KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG Bacillus flexus, Bacillus koreensis, Bacillus pumilus CÓ KHẢ NĂNG DÙNG LÀM CHẾ PHẨM VI SINH

 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG Bacillus
flexus, Bacillus koreensis, Bacillus pumilus CÓ KHẢ NĂNG DÙNG
LÀM CHẾ PHẨM VI SINH

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: LÊ VĂN CHÁNH QUY
Niên khóa: 2007 – 2011

1 
 


 

Tháng 7 / 2011

LỜI CẢM ƠN 
Với lòng biết ơn sâu sắc
Chân thành cảm ơn thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Đại học Nông Lâm Tp Hồ
Chí Minh đã tạo điều kiện học tập và truyền đạt kinh nghiệm thật tốt trong suốt 4 năm đại
học.
Cảm ơn ThS. Võ Minh Sơn đã tận tình hướng dẫn cho tôi hoàn thiện luận văn.
Cảm ơn chị Văn Thị Thúy và anh chị Phòng sinh học thực nghiệm – Viện nghiên cứu

nuôi trồng thủy sản II đã chỉ bảo nhiệt tình trong quá trình thực hiện luận văn.
Xin cám ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ trong suốt thời gian qua.
Lê Văn Chánh Quy

2 
 


 

TÓM TẮT 
Ngành nuôi trồng thủy sản ngày càng phát triển mạnh. Tuy nhiên việc sử dụng
chất kháng khuẩn để phòng bệnh như kháng sinh và hóa chất đã gây tình trạng vi khuẩn
kháng kháng sinh gây bệnh ngày càng gia tăng (Balcaza và ctv, 2006). Do đó việc sử
dụng chế phẩm vi sinh thay thế kháng sinh và hóa chất đã trở thành bước tiếp cận đầy
hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản (Jean và ctv, 2003). Các chủng Bacillus có khả năng
sản sinh các sản phẩm thứ cấp như: chất kháng khuẩn, chất diệt côn trùng, enzyme ngoại
bào; kích thích hệ thống miễn dịch, kháng virus (Wang và ctv, 2008; Ciprandi và ctv,
1986).
Những thử nghiệm định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào, khảo sát nhiệt độ,
pH, nồng độ muối và thử nghiệm khả năng chịu đựng pH dạ dày, muối mật, khả năng
phân hủy tín hiệu quorum sensing và khả năng tương thích của các chủng vi khuẩn
Bacillus pumilus, Bacillus koreensis, Bacillus flexus đã được thực hiện. Kết quả cho thấy
tất cả các chủng Bacillus sp. thử nghiệm đều có khả năng sinh enzyme ngoại bào; chủng
Bacillus koreensis thích nghi với khoảng nhiệt độ từ 30 - 400C, chủng Bacillus pumilus
chỉ thích nghi ở 300C, chủng Bacillus flexus thích nghi tốt nhất ở 350C; chủng Bacillus
flexus và Bacillus pumilus thích nghi tốt ở pH7 và pH8, chủng Bacillus koreensis thích
nghi tốt ở pH6 và pH7; chủng Bacillus pumilus thích nghi với nồng độ muối 1%, chủng
Bacillus flexus thích nghi tốt với nồng độ muối 1%, chủng Bacillus koreensis thích nghi
với nồng độ muối 0-1%; với thử nghiệm khả năng chịu đựng pH dạ dày thì chủng

Bacillus pumilus và Bacillus koreensis chịu đựng tốt ở pH2 và pH3, còn Bacillus flexus
chỉ chịu đựng được ở pH3; thử nghiệm khả năng chịu đựng muối mật thì nhìn chung cả 3
chủng Bacillus sp. đều chịu đựng tốt và còn có khả năng tăng trưởng ở nồng độ muối
mật 0,5% ở thời điểm 6 giờ, 1 - 2% ở thời điểm 2 giờ, ở thời điểm sau 9 giờ 3 chủng bắt
đầu phân hủy HHL mạnh thể hiện qua tốc độ phân hủy ở thời điểm 24 giờ từ 0,12- 0,18
ppm/ giờ, các chủng thử nghiệm không đối kháng nhau nên có thể trộn chung sử dụng
làm chế phẩm vi sinh.
3 
 


 

4 
 


 

SUMMARY
"Surveying biological characteristics of strains of Bacillus flexus, Bacillus
koreensis, Bacillus pumilus that are capable to use as probiotic" in aquaculture.
Aquaculture industry is growing strongly. However, the use of antimicrobial compounds
to prevent diseases such as antibiotics and chemicals have caused the situation of
antibiotic-resistant bacterial pathogens is increasing (Balcaza et al, 2006). Therefore the
use of microbial preparations to replace antibiotics and chemicals have become a
promising approach in aquaculture (Jean et al, 2003). The Bacillus strains can produce
secondary products such as antibacterial, insecticides, extracellular enzyme; stimulate the
immune system, anti-virus (Wang et al, 2008; Ciprandi et al, 1986).
The extracellular enzymes production, temperature, pH, salt concentration and

gastric pH, bile salts endurance, the breakdown of quorum sensing signal and
compatibility of the Bacillus pumilus, Bacillus koreensis, Bacillus flexus were tested. The
results showed that all strains of Bacillus sp. tested were capable of generating
extracellular enzymes; Bacillus koreensis adapted temperatures between 30 - 400C,
Bacillus pumilus only adapted at 300C, Bacillus flexus adapted at 350C well; Bacillus
pumilus and Bacillus flexus adapted at pH7 and pH8, Bacillus koreensis well-adapted at
pH6 and pH7; Bacillus pumilus adapted to 1% salt concentration, Bacillus flexus well adapted to the 1% salt concentration , strain Bacillus koreensis adapted to salinity 0 - 1%
salt concentration, the test of gastric pH endurance, the strain Bacillus pumilus and
Bacillus koreensis well - beared in pH 2 and pH 3, Bacillus flexus just stand at pH 3; test
of endurance bile salts endurance are generally all three strains of Bacillus sp. endure
well and has the ability to grow at 0,5% concentration of bile salts in the time of 6 hours,
1 - 2% concentration of bile salts at the time of 2 hours; in the time after 9 hours, three
strains start to disintegrate HHL expressed decomposition rates at the time of 24 hours
from 0,12 to 0,18 ppm/h. The strains could be used as a mixed microbial preparation. 

5 
 


 

Keywords: probiotics, pH, temperate, salt, HHL, bile, Bacillus pumilus, Bacillus flexus,
Bacillus koreensis.

iii

6 
 

 

MỤC LỤC 
Trang
Lời cảm ơn ....................................................................................................................... i
Tóm tắt ............................................................................................................................ ii
Summary ........................................................................................................................iii
Mục lục .......................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vii
Danh sách các bảng .....................................................................................................viii
Danh sách các hình ........................................................................................................ ix
Chương 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 2
1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 13
1.2. Yêu cầu của đề tài .............................................................................................. 15
1.3. Nội dung thực hiện ............................................................................................. 15
1.3.1. Phương pháp định tính các enzyme ngoại bào ............................................ 15
1.3.2. Thử nghiệm khả năng chịu muối ................................................................. 15
1.3.3. Thử nghiệm ảnh hưởng của pH ................................................................... 15
1.3.4. Thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................... 15
1.3.5. Thử nghiệm khả năng chịu đựng pH dạ dày (pH 2, pH 3) .......................... 15
1.3.6. Thử nghiệm khả năng chịu đựng muối mật (0,5%; 1%; 2%) ...................... 16
1.3.7. Thử nghiệm khả năng phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing.............. 16
1.3.8. Khảo sát khả năng tương thích giữa 3 chủng thí nghiệm ............................ 16
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 17
2.1. Tổng quan về probiotic - chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản .............. 17
2.1.1. Định nghĩa probiotic .................................................................................... 17
2.1.2. Đặc điểm chung của probiotic ..................................................................... 17
2.1.3. Các cơ chế tác động của probiotic ............................................................... 18
2.1.4. Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản........................................... 20
2.1.5. Tình hình nghiên cứu probiotic ứng dụng trong thủy sản ........................... 20

7 
 


 

2.2. Tổng quan vi khuẩn Bacillus.............................................................................. 21
2.2.1. Đặc điểm chung của chi Bacillus................................................................. 21
2.2.2. Dinh dưỡng và sinh trưởng .......................................................................... 23
2.2.3. Quá trình tạo bào tử của Bacillus ................................................................ 23
2.2.4. Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản ....................................... 25
iv

2.3. Khái quát hệ thống quorum sensing ................................................................... 26
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 29
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 29
3.1.1. Thời gian tiến hành ...................................................................................... 29
3.1.2. Địa điểm tiến hành thí nghiệm..................................................................... 29
3.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 29
3.2.1. Nguồn vật liệu.............................................................................................. 29
3.2.2. Môi trường hóa chất..................................................................................... 29
3.2.3. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................... 30
3.3. Nội dung thử nghiệm ......................................................................................... 31
3.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 31
3.4.1. Phương pháp định tính các enzyme ngoại bào ............................................ 31
3.4.2. Khảo sát các đặc tính sinh lý ....................................................................... 33
3.4.3. Khảo sát khả năng phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing ................... 36
3.4.4.Khảo sát đặc tính tương thích giữa các chủng vi khuẩn Bacllus .................. 37
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 39
4.1.Kết quả ................................................................................................................ 39

4.1.1. Phương pháp định tính các enzyme ngoại bào .............................................. 39
4.1.2. Thử nghiệm ảnh hưởng của muối, pH, nhiệt độ .......................................... 41
4.1.2.1.Thử nghiệm ảnh hưởng của các nồng độ muối lên vi khuẩn..................... 41
4.1.2.2. Thử nghiệm ảnh hưởng của pH ................................................................ 42
4.1.2.3. Thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................ 43
4.1.3. Thử nghiệm khả năng chịu đựng pH dạ dày và muối mật........................... 44
8 
 


 

4.1.3.1 Thử nghiệm khả năng chịu đựng acid dạ dày ............................................ 44
4.1.3.2. Thử khả năng chịu đựng muối mật ........................................................... 46
4.1.4. Khảo sát khả năng phân hủy phân tử quorum sensing ................................ 49
4.1.5. Kết quả kiểm tra tương thích giữa các chủng vi khuẩn Bacillus sp ............ 52
4.2.Thảo luận ............................................................................................................. 52
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 56
5.1. Kết luận .............................................................................................................. 56
5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 56
v

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 57

9 
 


 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
Ký hiệu viết tắt

Nội dung

Ctv

công tác viên

EPA

eicosapentaenoic acid 

DHA

docosahexaenoic acid

PUFAs

polyunsaturated fatty acids

BAMPs

bacteria associated molecular patterns

UV

tia cực tím

μm

micromet

AHL

N-acyl homoserine lactone

HHL

N- hexanoyl- L- Homoserin lacton 

nm

nanomet

cfu

Colony forming unit 

v/p

vòng/phút

SE

standard error

10 
 

 

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng thử nghiệm ................ 23
Bảng 4.2 Tốc độ phân hủy phân tử HHL ở thời điểm 9h và 24h ........................... 32
Bảng 4.3 Kết quả khảo sát tương thích giữa ba chủng Bacillus. ........................... 33

11 
 


 

DANH SÁCH CÁC HÌNH  
Hình 2.1 Mặt cắt ngang của bào tử Bacillus .......................................................... 11 
Hình 2.2 Quá trình bẻ gãy phân tử AHL ................................................................ 13
Hình 3.1 Nội dung thử nghiệm ............................................................................... 16
Hình 4.1 Thử nghiệm khả năng sinh enzyme amylase ........................................... 23
Hình 4.2 Thử nghiệm khả năng sinh enzyme caseinase và gelatinase ................... 24
Hình 4.3 Thử nghiệm khả năng sinh enzyme lipase và cellulase........................... 24
Hình 4.4 Ảnh hưởng của các nồng độ muối lên tăng trưởng ................................ 25
Hình 4.5 Ảnh hưởng của pH lên tăng trưởng ........................................................ 27
Hình 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng ................................................ 28
Hình 4.7 Tỉ lệ sống khi ủ ở pH 2 và pH 3 .............................................................. 30
Hình 4.8 Tỉ lệ sống khi ủ trong môi trường chứa muối mật................................... 33
Hình 4.9 Mối tương quan giữa đường kính vòng violacein và Ln[HHL] .............. 34
Hình 4.10 Vòng sắc tố violacein ở các nồng độ HHL khác nhau .......................... 34
Hình 4.11 Tốc độ phân hủy HHL ở thời điểm 9 giờ và 24 giờ .............................. 35
 

12 
 


 

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nuôi trồng thủy sản là thế mạnh của nước ta, trong 10 năm gần đây ngành thủy
sản nói chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ. Theo
thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn, đến năm 2008, diện tích nuôi
trồng thủy sản được mở rộng lên 1 triệu ha, sản lượng đạt gần 2,45 triệu tấn và giá trị
xuất khẩu thủy sản đạt 4,5 tỉ đô la Mỹ. Tuy nhiên, sự phát triển mạnh mẽ trong nuôi
trồng thủy sản, nhất là thủy sản nước ngọt đã gây ô nhiễm môi trường nước ngày càng
cao. Do trong quá trình nuôi, chất thải trong ao nuôi được thải ra sông, kênh mương và
lượng cá càng lớn thì chất thải càng nhiều (Thông tấn xã Việt Nam, 2008).
Sử dụng chế phẩm vi sinh thay thế kháng sinh và hóa chất đã trở thành bước tiếp
cận đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản, việc nghiên cứu các chế phẩm sinh học để
phòng bệnh và cải thiện môi trường trong nuôi trồng thủy sản ngày càng phổ biến (Jean,
2003). Chế phẩm vi sinh được định nghĩa là những sinh vật sống được kiểm soát chặt
chẽ với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ (Fioramonti, 2003). Chế phẩm vi
sinh sử dụng trong nghiên cứu nuôi trồng thủy sản phải có các đặc tính: ngăn chặn các
chủng vi sinh vật gây bệnh thông qua việc sản sinh các hợp chất ức chế, cải thiện chất
lượng nước, kích thích đáp ứng miễn dịch của vật chủ và cải thiện khả năng thu nhận
chất dinh dưỡng của vật chủ thông qua việc sản sinh các enzyme tiêu hóa (Thompson và
ctv, 1999; Vershuere và ctv, 2000).
Trong lĩnh vực thủy sản, ứng dụng Bacillus như là probiotic đã và đang được mở
rộng một cách nhanh chóng (Hong và ctv, 2005) do Bacillus có khả năng tạo bào tử chịu
nhiệt, kháng lại điều kiện bất lợi của môi trường nên thuận lợi cho quá trình sản xuất, bảo

quản. Phần lớn các chủng bacillus không gây hại cho người và động vật, là chủng có giá
trị kinh tế cao. Ngoài ra, các chủng này còn có khả năng sản sinh các sản phẩm thứ cấp
như: chất kháng khuẩn, chất diệt côn trùng, enzyme ngoại bào; kích thích hệ thống miễn
dịch, kháng virut (Wang và ctv, 2008; Ciprandi và ctv, 1986). Đề tài: “Khảo sát đặc tính
13 
 


 

sinh học của các chủng Bacillus flexus, Bacillus Koreensis, Bacillus pumilus có khả năng
dùng làm chế phẩm vi sinh” đã được tiến hành.

14 
 


 

1.2. Yêu cầu của đề tài
Thực hiện những thử nghiệm định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào, khảo sát nhiệt
độ, pH, nồng độ muối và thử nghiệm khả năng chịu đựng pH dạ dày và muối mật của các
chủng vi khuẩn Bacillus pumilus, Bacillus koreensis, Bacillus flexus để có thể sản xuất
chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản.
1.3. Nội dung thực hiện
1.3.1. Phương pháp định tính các enzyme ngoại bào
Các enzyme thử nghiệm là: amylase, protease, cellulase, lipase.
Mục đích là xác định các chủng vi khuẩn thử nghiệm có khả năng sinh emzyme ngoại
bào giúp hỗ trợ tiêu hóa cho vật chủ và cải thiện môi trường sống của động vật nước
ngọt bằng cách phân hủy nhanh chóng thức ăn dư thừa.

1.3.2. Thử nghiệm khả năng chịu muối
Nồng độ muối thử nghiệm là 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%.
Mục đích là xác định ảng hưởng của các nồng độ muối lên các chủng vi khuẩn để áp
dụng trong nuôi trồng thủy sản.
1.3.3. Thử nghiệm ảnh hưởng của pH
Các giá trị pH thử nghiệm là 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.
Mục đích nhằm xác định khoảng pH mà các chủng vi khuẩn có khả năng thích nghi trong
môi trường nuôi trồng thủy sản.
1.3.4. Thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ
Với nhiệt độ thử nghiệm là 25oC, 30oC, 35oC, 40oC.
Mục đích nhằm xác định khoảng nhiệt độ thích hợp cho các chủng vi khuẩn tồn tại và
phát triển.
1.3.5. Thử nghiệm khả năng chịu đựng pH dạ dày (pH 2, pH 3)
Mục đích là xác định khả năng sống sót trong điều kiện acid thấp trong dạ dày của các
chủng vi khuẩn.

15 
 


 

1.3.6. Thử nghiệm khả năng chịu đựng muối mật (0,5%; 1%; 2%)
Mục đích là xác định khả năng sống sót ở điều kiện muối mật trong đường ruột để từ đó
hình thành khuẩn lạc, tăng khả năng kết dính trong đường ruột.
1.3.7. Thử nghiệm khả năng phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing
Mục đích: Xác định chủng vi khuẩn thử nghiệm có hay không khả năng phân hủy hệ
thống tín hiệu của vi khuẩn gây bệnh.
1.3.8. Khảo sát khả năng tương thích giữa 3 chủng thí nghiệm
Mục đích: Khảo sát 3 chủng có tương thích với nhau hay không nhằm có cơ sở để phối

trộn tạo probiotic đa chủng, nâng cao hiệu quả sử dụng probiotic .

16 
 


 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về probiotic - chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản
2.1.1. Định nghĩa probiotic
Định nghĩa “probiotic là những vi sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích
hợp mang lại lợi ích cho vật chủ” (Reid và ctv, 2003).
Vào năm 2003, Fioramonti và ctv đã định nghĩa: “probiotic được định nghĩa là những vi
sinh vật ảnh hưởng có lợi lên sức khỏe và tốt cho vật chủ”.
Khác với người và động vật trên cạn, động vật thủy sản được bao bọc bởi môi trường
nước và ở đó các tác nhân gây bệnh tồn tại một cách độc lập với vật chủ. Những vi sinh
vật gây bệnh được hấp thụ liên tục bởi vật chủ thông qua quá trình tiêu thụ thức ăn, động
vật thủy sản tiêu hóa một lượng lớn vi khuẩn từ môi trường nước, kết quả của mối tương
tác tự nhiên giữa khu hệ vi sinh trong môi trường và đối tượng thủy sản. Trong nuôi trồng
thủy sản mối tương tác giữa probiotic và vật chủ không chỉ giới hạn trong đường ruột của
vật chủ, probiotic còn có thể hoạt động trên mang, da và cả môi trường nước xung quanh
vật chủ. Do vậy một định nghĩa mới cho phép mở rộng ứng dụng của thuật ngữ probiotic
trong nuôi trồng thủy sản là: “probiotic là hỗn hợp vi sinh vật sống được thêm vào có lợi
cho vật chủ bằng cách thay đổi các nhân tố liên quan đến vật chủ hoặc quần xã vi sinh vật
xung quanh, cải thiện khả năng sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng cường
chống chịu bệnh, cải thiện chất lượng môi trường sống của vật chủ” (Verschuere và ctv,
2000).
2.1.2. Đặc điểm chung của probiotic
Có khả năng sống sót trong môi trường acid dạ dày, tồn tại tạm thời hoặc hình thành

khuẩn lạc trong ruột non. Không gây hại cho vật chủ. Probiotic phải tới đúng vị trí cần
tác động trong cơ thể vật chủ. Biểu hiện có lợi đối với vật chủ (cạnh tranh đối kháng với
các sinh vật gây bệnh, sinh các enzyme hoặc các chế phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể
sử dụng được). Không chứa gen gây độc hoặc gen kháng kháng sinh (Sahu và ctv, 2008).

17 
 


 

2.1.3. Các cơ chế tác động của probiotic
2.1.3.1. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại
Khả năng hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic trong biểu mô ruột và
trong lớp nhầy đường ruột vật chủ là cơ chế bảo vệ vật chủ chống lại tác nhân gây bệnh
thông qua cạnh tranh các thụ quan bám dính, dinh dưỡng và không gian, oxy và sự sản
sinh các cơ chất kháng khuẩn. Một số cơ chế liên quan đến sự bám dính của vi sinh vật
lên tế bào biểu mô ruột bao gồm: Liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, vị trí gắn dựa trên
các cấu trúc chuyên biệt. Những đặc tính này là một thế mạnh cạnh tranh quan trọng giúp
duy trì vi khuẩn trong đường ruột động vật (Balca´zar và ctv, 2006; Nikoskelainen và ctv,
2001).
2.1.3.2. Đóng góp về mặt dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa
Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vi sinh vật ảnh hưởng có lợi cho quá trình tiêu hóa của
động vật thủy sản: khử độc các hợp chất độc hại trong thức ăn, phân hủy các hợp chất
khó tiêu như chitin, cellulose…trong thức ăn nhờ các enzyme thủy giải (cellulase,
amylase…). Ngoài ra probiotic còn cung cấp vitamin (biotin và vitamin B12), carotenoid,
protein, acid béo chuỗi ngắn và chuỗi acid béo không bão hòa (PUFAs - polyunsaturated
fatty acids) như eicosapentaenoic acid (EPA) và docosahexaenoic acid (DHA) cần thiết
cho sự sinh trưởng. Ở cá, có báo cáo cho rằng Bacteroides và Clostridium đã đóng góp về
mặt dinh dưỡng cho vật chủ đặc biệt là cung cấp acid béo và vitamin. Một số vi sinh vật

như Agrobacterium sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., Microbacterium sp. và
Staphylococcus sp. có thể đóng góp vào quá trình tiêu hóa ở cá hồi chấm hồng Bắc cực
(Salvelinus alpinus L.). Một số chủng Bacillus (Bacillus licheniformis, B. subtilis, B.
polymixa, B. laterosporus và B. circulans) thúc đẩy tăng trưởng của ấu trùng cá tầm
Acipenser nudiventris: tăng chiều dài và khối lượng, tăng hệ số chuyển đổi thức ăn, tăng
hệ số tăng trưởng đặc hiệu (Specific Growth Rate). Ngoài ra một số vi khuẩn còn tham
gia vào quá trình tiêu hóa của những loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng cách sản sinh các
enzyme ngoại bào như protease, lipase, đồng thời cung cấp các nhân tố dinh dưỡng cần
thiết. Những nghiên cứu tương tự cho thấy hệ vi sinh vật khu trú ở tôm Penaeus chinensis
18 
 


 

bổ sung nguồn enzyme tiêu hóa và các hợp chất đồng hóa tương tự như ở động vật
(Ringo và ctv, 1995; Yazawa và ctv, 1996; Gildberg và ctv, 1995; Dalmo và ctv, 1997).
2.1.3.3. Cải thiện chất lượng nước
Chất lượng nước đã được cải thiện nhờ bổ sung các chủng probiotic đặc biệt là các chủng
Bacillus spp. Các chủng gram dương chuyển đổi các hợp chất hữu cơ thành CO2 tốt hơn
các chủng gram âm. Có báo cáo cho rằng việc sử dụng các chủng Bacillus sp. cải thiện
chất lượng nước, tăng khả năng sống và tăng tốc độ phát triển của Penaeus monodon và
làm giảm tác nhân gây bệnh Vibrio. Việc xử lý nước nuôi thủy sản bằng probiotic đã cho
thấy tác dụng giảm được chất hữu cơ trong nước ao nuôi thủy sản, giảm hàm lượng BOD
(nhu cầu oxy sinh học) và giảm độc tố do amoni, nitrite và hydro sulfua, khống chế được
vi khuẩn gây bệnh, tăng năng suất tôm cá (Balca´zar và ctv, 2006; Gómez, 2007).
2.1.3.4. Tăng cường đáp ứng miễn dịch
Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi probiotic, quá trình hình
thành khuẩn lạc và sự bám dính của probiotic trong ruột cá là điều kiện cần thiết để tăng
cường đáp ứng miễn dịch thông quan liên kết giữa các kiểu phân tử liên quan đến vi

khuẩn - BAMPs (bacteria associated molecular patterns) có tính bảo tồn cao và các thụ
thể chyên biệt trên bề mặt của tế bào biểu mô ruột (Balca´zar và ctv, 2006).
Rengpipat và ctv (2000) cho rằng sử dụng Bacillus sp. (chủng S11) đã bảo vệ tôm sú
Penaeus monodon khỏi tác nhân gây bệnh bằng cách hoạt hóa hệ thống miễn dịch dịch
thể ở tôm. Balca´zar (2003) chứng minh sử dụng hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp và Vibrio
sp ảnh hưởng tốt tới sự phát triển và khả năng sống sót của ấu trùng tôm thẻ chân trắng
đồng thời bảo vệ chống lại Vibrio harveyi và virus gây hội chứng đốm trắng. Sự bảo vệ
này xuất phát từ sự kích thích hệ thống miễn dịch bằng việc gia tăng thực bào và hoạt
động kháng khuẩn. Ngoài ra, nhiều tác giả chứng minh sử dụng vi khuẩn lactic
Lactobacillus rhamnosus (chủng ATCC 53103) ở hàm lượng 105 cfu/g, Lactococcus
lactis, Leuconostoc mesenteroides, L. sakei kích thích miễn dịch ở cá hồi Oncorhynchus
mykiss bằng cách thúc đẩy hoạt tính thực bào, sản sinh superoxide, lyzozyme (Nikoskelai
nen và ctv, 2001).
19 
 


 

2.1.4. Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản
Khi đưa probiotic vào môi trường nước ao, các vi sinh vật sẽ sinh sôi và phát triển rất
nhanh trong môi trường nước. Sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi sẽ có các tác động:
Phân hủy các chất hữu cơ trong nước, hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của
lớp bùn đáy; Giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí: NH3, H2S… phát
sinh), do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước; Giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu
nước do probiotic hấp thu chất dinh dưỡng hòa tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển
nhiều, giúp giảm chi phí thay nước. Nâng cao khả năng miễn dịch của tôm cá (do kích
thích hệ miễn dịch không đặc hiệu ở tôm, cá). Ức chế sự hoạt động và phát triển của vi
sinh vật có hại (do các loài vi sinh vật có lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí
bám với vi sinh vật có hại). Trong môi trường nước, nếu vi sinh vật có lợi phát triển

nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự phát triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế
được sự phát triển của mầm bệnh (Bùi Quang Tề, 2006; Trang Trường Nhẫn, 2007). Khi
đưa probiotic vào thức ăn góp phần tăng hoạt tính enzyme thủy phân tinh bột và protein
từ đó góp phần thúc đẩy tiêu hóa tốt và thủy phân hợp chất hữu cơ trong môi trường nuôi
(Tovar và ctv, 2004).
Do đó, sử dụng probiotic sẽ có ý nghĩa nhiều mặt trong việc nâng cao hiệu quả kinh tế
cho các mô hình nuôi thủy sản như: Làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn. Tôm cá mau lớn,
rút ngắn thời gian nuôi. Tăng tỷ lệ sống và tăng năng suất do tôm cá nuôi ít bị hao hụt.
Giảm chi phí thay nước. Giảm chi phí sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất trong việc
điều trị bệnh (Nguyễn Thị Phương Dung, 2008).
2.1.5. Tình hình nghiên cứu probiotic ứng dụng trong thủy sản trên thế giới
và Việt Nam
2.1.5.1. Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới
Có nhiều nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong nhiều thập niên qua. Đầu
thập niên 80 các nghiên cứu tập trung vào sử dụng probiotic cho đối tượng con giống và
cá thương phẩm trong khi các nghiên cứu ứng dụng cho đối tượng ấu trùng bắt đầu trễ
hơn vào khoảng thập niên 90. Tuy nhiên đa số các nghiên cứu ở giai đoạn này tập trung
20 
 


 

vào ảnh hưởng về mặt dinh dưỡng của probiotic lên vật chủ như các nghiên cứu của
Brown và ctv (1996), Ringø và ctv (1995), Sakata (1990).
Những năm gần đây các nhóm tác giả Gildberg và ctv (1997) đã chứng minh được ảnh
hưởng của probiotic lên khả năng kháng bệnh của cá bột và cá giống. Austin (2006),
Nikoskelainen và ctv (2003), Sakai và ctv (1995 chứng minh kích thích miễn dịch của
probiotic. Các nghiên cứu của Gildberg và ctv (1995); Kelly và ctv (2007);
Nikoskelainen (2006) đã chứng minh tăng cường khả năng bám dính và hình thành khuẩn

lạc trong ruột của probiotic.
2.1.5.2. Tình hình nghiên cứu probiotic ở Việt Nam
Trong những năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hóa chất, việc
nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng bệnh và cải thiện môi trường
trong nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang phát triển mạnh.
Võ Thị Hạnh và ctv thuộc Viện Sinh học nhiệt đới Tp HCM nghiên cứu và tạo chế phẩm
BIO II có tác dụng: phân hủy những thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao, ổn định pH và
màu nước ao, kìm hãm sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh cho tôm, cá như các
vi khuẩn Vibrio spp, tăng năng suất nuôi trồng.
Ts. Nguyễn Hữu Phúc, Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM đã nghiên cứu chế tạo thành
công hai chế phẩm sinh học để nuôi tôm. Hai chế phẩm này có tên là Probact và Ecobact
dùng để trộn vào thức ăn của tôm, và Ecobact dùng để xử lý môi trường nước trong ao
nuôi tôm. Hai chế phẩm sinh học này có tác dụng giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh cho
tôm, cải thiện chất lượng nước và bùn trong các ao nuôi tôm (góp phần tăng tính miễn
dịch cho tôm trong quá trình nuôi). Bước đầu hai chế phẩm này đã được sử dụng thử
nghiệm tại một số hộ nông dân ở huyện Cần Giờ, Nhà Bè, các tỉnh Đồng bằng sông Cửu
Long, cho kết quả khá tốt. Tôm ít bị bệnh, tăng trưởng tốt, năng suất thu hoạch tăng từ 30
- 45%.
2.2. Tổng quan vi khuẩn Bacillus
2.2.1. Đặc điểm chung của chi Bacillus
Theo khóa phân loại của Bergey (1994) về B. pumilus
21 
 


 

Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus pumilus
B. pumilus là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình que, vi khuẩn được phân lập từ
nhiều nguồn khác nhau, đất, nước, cây trồng… Bào tử B. pumilus cho thấy khả năng
chống bức xạ UV và H2O2 là cao hơn đáng kể so với các chủng Bacillus khác (Gioia và
ctv, 2007).
Theo khóa phân loại của Priest về B. flexus
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus flexus 
B. flexus là vi khuẩn gram dương, có phản ứng catalase dương tính, hình thành nội bào 
tử. 
Theo khóa phân loại của Lim và ctv (2006) về B. koreensis
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
22 
 


 

Loài: Bacillus koreensis 
Vi khuẩn B. koreensis hiếu khí, gram dương (Lim và ctv, 2006). 
Đặc điểm của chi Bacilllus được mô tả như sau:
Có tế bào hình gậy, hoặc thẳng, kích thước 0,5 - 2,5 x 1,2 - 10 μm, các tế bào thường xếp
thành cặp hoặc chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông. Là vi khuẩn gram dương, di động nhờ
roi. Một tế bào chỉ có duy nhất một nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ, chịu
được điều kiện bất lợi như nhiệt độ, acid, sự hình thành bào tử không bị ngăn cản bởi sự
tiếp xúc không khí. Gram dương hoặc chỉ cho gram dương ở giai đoạn đầu của sự phát
triển, con đường biến dưỡng bằng lên men hoặc hô hấp, hầu hết có catalase dương tính.
Là vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, muối rộng, tồn
tại được trong điều kiện bất lợi một thời gian dài nên đa số chúng rất phổ biến và có thể
phân lập được từ nhiều nguồn khác nhau. Một số chủng gây bệnh cho người như B.
anthracis, B. cereus… (Holt và ctv, 1994).  
2.2.2. Dinh dưỡng và sinh trưởng
Hầu hết Bacillus là những sinh vật hoá dị dưỡng có khả năng hô hấp khi sử dụng một số
hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, amino acid, acid hữu cơ. Trong một số trường hợp,
chúng có khả năng lên men hỗn hợp cacbonhydrat tạo glycerol và butanediol. Hầu hết
các loài thuộc chi Bacillus (ngoại trừ B. megaterium và một số loài khác) yêu cầu amino
acid, vitamin B hoặc cả hai hợp chất trên cho sự tăng trưởng. Phần lớn, chúng là vi khuẩn
ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 30 - 45oC, một số là vi khuẩn chịu
nhiệt với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu lên tới 65oC, còn lại là những vi khuẩn ưa lạnh, có
thể sinh trưởng và tạo bào tử ở 0oC. Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus sinh trưởng
trong khoảng pH rộng từ 2 - 11. Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện sinh trưởng tối
ưu Bacillus có thời gian thế hệ khoảng 25 phút (Torda, 2008).
2.2.3. Quá trình tạo bào tử của Bacillus
Nội bào tử được mô tả đầu tiên bởi Cohn (1872) khi nghiên cứu về B.subtilis và sau đó
được Koch (1875) mô tả khi nghiên cứu về B.anthracis. Cohn đã chứng minh khả năng
chịu nhiệt của bào tử B.subtilis trong khi Koch cũng đã mô tả được sự hình thành bào tử
23 

 


 

trong B.anthracis. Do đặc điểm cấu tạo và đặc tính sinh lý nên bào tử được cho là dạng
tồn tại bền vững nhất được tìm thấy trong tự nhiên của tế bào, chúng có khả năng sống
sót trong điều kiện khắc nghiệt một thời gian dài, có thể hàng triệu năm.
Ở trạng thái không nhuộm màu, nội bào tử có màu đen ở mép, rất sáng và chiết quang.
Cấu trúc của một bào tử gồm:
-

Nang bào tử

-

Áo bào tử

-

Vỏ bào tử

-

Lõi bào tử: gồm thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất, vùng nhân

Bào tử không được hình thành trong suốt hoạt động tăng trưởng và phân chia tế bào. Nội
bào tử chỉ hình thành khi tế bào bắt đầu đi vào pha ổn định và trong điều kiện môi trường
bất lợi thường thiếu dinh dưỡng hoặc sinh ra các sản phẩm trao đổi chất có hại. Thông
thường mỗi tế bào chỉ hình thành một bào tử và sau khi trưởng thành bào tử được phóng

thích ra khỏi tế bào. Ở bào tử trưởng thành không diễn ra quá trình trao đổi chất (được
xem như ở trạng thái ngủ), có khả năng chịu đựng điều kiện môi trường khắc nghiệt như
nhiệt độ (có thể sống sót sau khi đun sôi vài giờ), phóng xạ, acid, chất tẩy… Vì vậy sự
hình thành nội bào tử là cơ chế đảm bảo cho sự sống còn của vi khuẩn khi trải qua điều
kiện khắc nghiệt không phải là một cơ chế sinh sản (Torda, 2008).

24 
 


 

 
Hình 2.1 Mặt cắt ngang của bào tử Bacillus (Torda, 2008).
2.2.4. Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản
Giống Bacillus có dạng hình que, gram âm, thường hình thành nội bào tử và đại
diện tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn được sử dụng làm probiotic (Wang, 2008).
Bacillus ứng dụng trong thủy sản như: Các chủng B. subtilis sản xuất enzyme ngoại bào
như protease và một số enzyme khác đóng góp vào hoạt tính enzyme tự nhiên của vật chủ
(Nejad và ctv, 2006), đóng góp nguồn vi lượng và đa lượng bổ sung thức ăn (Verschuere
và cs, 2000). B.licheniformis được chứng minh có hoạt tính kháng virut (Arena và ctv,
2006). Trong khi đó B. pumilus sản xuất enzyme ngoại bào bao gồm amylase, cellulase,
là những enzyme quan trọng trong hoạt động tiêu hóa của cá bột (Ghosh và ctv, 2002), ức
chế các vi khuẩn gây bệnh khác, xem như đây là hoạt tính của probiotic (Duc và ctv,
2004). B. koreensis sản xuất enzyme caseinase, cellulase, urease, asculinase (Jee và ctv,
2006). B. flexus sản xuất ra enzyme cellulase chịu mặn (15% NaCl) và kiềm (pH từ 9 –
12) (Nitin và ctv, 2011).
Hơn nữa Bacillus có tác dụng giảm lượng bùn hữu cơ, giúp giảm chu kì thay nước
và cải thiện môi trường, do có khả năng khử nitrate, phân hủy chất hữu cơ thải ra từ thức
ăn thừa bằng các enzyme ngoại bào như protease, amylase, lipase… Ngoài ra, một số

chủng Bacillus còn có hoạt tính kháng khuẩn, kháng Vibrio sp., Aeromonas sp., giúp
phòng và ức chế bệnh trong nuôi trồng thủy sản (Wang, 2008). 

25