PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN Arthrobacter CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA BỊ NHIỄM PHÈN
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1014.29 KB, 78 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN Arthrobacter
CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA
BỊ NHIỄM PHÈN
Ngành học
: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện
: NGUYỄN THỊ THU SƯƠNG
Niên khóa
: 2007 – 2011
Tháng 7 /2011
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN Arthrobacter
CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA
BỊ NHIỄM PHÈN
Hướng dẫn khoa học
Sinh viên thực hiện
ThS. TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG
KS. TRẦN THỊ QUỲNH DIỆP
Tháng 7/2011
NGUYỄN THỊ THU SƯƠNG
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả các quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến
thức cho tơi trong suốt q trình theo học tại trường.
ThS. Trương Phước Thiên Hồng đã hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt thời
gian làm đề tài tốt nghiệp.
KS. Trần Thị Quỳnh Diệp là người đã theo sát, hướng dẫn tôi tận tình trong
suốt thời gian làm đề tài.
Các Thầy Cơ giáo và các anh chị trong Viện Công nghệ Sinh học và Mơi
Trường tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian làm
đề tài tốt nghiệp.
Tồn thể lớp DH07SH đã tận tình chia sẻ, động viên tơi trong suốt q trình học
tập và làm đề tài tốt nghiệp.
Con cảm ơn ba mẹ đã nuôi dưỡng và tạo điều kiện tốt nhất cho con học tập
cũng như là chỗ dựa tinh thần để con vững bước trên đường đời.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2011
Nguyễn Thị Thu Sương
i
TĨM TẮT
Trong khí quyển nitơ là một trong những ngun tố dồi dào nhất, nó chiếm
khoảng 78,16% thể tích khơng khí. Tuy nhiên, sự thiếu hụt nitơ lại là một vấn đề dinh
dưỡng phổ biến nhất ảnh hưởng đến cây trồng trên tồn thế giới bởi vì nitơ khơng khí
là những phân tử gần như trơ (N2) mà cây trông khơng thể sử dụng trực tiếp cho các
q trình sinh trưởng, phát triển và sinh sản. Thực vật chỉ có thể đồng hóa nitơ trực
tiếp từ dạng muối nitrate. Những dạng nitơ này có thể được hiện diện trong đất từ các
lớp trầm tích tự nhiên, phân bón nhân tạo, chất thải động vật, hoặc quá trình phân hủy
hữu cơ. Vì vậy, việc bón phân đạm cho cây sẽ mang lại năng suất cao, đáp ứng cho
ngành nông nghiệp hiện đại, và nhu cầu về phân đạm sẽ tiếp tục tăng đáng kể khi dân
số và nhu cầu lương thực tồn cầu tăng. Tuy nhiên, việc sử dụng phân bón có chứa
nitơ cũng thường xuyên có tác động tiêu cực đối với mơi trường chẳng hạn như góp
phần vào sự ấm lên tồn cầu, gây nên tình trạng nitrat hóa quá mức và ô nhiễm nguồn
nước.
Nhằm bắt kịp xu thế phát triển sinh thái bền vững cũng như đáp ứng được nhu
cầu về đạm hiện nay chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và chọn lọc các
dòng vi khuẩn Arthrobacter cố định nitơ tự do trên đất trồng lúa bị nhiễm phèn”. Để
thực hiện đề tài trên chúng tôi đã sử dụng phương pháp thu thập mẫu, phương pháp
phân lập, làm thuần, phương pháp Kjeldahl, thử sinh hóa và nhuộm Gram, nhằm thu
nhận được các chủng vi khuẩn cố định nitơ tốt nhất cho cây trồng.
Với những phương pháp trên chúng tôi đã thu nhận được 20 chủng
Arthrobacter trong đó hai chủng A5, A6 có khả năng cố định đạm cao với hàm lượng
đạm lần lượt là 0,089% và 0,072%. Thời gian tối ưu cho quá trình cố định đạm của hai
chủng A5, A6 là 5 ngày. Và rỉ đường là nguồn cung cấp cacbon thích hợp nhất cho
môi trường tăng sinh khối và cố định đạm của hai chủng A5, A6 khi tiến hành sản xuất
ở quy mô lớn với tỉ lệ 2%. Hai chủng vi khuẩn có khả năng chịu pH thấp.
SUMMARY
Nitrogen is one of the most abundant elements on Earth, constituting 78,16% by
volume of the atmosphere. However, nitrogen deficiency is probably the most
common nutritional problem affecting plants worldwide because atmospheric gaseous
nitrogen is present as almost inert nitrogen (N2) molecules that is not directly available
to the plants that need it to grow, develop and reproduce. Plants are just able to
assimilate nitrogen directly in the form of nitrates that may be present in soil from
natural mineral deposits, artificial fertilizers, animal waste, or organic decay. Thus,
nitrogen fertilizers enable farmers to achieve the high yields that drive modern
agriculture, and the demand for it will continue to increase substantially as global
population and food requirements grow. However, the use of nitrogen fertilizers also
frequently has negative impacts on the environment such as contributing to global
warming and resulting in excess nitration and contamination of water supplies.
The thesis “Isolation and selection of Arthrobacter strains capable of fixing
nitrogen in acidizing rice-cultivated soil” was conducted to meet the growing demand
for nitrogen in agriculture in sustainable way. The Arthrobacter strains possessing
highest nitrogen-fixing activity were obtained by using a variety of established
methods including sample collection, isolation of pure cultures, Kjeldahl method,
biochemistry testing and Gram staining.
Among twenty strains of Arthrobacter isolated in this study, we selected two
strains A5 and A6 that were capable of fixing nitrogen with high nitrogen contents,
respectively 0,089% and 0,072%. The optimal fixation of these two strains was at five
days and molasses was found to be the most appropriate source of carbon for biomass
production and nitrogen fixation of these two strains, when conducting large-scale
production at a rate of 2%. These two strains were able to survive at low pH.
iii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ I
TÓM TẮT .................................................................................................................... II
SUMMARY ................................................................................................................. III
MỤC LỤC ................................................................................................................... IV
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................VII
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... VIII
DANH SÁCH CÁC HÌNH ......................................................................................... IX
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ .........................................................................................................1
1.2. YÊU CẦU ĐỀ TÀI .................................................................................................2
1.3. NỘI DUNG THỰC HIỆN ......................................................................................2
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3
2.1. ĐạI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO ....................................3
2.1.1. VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO (TRẦN CẨM VÂN, 2001) ..................3
2.1.2. ARTHROBACTER .............................................................................................3
2.2. QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH NITƠ .............................................................................4
2.2.1. VỊNG TUẦN HỒN NITƠ TRONG TỰ NHIÊN ..........................................4
2.2.2. CỐ ĐỊNH NITƠ TRONG TỰ NHIÊN ..............................................................5
2.2.3. SẢN XUẤT NITƠ TRONG CÔNG NGHIỆP ..................................................6
2.2.4. CỐ ĐỊNH NITƠ NHỜ VI SINH VẬT...............................................................6
2.3. QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP VÀ PHÂN GIẢI CÁC HỢP CHẤT CHỨA NITƠ
.........................................................................................................................................7
2.3.1. Q TRÌNH AMƠN HĨA ................................................................................7
2.3.2. Q TRÌNH NITRAT HĨA .............................................................................7
2.3.3. Q TRÌNH PHẢN NITRAT ...........................................................................8
2.3.4. Q TRÌNH CỐ ĐỊNH N2 ................................................................................8
2.4. VAI TRỊ CỦA NITƠ ĐỐI VỚI THỰC VẬT .....................................................8
2.5. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .....................................9
2.5.1. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC .......................................................9
2.5.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI ..................................................10
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................12
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ...............................................................................12
3.2. VẬT LIỆU, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT .......................................12
3.2.1. MẪU ĐẤT PHÂN LẬP .....................................................................................12
3.2.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ .................................................................................13
3.2.3. HÓA CHẤT .......................................................................................................13
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................13
3.3.1. PHÂN LẬP VÀ LÀM THUẦN ........................................................................13
3.3.1.1. LẤY MẪU .......................................................................................................13
3.3.1.2. PHÂN LẬP VÀ CHỌN LỌC ........................................................................14
3.3.1.3. LÀM THUẦN VI KHUẨN ............................................................................14
3.3.2. BẢO QUẢN GIỐNG VI KHUẨN ...................................................................14
3.3.3. ĐỊNH DANH VI KHUẨN.................................................................................14
3.3.3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI ...............................................................................14
3.3.3.2. NHUỘM GRAM .............................................................................................14
3.3.3.3. ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA.................................................................................14
3.3.4. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL ..17
3.3.5. KHảO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN, NGUỒN
CACBONHYDRATE LÊN KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH NITƠ CỦA CÁC CHỦNG
VI KHUẨN ...................................................................................................................19
3.3.6. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỊU AXIT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
CHỌN LỌC..................................................................................................................19
3.3.7. XỬ LÝ SỐ LIỆU ...............................................................................................20
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................21
4.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ LÀM THUẦN ........................................................21
4.2. KẾT QUẢ QUAN SÁT HÌNH THÁI, NHUỘM GRAM VÀ SINH HĨA ......22
4.2.1. KẾT QUẢ QUAN SÁT HÌNH THÁI ..............................................................22
4.2.2. KẾT QUẢ NHUỘM GRAM VÀ SINH HÓA.................................................23
v
4.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐẠM TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG
PHÁP KJELDAHL .....................................................................................................25
4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH
NITƠ .............................................................................................................................26
4.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBONHYDRATE
LÊN QUÁ TRÌNH NHÂN SINH KHỐI VÀ CỐ ĐỊNH NITƠ ...............................27
4.5.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC NGUỒN ĐƯỜNG LÊN
QUÁ TRÌNH NHÂN SINH KHỐI VÀ CỐ ĐỊNH NITƠ ........................................27
4.5.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỈ LỆ RỈ ĐƯỜNG THÍCH HỢP NHẤT CHO
Q TRÌNH NHÂN SINH KHỐI VÀ CỐ ĐỊNH NITƠ CỦA CÁC CHỦNG VI
KHUẨN CHỌN LỌC..................................................................................................28
4.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG AXIT LÊN
KHẢ NĂNG TĂNG SINH KHỐI VÀ CỐ ĐỊNH ĐẠM ..........................................30
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................32
5.1. KẾT LUẬN ...........................................................................................................32
5.2. ĐỀ NGHỊ ...............................................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHảO ...........................................................................................33
PHỤ LỤC .........................................................................................................................
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP: Adenosine Triphosphate
ADP: Adenosine Diphosphate
ĐH: Đại học
MIC: Minimal Inhibitory Concentration
NA: Nutrient agar
NB: Nutrient broth
NT: Nghiệm thức
vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu, nơi lấy mẫu và pH mẫu -------------------------------------------- 12
Bảng 4.1 Mật số vi khuẩn Arthrobacter trên các mẫu đất -------------------------------- 21
Bảng 4.2 Hình thái khuẩn lạc của các chủng Arthrobacter ------------------------------- 23
Bảng 4.3 Một số phản ứng sinh hóa của chủng Arthrobacter ---------------------------- 24
Bảng 4.4 Hàm lượng đạm trong canh trường nuôi cấy 20 chủng vi khuẩn ------------- 25
Bảng 4.5 Hàm lượng đạm tổng số trong canh trường nuôi cấy chủng a5, a6 với các
nguồn cacbonhydrate --------------------------------------------------------------------------- 27
Bảng 4.6 Hàm lượng đạm tổng số (%) trong canh trường nuôi cấy chủng a5, a6 ----- 29
Bảng 4.7 Hàm lượng đạm tổng số a5, a6 trong môi trường nuôi cấy axit -------------- 31
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Arthrobacter globiformis ifo 12137 .................................................................4
Hình 2.2 Vịng tuần hồn nitơ trong tự nhiên .................................................................5
Hình 2.3 Cấu trúc của protein fe ở nitrogenase ..............................................................7
Hình 2.4 Lúa bón đủ đạm và khơng bón đạm.................................................................9
Hình 3.1 Sơ đồ xác định hàm lượng đạm tổng số.........................................................18
Hình 4.1 Khuẩn lạc đặc trưng của chủng Arthrobacter................................................22
Hình 4.2 Nhuộm gram của nhóm vi khuẩn Arthrobacter .............................................24
Hình 4.3 Biểu đồ hàm lượng đạm tổng số trong canh trường ni cấy .......................26
Hình 4.4 Biểu đồ mật độ vi khuẩn trên các nguồn cacbonhydrate ...............................27
Hình 4.5 Biểu đồ mật độ vi khuẩn trên các hàm lượng rỉ đường .................................29
Hình 4.6 Biểu đồ mật độ vi khuẩn trong các môi trường axit ......................................30
ix
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Dân số ngày càng tăng, nhu cầu xã hội ngày càng phát triển cao đòi hỏi con
người phải sử dụng nhiều biện pháp khác nhau để tăng năng suất, sản lượng cây trồng
và vật nuôi. Đặc biệt là trong lĩnh vực nông nghiệp, lương thực thực phẩm là một vấn
đề cấp thiết hiện nay.
Vì thế năng suất cây trồng luôn luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu trong nông
nghiệp từ trước đến nay, đặc biệt là những nước có nền nơng nghiệp vẫn cịn giữ vai
trị quan trọng như nước ta. Do đó đã có nhiều phương pháp được sử dụng nhằm nâng
cao năng suất cây trồng như sử dụng phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật. Tuy
nhiên những biện pháp này dễ gây ô nhiễm môi trường sinh thái, gây thối hóa đất
trồng cũng như ảnh hưởng đến sức khỏe con người và vật ni. Trong khi đó xu thế
phát triển sinh thái bền vững đang thu hút sự quan tâm của toàn nhân loại hiện nay và
trong tương lai. Chính vì thế việc ứng dụng các chế phẩm sinh học cho mục đích ổn
định, tăng năng suất cây trồng cũng như phát triển sinh thái bền vững đang được đặt
lên hàng đầu.
Xu thế mới trong phát triển công nghệ và ứng dụng hiện nay là sử dụng các chế
phẩm, phân bón sinh học trong đó chủ yếu là các sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật.
Và thực tiễn sản xuất hiện nay là sử dụng các loại chế phẩm nhiều loài, nhiều chủng
nhằm làm tăng và ổn định hiệu lực của chế phẩm. Việc sử dụng các sản phẩm sinh học
như chế phẩm, phân bón sẽ góp phần cải tạo đất, giảm ô nhiễm môi trường, sinh thái
nhưng vẫn đáp ứng được nhu cầu bức thiết về lương thực hiện nay. Trong đó nhóm chế
phẩm đặc biệt quan trọng là nhóm có chứa vi sinh vật cố định đạm, nitơ tự do.
Chính vì thế mà việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật cố định đạm
trên đất phèn để bổ sung vào chế phẩm vi sinh là điều rất cần thiết để mang lại hiệu
quả cao trong nơng nghiệp. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập và
tuyển chọn các dòng vi khuẩn Arthrobacter cố định nitơ tự do trên đất trồng lúa bị
nhiễm phèn”.
1
1.2. Yêu cầu đề tài
Phân lập và chọn lọc các dịng Arthrobacter có khả năng cố định nitơ tự do trong đất
trồng lúa bị nhiễm phèn.
Khảo sát một số phản ứng sinh hóa và nhuộm Gram.
Xác định khả năng cố định nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl.
Xác định được thời gian tối ưu cho quá trình cố định nitơ trong mơi trường chọn lọc.
Xác định được nguồn cacbonhydrate tối ưu cho quá trình nhân sinh khối và cố định
nitơ của các chủng chọn lọc.
Đánh giá được khả năng chịu pH axit của các chủng chọn lọc.
1.3. Nội dung thực hiện
Thu thập 20 mẫu đất từ những vùng trồng lúa bị nhiễm phèn ở Tiền Giang và Long An.
Phân lập và làm thuần các dịng vi khuẩn trong mơi trường chọn lọc.
Tiến hành định danh bằng một số phản ứng sinh hóa khác nhau, nhuộm Gram nhằm
bước đầu xác định các dòng vi khuẩn Arthrobacter cố định nitơ tự do.
Chọn ra chủng Arthrobacter có khả năng cố định nitơ tự do cao nhất bằng phương
pháp xác định hàm lượng đạm tổng số (phương pháp Kjeldahl).
Khảo sát khả năng cố định nitơ của các dòng Arthrobacter chọn lọc ở những thời
gian nuôi cấy khác nhau.
Khảo sát khả năng tăng sinh khối và cố định nitơ trên các nguồn cacbonhydrate.
Khảo sát khả năng tăng sinh khối và cố định nitơ của các dịng Arthrobacter ở mơi
trường axit.
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ tự do
2.1.1. Vi khuẩn cố định nitơ tự do (Trần Cẩm Vân, 2001)
Là những vi khuẩn có hoạt tính nitrogenase có khả năng đồng hóa nitơ của
khơng khí thành đạm amơn. Thuộc về nhóm này có hàng nghìn chủng vi sinh vật khác
nhau như:
Vi khuẩn Azotobacter được nhà bác học Beyjeirinh phân lập năm 1901 từ đất
có khả năng cố định nitơ phân tử cao. Đây là chủng có khả năng đồng hóa tốt các loại
đường đơn và đường kép, khi tiêu tốn 1 g glucose nó có khả năng đồng hóa được 8 18 mgN. Ngồi ra Azotobacter cịn có khả năng tiết một số vitamine thuộc nhóm B,
một số axit hữu cơ, các loại chất kháng sinh thuộc nhóm Amixomycin.
Vi khuẩn Beijerinskii được phân lập ở ruộng lúa nước pH rất chua vào năm 1893
bởi nhà bác học Ấn Độ Stacke. Vi khuẩn này có khả năng chống chịu cao với axit, nó có
thể phát triển ở mơi trường pH 3. Vi khuẩn có khả năng đồng hóa tốt các loại đường
đơn, đường kép, cứ tiêu tốn 1 g glucose nó có khả năng cố định được 5 - 10 mgN.
Vi khuẩn Clostridium là loại trực khuẩn Gram dương yếm khí được phân lập
vào năm 1939 bởi nhà bác học người Nga Vinogratxkii. Vi khuẩn Clostridium có khả
năng đồng hóa tốt tất cả các nguồn thức ăn vô cơ và hữu cơ, cứ 1 g glucose thì đồng
hóa được 5 - 12 mgN. Ngồi ra cịn rất nhiều vi sinh vật có khả năng cố định nitơ phân
tử khác như Thodotorula, Azospirillum, Arthrobacter sp, Chlorobium sp, Klebsiella
pneumoniae, Methanobacterium sp, Streptomyces, Nostoccaloicola.
2.1.2. Arthrobacter
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales
Họ: Micrococcaceae
Chi: Arthrobacter
(Conn và Dimmick, 1947)
3
Hình 2.1 Arthrobacter globiformis IFO 12137
(Photo by: T. Tamura, T. Nishii và K. Hatano)
Arthrobacter khi cịn non tế bào hình que bất quy tắc có kích thước 0,8 - 1,2 x
1,0 - 8,0 µm đơi lúc có hình chữ V khơng có lơng tơ. Khi phát triển có dạng que mảnh
đến cầu nhỏ với đường kính 0,6 - 1,0 µm thường ở dạng đơn, dạng đôi, đôi lúc tập
trung thành từng đám. Khuẩn lạc khi non có màu trắng trong đến trắng đục, khi già hơi
ngà vàng, một số khuẩn lạc nhăn nheo, Gram dương. Là vi khuẩn hiếu khí không di
động và không tạo axit bền, dinh dưỡng hữu cơ thường phát triển trên mơi trường có
chứa biotin cùng với q trình oxy hóa oxy. Chỉ một ít hoặc khơng sinh axit, gas trong
q trình chuyển hóa glucose và những nguồn cacbohydrate khác. Phản ứng catalase
dương tính, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 250C - 300C. Phân bố rộng trong mơi
trường, chủ yếu có trong đất. Arthrobacter gồm nhiều loài khác nhau như: Arthrobacter
globiformis (Stackebrandt và cs, 1983), Arthrobacter nicotianae, Arthrobacter
uratoxydans, Arthrobacter protophormiae (Schleifer và cs, 1972; Stackebrandt và cs,
1983), Arthrobacter sulfurous (Stackebrandt và cs, 1995).
2.2. Q trình cố định nitơ
2.2.1. Vịng tuần hồn nitơ trong tự nhiên
Trong môi trường tự nhiên nitơ tồn tại ở các dạng khác nhau, từ nitơ phân tử ở
dạng khí cho đến các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong cơ thể động thực vật và con
người. Trong cơ thể sinh vật nitơ tồn tại chủ yếu dưới các dạng hợp chất đạm hữu cơ
như protein, axit amin. Khi cơ thể sinh vật chết đi, lượng nitơ hữu cơ này tồn tại trong
đất. Dưới tác dụng của các nhóm vi sinh vật hoại sinh, protein được phân giải thành
các axit amin. Các nhóm axit amin lại được một nhóm vi sinh vật phân giải thành NH3
hoặc NH4+ gọi là nhóm vi khuẩn amơn hóa. Q trình này gọi là sự khống hóa chất
hữu cơ vì qua đó nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khống. Dạng NH4+ sẽ
được chuyển hóa thành dạng NO3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa. Các hợp chất nitrat
lại được chuyển hố thành dạng nitơ phân tử, q trình này gọi là sự phản nitrat hóa
được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn phản nitrat. Khí nitơ sẽ được cố định lại trong tế
bào vi khuẩn và tế bào thực vật sau đó chuyển hóa thành dạng nitơ hữu cơ nhờ nhóm
vi khuẩn cố định nitơ. Như vậy vịng tuần hồn nitơ được khép kín. Trong hầu hết các
khâu chuyển hóa của vịng tuần hồn đều có sự tham gia của các nhóm vi sinh vật
khác nhau. Nếu sự hoạt động của một nhóm nào đó ngừng lại, tồn bộ sự chuyển hóa
của vịng tuần hồn cũng sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng.
Hình 2.2 Vịng tuần hồn nitơ trong tự nhiên
(Nguồn: />
2.2.2. Cố định nitơ trong tự nhiên
Vì phân tử nitơ bền vững nên cần nhiều năng lượng để tách thành nguyên tử tự
do rồi sau đó mới có khả năng kết hợp với nguyên tố khác tạo hợp chất. Chớp là một
nguồn năng lượng để cố định nitơ khi tạo ra sự kết hợp nitơ và oxy trong khơng khí.
Oxyt nitơ được tạo theo phương trình (1) có thể tiếp tục bị oxy hố thành oxyt nitơ hai
(phương trình (2)) sau đó có thể kết hợp với nước mưa tạo nên ion nitrat như phương
trình (3) như sau:
5
Khoảng 6% nitơ tách khỏi khí quyển mỗi năm được cố định theo cách này.
2.2.3. Sản xuất nitơ trong công nghiệp
Năm 1905, lần đầu tiên con người tìm được phương pháp phá vỡ các dây nối
này và bắt N2 liên kết với canxi để tạo hành một dạng phân nitơ hóa học đầu tiên là
canxi xianamit. Muốn thực hiện phản ứng này người ta phải duy trì một nhiệt độ cao
đến 1000 – 11000C:
CaC2 + N2
Ca(CN)2 + C
Ít lâu sau các nhà khoa học Na Uy lại tìm được cách liên kết N2 với O2 để tạo thành
một dạng phân nitơ hóa học khác – nitrat. Phản ứng này cũng có giai đoạn địi hỏi
nhiệt độ cao đến 40000C.
N2 + O2 2NO NO2 HNO3
Năm 1908, nhà khoa học Đức Gabe đã tìm được phương pháp liên kết N2 với
H2 để tạo ammoniac. Phản ứng này không những đòi hỏi nhiệt độ cao (6000C) áp suất
cao (100 atm) mà cịn địi hỏi phải có mặt một số chất xúc tác đắt tiền (Os, Ru).
2.2.4. Cố định nitơ nhờ vi sinh vật
Khó khăn chủ yếu làm cản trở việc mở rộng nhanh chóng hơn nữa việc sản xuất
phân nitơ hóa học là vì điều kiện để phá vỡ các liên kết trong phân tử N2 không phải là
đơn giản (cần nhiệt độ cao, áp suất cao và nhiều chất xúc tác đắt tiền).
Chính vì vậy mà vai trị của các vi sinh vật cố định nitơ có một ý nghĩa hết sức lớn lao
đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền cơng nghiệp phân hóa học chưa
phát triển lắm. Những nghiên cứu gần đây nhất cho biết tổng số nitơ cố định được bởi
vi sinh vật trên toàn thế giới là khoảng 175 triệu tấn. Cố định đạm sinh học trên lúa
làm tăng đạm tổng số lên 20 - 25% (Döbereiner, 1992).
Nitrogenase và cơ chế của quá trình cố định nitơ: nitrogenase bao gồm hai
thành phần khác nhau, thành phần 1 gồm protein và Fe, thành phần 2 gồm protein, Fe,
Mo. Electron của các chất khử sẽ đi vào thành phần 1 của nitrogenase sau đó được
chuyển sang thành phần thứ 2, qua đó electron được hoạt hóa có thể phản ứng với N2.
N2 cũng đi qua 2 thành phần của nitrogenase và được hoạt hóa. Hydro được hoạt hóa
nhờ các enzym của hệ thống hydrogenase.
Năng lượng dùng trong quá trình này là ATP của tế bào. Cuối cùng NH3 được hình
thành. Cơ chế cố định nitơ này được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự do
và nhóm vi khuẩn lam sống cộng sinh.
Hình 2.3 Cấu trúc của protein Fe ở nitrogenase
(Nguồn Prescott và cs, 2005)
2.3. Quá trình tổng hợp và phân giải các hợp chất chứa nitơ
2.3.1. Q trình amơn hóa
Q trình phân hủy, chuyển hóa các hợp chất hữu cơ dưới tác dụng của vi sinh
vật để tạo thành các hợp chất hữu cơ đơn giản hơn là NH4+ hoặc NH3 thì được gọi là
q trình amơn hóa.
Sự amơn hóa ure: nhờ vào khả năng tiết ra enzym urease của một số vi sinh vật như
Planosarcina ureae, Micrococcus ureae, Bacillus amylovorum, Proteus vulgaris.
Sự amơn hóa protein: nhờ nhóm vi sinh vật phân hủy protein có khả năng tiết ra
enzym protease bao gồm protenase và peptidase thường gặp ở nhóm vi khuẩn Bacillus
mycoides, Bacillus mesentericus, Pseudomonas fluorescens, Clostridium sporogenes,
nhóm xạ khuẩn như Streptomyces rimosus, Streptomyces griseus. Vi nấm có
Aspergillus oryzae, A. flavus, A. niger.
Q trình amơn hóa axit uric và xianamit canxi, kitin.
2.3.2. Q trình nitrat hóa
Dưới tác dụng của một số lồi vi sinh vật đặc biệt, NH4+ được hình thành do
q trình amơn hóa hoặc NH4+ có ở các loại phân hóa học sẽ được tiếp tục chuyển hóa
thành NO2- rồi sau đó thành NO3- gọi là q trình nitrat hóa.
7
a. Giai đoạn nitrit hóa: vi khuẩn tham gia chuyển hóa NH3 thành NO-2 thuộc về bốn
giống khác nhau như Nitrosomonas, Nitrocystis, Nitrosolobus, Nitrosospira.
Q trình nitrit hóa theo phương trình sau:
NH4+ + 3/2 O2 NO-2 + H2O + 2H + E
b.Giai đoạn nitrat hóa vi khuẩn tham gia vào giai đoạn này gồm các giống (chi):
Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus, Streptomyces, Corynebacterium.
Cơ chế của quá trình được biểu thị bằng phương trình sau:
NO-2 + ½ O2
NO-3 + E
2.3.3. Q trình phản nitrat
NO3- trong tự nhiên dưới tác dụng của một số vi sinh vật đặc biệt sẽ được
chuyển hóa thành N2 gọi là q trình phản nitrat hóa.
Vi sinh vật tham gia quá trình này bao gồm: Pseudomonas denitrificans, Ps.
Acruginosa, Micrococus denitrificans, Bacillus lichenforsmis.
2.3.4. Quá trình cố định N2
Cố định nitơ là q trình chuyển hóa nitơ thể khí trong khí quyển thành nitơ
hợp chất như nitrit, nitrat và ammoniac. Con người, động vật, thực vật đều cần đạm,
song chúng khơng thể sử dụng trực tiếp nguồn đạm từ khí N2 mà chỉ có nhóm vi sinh
vật cố định nitơ là có khả năng này.
2.4. Vai trị của Nitơ đối với thực vật
Nitơ có trong thành phần của hầu hết các chất trong cây như protein, axit
nucleic, các sắc tố quang hợp, các chất dự trữ năng lượng (ATP, ADP), các chất điều
hịa sinh trưởng. Nó là cơ sở cấu tạo nên tế bào và mơ cây. Đồng thời nó tham gia vào
các quá trình trao đổi chất và năng lượng từ đó quyết định đến tồn bộ q trình sinh
lý của cây trồng. Vì vậy nitơ có vai trị quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển
của cây trồng hay nó quyết định đến năng suất, chất lượng sản phẩm.
Hình 2.4 Lúa bón đủ đạm và khơng bón đạm
(Nguồn: />2.5. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước
2.5.1. Một số nghiên cứu trong nước
Một số chủng Azotobacter có hoạt tính nitrogenase và sinh tổng hợp IAA đã
được phân lập và tuyển chọn từ những mẫu đất thơn Bình Kỳ, Hịa Quý, Ngũ Hành
Sơn, thành phố Đà Nẵng do nhóm sinh viên khoa Sinh – Môi trường trường ĐH Sư
Phạm Đà Nẵng tiến hành. Kết quả họ đã phân lập được 8 chủng Azotobacter có khả
năng cố định đạm, trong đó đã tuyển chọn được chủng BK - 6 cố định đạm mạnh nhất
(3,28 mg/ml) và chủng BK - 5 sinh tổng hợp IAA mạnh nhất (4,313 µg/ml). Đồng thời
bước đầu họ đã xử lí hạt đậu đen bằng dịch ni cấy của chủng BK - 5 ở độ pha loãng
10-2 và 10-3. Sau 72 giờ tỉ lệ nảy mầm ở độ pha loãng 10-2 vượt 23 % so với đối chứng.
Như vậy dịch nuôi cấy chủng BK - 5 đã kích thích và rút ngắn thời gian nảy mầm của
hạt giống (Tuyển tập báo cáo “ Hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học” lần thứ 6, 2008).
Năm 2009 một số cán bộ thuộc viện lúa đồng bằng sông Cửu Long và Viện
nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, trường ĐH Cần Thơ đã tiến hành khảo
sát ảnh hưởng của vi khuẩn cố định đạm (Gluconacetobacter diazotrophicus) lên sự
sinh trưởng, năng suất và hiệu quả kinh tế của giống ngô lai LVN 61. Kết quả nghiên
cứu cho thấy việc chủng vi khuẩn cố định đạm kết hợp với bón đạm vơ cơ sẽ giúp tăng
chiều cao cây, chiều dài bắp, đường kính bắp và số hạt/ bắp, khối lượng 100 hạt so với
bón đạm đơn thuần ở cùng mức. Khi bón đạm vơ cơ ở các mức 100, 200 và 300 kg N/ ha
và có chủng vi khuẩn thì năng suất gia tăng có ý nghĩa thống kê với tỉ lệ gia tăng năng
9
suất tương ứng là 15%, 10,5% và 9,8% so với đối chứng chỉ bón đạm vơ cơ (Dương
Văn Chín, Trần Thị Ngọc Sơn, Cao Ngọc Điệp, Trần Thị Anh Thư, 2010).
2.5.2. Một số nghiên cứu trên thế giới
Vào năm 1996 nhóm nghiên cứu Guido Funke và cộng sự đã phân lập được 11
chủng Arthrobacter spp và bước đầu đã phân 11 chủng này thành 2 nhóm B – 1 và B - 3.
Họ thu được những khuẩn lạc màu trắng xám có đường kính lớn hơn hoặc bằng 2 mm
sau 24 giờ nuôi cấy. Đây là những chủng không sinh hoặc tạo axit yếu từ đường và
hydrolysis của gelatine. Qua quá trình khảo sát người ta phát hiện lysine là một
diamino axit trên thành tế bào cũng như có sự phân cực các axit béo. Dựa vào cấu trúc
của peptidoglycan và trình tự gen 16S rRNA thì nhóm nghiên cứu của Guido Funke đã
phát hiện được 3 trong 11 chủng nghiên cứu là Arthrobacter cumminssi và một chủng
mới khác là Arthrobacter woluwemsis. Trong các chủng phân lập được thì Funke và
cộng sự tiến hành xác định mức độ nhạy cảm của các chủng phân lập được với các
nguồn kháng sinh khác nhau bằng phương pháp pha loãng kháng sinh trong môi
trường lỏng để xác định giá trị MIC.
Kết quả cho thấy rằng tất cả mọi chủng đều nhạy cảm với teichoplanin và
vancomycin. Tác động của penicillin lên các chủng vi khuẩn tốt hơn cephalosporins,
phổ kháng khuẩn của cephalosporins thì thường có giá trị MIC thấp. Các chủng vi
khuẩn khảo sát kháng penicillin thấp hơn so với imipenem (giá trị MIC của penicillin
luôn bé hơn giá trị MIC của imipenem ở cùng một chủng). Hầu hết các chủng đều
nhạy cảm với tetracycline ngoại trừ hai chủng DMMZ 483 và DMMZ 537 (MIC = 16
µg/ml). Chủng LCDC93-0702 là một trong những chủng có khả năng kháng
chloramphenicoll trong khi đó A. ureafaciens và Arthrobacter uratoxydans thì kháng
với rifampin. Ciprofloxacin, clindamycin và gentamicin có một giới hạn hoạt động đối
với mọi chủng khảo sát. Chủng CUL 1808 kháng nhiều loại kháng sinh nhưng nhạy
cảm với tetracycline, teicoplanin và vancomycin (Funke và cs, 1996).
Một nghiên cứu khác về các chủng Arthrobacter spp và các chủng vi khuẩn tương
tự Arthrobacter phân lập được từ các phòng thí nghiệm vi sinh của Gartner, Ravensburg,
Đức. Mages và cộng sự đã tiến hành phân loại các chủng trên bằng phương pháp phân tử
dựa trên trình tự 16S rRNA . Kết quả xác định được 20 nhóm trong đó có 38/50 chủng
đúng là Arthrobacter spp. Mages và cộng sự khảo sát khả năng kháng kháng sinh của các
chủng Arthrobacter spp. Kết quả cho thấy có 90,5% chủng nhạy cảm tuyệt đối với kháng
sinh, 3,9% trung gian và 5,5 % kháng kháng sinh (Mages và cs, 2008).
11
