KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Weissella paramesenteroides CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI Edwardsiella ictaluri

 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Weissella
paramesenteroides CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG
VỚI Edwardsiella ictaluri
Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TĂNG NGỌC KIỀU VY

Niên khóa

: 2007 – 20011

Tháng 07/2011
1 
 


 

Lời cảm ơn

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:

-

Ths. Võ Minh Sơn, người hướng dẫn khoa học, người đã động viên, quan tâm và tận tình
hướng dẫn tôi thực hiện, hoàn thành khoá luận tốt nghiệp.

-

Quý thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm đã tận tình chỉ dạy
và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian đại học.

-

Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo viện, cô Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh cùng các anh chị
nghiên cứu viên trực thuộc viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II đã tạo điều kiện thuận
lợi và có những giúp đỡ thiết thực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành
luận văn.

-

Con xin gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến bố mẹ, gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc và
tạo mọi điều kiện cho con được học tập tốt.

-

Cuối cùng xin cảm ơn bạn bè đã luôn động viên, hỗ trợ và sát cánh bên tôi.
Tăng Ngọc Kiều Vy

2 

 


 

TÓM TẮT
Cá tra hay cá da trơn nước ngọt Pangasius hypophthalmus là loài cá bản địa của
vùng đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam. Một trong những bệnh gây thiệt hại kinh tế
nhiều nhất đến ngành nuôi cá tra Việt Nam là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri gây ra. Hiện nay, những phương thức điều trị thông thường không
những không phát huy tác dụng mà còn gây ra hiện tượng kháng thuốc và ô nhiễm môi
trường.
Nghiên cứu cho thấy rằng Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum và
Weissella paramesenteroides là ba chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng với vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri. Vì thế, nghiên cứu này được tiến hành để khảo sát các đặc
tính sinh lý của những vi khuẩn lactic trên, cung cấp cơ sở cho quá trình lên men ở quy
mô thí điểm, từ đó hướng tới sản xuất các chế phẩm sinh học giúp tăng cường khả năng đối
kháng của cá tra với bệnh gan thận mủ.

Kết quả cho thấy ba chủng vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng tốt nhất trong
môi trường nuôi cấy có độ pH 6 – 7 và biên nhiệt độ rộng 25 – 40oC. Tất cả ba chủng
đều có khả năng sống sót ở độ pH thấp (pH 3) và hàm lượng muối cao 5%. L. plantarum
có tỷ lệ sống hơn 100% sau 6 giờ ở tất cả các nồng độ muối mật dùng trong nghiên cứu.
Ở nồng độ muối mật là 0,5%, chủng L. fermentum cho thấy khả năng chịu đựng ổn định
nhất trong suốt 24 giờ mặc dù tỷ lệ sống sau 24 giờ của chủng L. plantarum là cao hơn.
Chủng W. paramesenteroides chết sau 2 giờ tại hai nồng độ muối mật 1 và 2%. Thử
nghiệm khả năng tương thích cho thấy chủng W. paramesenteroides tiết các yếu tố ức
chế chủng L. plantarum.

3 

 


 

SUMMARY
Title: A survey of physiological characteristics of Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
fermentum and Weissella paramesenteroides antagonistic to Edwardsiella ictaluri
The freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), is indigenous to the
Mekong Delta in Vietnam. It has been cultured traditionally for decades in earthen ponds
and more recently in river-based cages. One of the most economically important diseases
of this intensively reared freshwater catfish is liver and kidney disease. Major presenting
signs included an increase in mortality that would not respond to treatment. In addition,
the traditional treatments would cause antibiotic resistance and environmental pollution.
Lactobacillus

plantarum,

Lactobacillus

fermentum

and

Weissella

paramesenteroides are three strains of lactic bacteria antagonistic to Edwardsiella ictaluri
bacterium that causes liver and kidney disease in P. hypophthalmus. This study was
conducted to examine physiological characteristics of these three lactic bacteria,
providing a basis for the pilot-scale fermentation process that aims to produce probiotics

beneficial to the host catfish against liver and kidney disease.
The results showed that the three strains could grow better in culture media with
pH 6 – 7 and a wide temperature range 25 – 40oC. All these three strains survived at a
low pH (pH = 3) and high salt content with values of 5% respectively. L. plantarum
showed more than 100 % survival rate after 6 h at all three concentrations examined of
bile salts. At the bile salts concentration of 0,5%, L. fermentum showed the best stable
resistance during 24 h though survival rate after 24h of L. plantarum was higher. W.
paramesenteroides cells were 0% resistant just 2h post challenges at two bile salts
concentrations of 1 and 2%. In compatibility test, W. paramesenteroides secreted factors
that inhibited L. plantarum.
Keywords: freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), Edwardsiella
ictaluri, liver and kidney disease, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum,
Weissella paramesenteroides.
4 
 

iii


 

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................i
TÓM TẮT...................................................................................................................... ii
SUMMARY.................................................................................................................. iii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ......................................................................................... viii

Chương 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................2 
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................10 
1.2 YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI ...................................................................................11 
1.3 NỘI DUNG THỰC HIỆN ..................................................................................12 
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................13 
2.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA ..........................13 
2.1.2 Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri .........................14 
2.1.3 Một số phương pháp mới trong phòng và trị bệnh gan thận mủ trên cá tra.15 
2.2 PROBIOTIC – CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN16 
2.2.1 Định nghĩa probiotic ....................................................................................16 
2.2.2 Cơ chế tác động của probiotic ......................................................................17 
2.3 VI KHUẨN LACTIC – TIỀM NĂNG SẢN XUẤT PROBIOTIC ...................19 
2.4 QUORUM SENSING – PHÂN TỬ TÍN HIỆU Ở VI SINH VẬT ....................21 
2.4.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing ..........................................................21 
2.4.2 Các enzyme tham gia quá trình phân hủy AHL ...........................................21 
2.4.3 Hệ thống quorum sensing của vi khuẩn Edwardsiella spp. .........................23 
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................24 
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ....................................................24 
3.2 VẬT LIỆU ..........................................................................................................24 
5 
 


 

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................26 
3.3.1 Nội dung thử nghiệm ...................................................................................26 
3.3.2 Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa mật độ vi khuẩn và giá trị OD ....27 
3.3.3 Khảo sát đặc tính đối kháng với E. ictaluri và các chủng gây bệnh ............28 
3.3.4 Khảo sát phân huỷ quorum sensing .............................................................29 

iv

3.3.5 Khảo sát đặc tính sinh lý ..............................................................................30 
3.3.6 Khảo sát đặc tính tương thích giữa các chủng vi khuẩn lactic.....................32 
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................34 
4.1 Kết quả ................................................................................................................34 
4.1.1 Đường chuẩn tương quan giữa mật độ vi khuẩn và giá trị OD600 ..............34 
4.1.2 Kết quả đối kháng với Edwardseilla ictaluri và các chủng gây bệnh .........35 
4.1.3 Kết quả phân huỷ quorum sensing ...............................................................36 
4.1.4 Kết quả khảo sát đặc tính sinh lý .................................................................38 
4.1.5 Kết quả khảo sát đặc tính tương thích ..........................................................44 
4.2 Thảo luận ............................................................................................................45 
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................48 
5.1 Kết luận ...............................................................................................................48 
5.2 Đề nghị ................................................................................................................48 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................50 

6 
 


 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AHL

N-acyl homoserine lactone

BA

Blood agar

BHIA

Brain heart infusion Agar

BHIB

Brain Heart Infusion Broth

CFU

Colony forming unit

Ctv

Cộng tác viên

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

EMB

Eosine Methylene blue agar

ESC

Enteric Septicaemia of Catfish)

FAO

Food and Agriculture Organization

HHL

N-hexanoyl homoserine lactone

LAB

Lactic acid bacteria (vi khuẩn lactic)

LBA

Luria Bertani agar

MRSA

DeMan, Rogosa, and Sharpe agar

MRSB

DeMan, Rogosa, and Sharpe broth

TSA

Trytone Soya Agar

VSV

Vi sinh vật

WHO

World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)

7 
 


 

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1 Kết quả đối kháng với E. ictaluri và các chủng gây bệnh ............................22
Bảng 4. 2 Khảo sát khả năng phân hủy phân tử tín hiệu HHL ....................................37
Bảng 4.3 Kết quả khảo sát tương thích giữa các chủng vi khuẩn lactic ......................44

8 
 


 

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Sự phân hủy phân tử AHL bằng enzyme . ....................................................22
Hình 4.2 Phương trình đường chuẩn tương quan giữa mật độ vi khuẩn và OD. .........35
Hình 4.3 Vòng kháng khuẩn của các chủng lactic .......................................................36
Hình 4.4 Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ HHL và đường kính vòng sắc tố ...37
Hình 4.5 Vòng sắc tố violacein ở các nồng độ HHL khác nhau..................................37
Hình 4.6 Kết quả khả năng dung huyết của 3 chủng lactic .........................................38

Hình 4.7 Ảnh hưởng của pH lên tăng trưởng .............................................................39
Hình 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng .....................................................40
Hình 4.9 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên tăng trưởng. ............................................41
Hình 4.10 Khả năng chịu pH thấp . .............................................................................42
Hình 4.11 Khả năng chịu muối mật. ............................................................................44
Hình 4.12 Vòng đối kháng tạo thành bởi 108 ức chế 111. ..........................................45

9 
 


 

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Thuỷ sản là một trong những ngành mang lại lợi nhuận cao cho nền kinh tế và thu
hút nhiều lao động. Trong khoản 10 năm gần đây ngành thuỷ sản nói chung và nuôi trồng
thuỷ sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ. Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) là
loài cá da trơn nước ngọt có giá trị kinh tế cao, phân bố tự nhiên tập trung chủ yếu ở vùng
hạ lưu sông Mekong. Việt Nam, Campuchia, Lào và Thái Lan là những quốc gia chính
nuôi đối tượng này. Ở Việt Nam cá tra được nuôi với quy mô lớn ở một số tỉnh Đồng
Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền
Giang.... Sản lượng cá tra ước tính đạt khoảng 300000 tấn năm 2004, đạt 400000 tấn năm
2005, đạt 800000 tấn trong năm 2006, đạt 1000000 tấn vào năm 2007, 1128014 tấn trong
năm 2008 và 1,2 triệu tấn năm 2009, tổng sản lượng năm 2010 là 1,141 triệu tấn, kim
gạch xuất khuẩu đạt 1,44 tỉ USD (Báo cáo hội nghị tổng kết cá tra xuất khẩu năm 2010).
Kỹ thuật nuôi thâm canh đã giúp cải thiện đáng kể năng suất trong nuôi trồng thủy sản
nói chung và cá tra nói riêng. Tuy nhiên, bên cạnh đó, nó cũng đồng thời gây ra tình trạng
ô nhiễm môi trường, dịch bệnh. Bệnh cá tra chủ yếu do vi khuẩn và ký sinh trùng gây nên
và có thể gây chết lên đến 70 - 80% (Loan và ctv, 2007). Một trong những bệnh truyền

nhiễm đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng cá nuôi là bệnh gan
thận mủ gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi được phát
hiện đầu tiên vào cuối năm 1998. Hiện nay bệnh này gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá tra thâm
10 
 


 

canh ở các tỉnh ĐBSCL. Tỷ lệ cá chết khi bị nhiễm bệnh gan thận mủ có thể lên đến 90%. Để

phòng ngừa và điều trị bệnh, hầu hết nông dân dùng thuốc kháng sinh. Sự lạm dụng
kháng sinh đã tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc và dư lượng thuốc kháng sinh trong
các sản phẩm chế biến từ động vật thủy sản (Cabello, 2006).
Với mục tiêu thay thế dần phương pháp phòng và trị bệnh truyền thống, các
phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như
vaccine, các chất tăng cường hệ miễn dịch (immunostimulants), chế phẩm sinh học
(probiotic). Nghiên cứu về vaccine ứng dụng trên cá tra vẫn đang được nhiều nhà khoa
học quan tâm. Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa một số
bệnh gây ra bởi vi khuẩn và virus, nhưng chưa được sử dụng phổ biến do giá thành quá
cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc cho cá (Ellis, 1988). Do đó, phương
pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) đang được đánh giá cao và trở
thành công cụ phòng ngừa, điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông
qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh gây bệnh. Đã có nhiều nghiên
cứu được tiến hành nhằm phát triển các dòng sản phẩm probiotic phục vụ cho nuôi trồng
thuỷ sản, một trong số đó là đề tài “Tạo chế phẩm vi sinh có tính đối kháng với vi khuẩn gây
bệnh gan - thận mủ ở cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus)” do Viện Nghiên Cứu Nuôi
Trồng Thủy Sản II chủ trì. Sau quá trình tiến hành phân lập, tuyển chọn, định danh, tác giả đã
phân lập được một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn lactic từ hệ tiêu hóa cá tra được xác
định là có đặc tính đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Tuy nhiên trước khi bước vào giai

đoạn sản xuất trên qui mô pilot cần phải tiến hành khảo sát một số đặc tính sinh học nhằm đánh
giá tiềm năng probiotic phục vụ cho quá trình lên men sản xuất tạo chế phẩm vi sinh. Trên cơ sở
đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài tốt nghiệp “Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Weissella paramesenteroides có khả

năng đối kháng với Edwardsiella ictaluri“
1.2 YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
Khảo sát một số đặc tính sinh lý, khả năng tương thích, tính đối kháng với vi
khuẩn gây bệnh gan thận mủ của 3 chủng vi khuẩn Weissella paramesenteroides,
11 
 


 

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum. Từ đó cho phép đánh giá tiềm năng
probiotic của các chủng vi khuẩn này.

1.3 NỘI DUNG THỰC HIỆN
-

Khảo sát khả năng đối kháng với Edwardsiella ictaluri và các chủng vi khuẩn gây bệnh
trên động vật thủy sản.

-

Khảo sát khả năng phân hủy HHL.

-

Khảo sát đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn lactic:

 Khảo sát đặc tính dung huyết.
 Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, độ mặn lên tăng trưởng.

-

Khảo sát khả năng sống sót trong điều kiện pH dạ dày, muối mật.

Khảo sát sự tương thích giữa các chủng vi khuẩn lactic.

12 
 


 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA
2.1.1 Edwardsiella ictaluri và bệnh gan thận mủ trên cá tra

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đã được phát hiện gây bệnh trên cá nheo Mỹ,
Ictalurus punctatus, vào năm 1979 (Hawke, 1979). Năm 1999, Austin và ctv cũng đã xác
định Edwardsiella ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá da trơn,
hội chứng này được gọi tắt là ESC (Enteric Septicaemia of Catfish) và có thể dẫn đến tỉ lệ
chết cao ở cá nheo Mỹ.
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thuộc họ Enterbacteriaceae là vi khuẩn gram âm,
hình que, kích thước 1 x 2 – 3 μm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, phản
13 
 

 

ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi trường
glucose (Speyerer và Boyle, 1987; Newton và ctv,1988). Ewardsiella ictaluri là một
trong những loài khó tính nhất của chủng Edwarsiella. Tăng trưởng chậm trên môi
trường nuôi cấy, cần từ 36 - 48 giờ ở 28 - 30oC để phát triển thành khuẩn lạc nhỏ trên
thạch BHIA (Brain heart infusion Agar) và vi khuẩn tăng trưởng chậm hoặc không tăng
trưởng khi ủ ở 37oC. Vi khuẩn có thể phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận, tỳ tạng) trên
môi trường TSA (Trytone Soya Agar), EMB (Eosine Methylene blue agar) hoặc trên môi
trường thạch máu (Blood agar) sau 48 giờ ở 28oC tạo thành khuẩn lạc màu trắng đục.
Bệnh mủ ở gan thận trên cá tra xuất hiện lần đầu tiên ở Việt Nam vào cuối năm
1998 và trở thành bệnh đặc biệt nguy hiểm đối với nghề nuôi cá da trơn xuất khẩu ở
ĐBSCL. Bệnh có thể gây chết tích lũy 10 - 90% cá nuôi nếu không có biện pháp can
thiệp kịp thời khi bệnh xảy ra. Cho tới nay, tác nhân gây ra bệnh gan thận mủ ở cá tra
được xác định là Edwardsiella ictaluri (Crumlish và ctv, 2002).
2.1.2 Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận
mủ trên cá tra nuôi thâm canh
Do nghề nuôi cá tra ở Việt Nam phát triển tự phát quá nhanh nên các nghiên cứu
về dịch bệnh và các biện pháp quản lý chưa thể đáp ứng kịp. Trong những năm qua, hầu
hết người nuôi cá tra đối phó với dịch bệnh theo kinh nghiệm, qua quan sát dấu hiệu bệnh
lý hoặc dựa theo tỉ lệ cá chết hàng ngày. Việc sử dụng thuốc, hóa chất không đúng qui
định và lặp đi lặp lại trong thời gian dài đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của nhiều tác
nhân gây bệnh trong nuôi cá tra, đặc biệt là các bệnh do vi trùng gây ra. Cụ thể người ta
đã phát hiện rằng tác nhân gây bệnh gan thận mủ, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (theo
kết quả định danh của Crumlish và ctv, 2002), đã kháng với khá nhiều loại kháng sinh
như: Bactrime (100%), colistin (97,9%), florphenicol (42,5%), amoxicillin (40,4%),
tetracyclin (31,9%), doxycyclin (27,7%) (Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan,
2007). Nguyễn Thanh Phương (2007) xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của 8

chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá tra bệnh mủ gan, cho thấy cả 8
chủng đều cho kết quả kháng với colistin, oxolinic acid, streptomycin, cefepime,
14 
 


 

ceftriaxone, cefazolin, gentamycin, aztreonam, cefixim, cefotaxime, oxytetracycline và
amoxicillin. Đáng lo ngại hơn là sản phẩm cá tra sau thu hoạch thường không được ưa
chuộng do sự tích lũy thuốc, hóa chất trong thịt, làm giảm uy tín của sản phẩm cá tra xuất
khẩu ra thị trường nước ngoài.
2.1.3 Một số phương pháp mới trong phòng và trị bệnh gan thận mủ trên cá tra
Trước những nguy cơ tiềm ẩn từ việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị bệnh gan
thận mủ, ở nước ta đã có một số nghiên cứu hướng tới những liệu pháp điều trị an toàn và
hiệu quả hơn. Từ năm 2005, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản II đã phối hợp với
Công ty Thuốc Thú y Trung ương II (Navetco) thực hiện đề tài “ Nghiên cứu vaccine
phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá mú, cá giò, cá hồng mỹ nuôi công nghiệp”, trong
đó đối tượng được quan tâm đặc biệt là cá tra. Sau 3 năm thực hiện, việc nghiên cứu
vaccine phòng bệnh gan thận mủ ở cá tra đã đạt được một số kết quả khả quan và bước
đầu ứng dụng vào thực tiễn. Tuy nhiên, các loại vaccine này hầu hết là vaccine bất hoạt
có thời gian miễn dịch ngắn.
Việc sử dụng các chế phẩm sinh học hoặc vi khuẩn có lợi có khả năng kiểm soát mầm
bệnh thông qua một loạt các cơ chế, đang ngày càng được xem như là một giải pháp thay thế cho
điều trị kháng sinh. Các chế phẩm sinh học này được sử dụng trong dinh dưỡng cho con người
và động vật và gần đây, chúng đã bắt đầu được áp dụng trong nuôi trồng thủy sản (Balca´zar và
ctv, 2006). Trong đó, chế phẩm probiotic Bokashi được chiết xuất từ lá trầu của nhóm

nghiên cứu Khoa Thủy sản, trường Đại học Nông Lâm Huế được xem là một trong
những hướng nghiên cứu đột phá trong việc phòng và trị bệnh cho tôm cá. Thành phần hệ

vi sinh vật trong chế phẩm này bao gồm vi khuẩn lactic (50%), vi khuẩn quang hợp
(20%), nấm men (20%), xạ khuẩn (5%), nấm sợi (5%). Qua kết quả thử nghiệm của Công
ty TNHH Hải Nông Phát thành phố Hồ Chí Minh trên một số ao nuôi cá tra, basa từ
tháng 4/2006 đến nay đã đạt được những thành công nhất định trong việc phòng bệnh gan
thận mủ (Nguyễn Khoa Diệu Hà, 2009).

15 
 


 

2.2 PROBIOTIC – CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN
2.2.1 Định nghĩa probiotic
Thuật ngữ “probiotic” thường dùng để mô tả một quần thể vi sinh vật có nhiệm vụ
kiểm soát hoặc điều chỉnh quá trình sinh học. Từ probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp
“ pro” có nghĩa là “dành cho” và “bios” có nghĩa là “ sự sống” (Lilly và Stillwell, 1965).
Năm 1965, Lilly và Still đã định nghĩa probiotic là “những nhân tố kích thích sự phát
triển được sản xuất bởi vi sinh vật”. Năm 1974 Parker đã định nghĩa probiotic dựa trên
mối quan hệ giữa vi sinh vật với vật chủ “probiotic là những sinh vật và những cơ chất có
lợi cho động vật có khả năng cải thiện hệ vi sinh đường ruột”. Đến năm 1989, Fuller mở
rộng định nghĩa “probiotic là sinh vật sống được cung cấp dưới dạng thức ăn cho động
vật nhằm cải thiện cân bằng hệ sinh vật đường ruột”. FAO/WHO, định nghĩa “probiotic
là các vi sinh vật sống mà khi tiêu thụ với số lượng đầy đủ, tạo một lợi ích sức khỏe cho
cơ thể vật chủ” (Lillyvà Stillwell, 1965). Theo đó định nghĩa của Fuller được bổ sung:
“probiotic là những vi sinh vật sống được bổ sung vào thức ăn có ảnh hưởng tốt với vật
chủ bằng cách cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ” (Fuller, 1992). Một định
nghĩa ngắn gọn của Irianto và Austin (2002a): “probiotic là toàn bộ hoặc các thành phần
của một vi sinh vật có lợi cho sức khỏe của vật chủ”.
Tuy nhiên, đối với chế phẩm sinh học dùng cho thủy sản quan trọng là phải xem xét

yếu tố ảnh hưởng của các chế phẩm này đến môi trường bởi động vật thủy sản có mối
quan hệ gần gũi hơn với môi trường. Các tác nhân gây bệnh tiềm năng có thể duy trì sự
sống trong môi trường bên ngoài của động vật (nước) và sinh trưởng một cách độc lập
với vật chủ (động vật thủy sản). Đồng thời hệ vi sinh vật ở động vật thuỷ sản cũng có thể
bị tác động bởi điều kiện môi trường. Căn cứ vào mối quan hệ phức tạp của động vật
thủy sản với môi trường bên ngoài, định nghĩa của một probiotic cho thủy sản cần phải
được sửa đổi. Một định nghĩa khác được đưa ra "probiotic bao gồm một hay nhiều vi sinh
vật sống phụ trợ trong đó có tác động có lợi trên vật chủ bằng cách thay đổi các cộng
đồng vi sinh vật bên trong vật chủ hoặc hệ vi sinh vật của môi trường, cải thiện hay nâng
cao giá trị dinh dưỡng, kích thích miễn dịch, hoặc cải thiện chất lượng môi trường xung
16 
 


 

quanh" ( Verschuere và ctv, 2000). Verschuere và ctv (2000) đã đưa ra các tiêu chí chọn
lọc probiotic như sau:
 An toàn và hiệu quả.
 Không gây bệnh đối với vật chủ.
 Có thể sống sót trong hệ tiêu hóa, có khả năng bám vào biểu mô ruột và hình
thành quần thể trong hệ tiêu hóa.
 Hoàn toàn không mang gen kháng kháng sinh và tạo độc tố.
2.2.2 Cơ chế tác động của probiotic (Balcázar và ctv, 2006)
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về probiotic trong nuôi trồng thủy sản được công
bố trong nhiều thập kỷ qua nhưng cơ chế hoạt động của probiotic vẫn còn hạn chế. Tuy
nhiên có một vài đặc tính ưu việt của probiotic tác động trên vật chủ được đưa ra như: (i)
Đối kháng với vi khuẩn gây gệnh, (ii) Cung cấp chất dinh dưỡng và các enzyme tiêu hoá,
(iii)Trực tiếp hấp thu các chất hữu cơ bị phân huỷ, (iv) Tăng cường đáp ứng miễn dịch
của vật chủ với vi sinh vật gây bệnh, (v) Tác dụng kháng virus.

2.2.2.1 Đối kháng với vi khuẩn gây bệnh
Vi khuẩn đối kháng là một hiện tượng phổ biến trong tự nhiên, do vậy, các tương
tác vi sinh đóng một vai trò quan trọng trong cân bằng cạnh tranh giữa các vsv có lợi và
các vsv có khả năng gây bệnh. Có nhiều cơ chế cho sự đối kháng như: Sản sinh các hợp
chất ức chế, cạnh tranh chất dinh dưỡng hay năng lượng có sẵn, cạnh tranh vị trí bám
dính. Quan trọng hơn là thành phần của cộng đồng vi khuẩn có thể được thay đổi bằng
những tác động trong quá trình chăn nuôi và các điều kiện môi trường kích thích sự phát
triển của các loài vi khuẩn được lựa chọn. Điều đó cũng có nghĩa là các vi sinh vật ở
đường tiêu hóa của động vật thủy sản có thể được tác động để thay đổi, ví dụ bằng cách
ăn các vi sinh vật khác. Từ đó đưa ra một công cụ hữu hiệu, tiềm năng giúp giảm hoặc
loại bỏ tỷ lệ mắc bệnh cơ hội thông qua cơ chế sử dụng vi sinh vật đối kháng.
2.2.2.2 Cung cấp chất dinh dưỡng và các enzyme tiêu hoá
Một số nghiên cứu cho thấy vi sinh vật có lợi cho quá trình tiêu hóa của động vật
thuỷ sản. Cụ thể là ở cá, Bacteroides và Clostridium sp. cung cấp chất dinh dưỡng, đặc
17 
 


 

biệt là cung cấp các axit béo và các vitamin. Một số vi sinh vật như Agrobacterium sp.,
Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., Microbacterium sp. và Staphylococcus sp. có thể
đóng góp vào quá trình dinh dưỡng. Ngoài ra, một số vi khuẩn có thể tham gia vào các
quá trình tiêu hóa của động vật hai mảnh vỏ bằng cách sản xuất enzym ngoại bào như
protease, lipases, cũng như cung cấp các yếu tố tăng trưởng cần thiết. Vi sinh vật có thể
phục vụ như một nguồn bổ sung các dinh dưỡng và hoạt động của chúng trong đường
tiêu hóa có thể là một nguồn cung cấp vitamin hoặc các axit amin thiết yếu.
2.2.2.3 Tác động cải thiện chất lượng nước
Khả năng cải thiện chất lượng nước đã đặc biệt được gắn với nhóm vi khuẩn
Bacillus. Lý do là vi khuẩn Gram dương thì chuyển hoá chất hữu cơ thành CO2 tốt hơn so

với vi khuẩn Gram âm. Mức độ chuyển hoá cao của vi khuẩn Gram dương có thể giảm
thiểu sự tích tụ các cacbon hữu cơ.
2.2.2.4 Tăng cường đáp ứng miễn dịch
Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi probiotic. Nó đã
được chứng minh rằng vi khuẩn Clostridium butyricum giúp cá hồi vân tăng cường sức
đề kháng với các phẩy khuẩn gây bệnh - vibriosis, bằng cách tăng các hoạt động thực bào
của bạch cầu (Sakai và ctv, 1995). Sự bảo vệ này là do sự kích thích hệ thống miễn dịch,
bằng cách gia tăng quá trình thực bào thực bào và hoạt tính kháng khuẩn.
2.2.2.5 Kháng virus
Một số vi khuẩn có tác dụng kháng virus. Mặc dù cơ chế chính xác mà theo đó các
vi khuẩn làm điều này chưa được biết. Các nghiên cứu cho thấy sự bất hoạt virus có thể
xảy ra bởi hóa chất và các chất sinh học, chẳng hạn như chất chiết xuất từ tảo biển và các
chất ngoại bào của vi khuẩn. Ngoài ra còn có báo cáo các chủng Pseudomonas sp.,
Vibrios sp., Aeromonas sp., và nhóm Coryneforms phân lập từ các trại giống cá hồi cho
thấy hoạt động đối kháng đối với virus truyền nhiễm gây hoại tử tạo máu.

18 
 


 

2.3 VI KHUẨN LACTIC – TIỀM NĂNG SẢN XUẤT PROBIOTIC TRONG NUÔI
TRỒNG THUỶ SẢN
Vi khuẩn lactic (LAB) thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, chịu axit,
có dạng hình que hoặc hình cầu, có khả năng lên men đường để tạo axit lactic. Về mặt
sinh hoá, LAB được chia thành hai nhóm: nhóm lên men lactic đồng hình (sản phẩm lên
men chỉ thuần axit lactic) và nhóm lên men lactic dị hình (sản phẩm lên men ngoài axit
lactic còn có ethanol, CO2 hoặc axit axetic). LAB lần đầu tiên được phân lập từ sữa và từ
đó được tìm thấy trong các loại thực phẩm từ sữa và các sản phẩm lên men như thịt, rau

quả, đồ uống và các sản phẩm bánh. Ngoài ra LAB cũng đã được phát hiện trong đất,
phân, nước, nước thải. LAB tồn tại trong con người và trong động vật. Ngày nay, LAB
được sử dụng rộng rãi trong đời sống. Một số vi khuẩn lactic như lactobacilli, L. lactis,
và Streptococcus thermophilus có vai trò ức chế sự hư hỏng thực phẩm và vi khuẩn gây
bệnh và giữ gìn phẩm chất dinh dưỡng của thực phẩm tươi sống kéo dài thời gian bảo
quản (Shea Beasley, 2004).
Nhóm vi khuẩn lactic khá phổ biến trong ruột động vật có vú hay chim
(Bifidobacterium ở con người, Lactobacillus ở lợn, động vật gặm nhấm và chim,
Enterococcus ở động vật ăn thịt). LAB cũng được biết là có mặt trong ruột của những
con cá khỏe mạnh. Quan tâm đến nhóm vi khuẩn lactic xuất phát từ thực tế là chúng là
những vi sinh vật hiện diện phổ biến trong đường tiêu hoá con người với khả năng chịu
đựng được môi trường axit và muối mật của đường ruột. LAB cũng có chức năng chuyển
đổi lactose thành axit lactic, do đó làm giảm độ pH trong hệ tiêu hoá và tự nhiên ngăn
chặn sự hình thành của nhiều loại vi khuẩn. Vi khuẩn lactic có thể sản xuất chất kháng
khuẩn bacteriocins, nisin, axit hữu cơ, H2O2 ức chế sự phát triển của vi sinh vật (Ringo và
Gatesoupe, 1998).
Probiotic thường được ứng dụng cho người và động vật trên cạn, vì vậy thuật ngữ
probiotic thường được ngụ ý là những vi khuẩn Gram dương chủ yếu là Lactobacillus.
Dần dần các sinh vật được áp dụng làm probiotic ngày càng nhiều bao gồm cả vi khuẩn
Gram âm, Gram dương, bacteriophage, nấm men và tảo đơn bào. Và phạm vi sử dụng
19 
 


 

cũng rộng hơn, ngoài con người và động vật trên cạn, probiotic ngày nay được ứng dụng
trên cả đối tượng động vật thủy sản (Watson và ctv. 2008). Đã có nhiều nghiên cứu về
các ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản phẩm probiotic trên đối tượng thuỷ sản.
Schroder và ctv (1980) cho thấy rằng L. plantarum phân lập từ cá tuyết đen sản xuất các

chất ức chế chống lại vi khuẩn Vibrio sp. Các chủng vi khuẩn lactic, Pseudomonas,
Vibrio, Bacillus có thể ức chế sự phát triển của các tác nhân gây bệnh như A. hydrophila,
A. salmonicida, anguillarium V., V. ordalii, Pasteurella piscida, Edwardsiella tarda,
Flavobacterium psychrophilum, Photobacterium damselae piscicida (Vo Minh Son và
ctv, 2009).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 3 chủng lactic được phân lập từ nước, bùn và

hệ tiêu hoá cá tra đã được sàng lọc qua khả năng đối kháng với Edwardsiella ictaluri.
Theo khóa phân loại của Bergey, 3 chủng khảo sát được phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Leuconostocaceae

Họ: Lactobacillaceae

Chi: Weissella

Chi: Lactobacillus

Loài: Weissella paramesenteroides

Loài: Lactobacillus plantarum
Lactobacillus fermentum

Cả 3 chủng đều là vi khuẩn Gram dương, không gây bệnh, tồn tại trong pH thấp
của dạ dày và tá tràng, chống lại các tác động của axit mật trong ruột non, và có thể duy
trì trong đường tiêu hóa bằng cách gắn vào niêm mạc ruột và đại tràng. Chúng được phân
lập từ nhiều nguồn khác nhau, chẳng hạn như rau tươi, rau củ lên men, thịt hoặc các sản

phẩm từ thịt, mía đường, sản phẩm sữa, nước thải, đất, xúc xích lên men, kim chi. Ngoài
việc thường được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm, hiện nay chúng còn được
sử dụng phổ biến như một probiotic bởi các ưu việt mà các chủng lactic có được. Đây là

20 
 


 

cơ sở để chúng tôi tiến hành lựa chọn các chủng vi khuẩn này để tiến hành các nghiên
cứu phằm phục vụ cho sản xuất thực tiễn.
2.4 QUORUM SENSING – PHÂN TỬ TÍN HIỆU Ở VI SINH VẬT
2.4.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing
Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau bằng cách sử dụng các phân tử tín hiệu hóa
học. Chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng đối với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu
này. Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt
giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, kiểm sóat việc biểu hiện gen đối
với sự thay đổi về mật độ tế bào. Quá trình này gọi là “quorum sensing”. Nhiều kiểu hình
ở vi khuẩn được điều khiển bởi quorum sensing, bao gồm sự cộng sinh, độc lực, sự sản
xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học... Quá trình quorum sensing ở vi khuẩn
Gram âm được điều khiển bởi phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL). Ở vi
khuẩn Gram dương, quá trình quorum sensing được điều khiển bởi các phân tử
oligopeptide có chiều dài 5 đến 17 amino acid.
Phân tử AHL đựợc chứng minh có liên quan đến các quá trình quorum sensing ở
các vi khuẩn gây bệnh Gram âm ở người và động vật, ví dụ như Pseudomonas
aeruginosa, Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens, cũng như ở Vibrio harveyi
và những vi khuẩn gây bệnh khác trên cá (Tinh và ctv, 2007).
2.4.2 Các enzyme tham gia quá trình phân hủy AHL
Khả năng phân hủy phân tử AHL dường như phân bố rộng rãi trong giới vi khuẩn.

Những enzyme có thể ức chế phân tử AHL đã được khám phá ở các lòai vi khuẩn thuộc
nhóm ß-Proteobacteria, α-Proteobacteria và γ-Proteobacteria cũng như ở một số lòai
thuộc nhóm vi khuẩn gram Dương (Tinh và ctv, 2007). Những lòai vi khuẩn này có thể
khóa hệ thống quorum sensing của những lòai vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế
chọn lọc. Quá trình ức chế các hợp chất tín hiệu có thể được xúc tác bởi hai lọai enzyme
(Hình 1): AHL lactonase và AHL acylase (Defoirdt và ctv, 2004).

21 
 


 

Hình 2.1 Sự phân hủy phân tử AHL bằng enzyme (Defoirdt và ctv, 2004).

 Enzyme AHL lactonase
Dong và ctv (2000) sàng lọc hơn 500 chủng vi khuẩn thu từ thực địa và phòng thí
nghiệm về họat tính ức chế phân tử AHL. Nghiên cứu cho thấy gene AiiA chịu trách
nhiệm tổng hợp enzyme phân hủy AHL. Ly trích enzyme này từ chủng Bacillus 240B1
cho thấy ở nồng độ 50 mg/l, làm giảm nồng độ của N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine
lactone từ 20 µM xuống khỏang 5 µM sau 10 phút. Khi chạy quang phổ ion hóa phun
điện tử của sản phẩm thủy phân cho thấy enzyme AiiA làm mở vòng lactone để tạo thành
N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine (Dong và ctv, 2001). Những nghiên cứu tiếp theo cho
thấy các gen mã hóa enzyme lactonase phân bố rộng rãi ở nhiều lòai Bacillus (Dong và
ctv, 2004).
 Enzyme AHL acylase
Cùng một thời điểm khi Dong và ctv (2000) phát hiện chủng Bacillus có khả năng
phân hủy AHL, Leadbetter và Greenberg (2000) phân lập được một chủng vi khuẩn có
thể sử dụng phân tử AHL như là nguồn cacbon và nitơ. Chủng vi khuẩn này có tên là V.
paradoxus VAI-C, được nuôi cấy tăng sinh trong một môi trường có chứa 500 mg/l N-(3oxohexanoyl)-L-homoserine lactone như là nguồn cacbon và nitơ duy nhất. Trong các thí

nghiệm sử dụng AHL được dán nhãn phóng xạ, các nhà nghiên cứu đã suy ra rằng V.
paradoxus cắt đứt phân tử AHL bằng một enzyme AHL acylase, giải phóng ra
homoserine lactone và một axit béo. Sau đó, axit béo được sử dụng như nguồn cacbon

22 
 


 

thông qua đường dẫn ß-oxidation. Cần có thêm nhiều nghiên cứu trong tương lai để làm
sáng tỏ bằng cách nào vi khuẩn đã lấy được nitrogen từ homoserine lactone.
2.4.3 Hệ thống quorum sensing của vi khuẩn Edwardsiella spp.
Hệ thống quorum sensing gần đây cũng được phát hiện ở nhóm vi khuẩn gây bệnh
quan trọng trên cá (Edwardsiella spp.) Nghiên cứu xác định có bốn loại phân tử tín hiệu
AHL (BHL, HHL, 3-oxo-HHL và một phân tử AHL chưa xác định được) liên quan đến
độc lực của Edwardsiella tarda, tác nhân gây bệnh trên các loài cá nước ngọt và nước
mặn như lươn, cá nheo Mỹ, cá đối, cá tráp, cá rô phi, cá bơn. Gần đây, nhóm nghiên cứu
trên lại xác định bốn loại phân tử tín hiệu AHL nói trên cũng tồn tại ở Edwardsiella
ictaluri, vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá nheo Mỹ (Ictalurus
punctatus) và bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở Việt
Nam ((Han và ctv, 2010).

23 
 


 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
 Thời gian tiến hành
-

Từ 15/1/2011 → 15/6/2011

 Địa điểm nghiên cứu
-

Phòng thí nghiệm Vi Sinh - Phòng Sinh học Thực Nghiệm - Viện Nghiên Cứu
Nuôi Trồng Thủy Sản 2

3.2 VẬT LIỆU
 Chủng vi sinh vật thí nghiệm
-

Chủng vi khuẩn gây bệnh để thử nghiệm khả năng kháng khuẩn: Chủng
Edwardsiella ictaluri Gly 09M, Vibrio harveyi, Vibrio alginolitycus, Vibrio
parahemolyticus,

Streptococcus

iniae,

Streptococcus

sp.,

Pseudomonas

aeruginosa nhận từ Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và
Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ.
-

Chủng CV026, thể đột biến mini-Tn5 từ chủng Chromobacterium violaceum
ATCC31532 (McClean và ctv, 1997), được sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị để phát
hiện nồng độ dư lượng Acyl Homoserine Lactone (AHL) còn lại trong môi trường.
Chủng này không có khả năng sản xuất phân tử AHL, nhưng chúng có thể nhận
biết và phản hồi khi trong môi trường có các phân tử AHL (với chuỗi acyl có
mạch carbon dài từ 4-8 carbon) bằng cách tạo sắc tố màu tím violacein (purple
pigment violacein).

-

Chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ nước, bùn và hệ tiêu hoá cá tra đã được
sàng lọc qua khả năng đối kháng với Edwardsiella ictaluri, bao gồm: Lactobacillus
plantarum (108), Lactobacillus fermentum (109), Weissella paramesenteroides (111).


-

Môi trường, hoá chất
Môi trường dinh dưỡng:
 Brain Heart Infusion Agar (BHIA).
 Brain Heart Infusion Broth (BHIB).
24 

 

 

 Blood agar (BA).
 DeMan, Rogosa, and Sharpe agar (MRSA)
 DeMan, Rogosa, and Sharpe broth (MRSB).
 LB
 LB agar (LBA)
-

Hoá chất:
 Nước muối sinh lý 0,85%.
 Muối mật
 Phân tử tín hiệu quorum sensing (HHL) (hexanoyl homoserine lactone) là
phân tử tính hiệu ở vi khuẩn E. ictaluri dùng để sàng lọc và thử khả năng
phân hủy phân tử tín hiệu trong điều kiện in vitro.
 Dung dịch NaOH 1M, HCl 1M.

-

Thiết bị - Dụng cụ

Thiết bị:
 Tủ cấy vô trùng Microflow
 Tủ ấm lắc Orbital incubator SI 50
 Tủ ấm Memmert
 Tủ sấy Memmert
 Máy quang phổ tử ngoại khả biến Lambda EZ210
 Máy ly tâm Hettich (BIO – RAD)
 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA
 Cân điện tử 4 số lẻ AY220

 Máy đo pH để bàn Thermo Orion
 Tủ mát Sanyo
 Tủ lạnh sâu Sanyo
 Nồi hấp vô trùng Hirayama
 Máy cất nước Hamilton
25