KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TOÀN PHẦN CỦA QUẢ THỂ NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum ( Leyss. ex Fr. ) Karst. THEO THỜI GIAN SINH TRƯỞNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TOÀN PHẦN
CỦA QUẢ THỂ NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum
(Leyss. ex Fr.) Karst. THEO THỜI GIAN SINH TRƯỞNG

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ CẨM TÚ
Niên khóa: 2007 – 2011

Tháng 7/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TOÀN PHẦN
CỦA QUẢ THỂ NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum
(Leyss. ex Fr.) Karst. THEO THỜI GIAN SINH TRƯỞNG

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. TRƯƠNG THỊ ĐẸP

NGUYỄN THỊ CẨM TÚ

Tháng 7/2011


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trương Thị Đẹp, người đã tận tình hướng
dẫn cho tôi ngay từ bước đầu làm quen với nấm Linh chi Ganoderma lucidum cho đến
khi sẵn sàng sửa chữa từng lỗi nhỏ để khóa luận được hoàn chỉnh nhất.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phan Văn Minh, người thầy đã định hướng đề tài,
luôn dõi theo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn TS. Trần Công Luận đã sẵn lòng tạo điều kiện để đề tài
được thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TPHCM, GS.TS. Nguyễn Minh Đức,
DS. Nguyễn Minh Cang đã tận tình giúp đỡ để thực hiện phần Sắc ký lỏng hiệu năng
cao trong khoá luận.
Xin cảm ơn KS Nguyễn Minh Quang đã hướng dẫn rất tận tình về những kỹ thuật
trồng và chăm sóc nấm.
Xin cảm ơn Thầy cô tại Bộ môn Công nghệ sinh học trường ĐH Nông Lâm
TPHCM đã luôn quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập
cũng như thực hiện khoá luận, đã lắng nghe, góp ý và giúp tôi sữa chữa khoá luận này.
Xin cảm ơn Thầy cô, các anh chị và các bạn tại trại thực nghiệm Viện nghiên cứu
CNSH và Môi trường Trường Đại học Nông Lâm TPHCM, tại Trung tâm Sâm và
Dược liệu TPHCM, Bộ môn Thực vật và Ban nghiên cứu khoa học của khoa Dược ĐH Y Dược TPHCM, trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên TPHCM đã chỉ dẫn, chia sẻ
kinh nghiệm và giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn những người bạn đã cùng tôi chia ngọt sẻ bùi, hỗ trợ về vật
chất và cả tinh thần để tôi có thể luôn tiến lên phía trước.
Xin cảm ơn tập thể lớp DH07SH, những người bạn thân thiết đã gắn bó với cả
quãng đường sinh viên đầy kỉ niệm.
Tháng 7/2011

i


TÓM TẮT
Từ xưa, nấm Linh chi đã được xem là một loại thảo dược quý ở Việt Nam và
nhiều nước châu Á. Nấm Linh chi chứa nhiều dược chất có khả năng phòng và trị bệnh
cho con người. Trong đó, triterpenoid toàn phần là một trong những thành phần dùng
để đánh giá chất lượng nấm. Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid có thể sẽ thay đổi theo
thời gian sinh trưởng của nấm. Hiện nay, những nghiên cứu về hàm lượng triterpenoid
toàn phần trong quả thể nấm Linh chi Ganoderma lucidum theo thời gian sinh trưởng
ở Việt Nam rất ít. Do đó, đề tài “Khảo sát hàm lượng triterpenoid toàn phần của quả
thể nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst. theo thời gian sinh
trưởng” được tiến hành nhằm xác định thời điểm thích hợp để thu hoạch nấm có hàm
lượng triterpenoid toàn phần cao.
Cơ chất trồng nấm là mạt cưa cao su. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa
học cho thấy trong nấm Linh chi có chất béo, carotenoid, alkaloid, triterpenoid,
coumarin, glycosid tim, tannin, saponin, polyphenol, acid hữu cơ và chất khử. Phát
hiện được sự hiện diện của triterpenoid bằng phản ứng hóa học Liebermann - Burchard
và SKLM với hệ dung môi Toluen – Ethylacetat – Acid formic. Sau khi chiết Soxhlet
và định lượng bằng phương pháp cân, xác định được hàm lượng triterpenoid toàn phần
tăng theo thời gian sinh trưởng, cao nhất vào tuần thứ 8 và 10, đạt 4,51% và 4,54%
tính theo Khối lượng khô của quả thể nấm. Kết quả này cho thấy giai đoạn 8 - 10 tuần
tuổi là thời điểm thích hợp nhất cho việc thu hoạch nấm Linh chi có hàm lượng
triterpenoid toàn phần trong quả thể cao.
Ngoài ra, khi so sánh với mẫu Linh chi Nhật, kết quả của quá trình phân tích
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy thành phần triterpenoid toàn phần trong Linh
chi Nhật đa dạng hơn Linh chi Việt Nam.

ii

SUMMARY
“Lingzhi”, Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst., is a valuable medicinal
herb in Vietnam and many other Asian countries. It contains many beneficial
ingredients which are effective in preventing and treating human diseases. One of
these ingredients is total triterpenoid content which is used for estimating its quality.
However, the total triterpenoid content can vary during the growth of this fungus.
Presently, understandings on the variation of the total triterpenoid content in fruiting
body through the growth stages of this species is still very few in Vietnam. Therefore,
the objective of this thesis is “Investigating the variation of the total triterpenoid
content in fruiting body of Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst through its
growth stages”. This understanding can help in determining the best time for the
harvest of fruiting bodies with expected high total triterpenoid contents.
In the present study, Lingzhi was planted on rubber sawdust. And, the results of
analysis showed that chemical components of Lingzhi is composed of lipid,
carotenoid, triterpenoid, coumarin, cardiac glycosides, tannins, saponins, polyphenols,
organic acids and reductants.
Detection the presence of total triterpenoid was examined by Liebermann Burchard reaction and thin layer chromatography with Toluene – Ethylacetat – Formic
acid solvent. After Soxhlet extraction, the weighing method was applied and showed
that the total triterpenoid content on a basis of dry weight was increasing within
growth stage and highest at week 8 to 10 of the experiment; 4,51 and 4,54%,
respectively. This result introduced the best time for the haverst of Ganoderma
lucidum fruiting body with highest triterpenoid content should be from 8th to 10th week
of the cultivation.
In addition, in comparison to Japanese “Lingzhi”, the results of the high liquid
performance chromatography analyse showed the composition of the triterpenoid
ingredient of Japanese “Lingzhi” was more diverse than Vietnam “Lingzhi”,
Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst..
Key words: Ganoderma lucidum, Lingzhi, total triterpenoid content, growth

stage, fruiting bodies.

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................. i
TÓM TẮT.................................................................................................................. ii
SUMMARY.............................................................................................................. iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................x
DANH SÁCH CÁC HÌNH....................................................................................... xi
Chương 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu của đề tài........................................................................................... 1
1.3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
2.1. Tổng quan về nấm Linh chi............................................................................ 3
2.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................ 3
2.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố..................................................................... 4
2.1.3. Đặc điểm hình thái – cấu trúc nấm Linh chi ............................................... 4
2.1.4. Đặc điểm nuôi trồng nấm Linh chi .............................................................. 4
2.1.4.1. Các thông số thích hợp trong nuôi trồng .....................................................4
2.1.4.2. Tình hình phát triển trồng nấm Linh chi ......................................................5
2.1.5. Tác dụng dược lý của nấm Linh chi ............................................................ 7
2.2. Thành phần hóa học nấm Linh chi ................................................................. 8
2.3. Giới thiệu về nhóm triterpenoid ................................................................... 10
2.4. Phương pháp đánh giá hàm lượng triterpenoid trong nấm Linh chi ............ 12
2.4.1. Sắc ký lớp mỏng ........................................................................................ 12

2.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .............................................................. 13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................. 14
3.1. Thời gian và địa điểm................................................................................... 14
3.2. Đối tượng nghiên cứu................................................................................... 14
3.2.1. Nguyên liệu:............................................................................................... 14
3.2.2. Dung môi, hoá chất sử dụng ...................................................................... 15

iv


3.2.3. Thiết bị sử dụng ......................................................................................... 16
3.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 16
3.3.1. Quy trình trồng nấm .................................................................................. 16
3.3.2. Thiết kế thí nghiệm .................................................................................... 17
3.3.3. Mô tả nấm Linh chi thí nghiệm ................................................................. 18
3.3.4. Xác định đường cong tăng trưởng ............................................................. 18
3.3.5. Thử độ tinh khiết của dược liệu................................................................. 18
3.3.5.1. Xác định độ ẩm ........................................................................................... 18
3.3.5.2. Xác định độ tro ............................................................................................ 18
3.3.6. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của nấm Linh chi ...................... 19
3.3.7. Định tính triterpenoid toàn phần................................................................ 22
3.3.7.1. Định tính bằng phản ứng hoá học Liebermann- Burchard ...................... 22
3.3.7.2. Định tính triterpenoid toàn phần bằng SKLM ..........................................22
3.3.7.3. Định tính triterpenoid toàn phần bằng HPLC pha đảo ............................. 23
3.3.8. Định lượng triterpenoid toàn phần bằng chiết - cân .................................. 24
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 25
4.1 Mô tả nấm Linh chi thí nghiệm ..................................................................... 25
4.1.1. Đặc điểm hình thái – cấu trúc .................................................................... 25
4.1.2. Soi bột ........................................................................................................ 25
4.13. Xác định tên khoa học ............................................................................... 26

4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật bằng phản ứng hoá học ................. 31
4.3 Thử độ tinh khiết của dược liệu ..................................................................... 31
4.3.1 Độ ẩm........................................................................................................... 31
4.3.2 Độ tro ........................................................................................................... 32
4.4 Sự tăng trưởng của các mẫu nấm Linh chi thí nghiệm .................................. 33
4.5 Định tính triterpenoid..................................................................................... 35
4.5.2 Định tính triterpenoid bằng phương pháp HPLC ........................................ 37
4.6 Định lượng triterpenoid bằng phương pháp cân ............................................ 41
4.6.1 Chiết Soxhlet và tinh chế ............................................................................. 41
4.6.2 Hàm lượng triterpenoid toàn phần............................................................... 41
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................ 46
5.1 Kết luận.......................................................................................................... 46

v


5.2 Đề nghị .......................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 47
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ......................................................................................... 47
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI ...................................................................................... 48

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CHCl3: Cloroform
DĐVN: Dược Điển Việt Nam
EtOH: Ethanol
FeCl3: Ferric chloride
HCl: Chlohydric Acid

HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
H2SO4: Sulfuric Acid
KOH: Potassium Hydroxide
MeOH: Methanol
Na2CO3: Sodium carbonate
PDA: Photo Diod Array
PL: Phụ lục
SKLM: Sắc ký lớp mỏng
TLC: Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
TNHH: Trách nhiệm hữu hạn
TT: Thuốc thử
UV: Ultraviolet
VS: Vanillin – sulfuric

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Phân loại Linh chi theo màu sắc – công dụng ...................................................3
Bảng 2.2 Thành phần các chất có hoạt tính ở Linh chi ......................................................9
Bảng 3.1 Quả thể nấm Linh chi dùng trong nghiên cứu ..................................................15
Bảng 3.2 Phản ứng xác định các nhóm hợp chất..............................................................21
Bảng 4.1 Kết quả sơ bộ thành phần hoá thực vật .............................................................31
Bảng 4.2 Kết quả khảo sát độ ẩm của 7 mẫu quả thể nấm Linh chi ...............................31
Bảng 4.3 Kết quả khảo sát độ tro toàn phần của 7 mẫu quả thể nấm Linh chi...............32
Bảng 4.4 Kết quả khảo sát độ tro không tan trong acid ...................................................32
Bảng 4.5 Khối lượng quả thể Linh chi thí nghiệm ở các giai đoạn tăng trưởng ............33
Bảng 4.6 Vị trí các vết chất trên SKLM............................................................................37
Bảng 4.7 Kết quả chiết Soxhlet với dung môi methanol .................................................41

Bảng 4.8 Kết quả tinh chế cao methanol qua cột Diaion HP - 20 ...................................41
Bảng 4.9 Hàm lượng triterpenoid toàn phần.....................................................................42
Bảng 4.10 Khối lượng triterpenoid toàn phần theo khối lượng trung bình quả thể .......42

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Bốn nhóm triterpenoid pentacyclic....................................................................10
Hình 2.2 Ba nhóm triterpenoid tetracyclic........................................................................11
Hình 2.3 Các loại acid ganoderic được phân lập..............................................................12
Hình 3.1 Bột quả thể các mẫu Linh chi.............................................................................14
Hình 3.2 Quả thể các mẫu Linh chi...................................................................................15
Hình 3.3 Quy trình trồng nấm Linh chi trên giá thể mạt cưa cao su...............................16
Hình 3.4 Quy trình thí nghiệm...........................................................................................17
Bảng 3.2 Phản ứng xác định các nhóm hợp chất..............................................................21
Hình 3.5 Quy trình chiết xuất định tính triterpenoid toàn phần bằng HPLC..................24
Hình 4.1 Quả thể nấm Linh chi thí nghiệm ở các giai đoạn sinh trưởng........................27
Hình 4.2 Cấu tạo quả thể nấm Linh chi ............................................................................28
Hình 4.3 Bào tử đảm Linh chi ...........................................................................................29
Hình 4.4 Sợi nấm Linh chi dưới kinh hiển vi quang học vật kính 100...........................30
Hình 4.5 Biểu đồ tăng trọng của quả thể nấm Linh chi . .................................................34
Hình 4.6 Hàm lượng nước trong quả thể nấm Linh chi ..................................................34
Hình 4.7 Phản ứng Liebermann - Burchard định tính triterpenoid. ................................35
Hình 4.8 SKLM định tính triterpenoid của 7 mẫu nấm Linh chi. ...................................36
Hình 4.9 Sắc ký đồ HPLC mẫu quả thể Linh chi thí nghiệm 10 tuần tuổi. ....................38
Hình 4.10 Sắc ký đồ HPLC mẫu quả thể Linh chi VINA. ..............................................39
Hình 4.11 Sắc ký đồ HPLC mẫu quả thể nấm Linh chi Nhật. ........................................40
Hình 4.12 Hàm lượng triterpenoid toàn phần ..................................................................43

Hình 4.13 Sự gia tăng hàm lượng triterpenoid toàn phần ...............................................44

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Trong cuộc sống hiện đại với quá nhiều các sản phẩm tổng hợp nhân tạo như

ngày nay, người ta lại có xu hướng tìm về với những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên,
bao gồm các loại cây thuốc dân gian gọi là thảo dược. Trong số đó, nấm Linh chi từ
lâu đã được xếp vào nhóm “Thượng dược”, được ưa chuộng sử dụng trong y học cổ
truyền của nhiều nước châu Á, trong đó có Việt Nam. Nấm Linh chi có giá trị dược
liệu cao, chứa nhiều hoạt chất có tác dụng dược lý như polysaccharid, triterpenoid,
germanium, adenosin… giúp nâng cao thể chất, tăng khả năng phòng chống bệnh, điều
chỉnh cân bằng sinh lý, làm chậm quá trình lão hóa.
Trong số những hoạt chất trên, triterpenoid là một trong những chất được quan
tâm nhiều nhất với khả năng chống oxy hóa, ức chế sự ngưng kết tiểu cầu, hạ
cholesterol huyết, chống HIV... Ngoài ra, triterpenoid còn tạo nên vị đắng rất được ưa
chuộng cho nấm Linh chi. Do vậy, triterpenoid được xem là một trong những thành
phần dùng để đánh giá chất lượng của nấm. Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid có thể
sẽ thay đổi theo thời gian sinh trưởng của nấm. Hiện nay, những nghiên cứu về hàm
lượng triterpenoid toàn phần trong quả thể nấm Linh chi Ganoderma lucidum theo thời
gian sinh trưởng còn rất ít, và ở Việt Nam chưa có tài liệu nghiên cứu về vấn đề này.
Do đó, đề tài “Khảo sát hàm lượng triterpenoid toàn phần của quả thể nấm Linh chi
Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst. theo thời gian sinh trưởng” được tiến hành
nhằm xác định thời điểm thích hợp nhất cho việc thu hoạch nấm có hàm lượng
triterpenoid toàn phần trong quả thể cao.

1.2.

Yêu cầu của đề tài

 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của mẫu quả thể nấm Linh chi thí
nghiệm.
 Khảo sát hàm lượng triterpenoid toàn phần trong quả thể nấm Linh chi thí
nghiệm trồng trên cơ chất mạt cưa cao su theo thời gian sinh trưởng của quả
thể: 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần và 10 tuần tuổi. Từ đó, xác định thời gian quả
thể nấm Linh chi có hàm lượng triterpenoid toàn phần cao nhất.

1


1.3.

Nội dung nghiên cứu

 Xác định đường cong tăng trưởng của quả thể nấm Linh chi theo thời gian.
 Phân tích hoạt chất:
 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của nấm Linh chi thí nghiệm.
 So sánh hàm lượng triterpenoid toàn phần từ quả thể nấm Linh chi thí
nghiệm trồng trên cơ chất trên ở giai đoạn 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần và
10 tuần tuổi.
 Định tính triterpenoid:
 Phương pháp hóa học
 Sắc ký lớp mỏng
 Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
 Định lượng:
 Chiết Sohxlet – cân

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nấm Linh chi
2.1.1. Vị trí phân loại
Giới:

Nấm (Mycetalia)

Ngành: Nấm đảm (Basidiomycota)
Lớp:

Nấm đảm (Basidiomycetes)

Bộ:

Nấm lỗ (Aphyllophorales)

Họ:

Linh chi (Ganodermataceae)

Chi:

Linh chi (Ganoderma)

Loài :

Linh chi (Ganoderma lucidum)

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst.
Thông thường, Linh chi được gọi là Linhzhi theo tiếng Trung Quốc, Reishi hay
Mannentake trong tiếng Nhật. Ở Việt Nam, Linh chi còn có tên là nấm Lim, Bất lão
thảo, Vạn niên…
Linh chi có rất nhiều loài khác nhau. Sách Bản thảo cương mục (1595) của Lý
Thời Trân, đại danh y Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành 6 loại,
mỗi loại có công dụng chữa bệnh khác nhau (trích dẫn bởi Lê Xuân Thám, 1998).
Bảng 2.1 Phân loại Linh chi theo màu sắc – công dụng (Nguyễn Duy Đại, 2009)
Tên gọi

Màu

Thanh chi (Long chi)

Xanh

Hồng chi
(Xích chi, Đơn chi)

Đỏ

Hoàng chi (Kim chi)

Vàng

Bạch chi (Ngọc chi)

Trắng

Hắc chi (Huyền chi)

Đen

Tử chi

Tím

Đặc tính dược lý
Vị chua, tính bình, không độc, chủ trị sáng mắt, bổ
gan khí an thần, tăng trí nhớ
Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡng
tim, bổ trung, trị tức ngực
Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần, ích tì khí
Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông mũi,
an thần, chữa ho, nghịch hơi
Vị mặn, tính bình, không độc, trị chứng bí tiểu, ích
thận khí
Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị đau nhức khớp
xương, gân cốt

3


2.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố
Chi Ganoderma rất phong phú và phân bố khá rộng, nhất là ở vùng nhiệt đới
ẩm, gặp hầu hết ở các nước Châu Á (Cổ Đức Trọng, 2006).
Nấm Linh chi có thể mọc trên cây gỗ sống hay đã chết, mọc tốt dưới bóng rợp,
ánh sáng khuếch tán nhẹ. Nhờ có lớp vỏ láng, Linh chi có thể chịu được nắng, mưa.

Các chủng Linh chi chịu nhiệt độ cao thường chiếm ưu thế ở những vùng thấp
dưới 500 m. Các chủng ôn hoà thích hợp ở những vùng vĩ độ cao, các chủng này
thường được coi là các chủng nấm quý nhờ vào thành phần và hàm lượng các hoạt
chất trong nấm. Ở một số tỉnh của Trung Quốc, Linh chi thường mọc hoang dại ở các
vùng núi cao lạnh. Ở Việt Nam, Linh chi được gặp rải rác từ Bắc đến Nam.
2.1.3. Đặc điểm hình thái – cấu trúc nấm Linh chi
Quả thể nấm Linh chi gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm.
Cuống nấm dài hoặc ngắn, thường đính một bên bên, đôi khi đính tâm do quá
trình liền tán tạo thành. Cuống nấm thường hình trụ, thanh mảnh (đường kính 0,3 – 0,8
cm) hoặc mập khỏe (2 – 3,5 cm), ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp
vỏ cuống láng đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm.
Mũ nấm dạng thận, đôi khi xòe hình quạt hoặc dị dạng. Trên mặt mũ có vân gạch
đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím
nhẵn bóng như láng vecni. Mũ nấm có đường kính 2 – 36 cm, dày 0,8 – 3,3 cm, phần
đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm.
Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm. Bào
tử đảm có lớp vỏ kép, màu vàng mật ong, ở giữa có khối nội chất dạng giọt hình cầu.
Bào tử dạng trứng có đầu chóp tròn – nhọn, do có chụp phủ lỗ nảy mầm lõm thụt hoặc
phồng căng (Lê Xuân Thám, 1998).
2.1.4. Đặc điểm nuôi trồng nấm Linh chi
2.1.4.1. Các thông số thích hợp trong nuôi trồng (Nguyễn Duy Đại, 2009)


Nhiệt độ:
- Giai đoạn nuôi sợi: 20oC - 30oC.
- Giai đoạn quả thể: 22oC - 28oC.



Độ ẩm:

- Độ ẩm cơ chất: 60% - 62%
- Độ ẩm không khí: 80 - 95%.

4


Độ thông thoáng: Trong suốt quá trình nuôi sợi và phát triển quả thể, nấm Linh
chi đều cần có độ thông thoáng tốt.


Ánh sáng:
- Giai đoạn nuôi sợi: không cần ánh sáng
- Giai đoạn phát triển quả thể: cần ánh sáng tán xạ (ánh sáng đọc được). Cường độ
ánh sáng cân đối từ mọi phía.



pH: Linh chi thích nghi trong môi trường trung tính đến acid yếu (pH 5,5 - 7).



Dinh dưỡng: Sử dụng trực tiếp nguồn cellulose



Chất lượng của nấm Linh chi trồng thí nghiệm phụ thuộc vào 2 điều kiện chính:
- Giống thuần chủng, không bị lai tạp.
- Thành phần dinh dưỡng và điều kiện môi trường cho nấm sinh sản phát triển (đây

là bí mật công nghệ của từng nhà sản xuất).

Có 2 loại giá thể chính để trồng nấm Linh chi là mạt cưa và khúc gỗ chôn xuống
đất. Ở Việt Nam người ta trồng Linh chi bằng mạt cưa cao su đựng trong túi. Ở Hàn
Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản người ta trồng Linh chi bằng khúc gỗ chôn dưới đất, sau
6 - 7 tháng sẽ thu hoạch, nấm có đường kính lớn, mỗi cây nấm sau khi sấy khô đạt 200
– 400 g.
2.1.4.2. Tình hình phát triển trồng nấm Linh chi
 Trên thế giới
Theo Wang, X.J. (dẫn theo S. T. Chang, 1993), nấm Linh chi đã được nuôi trồng
ở Trung Quốc từ đầu thế kỷ 17, bởi giá trị dược liệu cao của chúng. Trung Quốc hiện
vẫn được thừa nhận là trung tâm lớn nhất thế giới về nuôi trồng, sản xuất Linh chi
(Zhao et Zhang, 1994). Ngoài ra ở Châu Á còn có các nước có truyền thống nghiên
cứu Linh chi: Nhật Bản, Hoa Kỳ, Hàn Quốc, Việt Nam, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,
Indonesia. Các nước Châu Á tập trung vào công nghệ nuôi trồng, khảo sát thành phần
hoá học, tác dụng dược lý, lâm sàng, các chế phẩm (Cổ Đức Trọng, 2006):
- Hàn Quốc là nước sản xuất Linh chi thứ hai trên thế giới sau Trung Quốc, sản
lượng năm 1998 đạt trên 1300 tấn.
- Ở Nhật, sản lượng nuôi trồng Linh chi từ 1979 - 1995 tăng đến 40 lần.
- Theo Teow và ctv (1994), Malaysia chú trọng cải tiến các quy trình trồng Linh
chi ngắn ngày trên phế thải giàu chất xơ (trích dẫn bởi Lê Xuân Thám, 1998).

5


- Thái Lan có một số trang trại cỡ vừa nuôi trồng G.lucidum và G.capense (Linh
chi sò).
Trong khi đó, các nước Châu Âu lại thường tập trung nghiên cứu hệ thống phân
loại, tiến hoá phát sinh: Cộng hoà liên bang Đức, New Zealand, Nam Phi, Úc.
Hoa Kỳ bắt đầu nuôi trồng nấm Linh chi ở quy mô công nghiệp sau khi xác định
được giá trị dược liệu của loại nấm này bằng thực nghiệm khoa học (Alice Chen và
ctv, 1996) và thành lập Viện Nghiên cứu Linh chi Quốc tế ở New York.

Trên thế giới nấm Linh chi cùng các chế phẩm Linh chi đã được sản xuất để làm
thuốc và thực phẩm dưỡng sinh.
 Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, Viện Dược liệu - Hà Nội đã trồng nấm Linh chi (giống Trung Quốc)
thành công vào năm 1978. Chín năm sau, năm 1987, các nhà khoa học thuộc Ðại học
khoa học tự nhiên đã chọn được giống Linh chi mọc hoang ở rừng núi Lâm Ðồng để
nhân giống và đưa vào sản xuất tại trại trồng nấm Linh chi của Xí nghiệp Dược phẩm
TW 24, đạt kết quả tốt vào năm 1988. Nuôi trồng Linh chi phát triển mạnh ở TP. Hồ
Chí Minh trong 20 năm trở lại đây (Lê Duy Thắng, 2001), sản lượng hàng năm đạt
khoảng 10 tấn (Cổ Đức Trọng, 2006).
Ngành nuôi trồng nấm Linh chi hiện nay rất dễ phát triển vì:
-

Điều kiện thiên nhiên ưu đãi, nhất là các tỉnh phía Nam.

-

Nguồn nguyên liệu dồi dào: mạt cưa, cùng các phế liệu khác cũng chiếm số

lượng rất lớn như rơm, bã mía, bông thải…
-

Lực lượng lao động nhàn rỗi khá đông, nhất là trong lĩnh vực nông nghiệp.

-

Nhiều nơi có truyền thống trồng nấm lâu đời như Bình Chánh (Tp HCM), Long

An… hoặc đang phát triển nghề nấm như Cần Thơ, Sóc Trăng, Long Khánh, Hóc Môn
(Tp HCM)…có đội ngũ kỹ thuật được rèn luyện trong thực tế ngày càng nhiều, sẽ là

hạt nhân thúc đẩy phong trào trồng nấm lan rộng.
-

Ngành chế biến và xuất khẩu nấm đang ở bước đầu với lợi nhuận tương đối, khuyến

khích được người trồng nấm.
-

Sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, sự bùng nổ của công nghệ thông tin và sự

hình thành các hiệp hội nấm.
-

Tuy nhiên chủ yếu vẫn do hiệu quả của nấm Linh chi nuôi trồng: chỉ sử dụng

nguyên liệu chính là phế liệu của ngành nông, công nghiệp như bã mía, bông thải, mạt

6


cưa… ít bị cạnh tranh bởi những ngành khác, nhưng sản phẩm lại là nguồn thực –
dược phẩm rất quý, có giá trị cao.
Do vậy, cần chú trọng phát triển trồng nấm Linh chi ở nước ta hiện nay (Nguyễn
Duy Đại, 2009; Lê Duy Thắng, 2001).
2.1.5. Tác dụng dược lý của nấm Linh chi
Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc. Các sách
dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh chi được sử dụng làm
thuốc từ lâu đời.
Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng cụ thể của
nấm Linh chi được tập hợp vào những mặt tác dụng lớn như sau:

-

Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn)

-

Bảo can (bảo vệ gan)

-

Cường tâm (thêm sức cho tim)

-

Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá)

-

Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp)

-

Giải độc (giải toả trạng thái nhiễm độc)

-

Giải cảm (giải toả trạng thái dị cảm)

-

Trường sinh (sống lâu tăng tuổi thọ).

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh chi,
người ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh (Lê Xuân Thám, 1998):
* Đối với bệnh về hệ tim mạch
Nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định huyết áp. Khi dùng cho người huyết
áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng nhiều thì huyết áp ổn
định. Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm Linh chi có tác
dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh dưỡng. Đối
với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh chi có tác dụng giảm cholesterol toàn
phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu, làm giảm hệ số sinh bệnh.
Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong máu, giảm
co tắc mạch, giải toả cơn đau thắt tim.
* Đối với các bệnh về hô hấp
Nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những ca điều trị viêm phế quản dị
ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn.

7


* Đối với hệ tuần hoàn
Ổn định huyết áp, lọc sạch máu tăng cường tuần hoàn máu, giảm mệt mỏi, hỗ trợ
thần kinh, chống đau đầu và tứ chi, điều hoà kinh nguyệt, làm da dẻ hồng hào chống
các bệnh ngoài da như dị ứng, trứng cá.
Ngoài ra nấm Linh chi còn có tác dụng tốt tới các bệnh gan mãn tính mới phát,
nâng cao chức năng gan, ổn định đường huyết ở những người bị bệnh đái tháo đường.
Các tác giả ở Đài Loan dùng Linh chi trồng thí nghiệm trên gỗ long não điều trị ung
thư cho kết quả rất tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn. Trên cơ sở nguyên lý hiệu dụng là
do nấm Linh chi làm tăng và khôi phục hệ miễn dịch (J.T.Xie và ctv, 2006). Hàng năm
doanh thu của các chế phẩm chống ung thư điều chế từ các loài nấm Linh chi ở Đài

Loan đạt trên 350 triệu USD.
2.2. Thành phần hóa học nấm Linh chi
Ganoderma lucidum có khoảng 400 hoạt chất sinh học khác nhau, chủ yếu là
triterpenoid, polysaccharid, nucleotid, sterol, steroid, acid béo, alkaloid, protein, amino
acid, peptid và các nguyên tố vi lượng. Trong đó, hai nhóm được quan tâm nhiều nhất
là polysaccharid và triterpenoid.
Tuy nhiên, định tính và định lượng các hoạt chất trong nấm Linh chi còn phụ
thuộc bộ phận, sự biến dạng, nguồn gốc của nấm, quy trình chiết xuất, điều kiện trồng.
 Polysaccharid
Polysaccharid gồm 2 loại chính :
GL-A: Gal: Glu: Rham: Xyl (3,2: 2,7: 1,8; 1,0)
GL-B: Glu: Rham: Xyl (6,8: 2,0: 1,0)

M= 23.000 Da
M= 25.000 Da

Polysaccharid có nguồn gốc từ Linh chi dùng điều trị ung thư đã được công nhận
sáng chế ở Nhật. Năm 1982, Cty Teikoko Chemical Industry sản xuất sản phẩm từ
Linh chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế neoplasm. Tại Mỹ đã có bằng sáng chế
trong việc sản xuất chất mucopolysaccharid từ Linh chi dùng chống ung thư (Nyoman
P. Aryantha và ctv, 2001).
 Triterpenoid
Triterpenoid đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải
phóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan. Hiện nay, đã tìm
thấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic. Trong đó ganodosteron được xem là chất kích
thích hoạt động của gan và bảo vệ gan.

8

Bảng 2.2 Thành phần các chất có hoạt tính ở Linh chi (Nguyễn Duy Đại, 2009)
Nhóm chất
(1)
Alkaloid

Polysaccharid

Hoạt chất
(2)

Hoạt tính
(3)
Trợ tim

b-D-glucan

Chống ung thư, tăng tính miễn dịch

Ganoderan A, B, C

Hạ đường huyết
Tăng tổng hợp protein, tăng chuyển
hoá acid nucleic
Giải độc gan

D- 6
Steroid

Triterpenoid

Ganodosteron
Lanosporeric acid A,
Lonosterol
Ganodermic acid Mf,T-O
Ganodermic acid R, S
Ganoderic acid B,D,F,H,
K,S,Y...
Ganodermadiol

Ức chế sinh tổng hợp Cholesterol
Ưc chế sinh tổng hợp Cholesterol
Ưc chế giải phóng Histamin*

Hạ huyết áp, ức chế ACE**

Ganosporelacton A, B
Lucidon A
Lucidol
Nucleosid

Chống khối u
Bảo vệ gan
Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giản cơ,
giãm đau

Adenosin dẫn suất

Protein

Lingzhi – 8

Chống dị ứng phổ rộng, điều hoà
miễn dịch

Acid béo

Oleic acid

Ưc chế giải phóng Histamin

Theo B. K. Kim và ctv (1994), thì dịch chiết nước và methanol của quả thể Linh
chi ức chế sự nhân lên của virus. Hiệu quả cũng nhận thấy trên tế bào lympho T của
người nhiễm HIV - 1. Phân đoạn hỗn hợp methanol (A) kháng virus rất mạnh. Các
phân đoạn khác, như hexan (B), etyl acetat (C), trung tính (E), kiềm (G)... đều có tác
dụng kháng virus tốt.
Phân tích thành phần nguyên tố của nấm Linh chi, còn phát hiện thấy khoảng 40
nguyên tố, trong đó phải kể đến germanium. Germanium có liên quan chặt chẽ với
hiệu quả lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô, đặc biệt là giảm bớt
đau đớn cho người bệnh bị ung thư ở giai đoạn cuối (R. Russellm và M. Paterson,
2006; Nyoman P.Aryantha và ctv, 2001; Jiang Jing Gao và ctv, 2006).

9


2.3. Giới thiệu về nhóm triterpenoid
Triterpenoid được tạo thành bởi 6 đơn vị isopren kết hợp và được phân bố rộng
rãi trong giới thực vật và động vật, bao gồm: sterol có trong động vật, thực vật;
triterpen; saponin (saponin triterpenoid; saponin steroid); glycosid có tác dụng trên tim
(Trịnh Thị Huyền Trang, 2010; Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985).
Triterpenoid chia làm 2 phân nhóm chính: triterpenoid pentacyclic và triterpenoid

tetracyclic. Các triterpenoid có cấu trúc hóa học cơ bản là nhân lanosterol, chất trung
gian quan trọng trong con đường sinh tổng hợp steroid và triterpenoid ở vi sinh vật và
động vật (Nguyễn Văn Đàn và Ngyễn Viết Tựu, 1985; S. B. Mahato và ctv, 1992).
 Triterpenoid pentacyclic: Chia thành 4 nhóm: Olean, ursan, lupan và hopan.

(b)

(a)

(c)

(d)

Hình 2.1 Bốn nhóm triterpenoid pentacyclic.(a): Cấu trúc khung Olean;

(b):Cấu trúc khung Ursan; (c): Cấu trúc khung Lupan; (d): Cấu trúc khung Hopan.

10




Triterpenoid tetracyclic: Chia thành 3 nhóm: dammaran, lanostan và cucurtan.

(a)

(b)

(c)

Hình 2.2 Ba nhóm triterpenoid tetracyclic. (a): Cấu trúc khung Dammaran;
(b): Cấu trúc Lanostan; (c): Cấu trúc Cucurbitan.

Theo Nishitoba và cộng sự, trong số các triterpenoid được phân lập, nổi bật hơn
cả là ganoderic (C30) và lucidenic (C27). Tùy thuộc chủng loại, môi trường sống, giai
đoạn sinh trưởng của nấm Linh chi mà hàm lượng acid ganodenic và mức độ đắng
cũng không giống nhau. Những loại Linh chi đắng thường có hàm lượng acid
ganodenic cao. Ganoderma lucidum là một nguồn giàu triterpen đắng và vị đắng được
xem như đặc trưng cho đặc tính trị liệu của chúng (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu
Hằng, 2009).
Các triterpenoid có thể biến đổi nhiều tùy theo chủng nấm Linh chi và theo từng
giai đoạn sinh trưởng phát triển. Acid ganoderic A, B, H chỉ phát hiện thấy trong quả
thể, trong khi acid ganoderic R, S, T chiếm chủ đạo trong hệ sợi nấm (M. Hirotani và
T. Furuya, 1990). Theo Miyahara và cộng sự (1987), hàm lượng triterpenoid tăng lên
khi quả thể xuất hiện và tích tụ nhiều hơn ở phía ngoài hoặc phần già (trích dẫn bởi
Nguyễn Thị Thu Hằng, 2009).

11


(a)

(b)

Hình 2.3 Các loại acid ganoderic được phân lập.
(a) Trong quả thể nấm ; (b): Trong hệ sợi nấm

2.4. Phương pháp khảo sát triterpenoid toàn phần trong nấm Linh chi
2.4.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký là kỹ thuật phân tích chất khai thác sự khác biệt trong phân bố giữa pha

động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp có thể tương tác với pha tĩnh
dựa trên điện tích, độ tan tương đối và tính hấp phụ.
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, là kỹ thuật khá đơn giản và tiện lợi.
Nó giúp nhận biết nhanh số lượng thành phần có trong hỗn hợp đem sắc ký, xác định
thành phần trong hỗn hợp nhờ so sánh hệ số lưu của hỗn hợp Rf và hệ số lưu Rf của
một số chất đã biết.
Nguyên tắc của kỹ thuật này là tách các chất trong mẫu phân tích dựa vào hiện
tượng hấp thu. Trong đó mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp nhiều chất với độ
phân cực khác nhau. Pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển
kéo theo mẫu chất ngang qua pha tĩnh là một chất hấp thu trơ như silica gel hoặc oxid
alumin. Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành
phần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau

12


theo thời gian. Một cách lí tưởng, mỗi thành phần đi qua một hệ thống trong một
khoảng thời gian riêng biệt, gọi là “thời gian lưu”.
Ưu điểm của kỹ thuật SKLM: sử dụng lượng nhỏ mẫu phân tích cũng như chất
hấp thu, quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong thời gian ngắn có thể biết ngay kết
quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau (Nguyễn Kim Phi Phụng,
2007).
2.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC được áp dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên
cứu như phân tích dược phẩm, các dung dịch sinh lý, polymer thiên nhiên hoặc tổng
hợp…
HPLC có thể phân tích nhiều mẫu phân tích có tính chất khác nhau như các hợp
chất có khối lượng phân tử lớn, hợp chất không phân cực, hợp chất rất phân cực, hợp
chất có tính bay hơi, hợp chất kém bền nhiệt…
Khả năng tách chất của HPLC dựa vào sự tương tác của các cấu tử của hỗn hợp

với các thành phần của pha động lỏng.
Ưu điểm: Áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc ký nhanh, có thể thu hồi
mẫu để thực hiện các phân tích tiếp theo do các đầu dò HPLC không làm hư hại mẫu
(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Y. Chen và ctv, 2008).
.

13


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 01/2011 đến tháng 7/2011.
Địa điểm thực hiện đề tài:


Trại thực nghiệm Viện nghiên cứu CNSH và Môi trường Trường Đại học Nông
Lâm TPHCM.



BM Thực vật – Khoa Dược Đại học Y Dược TPHCM.



Trung tâm Sâm và Dược liệu TPHCM.



Ban nghiên cứu khoa học - Khoa Dược Đại học Y Dược TPHCM.

3.2. Đối tượng nghiên cứu
3.2.1. Nguyên liệu:
-

Giống nấm trồng thí nghiệm: giống nấm Linh chi Ganoderma lucidum nguồn gốc
từ Trung tâm CNSH ứng dụng, 2 bis Nguyễn Hữu Cảnh, Q1, TPHCM.

-

Vật liệu nghiên cứu gồm:



Quả thể nấm Linh chi trồng tại trại thực nghiệm Viện nghiên cứu CNSH và Môi
trường Trường Đại học Nông Lâm TPHCM được khảo sát ở 2, 4, 6, 8 và 10 tuần
tuổi.



Quả thể nấm Linh chi mua tại công ty TNHH Linh chi VINA làm mẫu so sánh:
Linh chi VINA (Quả thể Linh chi chủng Việt Nam) và Linh chi Nhật (Quả thể Linh
chi chủng Nhật trồng tại Việt Nam).



Nguồn gốc và ngày thu mẫu thể hiện ở Bảng 3.1.
(a)

(c)

(b)
Hình 3.1 Bột quả thể các mẫu Linh chi.(a) Bột quả thể
Linh chi thí nghiệm;(b) Bột quả thể Linh chi VINA;
(c) Bột quả thể Linh chi Nhật.

14