Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong viên nang mềm bổ gan bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MAI

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID
CHLOROGENIC TRONG VIÊN NANG MỀM BỔ
GAN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MAI

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID
CHLOROGENIC TRONG VIÊN NANG MỀM BỔ
GAN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tôi đã nhận được sự
hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý tận tình của quý thầy cô trường Đại học Dược Hà
Nội.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành
nhất đến PGS TS. Nguyễn Thị Kiều Anh trường Đại học Dược Hà Nội đã dành
nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn chỉ dạy tận tình trong suốt quá trình
nghiên cứu tài liệu, thực nghiệm để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
dược học.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô trong ban Giám hiệu, phòng sau Đại
học, bộ môn Hóa phân tích - trường Đại học Dược Hà Nội, cảm ơn ban lãnh đạo
và cán bộ phòng phân tích Kiểm nghiệm - Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc
Gia và thầy cô bộ môn Hóa lý đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành chương
trình học tập và quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài.
Tôi xin cảm ơn công ty cổ phần Traphaco đã tạo điều kiện về thời gian,
hỗ trợ mẫu nghiên cứu giúp tôi hoàn thành luận văn này
Cảm ơn các bạn bè đồng nghiệp, bố mẹ, anh chị em trong gia đình, chồng
và con gái - những người luôn động viên, là chỗ dựa tinh thần giúp đỡ tôi hoàn
thiện luận văn.
Trong phạm vi khả năng của mình, tôi đã cố gắng hoàn thành luận văn
một cách tốt nhất có thể, tuy nhiên cũng không tránh khỏi những thiếu sót, rất
mong nhận được sự góp ý quý báu của quý thầy cô, các anh chị em và các bạn
đồng nghiệp.
Hà Nội, ngày 03 tháng 4 năm 2018
Học viên

Nguyễn Thị Mai


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...........................................
DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH .....................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN...................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về các dược liệu trong thành phần chế phẩm viên nang mềm Bổ
gan ......................................................................................................................... 3
1.1.1. Actiso........................................................................................................... 3
1.1.2. Rau đắng đất ................................................................................................ 4
1.1.3. Bìm bìm biếc ............................................................................................... 5
1.2. Acid chlorogenic ............................................................................................ 6
1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học ............................................... 6
1.2.2. Tác dụng ...................................................................................................... 7
1.2.3. Các phương pháp xác định acid chlorogenic .............................................. 7
1.3. Tổng quan về cao thuốc ............................................................................... 11
1.3.1. Định nghĩa ................................................................................................. 11
1.3.2. Phương pháp điều chế ............................................................................... 12
1.3.3. Yêu cầu chất lượng.................................................................................... 13
1.4. Tình hình tiêu chuẩn hóa trong chế phẩm Đông Dược ................................ 14
1.5. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu sắc ký lỏng hiệu năng cao ............ 15
PHẦN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 20
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và trang thiết bị ............................. 20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................ 20
2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, dung môi ................................................................ 20
2.1.3. Phương tiện, thiết bị nghiên cứu ............................................................... 20

2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 21
2.2.1. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu ......................................................... 21


2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký .......................................................................... 22
2.2.3. Thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trongmẫu cao
Actiso và viên nang mềm Bổ gan ....................................................................... 23
2.2.4. Ứng dụng .................................................................................................. 24
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 24
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................... 26
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu ................................................... 26
3.1.1. Khảo sát dung môi loại chất béo ............................................................... 26
3.1.2. Khảo sát dung môi chiết ............................................................................ 27
3.1.3. Khảo sát thời gian chiết ............................................................................. 28
3.2. Thẩm định phương pháp .............................................................................. 37
3.2.1. Độ chọn lọc: .............................................................................................. 37
3.2.2. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký .......................................................... 39
3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính ....................................................................... 39
3.2.4. Độ chính xác.............................................................................................. 40
3.2.5. Độ đúng ..................................................................................................... 42
3.2.6. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ......... 44
4. Ứng dụng ......................................................................................................... 45
4.1. Định lượng acid chlorogenic trong cao actiso ............................................. 45
4.2. Định lượng acid chlorogenic trong một số lô chế phẩm viên nang mềm Bổ
gan trên thị trường ............................................................................................... 46
PHẦN 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 49
1. Lựa chọn phương pháp phân tích .................................................................... 49
2. Về xây dựng phương pháp phân tích .............................................................. 50
3. Về thẩm định phương pháp phân tích ............................................................. 51
4. Về ứng dụng phương pháp xây dựng được trong phân tích mẫu thực ........... 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ACG

Acid chlorogenic

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức
(Association of Official Analytical Chemists)

HPTLC

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin
Layer Chromatography)

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

ICH

International Conference on Harmonisation

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

MeCN

Acetonitril

MeOH

Methanol

PTFE

Polytetrafluoroethylene

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối ( Relative Standard Deviation)

YHCT

Y học cổ truyền


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Kết quả khảo sát dung môi loại béo khi xử lý mẫu viên nang

26

mềm Bổ gan
Bảng 2. Kết quả khảo sát dung môi chiết

27

Bảng 3. Kết quả khảo sát thời gian chiết

28

Bảng 4. Các hệ gradient tỷ lệ pha động và tốc độ dòng

32

Bảng 5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

39

Bảng 6. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

39

Bảng 7. Kết quả đánh giá độ chính xác của phương pháp trên cao

40

actiso
Bảng 8. Kết quả đánh giá độ chính xác của phương pháp trên viên

41

nang mềm Bổ gan
Bảng 9. Kết quả khảo sát độ đúng trên cao actiso

42

Bảng 10. Kết quả khảo sát độ đúng trên viên nang mềm Bổ gan

43

Bảng 11. Kết quả giới hạn phát hiện

44

Bảng 12. Kết quả định lượng acid chlorogenic trên mẫu cao actiso

45

Bảng 13. Kết quả định lượng acid chlorogenic trên mẫu viên nang

47

mềm Bổ gan


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Công thức cấu tạo acid chlorogenic

6

Hình 2. Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

15

Hình 3. Biểu đồ kết quả khảo sát nồng độ dung môi chiết acid

28

chlorogenic trong viên nang mềm Bổ gan (n = 2)
Hình 4. Kết quả khảo sát thời gian chiết acid chlorogenic trong viên

29

nang mềm Bổ gan (n=2)
Hình 5. Sắc ký đồ tách chất phân tích với các hệ pha động

30

Hình 6 . Sắc ký đồ khảo sát gradient pha động chương 1(a), hệ 2(b) và

33

hệ 3(c)
Hình 7. Sắc ký đồ đánh giá ảnh hưởng của nhiệt cột

34

Hình 8. Phổ UV của pic acid chlorogenic

35

Hình 9. Sắc ký đồ mẫu thử cao actiso

36

Hình 10. Sắc ký đồ của mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017

37

(a), mẫu chuẩn (b), mẫu placebo (c), mẫu thử thêm chuẩn (d)
Hình 11. Sắc ký đồ của mẫu cao actiso (a), mẫu chuẩn (b), mẫu

37

placebo (methanol 60%) (c), mẫu thử thêm chuẩn (d)
Hình 12. Chồng phổ UV và tinh khiết píc của mẫu viên nang mềm Bổ

38

gan
Hình 13. Chồng phổ UV và tinh khiết píc của mẫu cao actiso

38

Hình 14. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích

40

pic


Hình 15. Sắc ký đồ xác định LOD của phương pháp dung dịch

44

chuẩn/placebo (a) và dung dịch chuẩn/MeOH 60% (b)
Hình 16. Sắc ký đồ của mẫu cao actiso AC04

45

Hình 17. Sắc ký đồ của mẫu thử viên nang mềm Bổ gan

47


ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ ngàn năm các bài thuốc YHCT phòng và chữa bệnh lưu truyền trong
dân gian đã trở thành nhu cầu của con người và cho đến nay nó vẫn giữ một vai
trò rất quan trọng trong nhiệm vụ chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân. Sử
dụng thuốc có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng chữa bệnh tốt, giúp điều hòa, cân
bằng hoạt động các cơ quan, bộ phận trong cơ thể. Với xu hướng “trở về thiên
nhiên” thì việc sử dụng các thuốc từ dược liệu của người dân ngày càng gia tăng
do thuốc ít độc hại và ít gây tác dụng phụ so với thuốc tân dược.
Thuốc Đông dược nói chung và dược liệu nói riêng cần phải qua chế biến
trước khi đưa vào sử dụng. Trước đây, dược liệu được dùng dưới dạng cây tươi
hoặc phơi sấy khô, chế biến (trích, tẩm, sao…) sau đó được hãm, sắc uống và
dùng theo kinh nghiệm nên không kiểm soát được hàm lượng, chất lượng cũng
như hiệu quả điều trị. Ngày nay, với thành tựu vượt bậc của công nghiệp hóa,

hiện đại hóa trong ngành Dược đã nghiên cứu, phát triển và ứng dụng bào chế
các dạng chế phẩm như viên nang, viên nén… từ bột dược liệu, cao dược liệu và
dịch chiết dược liệu. Việc tiêu chuẩn hóa ổn định chất lượng các sản phẩm này
cần tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu đầu vào. Tuy nhiên, nguyên liệu sản xuất
được lấy từ nhiều nguồn nên mức hàm lượng hoạt chất chính giữa các lô nguyên
liệu không đồng nhất. Do đó, để ổn định chất lượng sản phẩm cần tiêu chuẩn
bán thành phẩm trước khi đưa vào sản xuất.
Actiso được trồng trên quy mô lớn và được sử dụng làm nguyên liệu
chính trong nhiều chế phẩm Đông dược. Cao Actiso cùng với cao Rau đắng đất
và cao Bìm bìm biếc có trong công thức bào chế các chế phẩm Bổ gan như viên
nang mềm và viên bao đường Boganic của công ty CP Traphaco, viên nang
mềm Giadogane của HD Pharma, viên nang cứng Chobil của DHG Pharma,
nang mềm (cứng) Liverbil của công ty CP Dược OPC,... Sự phối hợp của 3 vị
thuốc quý này có tác dụng tăng cường chức năng gan - giải độc - mát gan.
Hoạt chất acid chlorogenic có trong Actiso có tác dụng chống oxy hóa,
chống viêm, ức chế sự phát triển của khối u; chống sự đột biến gen của tế bào;
1


tiêu diệt chất gây ung thư, có tác dụng chống virus, kháng khuẩn và chống nấm
đi kèm độc tính ở mức độ thấp.
Acid chlorogenic là hoạt chất được yêu cầu định lượng trong nhiều dược
liệu như kim ngân hoa trong Dược điển Trung Quốc 2015 [13]; Dược điển Mỹ
38 [26], yêu cầu định lượng phenol tổng (trong đó có thành phần acid
chlorogenic) trong Echinacea angustifolia DC.(Fam. Asteraceae) và Echinacea
pallida (Nutt.) (Fam. Asteraceae) bằng HPLC; Dược điển Châu Âu [14] quy
định định lượng ACG trong lá và cao khô chiết xuất từ lá actiso bằng phương
pháp HPLC, với yêu cầu hàm lượng CGA không ít hơn 0,8% trong lá và 0,6%
trong cao khô chiết xuất từ lá. Nhưng chuyên luận actiso trong Dược điển Việt
Nam IV [1] mới chỉ yêu cầu định lượng cynarin trong lá và cao đặc bằng

phương pháp quang phổ.
Để góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của chế phẩm viên nang
mềm có thành phần chứa Actiso, Rau đắng đất và Bìm bìm biếc chúng tôi tiến
hành đề tài nghiên cứu: “Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic
trong viên nang mềm Bổ gan bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, với các mục
tiêu sau:
- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trong
cao Actiso và viên nang mềm Bổ gan bằng HPLC.
- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng acid chlorogenic trong
một số mẫu cao Actiso và chế phẩm viên nang mềm Bổ gan đang lưu hành trên
thị trường.

2


PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về các dƣợc liệu trong thành phần chế phẩm viên nang mềm
Bổ gan
1.1.1. Actiso


Đặc điểm thực vật, phân bố của cây actiso.
Actiso có tên khoa học là Cynara scolymus L., thuộc họ Cúc

(Asteraceae). Cây thảo lớn, sống hai năm hoặc lâu năm, cao 1 - 1,2 m, có thể
đến 2 m. Thân ngắn, thẳng và cứng, có khía dọc, phủ lông trắng như bông. Lá
to, dài, mọc so le, phiến lá xẻ thùy sâu và có răng không đều, mặt trên xanh lục,
mặt dưới có lông trắng; cuống lá to và ngắn.
Cụm hoa to mọc ở ngọn thân thành đầu màu đỏ tím hoặc tím lơ nhạt; lá
bắc ngoài của cụm hoa rộng, dày và nhọn, đế cụm hoa nạc, phủ đầy lông tơ,

mang toàn hình ống.
Quả nhẵn bóng, màu nâu sẫm, có mào lông trắng [6], [2], [4].
Hiện nay cây được trồng nhiều nhất ở Đà Lạt (Lâm Đồng) và Sa Pa (Lào
Cai), tổng diện tích lên tới vài trăm hecta.


Bộ phận dùng
Lá, hoa (phần trên mặt đất)
Dược điển Việt Nam IV [1], quy định dùng lá đã phơi hoặc sấy khô.
Rễ và thân cũng được dùng làm thuốc [3].



Thành phần hóa học
Lá actiso chứa:
- Acid hữu cơ bao gồm: Acid phenol: Cynarin (acid 1-3 dicafeyl quinic)

và các sản phẩm thủy phân (acid cafeic, acid chlorogenic, acid neo
chlorogenic).Acid alcol: acid hydroxymethylacrilic, acid malic, acid lactic, acid
fumaric,…

3


- Hợp chất flavonoid (dẫn chất của luteolin) bao gồm cynarosid (luteolin 7 - D - glucopyrano - sid), scolymosid (luteolin - 7 - rutinosid) và cynarotriosid
(luteolin - 7 - rutinosid - 3’ - glucosid).
- Thành phần khác: Cynaropicrin, enzym: oxidase, peroxidase, oxigenase,
catalase. Các enzym hoạt động mạnh ở pH 4-7,6 và dễ phá hủy hoạt chất trong
quá trình phơi, sấy, chế biến. Nhiều chất vô cơ.
Dược điển châu Âu (EP) 8.0 qui định hàm lượng acid chlorogenic trong lá

actiso khô phải không dưới 0,8% [14].


Công dụng của actiso
Ngoài việc có thể dùng đế hoa hoặc lá bắc để ăn, actiso dùng làm thuốc

thông tiểu tiện, thông mật, các bệnh yếu gan, thận, viêm thận cấp tính và kinh
niên, sưng đau khớp.
Nhuận và tẩy nhẹ đối với trẻ em.
Lá tươi và khô dùng dưới hình thức thuốc sắc 5-10% hoặc cao lỏng 210/ngày.
Có thể chế thành cao mềm hay khô để chế thuốc viên...
1.1.2. Rau đắng đất


Đặc điểm thực vật, phân bố của cây rau đắng đất
Rau đắng đất có tên khoa học là Glinus oppositifolius (L) A.DC. Thuộc họ

rau đắng đất (Aizoaceae). Cây cỏ nhỏ, mọc bò, thân và cành mọc tỏa tròn gần
sát mặt đất, màu đỏ tím, đôi khi mọc cao tới 10 - 30cm. Lá nhỏ, mọc so le, có bẹ
chìa. Phiến lá dài 1,5 - 2 cm, rộng 0,4cm. Hoa nhỏ, màu hồng tím, mọc tụ từ 1
đến 5, thường 3 - 4 hoa ở kẽ lá.Quả ở cạnh, chứa một hạt đầu đen.Mùa hoa từ
tháng 5 - 6, kéo dài suốt mùa hè.
Tên gọi khác: rau đắng lá vòng. Phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt
đới, cây mọc nhiều ở các tỉnh như Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Ninh, Bắc Giang...


Bộ phận dùng: toàn cây.
4



Thành phần hóa học: Theo các tài liệu [3], [6] rau đắng đất chứa chủ yếu

là saponin và flavonoid. Một số tác giả đã phân lập được Spergulagenin. Theo
một số nghiên cứu gần đây, trong Rau đắng đất có chứa acid chlorogenic.


Công dụng:
Theo Đông y rau đắng đất có vị đắng, tính bình, có tác dụng lợi tiêu hoá,

khai vị, kháng sinh, lợi tiểu và nhuận gan.
Rau đắng làm mát gan do kích thích tiết mật, thông tiểu, nhuận tràng;
dùng trong trường hợp nóng nảy trong người làm lở miệng, viêm nha chu, chảy
máu răng; dùng lá rau đắng xông hơi trị ho cảm và viêm phổi; nước rau đắng
uống nhiều lần trong ngày trị ngừa sạn thận và sỏi mật...
Trong nhân dân, rau đắng đất được dùng làm thuốc lợi tiểu, chữa đái buốt,
sỏi thận [3], [6].
1.1.3. Bìm bìm biếc


Đặc điểm thực vật, phân bố của cây bìm bìm biếc
Bìm bìm biếc có tên khoa học là Pharbitis nil, thuộc họ Bìm bìm

(Convovulaceae). Bìm bìm biếc là một loại dây leo, cuốn, thân mảnh, có điểm
những lông hình sao. Lá hình tim, xẻ 3 thùy, nhẵn và xanh ở mặt trên, xanh nhạt
và có lông ở mặt dưới, dài 14cm, rộng 12cm, cuống dài 5 - 9cm, gầy, nhẵn. Hoa
màu hồng tím hay lam nhạt, lớn, mọc thành xim 1 - 3 hoa, ở kẽ lá. Quả nang
hình cầu, nhẵn, đường kính 8mm, có 3 ngăn. Hạt 2 - 4, hình 3 cạnh, lưng khum,
hai bên dẹt, nhẵn nhưng ở tễ hơi có lông, màu đen hay trắng tùy theo loài, dài 5 8mm, rộng 3 - 5mm.

Tên gọi khác: Khiên ngưu tử, Hắc sửu.
Phân bố, thu hái và chế biến: mọc hoang ở nhiều tỉnh nước ta. Vào các
tháng 7 - 10 quả chín, người ta hái về, đập lấy hạt phơi khô.


Bộ phận dùng: hạt.
5




Thành phần hóa học: có acid chlorogenic và khoảng 2% glucosid:

pharbitin, 11% chất béo,...
Pharbitin được cấu tạo bởi acid pharbatic, acid tiglic, acid nilic, acid
valeric, acid d-α-methylbutyric.
Hạt chưa chín của Bìm bìm biếc chứa giberelin A3, giberelin A5, giberelin
A20, giberelin A26, giberelin A27, giberelin glucosid.


Công dụng: bìm bìm có vị cay, tính nóng hơi có độc dùng để chữa tiện bĩ,

cước khí, lợi tiểu tiện, sát trùng [3], [6].
1.2. Acid chlorogenic
1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học

Hình 1. Công thức cấu tạo acid chlorogenic
Công thức phân tử: C16H18O9
Trọng lượng phân tử: 354,31
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: acid 3R-[[3-(3,4-dihydroxyphenyl)1-oxo-2- propenyl]oxy]-1S,4R,5R-trihydroxy-cyclohexanecarboxylic.

Tên khác: acid 3-0-Caffeoylquinic.
Acid chlorogenic có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, tan được
trong nước và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd,
dimethylformamid…Nhiệt độ nóng chảy: 210ºC.
Acid chlorogenic là một chất khá bền vững, điều kiện bảo quản tốt nhất là
ở 4ºC.
6


1.2.2. Tác dụng
Acid chlorogenic có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế sự phát
triển của khối u, chống sự đột biến gen của tế bào; tiêu diệt chất gây ung thư,
làm chậm quá trình giải phóng glucose vào tuần hoàn sau bữa ăn; có tác dụng
kháng virus, kháng khuẩn và chống nấm đi kèm độc tính ở mức độ thấp.
Acid chlorogenic được ứng dụng trong dược phẩm (ngăn bệnh đái tháo
đường typ 2, bệnh tim mạch…), được thương mại hóa dưới tên Sveltol (tại Anh
và Na uy). Là một thành phần thêm vào thực phẩm để thúc đẩy quá trình giảm
cân và dùng trong mỹ phẩm để làm đẹp [12], [16], [20].
Tất cả các nghiên cứu riêng lẻ các hợp chất trong actiso cho thấy acid
chlorogenic, lutein, luteolin-7-O-glucoside có hiệu quả chống oxy hoá cao, trong
đó acid chlorogenic là hợp chất chống oxy hóa mạnh nhất.
1.2.3. Các phương pháp xác định acid chlorogenic
Schütz K (2004) đã phát triển phương pháp định tính và định lượng các
hợp chất phenolic từ nước ép và bã của búp actiso bằng HPLC với detector
mảng diod và khối phổ [23]. Hàm lượng phenolic toàn phần xấp xỉ 12 g/kg trên
dược liệu khô cho thấy actiso là một nguồn các hợp chất phenolic triển vọng để
sử dụng làm chất chống oxy hoá tự nhiên hoặc là thành phần thực phẩm chức
năng.
Qing LI cùng cộng sự (2005) đã nghiên cứu xác định đồng thời
Protocatechuic Acid, Syringin, Chlorogenic Acid, Caffeic Acid, Liriodendrin

and Isofraxidin trong bột dược liệu Acanthopanax senticosus bằng phương pháp
HPLC – DAD [22]. Bột dược liệu siêu âm với nước, bốc hơi lấy cắn, hòa tan
trong MeOH. Điều kiện sắc ký: cột Agilent SB-C18 column (250 x 4.6mm; 5
μm), nhiệt độ cột được duy trì ở 35°C, pha động (gradient nước (0,05% v/v
phosphoric acid) - acetonitrile (0,01 phút, 94: 6, 50 phút, 65:35)), tốc độ dòng :
0,9 ml/phút, detector: DAD 200 - 370 nm, thời gian lưu của pic CGA khoảng
15,5 phút.
7


Yuan và cộng sự đã nghiên cứu định lượng đồng thời arctiin, acid
chlorogenic và glycyrrhizin trong một số thuốc viên của 7 thương hiệu khác
nhau của “Yin Qiao Jie Du” bằng phương pháp HPLC [27]. Mẫu được xử lý
bằng ethanol 50%. Sử dụng cột Phenomenex (Lichrosorb 10RP18, 240x4mm,
10µm, USA), thể tích tiêm 10µl, tốc độ dòng 1 ml/min. Pha động gồm: hỗn hợp
dung dịch B gồm 0,4% acetic acid và 4,5% tetrahydrofuran (dd B); acetonitril
(dd A). Chạy theo chương trình gradient, bước sóng phát hiện: 254nm, 280nm
và 326nm. Pic của acid chlorogenic phát hiện ở 15 phút đầu tiên.
Năm 2007, Zhang và các cộng sự đã nghiên cứu tiến hành định lượng
đồng thời acid chlorogenic, linarin và luteolin trong viên đạn Flos chrysantheni
Indici [28]. Sau khi xử lý mẫu, hòa tan mẫu thử vào dung dịch acetonitril – nước
(20: 80). Dùng cột Hypesil ODS (4,6mm x 250mm, 5µm), detetor UV phát hiện
trong khoảng từ 210 – 400nm, nhiệt độ cột 250C, thể tích tiêm 20µl, tốc độ dòng
1ml/min [23]. Chạy theo chương trình gradient.
Li-Mei Wang và các cộng sự (2009) đã tiến hành định lượng acid
chlorogenic trong kim ngân [20] như sau: Hoa tươi được cắt nhỏ thành miếng
nhỏ (5 mm). Thêm ethanol 70o vào 0,50 g mẫu thử theo cái tỷ lệ dung môi và
mẫu 20:1 (tt/kl). Siêu âm mẫu thử trong 30 phút. Tiến hành chiết lặp lại 2 lần.
Lấy dịch chiết và cô đặc để thu được dung dịch acid chlorogenic đặc. Tiếp tục
làm khô ở 45ºC trong chân không. Lấy 4 mg cắn hòa tan trong 20 ml methanol

và lọc. Mẫu thử được phân tích bằng HPLC với điều kiện là cột XDB-C18 (4,6
×150mm, 5µm), pha động là methanol/nước/acid acetic (15:85:0,4) phát hiện ở
bước sóng 327 nm, khoảng nồng độ của acid chlorogenic khảo sát (10-50 µg/ml)
với R2: 0,9994.
Các nhà khoa học Trung Quốc Tingting Wang, Xinhang Jiang, Lu Yang,
Shihua Wu đã định lượng acid chlorogenic trong hoa kim ngân bằng HPLC [25]
với điều kiện là cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 × 2,1mm, 3,5µm). Pha động
methanol - dung dịch acid trifluoroacetic 0,03% theo chế độ gradient methanol
5-80% trong 20 phút, tốc độ dòng 0,3 ml/phút, phát hiện ở bước sóng 330 nm,
tiêm mẫu 2 µm, thời gian lưu khoảng 10 phút [20].
8


Mirna Leonor Sua rez-Quiroz và các cộng sự đã phân lập acid chlorogenic
trong cà phê xanh sử dụng than hoạt tính [21]. Phương pháp TLC được thực
hiện trên bản mỏng silica gel 60 F254 (4 cm x 6,6 cm), thể tích mẫu 5 µl, dung
môi khai triển gồm butanol - nước - acid acetic (6: 2: 2), hiện màu bằng thuốc
thử iod và quan sát ở 254 và 366 nm. Phương pháp HPLC: Mẫu pha loãng được
lọc qua màng lọc 0,45µm, thể tích tiêm 10 µl, dùng cột C18 (5 µm; 250 mm 4,6
mm), bước sóng phát hiện tại UV 276 nm. Pha động sử dụng nước methanol nước(70:30) với tốc độ dòng 1 ml / phút [17].
Jiagen Wen và cộng sự (2012), nghiên cứu định lượng acid chlorogenic
trong bột dược liệu Lepidogrammitis drymoglossoides (Baker) Ching,
Polypodiaceae bằng HPLC – UV [19]. Chiết siêu âm với nước sau đó thêm
MeOH cất quay. Điều kiện sắc ký: cột Phenomenex Luna C18 (250 × 4,6 mm,
5μm), pha động: acetonitrile (acid phosphoric 0,5% (11,5:88,5 tt/tt), tốc độ dòng
: 1ml/phút, detector: UV 327 nm. Thời gian lưu của pic CGA khoảng 15,7 phút.
Hàm lượng CGA trong L.drymoglossoides xấp xỉ đạt 0,24%.[29]
Jan Fritsche đã sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột (Sephadex LH-20) kết
hợp với các phương pháp phân tích (HPLC-DAD-MS và HPLC-DAD) để phân
tách, định tính và định lượng các hợp chất trong actiso [18]. Nồng độ acid

chlorogenic trong khoảng 0,35-18,34 mg/g dịch chiết nước.
Abdul Mutalib A.G Nasser và cộng sự đã tiến hành xác định Cynarin và
acid chlorogenic trong Cynara scolymus L. bằng HPLC [10]. Mẫu thử dược liệu
được chiết bằng methanol 80%, sau đó tách 2 polyphenol bằng cột C18, tốc độ
dòng 1,3ml/ phút; pha động là nước: methanol: acid acetic (78,5:20:2,5); thể tích
tiêm 20 µl, phát hiện tại UV 316nm, thời gian lưu của cynarin và acid
chlorogenic lần lượt là 4,78 và 5,47 phút.
Florinda Fratianni và cộng sự đã nghiên cứu xác định polyphenol và hoạt
tính sinh học của Cynara cardunculus var.scolymus [15] bằng HPLC sử dụng
cột pha đảo (BEH C18; 1,7µm; 2,1×100mm); pha động gồm dung môi A (acid
acetic 7,5 mM) và dung môi B (acetonitril) với tốc độ dòng 250 µl/phút, rửa giải
theo chế độ gradient. Phát hiện bằng detectơ phạm vi quét: 210-400nm, thể tích
9


tiêm là 5 µl. Kết quả phân tích sắc ký đã xác định các polyphenol khác nhau,
gồm acid gallic, chlorogenic, caffeic, p-coumaric, ferulic, 1-3 dicaffeoylquinic
(cynarin), cũng như epicatechin, rutin và luteolin.
Theo Dược điển Trung Quốc [13], acid chlorogenic trong dược liệu kim
ngân hoa được định lượng bằng HPLC với cột tách C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm)
duy trì ở 40oC; hệ pha động là gồm A: acetonitil, B: acid phosphoric 0,4% chạy
đẳng dòng theo tỷ lệ acetonitril:acid phosphoric 0,4% (13:87), phát hiện bằng
detector UV ở 330 nm, thời gian phân tích khoảng 15 phút. Pic của acid
chlorogenic được tách ra và có thời gian lưu khoảng 7 phút.
Theo Dược điển châu Âu EP 8.0 [14], acid chlorogenic trong lá và cao
actiso được định lượng bằng HPLC với cột tách C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) duy
trì ở 40oC; hệ pha động là gồm A: acid phosphoric – nước (0,5:99,5), B: acid
phosphoric – acetonitril (0,5:99,5) chạy theo chế độ gradient thành phần pha
động, phát hiện bằng detectơ UV ở 330 nm, thời gian phân tích khoảng 40 phút.
Pic của acid chlorogenic được tách ra và có thời gian lưu khoảng 9,1 phút. Hàm

lượng acid chlorogenic yêu cầu không nhỏ hơn 0,8% tính theo dược liệu khô.
Theo Dược điển Mỹ 38 [26], acid chlorogenic trong một số dược liệu
được định tính bằng phương pháp HPTLC với điều kiện tương tự như trong EP
8.0 về pha tĩnh, cách phát hiện; cách xử lý mẫu và pha động có thay đổi, cụ thể
là đối với Echinacea angustifolia DC. (Fam. Asteraceae), Echinacea pallida
(Nutt.)Nutt.(Fam. Asteraceae) và Echinacea purpurea (L.) Moench (Fam.
Asteraceae) thì mẫu thử được chiết với methanol bằng siêu âm trong 10 phút;
pha động gồm ethyl acetat, methylethyl ceton, nước, - acid formic (5:3:1:1). Còn
với Ginkgo biloba L. (Fam. Ginkgoaceae) thì mẫu thử được chiết với methanol
hồi lưu cách thủy trong 5-10 phút, pha động là acid formic khan – acid acetic –
nước – ethyl acetat (1,1:1,1:2,6:10). Đồng thời, định lượng phenol tổng (trong
đó có thành phần acid chlorogenic) trong Echinacea angustifolia DC.(Fam.
Asteraceae) và Echinacea pallida (Nutt.)Nutt.(Fam. Asteraceae) bằng HPLC
được thực hiện với điều kiện tương tự EP 8.0.
10


Lê Thị Thu Hiền và cộng sự (2010), Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid
chlorogenic từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng [5]. Trong đó
định lượng acid chlorogenic sử dụng cột Phenomenex RP 18, (5µm, 5mm x
250mm), pha động (Acetonitril : Dung dịch acidphosphoric 0,4% tỷ lệ 13 : 87
(v/v)) tốc độ dòng: 1 ml/phút, thể tích tiêm: 20 µl, detector UV : 327 nm.
Vũ Bình Dương và cộng sự đã nghiên cứu định lượng acid chlorogenic
trong ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla) bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao [9], bột dược liệu được chiết siêu âm bằng MeOH. Acid chlorogenic trong
mẫu thử được tách bằng cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm, Phenomenex, Mỹ), pha
động: hệ dung môi acid acetic 0,1% : Acetonitril tỷ lệ 70 : 30 (v/v), tốc độ dòng:
1,2 ml/phút, thể tích tiêm: 10 µl, detector UV: 320. Thời gian lưu của pic ACG
khoảng 6,7 phút.
Nguyễn Thị Ánh Nguyệt và cộng sự (2016) đã phân lập và thiết lập chất

chuẩn acid chlorogenic từ actiso đạt độ tinh khiết 92,39% [7].
Phí Thị Bảo Thoa (2017) đã tiến hành định lượng acid chlorogenic trong
cao actiso bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, acid chlorogenic trong cao
actiso được chiết siêu âm bằng MeOH 60%, tách trên bản mỏng silica gel 60
F254, pha động etylacetat: acid acetic: acid formic: nước (10: 1,1: 1,1: 2,7), thể
tích chấm 25 µl, bước sóng phân tích 330nm. Kết quả hàm lượng acid
chlorogenic trong cao actiso từ 0,7 đến 4,57% [8].
1.3. Tổng quan về cao thuốc
1.3.1. Định nghĩa
Theo Dược điển Việt Nam IV [1] cao thuốc là chế phẩm được chế bằng
cách cô hay sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực
vật hay động vật với các dung môi thích hợp.
Các dược liệu trước khi chiết xuất cần được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia
nhỏ đến kích thước thích hợp). Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men
làm phân hủy hoạt chất cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách
dung hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác.
Cao thuốc được chia làm 3 loại:
11


 Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử
dụng trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo
quản hay cả hai). Nếu không có chỉ dẫn khác quy ước 1 ml cao lỏng tương
ứng với 1 g dược liệu dung để chế cao thuốc.
 Cao đặc: là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong
cao không quá 20%
 Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao khô
không được có độ ẩm lớn hơn 5%.
1.3.2. Phương pháp điều chế
Quá trình điều chế cao thường có 2 giai đoạn:

Giai đoạn I
Chiết xuất dược liệu bằng dung môi thích hợp. Tùy theo bản chất dược
liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm cũng như các điều kiện về
quy mô sản xuất và trang thiết bị, có thể sử dụng các phương pháp chiết xuất:
ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm kiệt, …Phương pháp ngâm nhỏ giọt thường được sử
dụng. Khi đó, dược liệu thô được chia nhỏ đến kích thước phù hợp, được làm
ẩm với một lượng dung môi vừa đủ rồi đậy kín để yên trong 2 - 4h. Sau đó,
chuyển khối dược liệu vào bình ngấm kiệt, thêm lượng dung môi vừa đủ đến khi
ngập hoàn toàn khối dược liệu. Thời gian ngâm lạnh và tốc độ chảy trong quá
trình chiết có thể thay đổi theo khối lượng và bản chất của dược liệu thô đem
chiết.
Giai đoạn II
Cao lỏng: Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết bằng
các phương pháp khác nhau để thu được cao lỏng có tỷ lệ theo như quy ước (1
ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu). trong trường hợp điều chế cao lỏng
bằng phương pháp ngâm nhỏ giọt, tốc độ chảy của dịch chiết có thể chậm, vừa
hay nhanh. Nếu chiết xuất 1000 g dược liệu thì:
Ở tốc độ chậm: không quá 1 ml dịch chiết/ phút
12


Ở tốc độ vừa: 1 - 3 ml dịch chiết/ phút
Ở tốc độ nhanh: 3 - 5 ml dịch chiết/ phút
Để riêng phần dịch chiết đầu đậm đặc bằng 4/5 lượng dược liệu đem chiết. Sau
đó đem cô các phần dịch chiết tiếp theo trên bếp cách thủy hoặc cô dưới áp suất
giảm ở nhiệt độ không quá 600C cho đến khi loại hết dung môi. Hoà tan cắn thu
được trong dịch chiết đầu đậm đặc nếu cần thêm dung môi vào để thu được cao
lỏng đạt tỷ lệ quy định. Cao lỏng có khuynh hướng bị lắng cặn vì vậy để cao
lỏng ở chỗ mát trong thời gian ít nhất 3 ngày rồi lọc.
Cao đặc và cao khô: Dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại không

quá 20%. Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy đến khi độ ẩm còn lại
không quá 5%. Để đạt được thể chất quy định , quá trình cô đặc và sấy khô dịch
chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ
không quá 600C.
Trường hợp muốn thu cao có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp
bằng các phương pháp thích hợp tùy thuộc vào bản chất của dược liệu, dung môi
và phương pháp chiết xuất. Có thể thêm chất bảo quản hoặc các chất trơ để làm
chất mang hay để cải thiện tính chất vật lý. Đối với cao khô có thể sử dụng bột
trơ thích hợp hay cao khô của dược liệu sử dụng để điều chỉnh nồng độ hoạt chất
đến tỷ lệ quy định.
1.3.3. êu cầu chất lượng
Đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và đạt các yêu cầu
chung sau đây:
Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc
đã mô tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng.
Ngoài ra, cao lỏng còn phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn bã
dược liệu và vật lạ.

13


Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều
chế cao.
Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác): Cao đặc không
quá 20 %. Cao khô không quá 5 %.
Hàm lượng cồn: Đạt từ 90 % đến 110 % lượng ethanol ghi trên nhãn (áp
dụng cho cao lỏng và cao đặc).
Kim loại nặng: Đáp ứng yêu cầu qui định trong chuyên luận riêng.
Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước
hay hỗn hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui

định trong DĐVN IV.
Dư lượng hóa chất

o vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu quy định trong

DĐVN IV.
Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu qui định trong DĐVN IV.
o qu n Cao thuốc được đựng trong bao bì kín, để nơi khô, mát, tránh
ánh sáng, nhiệt độ ít thay đổi.
1.4. Tình hình tiêu chuẩn hóa trong chế phẩm Đông Dƣợc
Dược liệu và các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu thường có rất nhiều
thành phần, nên việc đặt ra tiêu chuẩn cho tất cả các chế phẩm Đông Dược gặp
nhiều khó khăn, không thống nhất. Mỗi chế phẩm do một công ty sản xuất đều
có tiêu chuẩn riêng.
Dược điển Việt Nam là một văn bản quy phạm kỹ thuật quan trọng, là cơ
sở xem xét đánh giá, và xác định chất lượng thuốc ở phần lớn các cơ sở sản xuất
trên cả nước. Trong đó, có nhiều chuyên luận quy định tiêu chuẩn chất lượng
dược liệu (phần lớn là dược liệu chưa chế biến), một số bài thuốc.... Tuy nhiên,
việc đi vào thực tế để kiểm tra chất lượng dược liệu đã vấp phải rất nhiều khó
khăn như: nguồn dược liệu lưu hành trên thị trường chủ yếu là dược liệu chế,
14


dược liệu được nhập từ nhiều nguồn khác nhau, tiêu chuẩn quy định trong dược
điển ít đề cập tới việc xác định hoạt chất chính hay hoạt chất có tác dụng dược
lý. Vài năm trở lại đây vấn đề kiểm tra chất lượng dược liệu, các chế phẩm
Đông dược càng đặt ra nhiều thách thức hơn với công tác kiểm nghiệm, một
phần do nguồn dược liệu ngày càng phức tạp, công tác tiêu chuẩn hóa gặp nhiều
khó khăn.
Trên thực tế, việc sử dụng các phương pháp hiện đại như HPLC, sắc ký

lớp mỏng siêu hiệu năng, sắc ký khối phổ có sử dụng chất đối chiếu chưa được
sử dụng nhiều, giá thành chất chuẩn, dược liệu chuẩn cao. Viện kiểm nghiệm
thuốc Trung Ương là đơn vị đứng đầu trong ngành kiểm nghiệm đã và đang
nghiên cứu bổ sung nguồn dược liệu chuẩn, tinh chế chất chuẩn dược liệu. Tuy
nhiên, với tốc độ phát triển của thị trường ngày càng có nhiều dạng chế phẩm
khác nhau lưu hành, thành phần cũng ngày càng đa dạng hơn đặt ra dấu hỏi lớn
về chất lượng sản phẩm. Do vậy, xu hướng hiện nay là cần phải xây dựng các
phương pháp tối ưu đảm bảo độ chính xác, tính khách quan và khả thi để nâng
cao tiêu chuẩn cũng như chất lượng của chế phẩm đông dược.
1.5. Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nguyên tắc
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp tách sắc ký các chất dựa
trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó
pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột.

Hình 2. Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
15


Pha tĩnh
Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là chất nhồi cột để tách sắc
ký chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ,
đường kính hạt từ 3 - 10µm. Các hạt có hình cầu hoặc không có hình dạng
nhất định, có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu.
Cột thường được làm bằng thép không gỉ, có chiều dài và đường kính
trong khác nhau được sử dụng cho phân tích sắc ký. Cột có đường kính
trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là vi cột. Nhiệt độ của cột phải được
giữ ổn định trong suốt thời gian phân tích (nhiệt độ cột không được quá
60oC).
Trong sắc ký lỏng pha đảo, pha tĩnh gồm nhiều chất dạng biến đổi hóa

học được chế tạo từ polymer, silica gel hoặc than graphit xốp. Thường các
cột sắc ký pha đảo chế tạo trên nền silica được coi là ổn định với pha động
có pH từ 2,0 đến 8,0. Cột chứa than graphit xốp hoặc các hạt vật liệu
polymer ổn định ở khoảng pH rộng hơn.
Pha động
Pha động là hệ dung môi dùng để rửa giải các chất phân tích ra khỏi
cột tách để thực hiện quá trình sắc ký. Thành phần pha động có thể chỉ gồm
một dung môi hay hỗn hợp dung môi trộn với nhau theo tỷ lệ thích hợp của
acetonitril, methanol với nước hoặc dung dịch đệm, …
Các yếu tố thuộc về pha động ảnh hưởng đến kết quả tách sắc ký gồm :
+ Bản chất của dung môi pha chế pha động : Đối với sắc ký lỏng pha thuận
thường sử dụng dung môi ít phân cực. Đối với sắc ký lỏng pha đảo sử dụng
pha đảo chứa nước với dung môi hữu cơ. Dựa vào chỉ số phân cực P’ và UV
cut-off của dung môi để lựa chọn dung môi pha động phù hợp rửa giải chất
phân tích và dung môi không hoặc ít hấp thụ quang ở vùng bước sóng phát
hiện nếu như sử dụng detector tử ngoại.

16