẫu cá rô phi đỏ........................................ 33
Bảng 4.5 Đặc điểm đa dạng di truyền của 2 dòng cá rô phi đỏ .................................... 36

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cá rô phi đỏ ................................................................................................... 3
Hình 2.2 Nguyên tắc của PCR là nhân bản DNA đích qua các chu kỳ nhiệt.................. 8
Hình 2.3 Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân ............................................................ 15
Hình 2.4 Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã ........................................................ 15
Hình 2.5 Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số ...................................................... 16
Hình 2.6 Vùng flanking ở 2 bên trình tự microsatellite ............................................... 16
Hình 3.1 Quy trình tách chiết DNA salt extraction...................................................... 23
Hình 4.1 Kết quả điện di 10 mẫu DNA ....................................................................... 28
Hình 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp lên các cặp primer ..................................... 30
Hình 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 lên cặp primer UNH159 ............................. 31
Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR khi sử dụng primer OM05 ........................... 34
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR khi sử dụng primer UNH159 ....................... 34
Hình 4.6 Đồ thị so sánh tần số allele tại các locus ở 2 dòng cá rô phi đỏ ..................... 38

xi


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Một chương trình chọn giống khoa học đóng một vai trò quan trọng trong hệ
thống nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế của việc sản xuất.
Cá rô phi nói chung và cá rô phi đỏ nói riêng hiện đang được nuôi rộng rãi trên

thế giới, trong đó sản lượng cá rô phi của Trung Quốc và Ðông Nam Á là lớn nhất.
Hiện nay, nhu cầu cá giống tăng cao, do đó các cơ sở bồi dưỡng cá bố mẹ để ép đẻ, tuy
nhiên tỷ lệ trứng non, chất lượng phôi giống kém, điều này góp phần làm giảm chất
lượng con giống (Phạm Anh Tuấn, 2004). Bên cạnh đó, xét về mặt di truyền, nguyên
nhân chủ yếu dẫn tới sụt giảm chất lượng giống là do giao phối cận huyết (Graham
Mair, 1997). Trong quần thể chọn lọc, giao phối cận huyết gây ra các tác động tiêu cực
như tăng đồng hợp tử, dẫn đến cơ hội gia tăng biểu hiện của gene lặn gây chết, suy
thoái cận huyết và giảm biến dị di truyền (Falconer, 1989). Các nghiên cứu cho thấy
giao phối cận huyết làm giảm tăng trưởng, khả năng tồn tại và số lượng cá thể dị
thường tăng (Pante, 1996). Những nguyên nhân nêu trên dẫn đến việc suy thoái chất
lượng con giống. Do đó, việc lựa chọn con giống tốt là yếu tố quan trọng hàng đầu
không những đảm bảo hiệu quả kinh tế của việc sản xuất mà góp phần giữ được nguồn
gene đa dạng cho việc chọn lọc các tính trạng khác trong tương lai.
Cá rô phi là đối tượng nuôi rất triển vọng, thị trường có nhu cầu tăng nhanh, do
đó cần nhanh chóng đầu tư phát triển. Ðể sản phẩm cá rô phi nuôi có tính cạnh tranh
cao, cần tiếp tục nâng cao chất lượng con giống, tạo phẩm giống có khả năng lớn
nhanh hơn và thích ứng với các vùng nước khác nhau, nhanh chóng xây dựng các công
nghệ sản xuất giống và nuôi cho sản phẩm sạch (Phạm Anh Tuấn, 2004).
Microsatellite là một công cụ đắc lực để đánh giá mức độ đa dạng di truyền, góp phần
thiết thực để phục vụ cho công tác chọn giống. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài này.
1.2.Yêu cầu
Xây dựng quy trình PCR ổn định.
1


Đánh giá chỉ số cận huyết và phân tích đa dạng di truyền của 2 dòng cá rô phi đỏ
thông qua kỹ thuật Microsatellite.
1.3. Nội dung thực hiện
Xây dựng phương pháp nhận diện 2 dòng cá rô phi đỏ cần chọn giống, đánh giá các

tham số di truyền khảo sát dựa vào các SSR marker.
Tối ưu hóa các phản ứng khuếch đại của các SSR marker.
Kiểm tra độ ổn định và tính chính xác của các marker này.
Phân tích đa dạng di truyền của 2 dòng cá rô phi cần chọn giống.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu tổng quan về cá rô phi đỏ (Red tilapia)
Cá diêu hồng hay cá điêu hồng, hoặc còn gọi là cá rô phi đỏ (Red Tilapia) là
một loài cá nước ngọt thuộc họ Cá rô phi (Cichlidae) có nguồn gốc hình thành từ lai
tạo. Thuật ngữ diêu hồng hay điêu hồng được xuất phát từ việc dịch từ tiếng Trung
Quốc.
Cá diêu hồng thực chất là “con lai” của cá rô phi đen, thịt của hai con cá này có
thành phần dinh dưỡng như nhau. Cá diêu hồng được người Trung Quốc phát hiện và
phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt là được nuôi khá phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu
Long và được nhiều người tiêu dùng ưa chuộng nên giá bán cao hơn cá rô phi đen.
Cá rô phi đỏ không phải là một loài cá rô phi, đó là tên gọi sử dụng thay cho
các biến thể cá rô phi lai tạo khác nhau có biến dị và màu đỏ. Những biến thể này là
kết quả của nhân giống chọn lọc liên tục.

Hình 2.1 Cá rô phi đỏ.

( />
2.1.1. Phân loại
Về mặt phân loại cá rô phi đỏ thuộc:
 Giới (regnum): Animalia
 Ngành (phylum): Chordata
 Lớp (class): Actinopterygii

 Liên bộ (superordo): Labroidei
3


 Bộ (ordo): Perciformes
 Phân bộ (subordo): Labroidei
 Họ (familia): Cichlidae
2.1.2. Đặc điểm sinh học của cá rô phi đỏ
Những đặc điểm sinh học cơ bản trong điều kiện thả nuôi được xác định như sau:
 Môi trường sống của cá rô phi đỏ
Cá rô phi đỏ là một loài cá nước ngọt, được hình thành qua quá trình chọn lọc
nhân tạo nên môi trường sống chủ yếu là nuôi nhốt. Cá thích hợp với nguồn nước có
độ pH: 6,2 – 7,5, khả năng chịu phèn kém nhưng có thể phát triển tốt ở vùng nước
nhiễm mặn nhẹ 5 – 12%, cá sống trong mọi tầng nước.
Cá thịt có thể nuôi trong ao hoặc lồng bè. Trong ao, sau một năm nuôi, cá đạt
200 – 500 g/con chỉ từ 7 – 8 tháng và tỷ lệ hao hụt thấp (Chhorn Lim, 2007).
 Tập tính ăn của cá rô phi đỏ
Đây là loài cá ăn tạp, thức ăn thiên về nguồn gốc thực vật như cám, bắp xay
nhỏ, bã đậu, bèo tấm, rau muống và các chất như mùn bã hữu cơ, tảo, ấu trùng, côn
trùng, do đó nguồn thức ăn cho cá rất đa dạng, bao gồm các loại cám thực phẩm, khoai
củ, ngũ cốc...
Nói chung cá rô phi đỏ có thể ăn nhiều loại thức ăn khác nhau, đây là đặc điểm
thuận lợi cho nuôi thâm canh. Ngoài ra có thể tận dụng các nguyên liệu phụ phẩm từ
các nhà máy chế biến thủy sản (như vỏ tôm, râu mực, đầu cá,....) hay các phế phẩm lò
giết mổ gia súc để chế biến thành các nguồn thức ăn phụ cung cấp cho cá nuôi. Mặt
khác có thể chọn loài ốc bươu vàng làm nguồn thức ăn tươi sống để cho cá ăn.
Trong ao nuôi hoặc bằng bè, cá ăn thức ăn tự chế từ các phụ phẩm nông nghiệp,
thức ăn viên (đạm từ 20 – 25%). Nhưng do thả cá nuôi trong vèo với mật độ cao, nên
cần thiết phải sử dụng thức ăn dạng viên để dễ dàng kiểm soát lượng thức ăn thừa và
hạn chế sự thất thoát thức ăn cũng như kiểm soát được chất lượng nước ao nuôi. Thức

ăn công nghiệp được sản xuất tại những hãng có uy tín thường có đầy đủ thành phần
cơ bản bao gồm các chất dinh dưỡng cần thiết như đạm, vitamin, lipid....
(Chhorn Lim, 2007).

4


 Sinh sản ở cá rô phi đỏ
Về sinh sản, cá rô phi đỏ là loài mắn đẻ, đẻ quanh năm, ấp trứng trong miệng.
Có thể ương cá con trong ao hoặc trong chậu, lồng. Khi ương trong ao cần bón phân
gây thức ăn tự nhiên để nuôi cá bột, còn khi ương trong lồng, chậu thì không cần bón
phân nhưng phải thường xuyên vệ sinh chập, lồng. Môi trường nuôi chủ yếu trong ao
hoặc lồng bè (Chhorn Lim, 2007).
2.1.3. Giá trị kinh tế của cá rô phi đỏ
Cá rô phi đỏ là một loại cá có chất lượng thịt thơm ngon, thịt cá rô phi đỏ có
màu trắng, trong sạch, các thớ thịt được cấu trúc chắc và đặc biệt là thịt không quá
nhiều xương. Đặc biệt là cá có hàm lượng mỡ cao nên ăn rất béo.
Cá rô phi đỏ hiện đang được thị trường ưa chuộng và là một trong những loại cá
được nuôi phổ biến nhất ở đồng bằng sông Cửu Long. Sau khi nuôi thử nghiệm và
phát triển đại trà thời gian gần đây ở vùng đồng bằng sông Cửu Long.
Ở Vĩnh Long có những năm sản lượng cá đạt khoảng 3200 tấn, tăng khoảng
400 tấn so với cùng kỳ và dự kiến sẽ tăng khi số lượng lồng bè có thể lên tới 150 bè
lớn, 200 bè trung, 150 bè nhỏ và 200 lồng. Số lồng, bè đang nuôi cá đã tăng lên đến
440 chiếc, trong đó bè nuôi cá điêu hồng lên tới 378 chiếc.
Tiền Giang hiện có gần 1600 lồng bè nuôi cá, chủ yếu là nuôi cá rô phi đỏ với
sản lượng cá thịt cung cấp cho thị trường hàng năm khoảng 18000 tấn, tập trung chủ
yếu ở Thành phố Mỹ Tho và huyện Châu Thành (Phạm Anh Tuấn, 2004).
2.1.4. Đặc điểm chính của 2 dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu trong đề tài
Cá Rô phi đỏ thu từ các gia đình Rô phi thuộc đề tài “Chọn giống cá Rô phi”
của Chủ nhiệm đề tài Trịnh Quốc Trọng - Trung tâm quốc gia giống thủy sản nước

ngọt Nam Bộ - Cái Bè - Tiền Giang.
2.1.4.1. Dòng cá rô phi đỏ nhập từ Ecuador
Dòng cá này đã có nguồn gốc (máu) Israel và có những ưu điểm như tăng
trưởng tốt, trọng lượng trung bình 320,9 g, tỉ lệ sống 80%.
2.1.4.2. Dòng cá rô phi đỏ nhập từ Malaysia
Dòng cá này có nguồn gốc từ 03 máu là (1) Malaysia, (2) Thái Lan và (3) Đài
Loan thuộc 34 gia đình có phả hệ rõ ràng, là thế hệ chọn giống F1. Dòng cá này có giá
trị rất lớn về mặt di truyền, vì đây là cá F1 của một chương trình chọn giống cá rô phi
5


đỏ tại Malaysia do WorldFish Center thực hiện từ 2008. Đồng thời dòng cá này có
tính biến dị di truyền cao, do quần đàn ban đầu được thành lập trên cơ sở của 03 dòng
cá có nguồn gốc từ Maylasia, Thái Lan và Đài Loan.
2.2. Nghiên cứu kỹ thuật
2.2.1. Ly trích DNA
Kỹ thuật để ly trích một lượng lớn DNA và phương pháp được ưa chuộng phụ
thuộc nhiều vào chất lượng và số lượng DNA cần thiết và loại mô tách chiết. Những
nhà nghiên cứu ly trích DNA để nghiên cứu kiểu gene, xử lý với protease K để phá vỡ
protein rồi kết tủa trong dung dịch muối và rửa giải bằng ethanol với lượng vừa đủ.
Một vài phòng thí nghiệm thêm một lượng nhỏ mô mẫu và protease K trực tiếp
vào phản ứng PCR để khuếch đại những đoạn mong muốn (Ken Overturf, 2009).
Những phương pháp khác sử dụng thuốc tẩy để phá vỡ tế bào và màng tế bào
nhằm giải phóng DNA, ly trích nhờ ly tâm và kết dính (pelletization) vật liệu tế bào
(Ken Overturf, 2009).
DNA có thể được ly trích từ vật liệu tế bào bằng việc cho dung dịch hỗn hợp
vào một cột và nó sẽ giữ lại DNA trong khi những vật liệu tế bào sẽ bị đẩy ra ngoài,
sau đó DNA được rửa giải trong dung dịch thích hợp. Đây là sự lựa chọn chính để ly
trích plasmid của vi khuẩn. Việc tách chiết theo quy trình là một phương pháp để ly
trích DNA, đặc biệt đối với những tế bào hoặc mô khó dung giải (Csaikl và ctv, 1998).

Phương pháp khác để phá vỡ tế bào có thể dùng để ly trích những thành phần
bên trong tế bào, bao gồm việc làm đồng nhất những mảnh vỡ tế bào hoặc thông qua
việc sử dụng những hạt nhỏ với mật độ dày đặc (thủy tinh hoặc kim loại) thêm vào
tube, rồi lắc mạnh tube trong máy lắc. Tuy nhiên, cần biết rằng những phương pháp
này có thể làm đứt gãy DNA có trọng lượng phân tử cao. Một vài cột có thể ly trích
đặc hiệu DNA có trọng lượng phân tử cao, hoặc có thể ly trích nhờ ly tâm theo
gradient trong một dung dịch như cesium chloride (Gross-Bellard và ctv, 2005). Điều
chỉnh những phương pháp này cũng có thể ly trích những đoạn được khuếch đại đặc
hiệu hoặc những đoạn cắt giới hạn từ gel agarose.
2.2.2. Định lượng DNA bằng cách đo mật độ quang
Sau khi ly trích DNA có thể tiến hành định lượng bằng cách đo mật độ quang
nhờ máy quang phổ kế.
6


Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong
mẫu sau khi ly trích dựa vào mức hấp thụ ánh sáng của chúng.
Sự hấp thụ ánh sáng này tuân theo định luật Beer - Lambert. Mỗi loại phân tử
có một đỉnh hấp thụ (tức là nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng
nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Đỉnh hấp thụ của acid nucleic là ở 260 nm
trong vùng tử ngoại. Sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa các photon với các
electron của vòng purine và pyrimidine. Sự hấp thụ ở đây được tính bằng đơn vị OD
(optical density). Một đơn vị OD tương ứng với
 50 µg/ml DNA sợi đôi.
 40 µg/ml DNA sợi đơn hay RNA.
 20 µg/ml oligonucleotide sợi đơn.
Từ giá trị OD đo được, người ta có thể suy ra được nồng độ acid nucleic của
dung dịch.
Bên cạnh đó, người ta còn ước tính tỉ lệ OD260/OD280 để ước lượng độ tinh sạch
của dung dịch acid nucleic. Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2, dung dịch acid

nucleic được xem là sạch. Nếu nhiễm protein hay phenol, tỉ lệ này sẽ thấp hơn nhiều
và khi đó việc định lượng acid nucleic bằng đo mật độ quang sẽ không còn chính xác.
Đối với một dung dịch DNA sợi đôi, sự hấp thu ở bước sóng 260 nm tăng lên khi phân
tử DNA bị biến tính tức là khi hai sợi đơn tách rời nhau. Người ta gọi đó là hiệu quả
siêu sắc (hyperchromic effect) (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997).
2.2.3. Giới thiệu về kỹ thuật PCR
2.2.3.1. PCR là gì
PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu
kỳ nhiệt. Thử nghiệm được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản
ứng (gọi là PCR mix) có thể tích vào khoảng 10 µl đến 50 µl với các thành phần chủ
yếu là:
 Enzyme polymerase chịu nhiệt, thường gọi là Taq polymerase, có hoạt tính tối đa
ở 72oC và bền được với nhiệt độ.
 4 loại deoxyribonucleotide (dNTP) là Adenine, Thymine, Guanine và Cytosine
(dATP, dTTP, dGTP và dCTP).
7


 DNA chứa các đoạn DNA sẽ được nhân bản trong ống phản ứng.
 Các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide có chiều dài
khoảng 20 - 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự
của 2 đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản.
 Ion Mg++ trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp.
 Dung dịch đêm Tris - KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng.
Khi ống nghiệm phản ứng này được cho vào buồng ủ chu kỳ nhiệt của máy luân
nhiệt (thermal cycler), mà chúng ta gọi là máy PCR, chương trình nhiệt độ trong máy
sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đổi theo chu kỳ, nhờ vậy mà
phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra. (Phạm Hùng Vân, 2002).
2.2.3.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR

Hình 2.2 Nguyên tắc của PCR là nhân bản DNA đích qua các chu kỳ nhiệt.
Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:
(1) Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro
của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn;
giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính.
8


(2) Kế đó nhiệt độ sẽ được hạ đến 55oC - 65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn
mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ này
được gọi là giai đoạn bắt cặp.
(3) Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của
enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên
đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản
sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì từ một DNA đích đã
nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.
2.3. Di truyền quần thể
2.3.1. Một số khái niệm
2.3.1.1. Quần thể
Thuật ngữ “quần thể” được dùng theo một số nghĩa khác nhau. Các nhà sinh
thái học có thể nói về quần thể sinh vật nổi của một hồ nước, ngụ ý là dùng chữ quần
thể để chỉ một tập hợp nhiều cá thể của những loài khác nhau. Khi nói về quần thể
người thì có nghĩa là nói về một tập hợp các cá thể của một loài. Đó là loài người.
Trong trường hợp này thuật ngữ dùng đúng. Hiện nay người ta giới hạn việc sử dụng
thuật ngữ quần thể trong sinh học, thường dùng để chỉ một quần thể địa phương, tức
một tập hợp những cá thể có thể giao phối với nhau, sống ở một địa phương nhất định.
Loài gồm nhiều quần thể địa phương, mỗi quần thể có sự tách biệt nào đó, nhưng đồng
thời có mối quan hệ qua lại với nhau (Phạm Thành Hổ, 2007).
Theo Yablokov (1986), quần thể là một nhóm các cá thể cùng loài có khả năng

giao phối tự do với nhau, chiếm cứ một khu phân bố xác định và trải qua một khoảng
thời gian tiến hoá lâu dài để hình thành nên một hệ thống di truyền độc lập và một ổ
sinh thái riêng.
Nói ngắn gọn, quần thể là một nhóm sinh vật có khả năng giao phối qua lại và
cùng chia sẻ một vốn gene chung (Ridley, 1993). Nó còn được gọi là quần thể Mendel,
mà tập hợp lớn nhất là loài (species). Tác dụng tương hỗ giữa ba nhân tố tiến hóa: di
truyền, biến dị và chọn lọc ảnh hưởng lên sự hình thành quần thể.
2.3.1.2. Locus, gene và allele
Locus (số nhiều là loci) là vị trí mang gene, nằm dọc trên nhiễm sắc thể.
9


Gene là một trình tự các nucleotide đảm nhận nhiệm vụ là vật liệu di truyền cho
quá trình phiên mã và dịch mã thành một protein hoàn chỉnh quy định nên tính trạng.
Allele là các trạng thái khác nhau của gene.
2.3.1.3. Vốn gene (gene pool)
Vốn gene là tập hợp toàn bộ các allele ở tất cả các gene của mọi cá thể trong
quần thể tại một thời điểm xác định.
Vốn gene này được sử dụng chung cho các cá thể trong quần thể. Mỗi quần thể
đặc trưng bằng một vốn gene nhất định và nó được mô tả bằng tần số các allele ở từng
locus.
2.3.2. Sự đa dạng di truyền trong quần thể
2.3.2.1. Đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là tất cả các gen di truyền khác nhau của tất cả các cá thể
thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật. Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa
các loài khác nhau .
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gene giữa các cá thể trong cùng
một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gene có thể di truyền được trong
một quần thể hoặc giữa các quần thể.
Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong

một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng di truyền
chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của acid
nucleic, tạo thành mã di truyền (Griffiths, 2000).
2.3.2.2. Nguyên nhân dẫn đến sự đa dạng di truyền trong quần thể
Trong quần thể tự nhiên, các cá thể có cùng kiểu hình giống nhau nhưng kiểu
gen thì rất đa dạng. Sự đa dạng gen chủ yếu do đột biến tạo gen dị hợp tử và quá trình
giao phối tái tổ hợp. Tái tổ hợp là nhân tố biến dị quan trọng nhất và đột biến xảy ra
ngẫu nhiên.
Các đột biến về cấu trúc nhiễm sắc thể (NST) và sự thay đổi về số lượng NST
có ý nghĩa quan trọng trong sự hình thành loài. Đồng thời sự cách ly địa lý ngăn cản sự
giao phối tự do, tạo điều kiện hình thành quần thể mới phân hóa thành loài mới. Nhưng
những đột biến gen lặn thì không bị mất đi, chúng là nguồn dự trữ biến dị quần thể.
10


Hệ thống gen mỗi loài mang tính đặc trưng, tồn tại những gen có nhiều trạng
thái biểu hiện tức locus có nhiều trạng thái allele (từ 2 trở lên). Bộ gen của mỗi cá thể
góp phần vào hệ thống gen của loài. Các trạng thái thể hiện di truyền khác nhau của
một locus chỉ có thể được phát hiện khi quan sát trên nhiều cá thể trong quần thể.
Sự đa dạng di truyền của quần thể liên quan tới các trạng thái thể hiện di truyền
ổn định của locus và sự đa dạng này xuất hiện khi có đột biến gene (Griffiths, 2000).
2.4. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể
Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các
giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính
trạng bên ngoài. Người ta thường tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra được sự khác
nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị (Bùi Chí
Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.4.1. Các chỉ thị hình thái
Sự đa dạng di truyền có thể phát hiện dựa vào các biểu hiện hình thái. Gen thể
hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người

ta có thể đo đếm được – gene đó có thể xem như chỉ thị. Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái
hiện diện trong tự nhiên cũng rất ít, không thỏa mãn yêu cầu của nhiều chương trình
chọn giống và chỉ có quy mô hình thái (cơ quan) hoặc ở giai đoạn phát triển đặc biệt
của cá thể.
Sự thể hiện các chỉ thị hình thái bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường, điều
này làm cho chỉ thị hình thái kém thu hút trong cải tiến giống cây trồng (Nguyễn Đức
Thành, 2004).
2.4.2. Các chỉ thị isozyme
Isozyme là các dạng protein có cùng đặc tính xúc tác nhưng lại có sự khác nhau
khi chạy điện di. Kỹ thuật điện di được dùng để đo sự di động của phân tử protein
trong một khoảng thời gian nhất định, trên điện trường đồng nhất. Các protein đột biến
khác nhau về điện tích sẽ có sự di chuyển khác nhau nên có thể phát hiện sự khác nhau
giữa chúng bằng kỹ thuật điện di. Nhờ kỹ thuật điện di này, cùng lúc có thể phân tích
nhiều cá thể của một quần thể nào đó để đánh giá chính xác số phần trăm dị hợp tử của
một gen nhất định, đánh giá sự đa dạng giữa các nhóm sinh vật theo các protein được
11


quan sát. Với sự phát triển của kỹ thuật điện di, người ta có thể chẩn đoán được một
phần nào sự biến dị ở mức độ DNA.
Tuy việc áp dụng chỉ thị isozyme đã làm thay đổi việc nghiên cứu đa dạng di
truyền theo chiều hướng thuận lợi hơn do đây là chỉ thị rẻ tiền, nhanh và vật liệu có thể
sử dụng trong một thời gian dài nhưng số chỉ thị quá ít, không thỏa mãn cho nhu cầu
nghiên cứu.
2.4.3. Các chỉ thị DNA
Chỉ thị DNA là một đoạn DNA sử dụng để đánh dấu hay truy theo một vị trí
đặc biệt (locus) trên nhiễm sắc thể (NST). Những chỉ thị DNA mang đầy đủ các đặc
tính của một chỉ thị di truyền điển hình. Dựa trên chuỗi phản ứng polymerase gọi là
PCR (polymerase chain reaction) và trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA, chỉ thị
DNA được chia làm 2 nhóm:

(1) Nhóm chỉ thị DNA dựa trên PCR gồm: AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeats), RAPD (Randomly Amplified
Polymorphic DNA), ISSR (Inter Simple Sequence Repeats).
(2) Nhóm chỉ thị DNA dựa trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai giữa DNA gồm
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), minisatellite (Semagn và ctv,
2006).
Chỉ thị DNA có ưu điểm hơn chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme do chỉ thị này
có thể đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền, có nhiều chỉ thị trong quần thể, không
ảnh hưởng của môi trường, nhanh, kỹ thuật đơn giản dễ ứng dụng, có thể áp dụng với
nhiều đối tượng, cần một lượng nguyên liệu tối thiểu, có vị trí trên bản đồ di truyền,
cho lượng thông tin cao, đáng tin cậy (Santoni và ctv, 2000).
Bảng 2.1 So sánh chi phí và lĩnh vực áp dụng của một số loại chỉ thị phân tử
Chỉ tiêu so sánh
(1)
Chi phí phân tích (trên 1 locus
phát hiện)

Các loại chỉ thị
RFLP

SSR

AFLP

ISSR

RAPD

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

Cao

Thấp Thấp

Thấp

Thấp

12


Bảng 2.1 (tt) So sánh chi phí và lĩnh vực áp dụng của một số loại chỉ thị phân tử
(1)
Chi phí và mức độ khó khăn
để tiến hành
Mức đa hình
Khả năng lặp lại
Cấu trúc và sự khác biệt di
truyền

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

Cao

Cao

Thấp

Thấp

Thấp

Cao

Cao

Trung

Cao

bình

Rất
cao

Cao

Cao

Cao

+++

+++

Trung bình Trung
đến cao

bình

+

+

+

Phân loại và phân vùng địa lý +++
Định danh giống

++

+++

+++

+++

++

Tìm kiếm cha mẹ

+

+++

+

+

+

Chế độ sinh sản

++

+++

+

+

Luồng gen giữa các loài

++

++

+

Lập bản đồ và phát hiện QTL

+++

+++

+++

++

+

+++

++

+

Dòng hóa điểm
Lập bản đồ so sánh

++

+

+: có thể sử dụng; ++: phù hợp để áp dụng; +++: rất hiệu quả (Santoni và ctv, 2000;
Semagn và ctv, 2006).

2.4.4. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat_Microsatellite) hay VNTR (Variable
Number Tamdem Repeat)
Trên nhiễm sắc thể của tế bào eukaryote có hai vùng chứa cấu trúc đặc biệt
quan trọng gọi là vùng “tổ chức nhân”: vùng tâm động (centromere) và đầu mút nhiễm
sắc thể (telomere). Tâm động là vị trí để nhiễm sắc thể đính vào thoi vô sắc trong suốt
quá trình phân chia tế bào. Vùng đầu mút tâm động chỉ là vùng kết thúc của một
13


nhiễm sắc thể hay phân tử DNA mà nó cũng đảm nhận một chức năng đặc biệt. Cả hai
vùng kể trên đều được mang một trình tự lặp lại liên tục VNTR (Variable Number
Tamdem Repeat), rất ít biến động giữa các loài. Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy,
cùng với protein cấu trúc kết gắn ở vùng telomere, những trình tự lặp lại này ngăn
chặn sự bắt cặp giữa các đầu mút của nhiễm sắc thể với nhau (Winter và ctv, 2000).
Ngoài ra, rải rác trên bộ gene của eukaryote cũng có những vùng VNTR còn
gọi là satellile. VNTR có hai loại minisatellite và microsatellite. Những vùng VNTR
không quy định gene hình thành tính trạng nên số lượng các đoạn lặp lại trên mỗi loài
hay mỗi cá thể trong loài độ biến động rất cao, không chịu áp lực của chọn lọc tự
nhiên và sự kiểm soát của môi trường. Mặc dù vậy, trình tự ở hai đầu của các vùng
VNTR vẫn được bảo toàn và tương đối đặc hiệu theo loài (Bùi Thị Liên Hà, 2004).
2.4.4.1. Khái niệm microsatellite
Là các đoạn DNA mang các trình tự ngắn (short DNA sequence motif) được lặp
lại nhiều lần. Chúng phân bố rộng khắp trong bộ gen của sinh vật nhân chuẩn
(eukaryotic) nên rất có giá trị trong nghiên cứu di truyền, đặc biệt giúp thiết lập các
bản đồ di truyền có độ phân giải cao (Semagn và ctv, 2006). Đơn vị trình tự của
Microsatellite từ 1 – 6 bp và số lần lặp lại không vượt quá 70 lần tại mỗi điểm VNTR.
Kỹ thuật SSR dựa trên sự khuếch đại các trình tự microsatellite bằng các primer

đặc hiệu có khả năng bổ sung vào hai đầu locus microsatellite. Các primer được thiết
kế dựa vào trình tự các vùng có chứa các microsatellite. Theo phương pháp này, các
nhà nghiên cứu phải thực hiện một ngân hàng gen và kiểm tra kỹ càng để tìm ra những
dòng chứa các motif microsatellite. Những dòng này sẽ được xác định thứ tự chuỗi, từ
đó những đoạn mồi sẽ được xác định và những điều kiện về khuếch đại và phát hiện sự
đa hình sẽ được tiến hành. Sản phẩm cuối cùng của phương pháp SSR là các đoạn
DNA có kích thước chênh lệch nhau rất nhỏ được phân tách bằng kỹ thuật điện di.
2.4.4.2. Cơ chế hình thành microsatellite
Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy
đủ. Tuy nhiên di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình
thành microsatellite là do 2 quá trình sau:
(1) Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing - over
during meiosis)
14