ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR SỬ DỤNG EVAGREEN ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 ( PCV2 )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR SỬ DỤNG
EVAGREEN ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG
PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: VÕ TẤN LỰC

Niên khóa

: 2007 – 2011

Tháng 7 năm 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR SỬ DỤNG
EVAGREEN ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG

PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN

VÕ TẤN LỰC

KS. VÕ KHÁNH HƯNG

Tháng 7 năm 2011


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên con xin bày tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ cùng những người thân trong
gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.
Em xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, ban chủ nhiệm bộ môn
Công nghệ sinh học cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt
quá trình học tập tại trường.
PGS.TS. Trần Thị Dân và KS. Võ Khánh Hưng đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn,
giúp đỡ và động viên em suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Các thầy cô và anh chị ở Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường –
trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho em thực tập tốt
nghiệp.
Thầy Phạm Hùng Vân, chị Trang cùng các anh, chị tại công ty Nam Khoa đã
giúp đỡ em hoàn thành khóa luận.
Tập thể lớp Công nghệ sinh học khóa 2007 và bạn bè đã động viên và giúp đỡ

trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn đến bạn Trâm Anh đã luôn luôn động viên, giúp đỡ và
dành cho tôi những tình cảm tốt đẹp nhất.
Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2011
Võ Tấn Lực

iii


TÓM TẮT
Hội chứng gầy còm trên heo sau cai sữa (Post-weaning multisystemic wasting
syndrome - PMWS) là một bệnh nổi bật gần đây trên heo sau cai sữa, gây thiệt hại
kinh tế nghiêm trọng cho nền chăn nuôi heo trên thế giới. Ở Việt Nam, các mẫu hạch
của heo thu thập từ 4 trại chăn nuôi công nghiệp ở thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh
lân cận được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR, kết quả có 36% mẫu dương tính với PCV2
gây PMWS. Đồng thời tỷ lệ mẫu máu có kháng thể chống PCV2 có chiều hướng tăng
dần qua các năm, cụ thể năm 2000 là 38,97%, từ năm 2003 - 2004 là 84,9%, năm
2005 là 90,26%. Vì vậy chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình real-time PCR sử dụng
EvaGreen nhằm định tính và định lượng vi-rút này trong máu heo sau cai sữa, góp
phần kiểm soát bệnh PMWS ở các trại.
Vùng gen ORF1 được chèn vào plasmid, và dùng hệ thống tế bào chủ E.coli
DH5α khuếch đại vùng gen này. Sau đó ly trích và tinh sạch plasmid chứa vùng gen
ORF1, sản phẩm plasmid tinh sạch đã chèn đoạn gen đích này sẽ được sử dụng để xây
dựng đường chuẩn cho phương pháp real-time PCR. Trong nghiên cứu này, chúng tôi
ứng dụng phương pháp real-time PCR sử dụng EvaGreen để kiểm tra 19 mẫu máu của
heo sau cai sữa, kết quả cho thấy 18 trên 19 mẫu cho kết quả dương tính với PCV2 và
số bản sao ban đầu của những mẫu này khá cao, 104 – 105 bản sao/ml máu.

iv

SUMMARY
Research title: Use of EvaGreen - based real-time PCR assay to detect and
quantify porcine circovirus type 2 (PCV2).
Post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) was a recently
emerged disease of nursery pigs, caused serious economic loss for the swine industry
in the world. In Vietnam, samples lymph of node collected from four intensive farms
at Ho Chi Minh city and some surrounding provinces were tested by PCR assay. The
results were 36 percent of samples positive to PCV2. The proportion of blood sample
having antibody against the virus also increased in several years. In 2000, that was
38,9%; then 84,9% from 2003 to 2004, and 90,26% in 2005. Thus, we constructed
real-time PCR procedure using EvaGreen to detect and quantify it in blood of the
nursery pigs that helped control PMWS at intensive farms.
ORF1 was inserted into plasmid, and then host cell E.coli DH5α was used to
amplify it. The plasmid containing ORF1 was extracted. The purified plasmid that was
inserted the target gene was used to construct standard curve for real-time PCR assay.
In this study we applied real-time PCR assay to test 19 blood samples of nursery pigs,
the results showed 18 of 19 samples being positive to PCV2 and the DNA copies
number of these samples was quite high, about 10 4 - 105 copies/ml blood.

v


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. iii
TÓM TẮT ................................................................................................................... iv
SUMMARY ................................................................................................................. v
MỤC LỤC................................................................................................................... vi
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................... x
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... xi
Chương 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................. 1
1.2. Mục đích đề tài ...................................................................................................... 1
1.3. Nội dung thực hiện của đề tài................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 3
2.1. Giới thiệu hội chứng gầy còm trên heo sau cai sữa................................................. 3
2.1.1. Dịch tễ học của PCV2. ........................................................................................ 3
2.1.2. Triệu chứng và bệnh tích của PMWS. ................................................................. 4
2.1.2.1. Triệu chứng của PMWS ................................................................................... 4
2.1.2.2. Bệnh tích của PMWS ....................................................................................... 5
2.2. Porcine circovirus type 2 – vi-rút gây hội chứng PMWS........................................ 5
2.3. Các phương pháp chẩn đoán PMWS. ..................................................................... 7
2.4. Tổng quan về phương pháp PCR và real-time PCR................................................ 8
2.4.1. Phương pháp PCR............................................................................................... 8
2.4.1.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR. .................................................................. 8
2.4.1.2. Các thành phần của phản ứng PCR................................................................... 8
2.4.1.3. Các bước phản ứng .......................................................................................... 9
2.4.1.4. Ưu và nhược điểm............................................................................................ 9
2.4.2. Phương pháp real-time PCR...............................................................................10
2.4.2.1. Khái niệm phương pháp real-time PCR. ..........................................................10
2.4.2.2. Nguyên tắc phương pháp real-time PCR .........................................................10
vi


2.4.2.3. Nguyên lý hoạt động của hệ thống real-time PCR ...........................................11
2.4.2.4. Hóa chất của phương pháp real-time PCR .......................................................11
2.4.2.5. Nguyên lý định lượng của kỹ thuật real-time PCR. .........................................16
2.4.2.6. Phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy .......................................................18

2.4.2.7. Ưu và nhược điểm phương pháp real-time PCR ..............................................19
2.4.2.8. Ứng dụng phương pháp real-time PCR............................................................19
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................20
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .........................................................................20
3.2. Vật liệu .................................................................................................................20
3.2.1. Mẫu. ..................................................................................................................20
3.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ dùng cho phản ứng PCR và real-time PCR. ...................20
3.2.3. Hóa chất.............................................................................................................21
3.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................22
3.3.1. Thu mẫu và bảo quản mẫu .................................................................................22
3.3.2. Ly trích DNA.....................................................................................................22
3.3.3. Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR .........................................23
3.3.3.1. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ORF1.....................................24
3.3.3.2. Thực hiện phản ứng nối (ligation) ...................................................................26
3.3.3.3. Chuẩn bị tế bào khả nạp E.coli DH5α bằng phương pháp calcium chloride.....27
3.3.3.4. Biến nạp plasmid pGEM-T Easy đã chèn DNA đích vào tế bào khả nạp .........28
3.3.3.5. Chọn lọc những tế bào đã biến nạp plasmid DNA ...........................................28
3.3.3.6. Tách chiết plasmid DNA. ................................................................................28
3.3.3.7. Kiểm tra plasmid DNA bằng PCR...................................................................29
3.3.3.8. Kiểm tra plasmid DNA bằng phương pháp giải trình tự ..................................30
3.3.3.9. Pha loãng plasmid DNA..................................................................................30
3.3.4. Thực hiện phản ứng real-time PCR ....................................................................31
3.3.4.1. Chuẩn bị hỗn hợp để chuẩn bị thực hiện phản ứng real-time PCR ...................32
3.3.4.2. Thiết lập chương trình real-time PCR trên phần mềm máy CFX96 .................33
3.3.4.3. Phân tích kết quả .............................................................................................33
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. ....................................................................35
4.1. Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR............................................35
4.1.1. Sản phẩm PCR 492 bp của ORF1.......................................................................35
vii

4.1.2. Vi khuẩn E.coli DH5α chứa plasmid chèn đoạn gen đích ...................................36
4.1.2.1. Ly trích plasmid DNA từ khuẩn lạc được chọn lọc..........................................36
4.1.2.2. Kiểm tra plasmid đã chèn đoạn gen đích .........................................................36
4.1.2.3. Kiểm tra đoạn gen đích được chèn vào plasmid...............................................37
4.2. Kết quả thực hiện real-time PCR...........................................................................38
4.3. Kết quả phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy ................................................40
4.4. Ứng dụng real-time PCR sử dụng EvaGreen trên các mẫu thực tế.........................41
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................45
5.1. Kết luận ................................................................................................................45
5.2. Đề nghị .................................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................46
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
bp

Base pair

CV

Coefficient of variation

Ct

Threshold cycle

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

GMO

Genetically modified organism

IHC

Immunohistochemistry

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

ISH

In situ hybridisation

LB

Luria bertani

OD

Optical density

ORFs

Open reading frames

PCR

Polymerase chain reaction

PCV

Porcine circovirus virus

PCV1

Porcine circovirus virus type 1

PCV2

Porcine circovirus virus type 2

PDNS

Porcine dermatitis and nephropathy syndrome

PK-15

Pig kidney-15

PMWS

Post-weaning multisystemic wasting syndrome

PRDC

Porcine respiratory disease complex

PRRSV

Porcine respiratory and reproductive syndrome virus

RF

Replicate form

SD

Standard deviation

SNP

Single nucleotide polymorphism

SQ

Starting quantity

TBE

Tris borate EDTA

Tm

Melting temperature

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Thành phần hóa chất phản ứng PCR sử dụng iAdvance iVAPCR Mastermix.25
Bảng 3.2 Quy trình nhiệt phản ứng PCR sử dụng mồi PCV2-492F, PCV2-492R.........26
Bảng 3.3 Thành phần hóa chất phản ứng ligation ........................................................27
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất phản ứng PCR sử dụng PCR Master Mix 2X ..............29
Bảng 3.5 Quy trình nhiệt phản ứng PCR sử dụng mồi PCV2-83F, PCV2-83R ............30
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng real-time PCR sử dụng EvaGreen qPCR Mastermix ..32
Bảng 4.1 Số lượng bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn với 3 lần lập lại .....................40
Bảng 4.2 Phân tích biến động giá trị Ct của các nồng độ chuẩn ...................................40
Bảng 4.3 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu của 19 mẫu thực tế .............................42
Bảng 4.4 Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại của 19 mẫu thực tế.......................44

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Heo mắc hội chứng gầy còm sau cai sữa........................................................ 4
Hình 2.2 Virion của PCV ............................................................................................. 5
Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của PCV2 với 6 khung đọc mở............................................. 7
Hình 2.4 Sơ đồ các bước phản ứng PCR .....................................................................10
Hình 2.5 Hệ thống real-time PCR................................................................................11
Hình 2.6 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống real-time PCR .......................................12
Hình 2.7 SYBR Green chèn vào sợi đôi DNA .............................................................13

Hình 2.8 Nguyên tắc hoạt động của mẫu dò Molecular Beacons .................................14
Hình 2.9 Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman .........................................................15
Hình 2.10 Biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang ........17
Hình 3.1 (a) máy PCR (Eppendorf); (b) hệ thống real-time PCR CFX96 (Bio-rad) .....20
Hình 3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA đích vào vi khuẩn E.coli DH5α.....................24
Hình 3.3 Vị trí của cặp mồi PCV2-492F, PCV2-492R trên bộ gen PCV2....................25
Hình 3.4 Vị trí của hai cặp mồi PCV2-83F, PCV2-83R...............................................32
Hình 3.5 Quy trình nhiệt thực hiện real-time PCR.......................................................33
Hình 4.1 Sản phẩm của phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ORF1 ............................35
Hình 4.2 Kết quả khuếch đại plasmid sau khi ly trích ..................................................36
Hình 4.3 Kết quả sản phẩm khuếch đại plasmid DNA .................................................37
Hình 4.4 Kết quả blast vùng giải trình tự trên NCBI....................................................38
Hình 4.5 Kết quả giải trình tự vùng gen đích trên plasmid DNA .................................38
Hình 4.6 Biểu đồ khuếch đại của các mẫu chuẩn và chứng âm....................................39
Hình 4.7 Biểu đồ đường chuẩn của các mẫu chuẩn .....................................................39
Hình 4.8 Đồ thị đường cong nhiệt độ nóng chảy của các chuẩn..................................41
Hình 4.9 Biểu đồ khuếch đại của các mẫu thực tế, mẫu chuẩn, chứng âm ...................42
Hình 4.10 Biểu đồ đường chuẩn của các mẫu chuẩn và kèm với mẫu thực tế ..............42
Hình 4.11 Đồ thị đường cong nhiệt độ nóng chảy của mẫu thực tế ..............................43

xi


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam là nước có nền nông nghiệp phát triển, trong đó ngành chăn nuôi heo
đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Một mặt, nước ta có nguồn lao
động dồi dào và trình độ chuyên môn ngày được nâng cao; mặt khác, cùng với sự tiến
bộ của khoa học kỹ thuật đã hỗ trợ rất nhiều cho ngành chăn nuôi nói chung, chăn nuôi
heo nói riêng, do đó năng suất tăng lên đáng kể. Bên cạnh những thuận lợi trên, ngành

chăn nuôi cũng vấp phải những khó khăn nhất định, đặc biệt là trong công tác phòng
ngừa và kiểm soát tình hình dịch bệnh.
Một trong những bệnh ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi là hội chứng gầy
còm trên heo sau cai sữa (post-weaning multisystemic wasting syndrome – PMWS).
Hội chứng PMWS thường xuất hiện trên heo từ 4 - 16 tuần tuổi , tỷ lệ chết có thể đến
80% ở một số đàn heo. Nguyên nhân gây hội chứng PMWS là do porcine circovirus
type 2 - PCV2 (Allan và ctv, 1999). Vi-rút PCV2 gây suy yếu miễn dịch làm heo dễ bị
nhiễm kế phát một số mầm bệnh khác như PRRSV, porcine pavovirus, Mycoplasma
hyopneumonia… do đó làm tăng thêm mức độ trầm trọng của bệnh, gây thiệt hại đáng
kể cho ngành chăn nuôi.
Việc chẩn đoán nhằm định tính và định lượng sự hiện diện của PCV2 trong mẫu
máu heo bệnh giúp cho công tác chẩn đoán, phòng và chữa bệnh kịp thời, hạn chế đến
mức thấp nhất những rủi ro cho nhà chăn nuôi.
Xuất phát từ những vấn đề trên, tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật realtime PCR sử dụng EvaGreen định tính và định lượng porcine circovirus type 2
(PCV2)”.
1.2. Mục đích đề tài
Thiết lập được quy trình định lượng PCV2 bằng phương pháp real-time PCR sử
dụng EvaGreen.
Bước đầu xác định số bản sao DNA của PCV2 hiện diện trong máu heo sau cai sữa.

1


1.3. Nội dung thực hiện của đề tài
Xây dựng đường chuẩn với plasmid nhằm định lượng PCV2.
Xây dựng quy trình định lượng PCV2 bằng phương pháp real-time
PCR sử dụng Evagreen.
Ứng dụng real-time PCR EvaGreen để định lượng PCV2 trên các
mẫu thực tế.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu hội chứng gầy còm trên heo sau cai sữa
Hội chứng PMWS (post-weaning multisystemic wasting syndrome) được phát
hiện đầu tiên vào năm 1991 trên đàn heo khỏe ở phía tây Canada, sau đó cũng được
báo cáo ở bắc Mỹ, châu Âu, châu Á. Hội chứng PMWS gây thiệt hại đáng kể cho nền
chăn nuôi heo công nghiệp do tỷ lệ tử vong cao.
Hội chứng PMWS thường xuất hiện trên heo từ 4 - 16 tuần tuổi nhưng thường
tập trung cao nhất trên heo con từ 8 - 12 tuần tuổi, tỷ lệ tử vong có thể lên đến 80%.
Bệnh thường xuất hiện những dấu hiệu lâm sàng như gầy còm, khó thở, tiêu chảy,
thỉnh thoảng vàng da.
Nguyên nhân gây ra bệnh là do porcine circovirus type 2, gọi tắt là PCV2. Đây
là vi-rút thuộc họ Circoviridae, có bộ gen DNA chuỗi đơn vòng, không vỏ ngoài,
đường kính 17 nm. PCV2 được phân lập vào 1997 từ heo con bị hội chứng PMWS.
Mặc dù PCV2 là nhân tố sơ khởi nhưng không phải là duy nhất gây ra bệnh PMWS.
Dấu hiệu lâm sàng của PMWS xuất hiện trong những heo nhiễm PCV2 và đồng nhiễm
với porcine parvovirus, PRRSV, Mycoplasma hyopneumonia (Harms và ctv, 2001).
Nhiều nghiên cứu còn cho thấy việc nhiễm PCV2 cũng liên quan đến hội
chứng viêm da thận (PDNS - porcine dermatitis and nephropathy syndrome), hội
chứng hô hấp phức tạp trên heo (PRDC - porcine respiratory disease complex), hội
chứng viêm khí quản, chứng rung bẩm sinh. Các hội chứng này có thể xuất hiện đồng
thời với hội chứng PMWS gây khó khăn cho việc chẩn đoán bệnh.
PMWS có chiều hướng lây lan rộng trên khắp thế giới nhưng những hiểu biết
về bệnh vẫn còn hạn chế, vì thế các nhà khoa học vẫn đang nổ lực nghiên cứu và tìm
cách khống chế căn bệnh này.
2.1.1. Dịch tễ học của PCV2
Hội chứng PMWS thường tác động trên heo trên 3 tuần tuổi và rõ ràng hơn từ 4
- 6 tuần tuổi trở đi. Heo con có hàm lượng kháng thể mẹ truyền cao thường không

nhiễm bệnh (Lâm Thị Thu Hương và ctv, 2005).

3


PCV2 hiện diện nhiều ở hạch bạch huyết và hạch lympho, ngoài ra vi-rút cũng
được tìm thấy trong phân, nước tiểu, máu, xoang mũi heo bệnh cũng như trong tinh
dịch của heo đực. Tỷ lệ heo mắc bệnh trong đàn biến thiên từ 5 - 50% và tỷ lệ tử vong
từ 5 - 80% trong số những heo bệnh.
PCV2 có thể lây truyền qua các đường hô hấp, đường máu, nhau thai và đường
sinh dục. Bệnh này chủ yếu lây từ heo bệnh sang heo khỏe qua phân, tiếp xúc trực tiếp,
mật độ chăn nuôi cao hay thông qua dụng cụ, động vật trung gian mang mầm bệnh
như chuột, chim…
Sự phân bố bệnh trong đàn bị nhiễm PMWS cũng thay đổi, một số heo trong
đàn nhiễm và chết trong khi một số vẫn khỏe mạnh và phát triển bình thường.
2.1.2. Triệu chứng và bệnh tích của PMWS
2.1.2.1. Triệu chứng của PMWS
Biểu hiện lâm sàng của PMWS không đặc hiệu và thay đổi khác nhau tùy thuộc
vào bệnh phụ nhiễm gây ra bởi một số vi-rút khác như porcine parvovirus, PRRSV…
hoặc phụ thuộc vào công tác quản lý.
Hội chứng PMWS thường ảnh hưởng trên heo từ 4 - 16 tuần tuổi. Heo mắc hội
chứng PMWS thường có diễn biến bệnh chậm. PMWS thường xuất hiện trên heo sau
cai sữa 1 - 2 tuần. Những dấu hiệu lâm sàng có thể kéo dài nhiều tháng cụ thể là heo
đang phát triển bình thường rồi sau đó gầy ốm một cách nhanh chóng. Heo xanh xao
gầy ốm một cách đột ngột và xuất hiện những con gầy còm ốm yếu nhất đàn. Heo có
biểu hiện giảm cân, khó thở, hoàng đản, tiêu chảy và những bệnh học được nhận thấy
là viêm phổi kẽ, hạch lympho sưng, viêm gan và thận (Ellis và Harding, 1998). Một
số heo có triệu chứng ho, sốt, triệu chứng thần kinh, và chết đột ngột đôi khi cũng xuất
hiện (Harms, 1999).

Hình 2.1 Heo mắc hội chứng gầy còm sau cai sữa.
( />4


2.1.2.2. Bệnh tích của PMWS
Bệnh tích đại thể
Bệnh tích đại thể chủ yếu là tổn thương mô bạch huyết và mô phổi. Lách sưng
lớn nhưng không sung huyết. Ruột viêm, thành ruột mỏng, dạ dày bị loét, vách dạ dày
sưng. Ngoài ra cũng có thể quan sát các bệnh tích như viêm phổi kẽ, viêm gan, thận
sưng lớn đồng thời phù thủng (Allan và ctv, 1997; Darwich và ctv, 2003). Tuyến ức
kém phát triển và phù thủng các mô liên kết, tích dịch trong xoang bụng, xoang ngực
và bao tim.
Bệnh tích vi thể
Hội chứng PMWS có đặc điểm là tổn thương ở mô lympho, đó là sự suy giảm
tế bào lympho, tổn thương này được quan sát ở hầu hết các cơ quan lympho như hạch
lympho, hạch hạnh nhân, mảng Peyer’s, lá lách, tuyến ức. Thể vùi trong bào tương và
lympho bào hoại tử cũng hiện diện ở mảng Peyer’s và hạch hạch nhân (Lâm Thị Thu
Hương và ctv, 2005).
Tế bào biểu mô xơ hóa xuất hiện ở phổi, sự xâm nhiễm của tế bào viêm gây
viêm phế quản cấp tính. Trên gan, các tế bào mô gan hoại tử cùng với sự xâm nhiễm
mô lympho vào vùng cửa gan. Sự phân bố và mức độ bệnh tích tại các cơ quan khác
nhau tùy thuộc vào từng giai đoạn bệnh.
2.2. Porcine circovirus type 2 – vi-rút gây hội chứng PMWS
PCV được mô tả cách đây hơn 40 năm như là một tác nhân gây nhiễm vào môi
trường tế bào thận heo (PK-15). Khoảng 8 năm sau đó, các nhà khoa học này đã báo
cáo PCV là vi-rút không vỏ ngoài, nhỏ, đường kính khoảng 17 nm, hình khối 20 mặt,
thuộc họ Circoviridae với bộ gen DNA mạch đơn vòng và là vi-rút lây nhiễm trên
động vật hữu nhũ có kích thước nhỏ nhất được ghi nhận (Tischer và ctv, 1982).

Hình 2.2 Virion của PCV (ViralZone, 2008).

5


Một tuýp PCV riêng biệt với đặc tính bộ gen và kháng nguyên mới trên đàn heo
khắp thế giới và liên quan trực tiếp đến vài dấu hiệu lâm sàng của PMWS đã được
quan tâm. Tuýp PCV mới này được gọi là porcine circovirus type 2 (PCV2), và tuýp PCV
nhiễm trên môi trường PK-15 không gây bệnh gọi là porcine circovirus type 1 (PCV1).
PCV1 được phát hiện đầu tiên vào năm 1974 và mô tả như là tác nhân gây
nhiễm trên dòng tế bào PK-15. PCV1 không phải là nguyên nhân gây bệnh trên heo
(Tischer và ctv, 1986; Allan và ctv, 1995), trái lại PCV2 được xem như là tác nhân gây
ra hội chứng PMWS, bệnh gây gầy còm và chết trên heo con (Harding, 1996; Nayar và
ctv, 1997; Ellis và ctv, 1998; Allan và Ellis, 2000).
PCV2 được ghi nhận lần đâu tiên vào năm 1991 trên đàn heo ở phía tây
Canada. PCV2 được phân lập từ heo bị hội chứng PMWS, gần đây vi-rút này cũng
được phát hiện trong bào thai còn sống và đã chết. Mặc dù PCV2 là nhân tố sơ khởi
nhưng không phải là duy nhất gây ra PMWS mà nguyên nhân gây bệnh là do sự nhiễm
thứ cấp của một số vi-rút và vi khuẩn như porcine parvovirus, PRRSV, Mycoplasma
hyopneumonia…(Harms và ctv, 2001).
Kích thước bộ gen của các phân lập PCV1 là 1759 bp (Meehan và ctv, 1997)
và PCV2 khoảng 1767 - 1768 bp (Mankertz, 1997). PCV tái bản thông qua dạng mạch
kép trung gian (double-stranded replicate form -RF) (Todd và ctv, 1996; Meehan và
ctv, 1997). Các phân lập PCV2 có nhiều kiểu gen khác nhau và được xếp vào 4 nhóm:
PCV2a, PCV2b, PCV2c, PCV2d (Guo và ctv, 2010).
PCV1 có 7 khung đọc mở - open reading frames (ORFs) mã hóa cho protein
hơn 5 kD. PCV2 có 6 khung đọc mở (hình 2.3).
ORF1 tương đồng khoảng 83% về trình tự nucleotide và 86% về trình tự acid
amin giữa PCV1 và PCV2 (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). ORF1 nằm trên mạch DNA virút, mã hóa cho cho protein liên quan đến quá trình tái bản Rep có kích thước 37,5 kD
và Rep’có kích thước 20,2 kD (Mankertz và ctv, 2001).
ORF2 tương đồng khoảng 67% về trình tự nucleotide và 65% trình tự acid amin
giữa PCV1 và PCV2. Khi giải mã trình tự gen khung đọc mở ORF2, những phân lập

PCV2 ở châu Mỹ có tính tương đồng rất cao với các phân lập PCV2 khác trên thế giới.
Mặc dù có một số khác biệt về gen của ORF2, nhưng vùng gen mã hóa đầu N cuối (Nterminal region) của ORF2 gần như không thay đổi ở tất cả các phân lập vi-rút được
nghiên cứu. ORF2 nằm trên mạch DNA bổ sung của mạch DNA trung gian (RF)
6


(Nawagitgul và ctv, 2000) mã hóa cho protein capsid liên quan đến quá trình đáp ứng
miễn dịch của tế chủ với kích thước là 27,8 kD (Hamel và ctv, 1998; Meehan và ctv, 1998).

Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của PCV2
với 6 khung đọc mở (Andrel, 1998).
ORF3 mã hóa cho protein có kích thước 11,8 kD và gần đây được xem như có
liên quan đến chu trình apoptosis in vitro và là tác nhân vi-rút gây bệnh trên chuột (Liu
và ctv, 2005, 2006).
2.3. Các phương pháp chẩn đoán PMWS
Chẩn đoán bệnh PMWS không chỉ dựa vào sự hiện diện của PCV2 vì heo khỏe
mạnh bình thường cũng chứa PCV2, hơn nữa PMWS còn do sự phụ nhiễm của một số
tác nhân khác như porcine parvovirus, PRRSV… Do đó để chẩn đoán chính xác heo bị
hội chứng PMWS, đòi hỏi đàn heo phải đáp ứng được ba yêu cầu: dấu hiệu lâm sàng,
bệnh tích mô học và sự hiện diện của PCV2 trong các mô bệnh tích đặc trưng đó.
Dấu hiệu lâm sàng thường gặp là heo gầy ốm, giảm cân, sức khỏe kém đi kèm
với khó thở, hoàng đản.
Bệnh tích mô học gồm suy giảm cơ quan lympho, viêm nhiễm mô lympho,
phổi, gan và một số cơ quan khác.
Sự hiện diện của PCV2 trong bệnh phẩm được xác định bằng các phương pháp sau:


Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC - immunohistochemistry): nguyên tắc của kỹ

thuật này là phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu ngay trong

mô, tế bào, dịch tiết, chất bài tiết. Phương pháp này nhanh, nhạy, đặc hiệu, định vị
kháng nguyên ngay trong tế bào giúp tăng cường tính chính xác của chẩn đoán.

7




Kỹ thuật lai tại chỗ ( ISH - in situ hybridisation): trong phương pháp này có

sự kết hợp đặc hiệu giữa acid nhân và đoạn dò DNA, phương pháp này nhanh, đơn
giản, độ nhạy và độ đặc hiệu cao.


Phương pháp nuôi cấy tế bào: phát hiện vi-rút qua bệnh phẩm từ các dịch

chiết, từ mô, tế bào, dịch tiết, chất bài tiết. Nhược điểm của phương pháp này là thời
gian dài, đắt tiền, đòi hỏi tay nghề kỹ thuật, đây là phương pháp duy nhất thu nhận virút cho các nghiên cứu tiếp theo.


Xác định acid nucleic của vi-rút bằng PCR cũng là kỹ thuật phổ biến trong xét

nghiệm PCV2, phương pháp này cho phép khuếch đại gen của acid nhân, xác định dựa
theo kích thước đoạn gen, quy trình nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chi phí thấp,
đặc biệt là kỹ thuật real-time PCR cho kết quả đặc hiệu và độ chính xác cao cũng như
định lượng được số bản sao đích ban đầu của vi-rút trong mẫu bệnh.
2.4. Tổng quan về phương pháp PCR và real-time PCR
2.4.1. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền
nhờ polymerase) được Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phương pháp này

cho phép từ khuôn DNA đích ban đầu, khuếch đại, nhân khuôn đích này lên thành rất
nhiều bản sao nhờ hoạt động của polymerase và cặp mồi đặc hiệu với khuôn đích.
2.4.1.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR
Các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn
đều cần sự hiện diện của những đoạn mồi chuyên biệt. Đoạn mồi là những đoạn
oligonucleotide ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, nhờ
DNA polymerase, đoạn mồi sẽ được nối dài để hình thành mạch mới, kết quả tạo ra
bản sao mới của mạch khuôn nằm giữa hai đoạn mồi. Sau khi đoạn mồi kéo dài hoàn
tất, mẫu sẽ được gia nhiệt lên để biến tính DNA mạch đôi mới này thành hai mạch đơn
làm khuôn để đoạn mồi bắt cặp ở chu kỳ kế tiếp. Qua nhiều chu kỳ, kết quả tạo ra sự
tích lũy các sản phẩm khuếch đại từ trình tự đích ban đầu theo cấp số nhân.
2.4.1.2. Các thành phần của phản ứng PCR
 Khuôn mẫu: DNA đích
 Cặp mồi
 Bốn loại dNTP (2’-deoxynucleoside-5’-triphosphate): dATP, dTTP, dGTP, dCTP
 Taq DNA polymerase
8


 Mg2+
 Dung dịch đệm
2.4.1.3. Các bước phản ứng
Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (1997), phản ứng PCR gồm ba bước:
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho
sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm)
của phân tử, thường là 94 - 950C trong vòng 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến
tính (denaturation).
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của đoạn mồi) cho phép các đoạn
mồi bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 400 700C, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các đoạn mồi sử dụng và kéo dài từ
30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization).

Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase sử dụng
vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài
của DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn
tổng hợp hay kéo dài (elongation).
Mỗi chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm
tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân.
2.4.1.4. Ưu và nhược điểm
PCR có độ nhạy và độ tin cậy cao, dễ sử dụng. Phương pháp này cho phép phát
hiện một lượng mẫu rất ít của tác nhân gây bệnh. Mặc dù kỹ thuật này cho độ nhạy cao
nhưng thời gian cần cho một xét nghiệm từ 3 - 5 giờ, mức độ biểu hiệu gen được so
sánh bằng cường độ của các băng DNA trên gel do đó khó có thể phân biệt chính xác,
giữa các giếng chạy điện di cũng có sự khác nhau. Trong phản ứng PCR nhiều khi sản
phẩm PCR không đặc hiệu cũng có kích thước bằng kích thước sản phẩm PCR mong
muốn, do đó có thể dẫn đến nhầm lẫn. Ngoài ra kỹ thuật này cũng không có khả năng
định lượng chính xác số bản sao của tác nhân đích cần kiểm tra trong bệnh phẩm.
Trong những năm gần đây, kỹ thuật PCR đã không ngừng được cải tiến về
nguyên lý, hóa chất và thiết bị, trong đó real-time PCR là cải tiến mới nhất, có độ nhạy
và độ đặc hiệu rất cao, đặc biệt có khả năng định lượng chính xác số bản sao đích ban đầu.

9


Hình 2.4 Sơ đồ các bước phản ứng PCR (Phạm Hùng Vân, 2002).
2.4.2. Phương pháp real-time PCR
2.4.2.1. Khái niệm phương pháp real-time PCR
Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theo
từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp.
Real-time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản
ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành
(Nguyễn Thái Thủy, 2008).

2.4.2.2. Nguyên tắc phương pháp real-time PCR
Real-time PCR là phương pháp cho phép khuếch đại đặc hiệu trình tự đích ban
đầu, sản phẩm khuếch đại sẽ được phát hiện và định lượng trong suốt quá trình phản
ứng xảy ra (đây là ý nghĩa của từ “real-time”).
Sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được phát hiện thông qua các chỉ thị màu hoặc
mẫu dò gắn huỳnh quang. Trong kỹ thuật này, ở mỗi chu kỳ, lượng DNA khuếch đại
sẽ phát ra một lượng tín hiệu huỳnh quang nhất định, và tín hiệu huỳnh quang này sẽ
được ghi nhận lại. Nói cách khác, lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ tỷ lệ thuận với
lượng DNA tạo thành sau mỗi chu kỳ. Mẫu xét nghiệm chứa nhiều DNA đích ban đầu
sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu có ít DNA đích ban đầu. Nồng độ ban

10


đầu của tác nhân cần xét nghiệm sẽ được xác định thông qua biểu đồ đường chuẩn biểu
diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với log10 số bản sao ban đầu của các mức chuẩn.
2.4.2.3. Nguyên lý hoạt động của hệ thống real-time PCR
Hệ thống real-time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) nối với máy quang phổ
huỳnh quang và máy vi tính.
Máy quang phổ huỳnh quang
Máy vi tính
Máy luân nhiệt
Hình 2.5 Hệ thống real-time PCR (Nguyễn Thái Thủy, 2008).
Nguyên tắc hoạt động của hệ thống: nguồn sáng chiếu qua kính lọc kích thích
và truyền đến mẫu đặt trên máy luân nhiệt. Ánh sáng kích thích sẽ kích thích chất chỉ
thị huỳnh quang (màu huỳnh quang hoặc mẫu dò phát huỳnh quang) phát ra ánh sáng
có bước sóng khác với ánh sáng kích thích ban đầu, và ánh sáng này sẽ đi qua kính lọc
phát sáng. Kính lọc này chỉ cho những ánh sáng có bước sóng phù hợp đi qua, cuối
cùng bộ phận phát hiện sẽ ghi nhận ánh sáng này. Cường độ ánh sáng phát ra từ mẫu
sẽ tỷ lệ với lượng DNA có trong mẫu.

2.4.2.4. Hóa chất của phương pháp real-time PCR
Ưu điểm của real-time PCR là tính đặc hiệu cao và khả năng định lượng tác
nhân đích ban đầu, nhưng để định lượng được thì đòi hỏi phải thu nhận được tín hiệu
huỳnh quang phát ra từ các chỉ thị huỳnh quang trong phản ứng. Do đó, hóa chất định
lượng sử dụng trong phản ứng real-time PCR có thể bao gồm các chỉ thị huỳnh quang sau:
Phẩm nhuộm chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang mạnh hơn khi ở trạng
thái tự do: ethidium bromide, SYBR Green I.
Mẫu dò đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang chỉ phát sáng khi bắt cặp với
trình tự đích: mẫu dò Taqman, mẫu dò Molecular Beacons, mẫu dò Fluorescence
Resonance Energy Transfer (FRET), mẫu dò Ampliflour, mẫu dò Scorpion …
Các hóa chất được sử dụng phổ biến hiện nay trong real-time PCR: SYBR
Green I, mẫu dò Taqman, mẫu dò Molecular Beacons.

11


Bộ phận phát hiện

Nguồn sáng

Mẫu

Kính lọc phát sáng

Kính lọc kích thích

Máy luân nhiệt
Tia sáng phân tán
Hình 2.6 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống real-time PCR.
(Nguyễn Thái Thủy, 2008)

 SYBR Green I
SYBR Green I không gắn vào sợi đơn DNA mà chỉ gắn vào sợi đôi DNA làm
cho sợi đôi DNA phát ra ánh sáng huỳnh quang với bước sóng 522 nm khi bị chiếu bởi
ánh sáng kích thích có bước sóng 488 nm.
Khi không có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại của PCR, SYBR Green I bị
phân tán trong dung dịch PCR mix. Do vậy ống phản ứng sẽ không phát huỳnh quang
hay chỉ phát huỳnh quang không đáng kể khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích.
Nhưng khi có sự hiện diện của sản phẩm PCR thì SYBR Green I sẽ chèn vào các sợi
đôi DNA của sản phẩm khuếch đại và sẽ làm cho ống phản ứng phát huỳnh quang khi
bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Đối với SYBR Green I, dữ liệu huỳnh quang được
thu nhận trong giai đoạn kéo dài của phản ứng PCR. SYBR Green I gắn vào mạch đôi
DNA phát huỳnh quang sáng gấp 200 lần so với khi không gắn vào DNA (Nguyễn
Thái Thủy, 2008).
Một điểm hạn chế của SYBR Green I là hóa chất này liên kết không đặc hiệu
với DNA mạch đôi. Do vậy, mọi phân tử DNA mạch đôi trong phản ứng đều được
định lượng, kể cả sản phẩm PCR không đặc hiệu (nhị trùng của đoạn mồi). Để khắc
phục nhược điểm này, một chương trình phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy cần
12


được thực hiện sau khi hoàn tất các chu kỳ luân nhiệt của real-time PCR, sản phẩm
khuếch đại được nung biến tính thành mạch đơn từ từ, dữ liệu huỳnh quang được thu
nhận lại. Do các phân tử DNA mạch đôi có kích thước khác nhau sẽ có nhiệt độ nóng
chảy khác nhau, do vậy ta có thể phân biệt được sản phẩm khuếch đại trong phản ứng
là DNA đích hay là nhị trùng của đoạn mồi, khắc phục được nhược điểm không đặc
hiệu của SYBR Green I trong phát hiện sản phẩm khuếch đại.

Hình 2.7 SYBR Green chèn vào sợi đôi DNA (Nguyễn Thái Thủy, 2008).
 Phẩm nhuộm huỳnh quang EvaGreen

EvaGreen qPCR Mastermix được thiết kế dùng trong real-time PCR định lượng
giúp tối ưu hóa phản ứng khuếch đại, tăng độ nhạy, tín hiệu huỳnh quang mạnh, tránh
tạo ra sản phẩm không đặc hiệu. Hotstart Taq polymerase trong hỗn hợp pha trộn giúp
làm giảm đáng kể sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu so với Taq polymerase thông
thường. EvaGreen là loại phẩm nhuộm huỳnh quang gắn vào mạch đôi DNA, có đặc
tính tương tự như SYBR Green I, nghĩa là sẽ gắn lên tất cả các DNA mạch đôi trong
phản ứng, tuy nhiên có điểm khác với SYBR Green I là Evagreen ổn định, ức chế phản
ứng PCR rất thấp. Vì vậy mà Evagreen là sự lựa chọn tốt cho các phản ứng định lượng
sử dụng màu huỳnh quang chèn.
 Mẫu dò Molecular Beacons
Molecular Beacons là mẫu dò có trình tự dài khoảng 25 - 40 base, có đầu 5’ gắn
13


với chất phát huỳnh quang và đầu 3’ gắn với chất hấp thụ. Mẫu dò có trình tự ở giữa
bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên một sợi của DNA đích, còn hai đầu của mẫu dò
thì mỗi đầu có một trình tự 5 - 6 base bổ sung với nhau làm cho mẫu dò tạo thành cấu
trúc kẹp tóc do trình tự của hai đầu bắt cặp nhau. Khi ở dạng tự do mẫu dò có cấu trúc
kẹp tóc, chất phát huỳnh quang và chất hấp thụ nằm gần nhau nên chất hấp thụ sẽ hấp
thụ huỳnh quang từ chất phát huỳnh quang. Khi mẫu dò gắn vào DNA đích, đầu chất
phát huỳnh quang và chất hấp thụ nằm cách xa nên tín hiệu huỳnh quang được phát ra.

Hình 2.8 Nguyên tắc hoạt động của mẫu dò
Molecular Beacons (Phạm Hùng Vân, 2002).
Ở giai đoạn nhiệt độ biến tính, cấu trúc kẹp tóc của mẫu dò Beacons không còn
nên chất phát huỳnh quang nhận nguồn sáng kích thích và phát quang.
Ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, mẫu dò Beacons sẽ bắt cặp vào trình tự đặc hiệu
trên sợi DNA đích, nhờ vậy chất phát huỳnh quang cách xa chất hấp thụ nên chất phát
huỳnh quang phát ra huỳnh quang khi nhận nguồn ánh sáng kích thích.
Trong giai đoạn nhiệt độ kéo dài, Taq polymerase không thủy giải mẫu dò

Beacons mà chỉ làm tách mẫu dò khỏi sợi đích khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài
đến trình tự mà mẫu dò bắt cặp vào. Cuối giai đoạn kéo dài, mẫu dò Beacons tách khỏi
14